多光源顕微鏡
【課題】同一の生体組織試料について、電子像観察だけでなく、蛍光像観察、そして透視像観察等を行うことも可能な、複数の観察用光源を備えた多光源顕微鏡を提供する。
【解決手段】電子顕微鏡の光源である電子銃とそれ以外の少なくとも１種の光源を有し、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、蛍光を観察するための光学顕微鏡２０と走査型電子顕微鏡２とからなり、該走査型電子顕微鏡の電子ビームの光軸と同軸となるように該光学顕微鏡のカセグレン鏡１２が該走査型顕微鏡の鏡筒内に配置されてなり、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いる。
【解決手段】電子顕微鏡の光源である電子銃とそれ以外の少なくとも１種の光源を有し、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、蛍光を観察するための光学顕微鏡２０と走査型電子顕微鏡２とからなり、該走査型電子顕微鏡の電子ビームの光軸と同軸となるように該光学顕微鏡のカセグレン鏡１２が該走査型顕微鏡の鏡筒内に配置されてなり、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の光源を有し、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病診断方法の開発等の医療バイオ分野では、生体組織を蛍光色素で免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡を用いて観察している。しかし、この方法では１０００倍程度の解像度が限界である。それに対し、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を高倍率で観察する方法として、走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭという。）の電子線を試料に照射して蛍光を発生させ（カソードルミネッセンス）、その蛍光を観察する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。また、半導体ウェハ等の分析に関するものではあるが、荷電粒子による試料励起と光による試料励起を一つの装置で行うようＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせて、試料の分析点のＸ線分光スペクトルと蛍光スペクトルとを測定する表面分析装置も提案されている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−２６０３０３号公報
【特許文献２】特開平５−１１３４１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせることにより、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を即座にＳＥＭで観察することにより、その分析点の形態的特徴から対象物を短時間で同定できることが期待できる。しかしながら、分解能が不十分であり、生体組織の観察に使用可能な、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせた実用レベルの分析装置は報告されていない。
【０００５】
また、ＳＥＭと光学顕微鏡との組み合わせだけでなく、ＳＥＭとＸ線顕微鏡、あるいはＳＥＭと光学顕微鏡とＸ線顕微鏡との組み合わせも必要とされている。
【０００６】
そこで、本発明は、同一の生体組織試料について、電子像観察だけでなく、蛍光像観察、そして透視像観察等を行うことも可能な、複数の観察用光源を備えた多光源顕微鏡を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明の多光源顕微鏡は、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、蛍光を観察するための光学顕微鏡部と走査型電子顕微鏡部とからなり、該走査型電子顕微鏡部の電子ビームの光軸と同軸となるように該光学顕微鏡部のカセグレン鏡が該走査型顕微鏡部の鏡筒内に配置されてなる多光源顕微鏡であって、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いることを特徴とする。
【０００８】
上記の多光源顕微鏡には、上記カセグレン鏡が、中央に開口を有する大鏡と、該開口の下方に該大鏡に対向するように配置された小鏡とからなり、大鏡と小鏡の反射面が非球面型であるものを用いることができる。
【０００９】
また、上記の多光源顕微鏡には、光学顕微鏡部の光源としてレーザ光源を用いることができる。
【００１０】
また、本発明の別の多光源顕微鏡は、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、移動可能に配置された、電子銃と、レーザ光源と、Ｘ線源とを備えた光源部と、該光源部からの電子線又は電磁波を試料に照射する光学系と、セリウムドープＹＡＧからなる蛍光板を有し試料を透過した電子線又は電磁波を検出する検出部を少なくとも有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の多光源顕微鏡は、複数の光源の光軸が同軸となるように構成されており、試料を移動させることなく、１台の装置で、蛍光観察と電子像観察、あるいは蛍光観察と電子像観察と透視Ｘ線像観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。本発明によれば、光源に電子銃を用いた場合、二次電子像観察、反射電子像観察、透過電子像観察、ＥＤＸ観察、そしてＳＴＥＭ観察が可能であり、光源にレーザを用いた場合、ケーラー照明による像観察やケーラー照明による蛍光像観察、光源にＸ線を用いた場合、透視Ｘ線像観察や３Ｄ透視Ｘ線像観察、そして電子線照射によるカソードルミネッセンス観察や、レーザ照射によるラマン／蛍光測定等が可能である。なお、本発明の観察対象は生体組織に限定されず、従来の電子顕微鏡、Ｘ線顕微鏡、そして光学顕微鏡が対象とするものであれば、金属、半導体、セラミックス、プラスチック等の種々の材料も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施の形態１に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
【図２】実施例１におけるラットの神経組織の顕微鏡写真であり、（ａ）は蛍光画像、（ｂ）は蛍光ＳＥＭ画像である。
【図３】実施例２におけるラットの腎(尿細管)の顕微鏡写真であり、（ａ）はＳＥＭ画像、（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）は蛍光ＳＥＭ画像である。
【図４】実施例３におけるマクロファージを含むリンパ節組織の顕微鏡写真であり、（ａ）はＳＥＭ画像、（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）は蛍光ＳＥＭ画像である。
【図５】実施の形態２に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータ１からなるシステム制御部１と、ＳＥＭ部２と、光学顕微鏡部２０とから構成されている。ＳＥＭ部２においては、電子線発生部３から発生し加速された電子線が、電子線走査部４により２次元的に走査され、真空チャンバ６内に配置された鏡筒部５を通って試料９に照射される。なお、鏡筒内５には、光学顕微鏡用の反射ミラー１３が配置されているが、電子線は反射ミラー１３内の通過孔（不図示）を通って試料１０に至る。また、１１は試料１０をＸＹ方向に移動させる試料ステージであり、試料ステージ制御部９により駆動される。また、試料１０への電子線照射により発生する二次電子は検出器７により検出され、増幅器８により増幅される。
【００１４】
一方、光学顕微鏡部２０は、ＳＥＭ部の光軸から離れた位置に配置された、照明用の光源２１と、照明部２２と、観察カメラ２３と、試料９からの蛍光を集光する光ファイバー部２４と、その光ファイバー部２４からの蛍光強度を測定する分光器２５とを有している。
【００１５】
例えば、試料１０の光学像を観察する場合、光学顕微鏡部２０の光源２１の光を、照明部２２からレンズやミラー等の光学系（不図示）により反射ミラー１３に向けて照射する。反射ミラー１３で反射された光は、ＳＥＭ部に電子線の光軸に沿って、鏡筒内５に配置されたカセグレン鏡１２に至る。カセグレン鏡１２は、中央に開口を有し上方に配置された１個の大鏡１２ａと、その開口の下方に配置された小鏡１２ｂとからなり、その大鏡１２ａと小鏡１２ｂとが対向するように配置されている。反射ミラー１３からの光は、大鏡１２ａの開口を通過し、小鏡１２ｂによって反射され、その反射光は大鏡１２ａによって反射集束されて試料１０に照射される。
【００１６】
そして、試料１０からの光は、大鏡１２ａによって反射され、小鏡１２ｂによって反射され、反射ミラー１３へ向かう。反射ミラー１３で反射された光は、光学系（不図示）によって観察カメラ２３と光ファイバー部２４へと向かう。
【００１７】
蛍光標識されて試料について光学顕微鏡で数百倍程度の観察倍率で観察を行い、さらに所望の試料領域についてＳＥＭを用いてさらに高倍率の観察を行う。
【００１８】
ここで、ＳＥＭ部は、ホストコンピュータ１で電子線を走査制御して得られた二次電子等を検出部７で検出してＩ−Ｖアンプ（不図示）にて電気信号に変え、ホストコンピュータ１のＡ・Ｄコンバータ（不図示）で変換してＳＥＭ画像を取得する。また、光学顕微鏡部は、蛍光選択フィルタ（不図示）と観察用カメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出し、ホストコンピュータ１へデジタル信号として送る。送られたＳＥＭ画像と蛍光画像は、ホストコンピュータ１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
【００１９】
本実施の形態では、非球面型のカセグレン鏡を用いている。すなわち、従来、光学顕微鏡を構成するカセグレン鏡は、中央に開口を有する１個の凹面鏡と、その凹面鏡よりは小さい１個の凸面鏡とから構成されており、その反射面の形状が放物面、楕円面、双曲面等の球面型であった。しかしながら、反射面が球面型であると、光学像を観察した際に周辺部が歪むため、電子顕微鏡像と重ね合わせることはできない。これに対し本実施の形態では、大鏡と小鏡の反射面が非球面である非球面型のカセグレン鏡を用いているので、光学像の周囲に歪みがなく、電子顕微鏡像との重ね合わせが容易である。これにより分解能をさらに向上させることができるので、高倍率での蛍光観察が可能となる。ここで、非球面型とは、反射面が上記の放物面、楕円面、双曲面等の球面型でないもの、具体的には平坦面を意味する。効果についてさらに詳しく説明すると、カセグレン鏡を非球面化することで、ザイデル収差の一つ歪曲収差(物体平面上の形状と像面での形状が相似形とはならない現象)が改善され、球面収差(軸上光線で開口数Ｎ．Ａ．の差によって結像位置が異なる現象)、コマ収差(球面収差が十分小さく補正されていても、軸外物点から出た光線は像面上の1点に集まらず、彗星のように尾を引いた非対称なボケを作る現象)等も同時に改善され、尚且つ、光学的な問題(軸上、倍率)である色収差(光学系に使用するガラスは、各波長により屈折率が異なる特性を有している。それにより各波長毎で焦点距離が異なることとなり、結像位置のズレが発生する現象)も改善され、電子顕微鏡像と重ね合わせても光学顕微鏡で観察している蛍光像の視野範囲内でのズレが生じなくなる。
【００２０】
また、本実施の形態においては、試料から反射して戻って来た戻り光の光量が光源の照射光量に対し６０〜９０％の範囲にあることが好ましい。より好ましくは、７０〜９０％、さらに好ましくは７０％である。戻り光の光量低下を抑制することにより、試料から反射して戻って来た戻り光の光量が向上し、高価な高感度観察カメラを使用すること無く、観察カメラで観察できる。また、観察カメラを単眼鏡または双眼鏡に置き換えて目視でも観察可能となる。
【００２１】
光学顕微鏡部の光源には、レーザ光等の単色光、白色光及びそれらの組み合わせを用いることができる。また、照明部はケーラー照明又はスポット照明が可能であることが好ましい。例えば、光源にレーザ光源を用い、照明部にケーラー照明を用いることにより、蛍光顕微鏡を構成することができる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、試料ステージをＸＹ方向に走査して、戻り光を検出器でＩ／Ｖ変換させ、試料ステージの走査信号に同期させＸＹマップとして表示することで、走査型レーザ顕微鏡を構成することもでき、さらに、検出器の位置調整を行うことで共焦点型走査レーザ顕微鏡とすることもできる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、戻り光を分光器に導くことにより、蛍光測定及びラマン測定が可能な構成とすることもできる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、試料ステージをＸＹ方向に走査して、戻り光を分光器に導き、走査位置毎の分光分析を実施しながら、試料ステージの走査信号に同期させＸＹマップとして表示することで、３次元での蛍光測定及びラマン測定が可能な構成とすることもできる。ここで、ＸＹ軸は共に試料面上の位置情報となり、Ｚ軸方向は分光分析による波長軸となる。
【００２２】
本実施の形態に用いる観察用試料の作製方法は、特に限定されず、従来、顕微鏡観察用に用いられているいずれの作製方法も用いることができ、例えば、検体の薄切片を用いる包埋法や凍結法を挙げることができる。また、実体観察のため、検体片自身を支持基材上に固定する方法も含まれる。なお、蛍光色素には、（国際公開第２００８／０１３２６０号パンフレット）に記載された蛍光色素を用いることが好ましい。その国際公開パンフレットに記載された蛍光色素（オキサジアゾロピリジン誘導体）を用いることにより、期間保存しても蛍光色素からの蛍光が消失することがない永久標本を提供することができる。すなわち、従来の蛍光色素を用いた生体標本では、１週間程度で褪色するのに対し、その蛍光色素を用いた生体標本は、冷蔵保存可能である限り半永久的に保存することが可能となる。また、従来の蛍光色素に比べ安価である。また、実質的に乾燥状態である生体標本でも高い蛍光強度を与えるため、さらに信頼性の高い病理診断が可能である。
【００２３】
以下に、バルク観察とエッチング切片観察を行う場合の試料作製方法の一例を示す。なお、試料作製には、以下の試薬を共通して用いることができる。
ａ）免疫染色およびレクチン染色用の蛍光色素には、電子線耐性が高い、上記国際公開パンフレットに記載された蛍光色素又はAlexa系を用いることができる。
ｂ）脱水剤にはアセトンを用い、上昇系脱水法による（50-75-85-95-100%×2(各７分)）。
【００２４】
（バルク観察用試料作製法）
＜Ａ：灌流固定＞
１)固定液は、2.8%パラフォルムアルデヒド＋0.2%ピクリン酸＋0.06%グルタルアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。後固定として4%パラフォルムアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。
＜Ｂ：凍結割断（DMSO法）＞
２)4%パラフォルムによる後固定後、PBSで十分な洗浄を行い、試料を30%DMSO→50%DMSOへ置換し、凍結割断装置（液体窒素）を用い50%DMSOに封じ込めた試料を割断・洗浄する。
＜Ｃ：蛍光標識＞
３）PBS洗浄後、免疫蛍光法およびレクチン染色により試料を蛍光色素で標識する。
＜Ｄ：試料処理−１＞
４）蛍光標識された試料を、アセトン脱水系に回した後、上昇系Tert-ブチルアルコール（50-100%×2(各５分)）に置換する。凍結乾燥機（エイコー製ＲＤ−１）にて乾燥しバルク試料とする。
＜Ｅ：コーティング＞
５）試料をＳＥＭ用試料台にカーボン製両面テープ等で接着後、オスミウムコータ（真空デバイス社製ＩＤ−２）を用い、約２ｎｍの厚さにオスミウムをコートする。
【００２５】
（エッチング観察用試料作製法）
試料処理に以下の方法を用いた以外は、バルク観察用試料作製法と同様の方法で行うことができる。
＜Ｄ：試料処理−２＞
５）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製する。蛍光輝度を確保するため、切片の厚さを１０μｍとすることもできる。
６）試料搭載用の板には、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、試料を載せる。
７）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とする。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行う。
【００２６】
本実施の形態によれば、ＳＥＭシステムの電子ビームの光軸と同軸となるように光学顕微鏡のカセグレン鏡がＳＥＭの鏡筒内に配置されていることで、試料を移動させることなく、１台の装置で蛍光観察とＳＥＭ観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。また、従来、光学顕微鏡を構成するカセグレン鏡の反射面は球面型であり、光学像を観察した際に周辺部が歪んでおり、電子顕微鏡像と重ね合わせることはできなかった。これに対し本発明では、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いているので、光学像の周囲に歪みがなく、電子顕微鏡像との重ね合わせが容易であり、分解能を向上させることができる。それにより、試料中の蛍光標識した部位を即座に拡大して高倍率で観察することが可能となる。それにより標識部位の同定確認を迅速に行うことができる。
【００２７】
実施の形態２．
図５は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータからなるシステム制御部５１と、分光器５２と、顕微鏡部５０とから構成されている。顕微鏡部５０は、複数の光源５４，５５，５６と、それら光源を移動可能に保持する光源保持手段５７とを有する光源部５３と、鏡筒５８内に配置され、光源からの電子線を加速し試料に照射する複数の電磁レンズ６０ａからなる光学系６０と、試料６８を保持し、ＸＹ方向へ移動可能でかつ回転可能な試料筒６９と、試料の透過電子を検出する検出部７０と、鏡筒５８外に配置された観察部６４を有する。検出部７０は、試料６８を透過した電子が到達する蛍光板７１と、蛍光板７１が取着されたファイバーテーパー７２と、レンズユニット７４と、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５と、ファイバーテーパー７２とレンズユニット７４との間に取り付けられたフィルター７３とから構成されている。また、観察部６４は、外部ＣＣＤカメラ６５と蛍光選択フィルター６７が取着された三眼鏡筒６６から構成されている。また、５９は仕切り板であり、鏡筒と光源部を遮断するのに用いる。すなわち、光源部内の光源を切り換える場合、光源部だけでなく真空状態にある鏡筒全体をリークすると、リークと再度真空状態に戻すのに時間を要する。そこで、仕切り弁で光源部と鏡筒を遮断し、光源部のリークと再真空引きの時間を短縮する。また、６１は、試料からの反射電子を検出する反射電子検出器である。また、６２は、試料からの二次電子を検出する二次電子検出器である。また、６３は、エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）検出器である。また、７６は、可動型小反射蛍光板であり、試料６８からの透過電子を観察部６４に導くものである。
【００２８】
光源部５３の光源としては、電子銃、レーザ光源、そしてＸ線源の３種の光源を用いることができる。本実施の形態に係る多光源顕微鏡では、この３種の光源を適宜切り換えて使用する。
【００２９】
（電子顕微鏡）
光源に電子銃を用いることにより電子顕微鏡として使用することができる。
すなわち、光源部５３内の電子銃より照射された電子線は、仕切弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０により加速され、試料筒６９に固定された試料６８に照射される。試料６８からの反射電子は反射電子検出器６１で検出される。また、試料６８を透過した電子は、蛍光板７１、ファイバーテーパー７２、レンズユニット７４を通過し、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５で検出され、システム制御部５１のモニタに画像化されて表示される。すなわち、透過型電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット７４を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光７６を光路上に移動させることで、試料６８からの透過電子像を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。また、試料より発生したＸ線をＥＤＸ検出器６３を用いて検出することで元素分析が可能となる。
【００３０】
また、試料筒６９をＸＹ方向へ走査、そして回転走査(θ方向)し、二次電子検出器６２を用いて試料６８からの二次電子を検出することにより、走査型電子顕微鏡として使用することができる。また、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５を用いることによりＳＴＥＭ像（走査透過電子顕微鏡像）の観察が可能となる。また、ＥＤＸ検出器６３を用いることで、ＸＹ方向の２次元元素マップ像の観察が可能となる。
【００３１】
また、試料６８からの発光を三眼鏡筒６６を経由して分光器５２に光ファイバ等で導くことで、カソードルミネッセンス測定が可能となる。そして、試料筒６９をＸＹ方向へ走査することで２次元カソードルミネッセンスマップ像の観察が可能となる。
【００３２】
（レーザ顕微鏡）
光源にレーザ光源を用いることにより、レーザ顕微鏡（光学顕微鏡）として使用することができる。ただし、電顕鏡筒内に光学系が組み込まれていないのでケーラー照明としてある面積に対してのみレーザが照射される。
光源部５３内のレーザ光源より照射されたレーザ光は、仕切り弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０を通り、試料筒６９内に固定された試料６８に照射される。可動型小反射蛍光板７６を光路上に移動させることで、試料６８からの光を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。すなわち、光学顕微鏡として使用することができる。また、試料が蛍光色素で標識されている場合は、三眼鏡筒６６に搭載されている蛍光選択フィルタ６７を光軸上に挿入することで、レーザ光(励起光)をカットして蛍光像を観察することが可能となる。また、試料からの光を三眼鏡筒６６経由で分光器５２に光ファイバ等で導くことで、ラマン測定が可能となる。また、試料筒６９のＸＹ方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、３Ｄ光学像又は３Ｄ蛍光像の観察が可能となる。
【００３３】
また、透過光で撮影する場合、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５を用いるが、試料作製により蛍光剤感度に低下が起こる場合がある。すると検出器７５のみでの撮影では、長時間の露出を強いられる可能性があり、それを補助する手段として蛍光板７１を用いることで輝度を確保できる。また、テーパー７２で広い視野を確保し検出器７５に画像を導く事ができる。
【００３４】
なお、レーザ光源としては、白色レーザを用いることができる。あるいは、波長が異なる複数のレーザ光源を必要に応じて切り換えて使用することもできる。
【００３５】
（Ｘ線顕微鏡）
光源にＸ線源を用いることによりＸ線顕微鏡として使用することができる。
すなわち、光源部５３内のＸ線源より照射されたＸ線は、仕切弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０により加速され、試料筒６９に固定された試料６８に照射される。試料６８を透過したＸ線は、蛍光板７１、ファイバーテーパー７２、レンズユニット７４を通過し、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５で検出され、システム制御部５１のモニタに画像化されて表示される。すなわち、Ｘ線電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット７４を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光７６を光路上に移動させることで、試料６８からの透過Ｘ線像を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。また、試料筒６９のＸＹ方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、３Ｄ透視Ｘ線像の観察が可能となる。
【００３６】
なお、Ｘ線源としては、公知のＸ線源を用いることができるが、チップ化されたものを用いることが好ましい。
【００３７】
本実施の形態で用いる蛍光板は、試料を透過した電子線や電磁波のエネルギーを吸収して蛍光を発生させるものである。蛍光板には試料透過部の拡大像が形成され、その拡大像はＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器により撮影される。従来、電子顕微鏡にはＰ２２粉末蛍光体からなる蛍光板が使用され、Ｘ線顕微鏡には微量の銀の入った硫化亜鉛等の蛍光板が使用されていた。電子顕微鏡用の蛍光板の検出波長域は、０．００３７ｎｍ〜０．００２５ｎｍであるのに対し、Ｘ線顕微鏡の蛍光板の検出波長域は０．０７ｎｍ〜０．１５ｎｍであり、共通に使用できるものではなかった。これに対し、本実施の形態では、蛍光板にセリウムドープＹＡＧを用いている。このセリウムドープＹＡＧは、０．００２〜７００ｎｍの検出波長域を有しているため、１種の蛍光板で電子顕微鏡観察とＸ線顕微鏡観察を行うことが可能である。
【００３８】
セリウムドープＹＡＧは、例えば、以下の文献に記載された方法で作製された単結晶を用いる。
1. "Evaluation of properties of YAG (Ce) poly-crystal scintillator with APD" Takayuki Yanagida, Hiromitsu Takahashi, Daisuke Kasama, Takeshi Ito, Hisako Niko, Motohide Kokubun, Kazuo Makishima, Takagimi Yanagitani, Hideki Yagi,Takashi Shigeta, and Takashi Ito Proceedings of Scintillating Crystals and their Applications at KEK, p111-116.
2. Tadayuki Takahashi: Future Prospects on X-ray and Gamma-ray Mission: 17th Annual October Astrophysics Conference in Maryland, Radiation Backgrounds from the First Stars, Galaxies and Black Holes: (2006)).
その方法によれば、チョクラルスキー法（Cz法）、又は、フローティングゾーン法（FZ法）によって単結晶のインゴットが作製可能である。また、セリウムのドープ量は、０．００５〜０．５ｍｏｌ％である。
【００３９】
ここで、電子顕微鏡画像と、レーザ顕微鏡画像及び／又はＸ線顕微鏡画像との重ね合わせについて説明する。
例えば、透過電子顕微鏡画像とレーザ顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
試料からの透過電子は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、レーザ顕微鏡は、蛍光選択フィルタ６７と外部ＣＣＤカメラ６５を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出し、システム制御部１へデジタル信号として送る。送られた透過電子顕微鏡画像と蛍光画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
【００４０】
また、透過電子顕微鏡画像とＸ線顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
試料からの透過電子は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、試料からの透過Ｘ線は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過Ｘ線顕微鏡画像が得られる。送られた透過電子顕微鏡画像と透過Ｘ線顕微鏡画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
【００４１】
また、透過電子顕微鏡画像と、レーザ顕微鏡画像と、Ｘ線顕微鏡画像とを重ね合わせる場合、送られた透過電子顕微鏡画像と、蛍光画像と、透過Ｘ線顕微鏡画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
【００４２】
なお、本実施の形態に用いる観察用試料の作製方法は、実施の形態１で用いたと同様の作製方法を用いることができる。
【００４３】
本実施の形態によれば、検出部の蛍光板にセリウムドープＹＡＧを用いるようにしたので、試料を移動させることなく、１台の装置で電子顕微鏡観察とＸ線顕微鏡観察、そしてレーザ顕微鏡観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。それにより標識部位の同定確認を迅速に行うことができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１．
（試料作製）
ラットの神経組織であるアストロサイトに対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）4%パラフォルムアルデヒドを含む0.1M PB(Phosphate Buffer)で還流固定後、浸漬固定した（３時間）。
２）20%シュークロースを含む0.1M PBで洗浄した（４℃、一晩）。
３）ａ．カミソリによる切断、ｂ．ＳＥＭ用凍結割断、ｃ．１０μｍ凍結切片作製などの、各用途に応じた技法により神経(脊髄)組織を小さな試料に分けた。図２（ａ）にはｃ、図２（ｂ）にはａの方法を用いた。
４）0.1M PB洗浄（５分×３回）
５）0.8% fish gelatin、１％ 牛血清アルブミン, 0.2%Triton X-100を含む0.1M PBS(PBSTBF)でブロッキングした（室温、１時間）。
６）抗グリア線維性酸性蛋白Glial fibrillary acidic protein (GFAP)マウスモノクローナル抗体(1: 20,000; Sigma) in PBSTBF（４℃、１４時間）。コントロールはPBSTBFのみでインキュベートした。
７）0.1M PB洗浄（５分×３回）
８）ビオチン標識抗マウス抗体(1: 400; Jackson Lab) in PBSTBF（室温、９０分）
９）0.1M PB洗浄（５分×３回）
１０）Fluolid-labeled streptavidin in 10m M HEPES, 0.15M NaCl (pH7.3), 室温, 90分AMCA(7-amino-4-methylcoumarine-3-acetic acid)標識ストレプトアビジン(1: 200; Jackson Lab) in PBSTBF, 室温,９０分。
但し、希釈倍率はFluolidの製作過程により変動する。
１１)0.1M PB洗浄（５分×３回）
なお、本実施例及び以下の実施例中、Fluolidとは、前記国際公開に記載された蛍光色素を指す。
【００４６】
（顕微鏡観察方法）
ＳＥＭ部と光学顕微鏡部を備えた日本電子（株）製の波長分散型元素分析装置ＪＸＡ−８６００の光学顕微鏡部の光学系を改造したものを用いた。
【００４７】
（結果）
図２（ａ）に蛍光顕微鏡画像を、そして（ｂ）に本発明の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。本発明の蛍光ＳＥＭシステムを用いることにより、アストロサイトのみが染色された鮮明な画像が得られた。
【００４８】
実施例２．
（試料作製）
ラットの腎(尿細管)に対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）2.8％パラホルムアルデヒド−0.2％ピクリン酸−0.06％グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、4%パラホルムアルデヒドin PBにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１ｍｍの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した（４℃、１日）。
３) Biotinylated Peanut Agglutinin（PNA）(Vector)in PBS （４℃、４日）（1：100）
４）PBS洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
Streptavidin-Fluolid-W-Orange in PBS（1：10）
６）PBS洗浄（４℃,２０分×３）
７）アセトン脱水 （50-75-85-95-100 %上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行った。
【００４９】
（結果）
図３（ａ）にＳＥＭ画像、（ｂ）に蛍光画像、そして（ｃ）に本発明の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。蛍光ＳＥＭ画像により、尿細管断面のブラッシュボーダーが選択的に染色されていることを確認できた。また、蛍光顕微鏡では観察不可能な尿細管内壁の絨毛を詳細に観察することができた。
【００５０】
実施例３．
（試料作製）
１）2.8％パラホルムアルデヒド−0.2％ピクリン酸−0.06％グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、４％パラホルムアルデヒドPBにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１mmの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した（４℃、１日）。
３)Biotinylated Peanut Agglutinin（PNA）(Vector)in PBS （４℃、４日）（1：100）
４）PBS洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
Streptavidin-Fluolid-W-Orange（IST）in PBS（1：10）
６）PBS洗浄（４℃,２０分×３）
７）アセトン脱水 （50-75-85-95-100 %上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行った。
【００５１】
（結果）
図４（ａ）にＳＥＭ画像、（ｂ）に蛍光画像、そして（ｃ）に本発明の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。試料は、マクロファージを含むラットのリンパ節である。リンパ節組織中にあるマクロファージ(貪食細胞)は、生体内の様々な老廃物を取り込んでいるため、自家蛍光を有すると考えられている。そこで、無染色のまま、本装置にてリンパ節を蛍光観察した結果が（ｂ）であり、この黄色に光る蛍光部と一致してマクロファージの存在を同定することができた。ＳＥＭ像と重ね合わせることにより（ｃ）マクロファージ細胞を他の細胞と区別してＳＥＭにて観察することができた。
【００５２】
これら実施例１から３で説明した蛍光ＳＥＭ画像は、従来全く報告がなく、本発明により初めて観察することが可能となったものである。以上の通り、本発明によれば、迅速に蛍光ＳＥＭ画像を観察することができるので、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせた実用レベルの生体組織分析装置を提供することが可能となる。
【符号の説明】
【００５３】
１ システム制御部
２ ＳＥＭ部
３ 電子発生部
４ 電子線走査部
５ 真空チャンバ
６ 鏡筒
７ 検出器
８ 増幅器
９ 試料ステージ制御部
１０ 試料
１１ 試料ステージ
１２ カセグレン鏡
１２ａ 大鏡
１２ｂ 小鏡
１３ 反射ミラー
２０ 光学顕微鏡部
２１ 光源
２２ 照明部
２３ 観察カメラ
２４ 光ファイバー部
２５ 分光器
５０ 顕微鏡部
５１ システム制御部
５２ 分光器
５３ 光源部
５４，５５，５６ 光源
５７ 光源保持手段
５８ 鏡筒
５９ 仕切板
６０ 光学系
６０ａ 電磁レンズ
６１ 反射電子検出器
６２ 二次電子検出器
６３ ＥＤＸ検出器
６４ 観察部
６５ 外部ＣＣＤカメラ
６６ 三眼鏡筒
６７ 蛍光選択フィルター
６８ 試料
６９ 試料筒
７０ 検出部
７１ 蛍光板
７２ ファイバーテーパー
７３ フィルター
７４ レンズユニット
７５ ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器
７６ 可動型小反射蛍光板
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の光源を有し、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病診断方法の開発等の医療バイオ分野では、生体組織を蛍光色素で免疫染色を行った後、蛍光顕微鏡を用いて観察している。しかし、この方法では１０００倍程度の解像度が限界である。それに対し、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を高倍率で観察する方法として、走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭという。）の電子線を試料に照射して蛍光を発生させ（カソードルミネッセンス）、その蛍光を観察する方法が提案されている（例えば、特許文献１）。また、半導体ウェハ等の分析に関するものではあるが、荷電粒子による試料励起と光による試料励起を一つの装置で行うようＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせて、試料の分析点のＸ線分光スペクトルと蛍光スペクトルとを測定する表面分析装置も提案されている（例えば、特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平１１−２６０３０３号公報
【特許文献２】特開平５−１１３４１８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせることにより、蛍光色素で標識された生体組織からなる試料の分析点を即座にＳＥＭで観察することにより、その分析点の形態的特徴から対象物を短時間で同定できることが期待できる。しかしながら、分解能が不十分であり、生体組織の観察に使用可能な、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせた実用レベルの分析装置は報告されていない。
【０００５】
また、ＳＥＭと光学顕微鏡との組み合わせだけでなく、ＳＥＭとＸ線顕微鏡、あるいはＳＥＭと光学顕微鏡とＸ線顕微鏡との組み合わせも必要とされている。
【０００６】
そこで、本発明は、同一の生体組織試料について、電子像観察だけでなく、蛍光像観察、そして透視像観察等を行うことも可能な、複数の観察用光源を備えた多光源顕微鏡を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するため、本発明の多光源顕微鏡は、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、蛍光を観察するための光学顕微鏡部と走査型電子顕微鏡部とからなり、該走査型電子顕微鏡部の電子ビームの光軸と同軸となるように該光学顕微鏡部のカセグレン鏡が該走査型顕微鏡部の鏡筒内に配置されてなる多光源顕微鏡であって、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いることを特徴とする。
【０００８】
上記の多光源顕微鏡には、上記カセグレン鏡が、中央に開口を有する大鏡と、該開口の下方に該大鏡に対向するように配置された小鏡とからなり、大鏡と小鏡の反射面が非球面型であるものを用いることができる。
【０００９】
また、上記の多光源顕微鏡には、光学顕微鏡部の光源としてレーザ光源を用いることができる。
【００１０】
また、本発明の別の多光源顕微鏡は、試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、移動可能に配置された、電子銃と、レーザ光源と、Ｘ線源とを備えた光源部と、該光源部からの電子線又は電磁波を試料に照射する光学系と、セリウムドープＹＡＧからなる蛍光板を有し試料を透過した電子線又は電磁波を検出する検出部を少なくとも有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の多光源顕微鏡は、複数の光源の光軸が同軸となるように構成されており、試料を移動させることなく、１台の装置で、蛍光観察と電子像観察、あるいは蛍光観察と電子像観察と透視Ｘ線像観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。本発明によれば、光源に電子銃を用いた場合、二次電子像観察、反射電子像観察、透過電子像観察、ＥＤＸ観察、そしてＳＴＥＭ観察が可能であり、光源にレーザを用いた場合、ケーラー照明による像観察やケーラー照明による蛍光像観察、光源にＸ線を用いた場合、透視Ｘ線像観察や３Ｄ透視Ｘ線像観察、そして電子線照射によるカソードルミネッセンス観察や、レーザ照射によるラマン／蛍光測定等が可能である。なお、本発明の観察対象は生体組織に限定されず、従来の電子顕微鏡、Ｘ線顕微鏡、そして光学顕微鏡が対象とするものであれば、金属、半導体、セラミックス、プラスチック等の種々の材料も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施の形態１に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
【図２】実施例１におけるラットの神経組織の顕微鏡写真であり、（ａ）は蛍光画像、（ｂ）は蛍光ＳＥＭ画像である。
【図３】実施例２におけるラットの腎(尿細管)の顕微鏡写真であり、（ａ）はＳＥＭ画像、（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）は蛍光ＳＥＭ画像である。
【図４】実施例３におけるマクロファージを含むリンパ節組織の顕微鏡写真であり、（ａ）はＳＥＭ画像、（ｂ）は蛍光画像、（ｃ）は蛍光ＳＥＭ画像である。
【図５】実施の形態２に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照して説明する。
実施の形態１．
図１は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータ１からなるシステム制御部１と、ＳＥＭ部２と、光学顕微鏡部２０とから構成されている。ＳＥＭ部２においては、電子線発生部３から発生し加速された電子線が、電子線走査部４により２次元的に走査され、真空チャンバ６内に配置された鏡筒部５を通って試料９に照射される。なお、鏡筒内５には、光学顕微鏡用の反射ミラー１３が配置されているが、電子線は反射ミラー１３内の通過孔（不図示）を通って試料１０に至る。また、１１は試料１０をＸＹ方向に移動させる試料ステージであり、試料ステージ制御部９により駆動される。また、試料１０への電子線照射により発生する二次電子は検出器７により検出され、増幅器８により増幅される。
【００１４】
一方、光学顕微鏡部２０は、ＳＥＭ部の光軸から離れた位置に配置された、照明用の光源２１と、照明部２２と、観察カメラ２３と、試料９からの蛍光を集光する光ファイバー部２４と、その光ファイバー部２４からの蛍光強度を測定する分光器２５とを有している。
【００１５】
例えば、試料１０の光学像を観察する場合、光学顕微鏡部２０の光源２１の光を、照明部２２からレンズやミラー等の光学系（不図示）により反射ミラー１３に向けて照射する。反射ミラー１３で反射された光は、ＳＥＭ部に電子線の光軸に沿って、鏡筒内５に配置されたカセグレン鏡１２に至る。カセグレン鏡１２は、中央に開口を有し上方に配置された１個の大鏡１２ａと、その開口の下方に配置された小鏡１２ｂとからなり、その大鏡１２ａと小鏡１２ｂとが対向するように配置されている。反射ミラー１３からの光は、大鏡１２ａの開口を通過し、小鏡１２ｂによって反射され、その反射光は大鏡１２ａによって反射集束されて試料１０に照射される。
【００１６】
そして、試料１０からの光は、大鏡１２ａによって反射され、小鏡１２ｂによって反射され、反射ミラー１３へ向かう。反射ミラー１３で反射された光は、光学系（不図示）によって観察カメラ２３と光ファイバー部２４へと向かう。
【００１７】
蛍光標識されて試料について光学顕微鏡で数百倍程度の観察倍率で観察を行い、さらに所望の試料領域についてＳＥＭを用いてさらに高倍率の観察を行う。
【００１８】
ここで、ＳＥＭ部は、ホストコンピュータ１で電子線を走査制御して得られた二次電子等を検出部７で検出してＩ−Ｖアンプ（不図示）にて電気信号に変え、ホストコンピュータ１のＡ・Ｄコンバータ（不図示）で変換してＳＥＭ画像を取得する。また、光学顕微鏡部は、蛍光選択フィルタ（不図示）と観察用カメラ（例えば、ＣＣＤカメラ）を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出し、ホストコンピュータ１へデジタル信号として送る。送られたＳＥＭ画像と蛍光画像は、ホストコンピュータ１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
【００１９】
本実施の形態では、非球面型のカセグレン鏡を用いている。すなわち、従来、光学顕微鏡を構成するカセグレン鏡は、中央に開口を有する１個の凹面鏡と、その凹面鏡よりは小さい１個の凸面鏡とから構成されており、その反射面の形状が放物面、楕円面、双曲面等の球面型であった。しかしながら、反射面が球面型であると、光学像を観察した際に周辺部が歪むため、電子顕微鏡像と重ね合わせることはできない。これに対し本実施の形態では、大鏡と小鏡の反射面が非球面である非球面型のカセグレン鏡を用いているので、光学像の周囲に歪みがなく、電子顕微鏡像との重ね合わせが容易である。これにより分解能をさらに向上させることができるので、高倍率での蛍光観察が可能となる。ここで、非球面型とは、反射面が上記の放物面、楕円面、双曲面等の球面型でないもの、具体的には平坦面を意味する。効果についてさらに詳しく説明すると、カセグレン鏡を非球面化することで、ザイデル収差の一つ歪曲収差(物体平面上の形状と像面での形状が相似形とはならない現象)が改善され、球面収差(軸上光線で開口数Ｎ．Ａ．の差によって結像位置が異なる現象)、コマ収差(球面収差が十分小さく補正されていても、軸外物点から出た光線は像面上の1点に集まらず、彗星のように尾を引いた非対称なボケを作る現象)等も同時に改善され、尚且つ、光学的な問題(軸上、倍率)である色収差(光学系に使用するガラスは、各波長により屈折率が異なる特性を有している。それにより各波長毎で焦点距離が異なることとなり、結像位置のズレが発生する現象)も改善され、電子顕微鏡像と重ね合わせても光学顕微鏡で観察している蛍光像の視野範囲内でのズレが生じなくなる。
【００２０】
また、本実施の形態においては、試料から反射して戻って来た戻り光の光量が光源の照射光量に対し６０〜９０％の範囲にあることが好ましい。より好ましくは、７０〜９０％、さらに好ましくは７０％である。戻り光の光量低下を抑制することにより、試料から反射して戻って来た戻り光の光量が向上し、高価な高感度観察カメラを使用すること無く、観察カメラで観察できる。また、観察カメラを単眼鏡または双眼鏡に置き換えて目視でも観察可能となる。
【００２１】
光学顕微鏡部の光源には、レーザ光等の単色光、白色光及びそれらの組み合わせを用いることができる。また、照明部はケーラー照明又はスポット照明が可能であることが好ましい。例えば、光源にレーザ光源を用い、照明部にケーラー照明を用いることにより、蛍光顕微鏡を構成することができる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、試料ステージをＸＹ方向に走査して、戻り光を検出器でＩ／Ｖ変換させ、試料ステージの走査信号に同期させＸＹマップとして表示することで、走査型レーザ顕微鏡を構成することもでき、さらに、検出器の位置調整を行うことで共焦点型走査レーザ顕微鏡とすることもできる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、戻り光を分光器に導くことにより、蛍光測定及びラマン測定が可能な構成とすることもできる。また、光源にレーザ光源を用い、照明部にスポット照明を用い、試料ステージをＸＹ方向に走査して、戻り光を分光器に導き、走査位置毎の分光分析を実施しながら、試料ステージの走査信号に同期させＸＹマップとして表示することで、３次元での蛍光測定及びラマン測定が可能な構成とすることもできる。ここで、ＸＹ軸は共に試料面上の位置情報となり、Ｚ軸方向は分光分析による波長軸となる。
【００２２】
本実施の形態に用いる観察用試料の作製方法は、特に限定されず、従来、顕微鏡観察用に用いられているいずれの作製方法も用いることができ、例えば、検体の薄切片を用いる包埋法や凍結法を挙げることができる。また、実体観察のため、検体片自身を支持基材上に固定する方法も含まれる。なお、蛍光色素には、（国際公開第２００８／０１３２６０号パンフレット）に記載された蛍光色素を用いることが好ましい。その国際公開パンフレットに記載された蛍光色素（オキサジアゾロピリジン誘導体）を用いることにより、期間保存しても蛍光色素からの蛍光が消失することがない永久標本を提供することができる。すなわち、従来の蛍光色素を用いた生体標本では、１週間程度で褪色するのに対し、その蛍光色素を用いた生体標本は、冷蔵保存可能である限り半永久的に保存することが可能となる。また、従来の蛍光色素に比べ安価である。また、実質的に乾燥状態である生体標本でも高い蛍光強度を与えるため、さらに信頼性の高い病理診断が可能である。
【００２３】
以下に、バルク観察とエッチング切片観察を行う場合の試料作製方法の一例を示す。なお、試料作製には、以下の試薬を共通して用いることができる。
ａ）免疫染色およびレクチン染色用の蛍光色素には、電子線耐性が高い、上記国際公開パンフレットに記載された蛍光色素又はAlexa系を用いることができる。
ｂ）脱水剤にはアセトンを用い、上昇系脱水法による（50-75-85-95-100%×2(各７分)）。
【００２４】
（バルク観察用試料作製法）
＜Ａ：灌流固定＞
１)固定液は、2.8%パラフォルムアルデヒド＋0.2%ピクリン酸＋0.06%グルタルアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。後固定として4%パラフォルムアルデヒドのリン酸緩衝液を用いる。
＜Ｂ：凍結割断（DMSO法）＞
２)4%パラフォルムによる後固定後、PBSで十分な洗浄を行い、試料を30%DMSO→50%DMSOへ置換し、凍結割断装置（液体窒素）を用い50%DMSOに封じ込めた試料を割断・洗浄する。
＜Ｃ：蛍光標識＞
３）PBS洗浄後、免疫蛍光法およびレクチン染色により試料を蛍光色素で標識する。
＜Ｄ：試料処理−１＞
４）蛍光標識された試料を、アセトン脱水系に回した後、上昇系Tert-ブチルアルコール（50-100%×2(各５分)）に置換する。凍結乾燥機（エイコー製ＲＤ−１）にて乾燥しバルク試料とする。
＜Ｅ：コーティング＞
５）試料をＳＥＭ用試料台にカーボン製両面テープ等で接着後、オスミウムコータ（真空デバイス社製ＩＤ−２）を用い、約２ｎｍの厚さにオスミウムをコートする。
【００２５】
（エッチング観察用試料作製法）
試料処理に以下の方法を用いた以外は、バルク観察用試料作製法と同様の方法で行うことができる。
＜Ｄ：試料処理−２＞
５）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製する。蛍光輝度を確保するため、切片の厚さを１０μｍとすることもできる。
６）試料搭載用の板には、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、試料を載せる。
７）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とする。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行う。
【００２６】
本実施の形態によれば、ＳＥＭシステムの電子ビームの光軸と同軸となるように光学顕微鏡のカセグレン鏡がＳＥＭの鏡筒内に配置されていることで、試料を移動させることなく、１台の装置で蛍光観察とＳＥＭ観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。また、従来、光学顕微鏡を構成するカセグレン鏡の反射面は球面型であり、光学像を観察した際に周辺部が歪んでおり、電子顕微鏡像と重ね合わせることはできなかった。これに対し本発明では、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いているので、光学像の周囲に歪みがなく、電子顕微鏡像との重ね合わせが容易であり、分解能を向上させることができる。それにより、試料中の蛍光標識した部位を即座に拡大して高倍率で観察することが可能となる。それにより標識部位の同定確認を迅速に行うことができる。
【００２７】
実施の形態２．
図５は、本実施の形態に係る多光源顕微鏡の構成の一例を示す模式図である。
多光源顕微鏡は、ホストコンピュータからなるシステム制御部５１と、分光器５２と、顕微鏡部５０とから構成されている。顕微鏡部５０は、複数の光源５４，５５，５６と、それら光源を移動可能に保持する光源保持手段５７とを有する光源部５３と、鏡筒５８内に配置され、光源からの電子線を加速し試料に照射する複数の電磁レンズ６０ａからなる光学系６０と、試料６８を保持し、ＸＹ方向へ移動可能でかつ回転可能な試料筒６９と、試料の透過電子を検出する検出部７０と、鏡筒５８外に配置された観察部６４を有する。検出部７０は、試料６８を透過した電子が到達する蛍光板７１と、蛍光板７１が取着されたファイバーテーパー７２と、レンズユニット７４と、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５と、ファイバーテーパー７２とレンズユニット７４との間に取り付けられたフィルター７３とから構成されている。また、観察部６４は、外部ＣＣＤカメラ６５と蛍光選択フィルター６７が取着された三眼鏡筒６６から構成されている。また、５９は仕切り板であり、鏡筒と光源部を遮断するのに用いる。すなわち、光源部内の光源を切り換える場合、光源部だけでなく真空状態にある鏡筒全体をリークすると、リークと再度真空状態に戻すのに時間を要する。そこで、仕切り弁で光源部と鏡筒を遮断し、光源部のリークと再真空引きの時間を短縮する。また、６１は、試料からの反射電子を検出する反射電子検出器である。また、６２は、試料からの二次電子を検出する二次電子検出器である。また、６３は、エネルギー分散型Ｘ線分光法（ＥＤＸ）検出器である。また、７６は、可動型小反射蛍光板であり、試料６８からの透過電子を観察部６４に導くものである。
【００２８】
光源部５３の光源としては、電子銃、レーザ光源、そしてＸ線源の３種の光源を用いることができる。本実施の形態に係る多光源顕微鏡では、この３種の光源を適宜切り換えて使用する。
【００２９】
（電子顕微鏡）
光源に電子銃を用いることにより電子顕微鏡として使用することができる。
すなわち、光源部５３内の電子銃より照射された電子線は、仕切弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０により加速され、試料筒６９に固定された試料６８に照射される。試料６８からの反射電子は反射電子検出器６１で検出される。また、試料６８を透過した電子は、蛍光板７１、ファイバーテーパー７２、レンズユニット７４を通過し、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５で検出され、システム制御部５１のモニタに画像化されて表示される。すなわち、透過型電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット７４を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光７６を光路上に移動させることで、試料６８からの透過電子像を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。また、試料より発生したＸ線をＥＤＸ検出器６３を用いて検出することで元素分析が可能となる。
【００３０】
また、試料筒６９をＸＹ方向へ走査、そして回転走査(θ方向)し、二次電子検出器６２を用いて試料６８からの二次電子を検出することにより、走査型電子顕微鏡として使用することができる。また、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５を用いることによりＳＴＥＭ像（走査透過電子顕微鏡像）の観察が可能となる。また、ＥＤＸ検出器６３を用いることで、ＸＹ方向の２次元元素マップ像の観察が可能となる。
【００３１】
また、試料６８からの発光を三眼鏡筒６６を経由して分光器５２に光ファイバ等で導くことで、カソードルミネッセンス測定が可能となる。そして、試料筒６９をＸＹ方向へ走査することで２次元カソードルミネッセンスマップ像の観察が可能となる。
【００３２】
（レーザ顕微鏡）
光源にレーザ光源を用いることにより、レーザ顕微鏡（光学顕微鏡）として使用することができる。ただし、電顕鏡筒内に光学系が組み込まれていないのでケーラー照明としてある面積に対してのみレーザが照射される。
光源部５３内のレーザ光源より照射されたレーザ光は、仕切り弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０を通り、試料筒６９内に固定された試料６８に照射される。可動型小反射蛍光板７６を光路上に移動させることで、試料６８からの光を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。すなわち、光学顕微鏡として使用することができる。また、試料が蛍光色素で標識されている場合は、三眼鏡筒６６に搭載されている蛍光選択フィルタ６７を光軸上に挿入することで、レーザ光(励起光)をカットして蛍光像を観察することが可能となる。また、試料からの光を三眼鏡筒６６経由で分光器５２に光ファイバ等で導くことで、ラマン測定が可能となる。また、試料筒６９のＸＹ方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、３Ｄ光学像又は３Ｄ蛍光像の観察が可能となる。
【００３３】
また、透過光で撮影する場合、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５を用いるが、試料作製により蛍光剤感度に低下が起こる場合がある。すると検出器７５のみでの撮影では、長時間の露出を強いられる可能性があり、それを補助する手段として蛍光板７１を用いることで輝度を確保できる。また、テーパー７２で広い視野を確保し検出器７５に画像を導く事ができる。
【００３４】
なお、レーザ光源としては、白色レーザを用いることができる。あるいは、波長が異なる複数のレーザ光源を必要に応じて切り換えて使用することもできる。
【００３５】
（Ｘ線顕微鏡）
光源にＸ線源を用いることによりＸ線顕微鏡として使用することができる。
すなわち、光源部５３内のＸ線源より照射されたＸ線は、仕切弁５９を通り鏡筒５８内の光学系６０により加速され、試料筒６９に固定された試料６８に照射される。試料６８を透過したＸ線は、蛍光板７１、ファイバーテーパー７２、レンズユニット７４を通過し、ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器７５で検出され、システム制御部５１のモニタに画像化されて表示される。すなわち、Ｘ線電子顕微鏡として使用することができる。ここで、観察倍率は、レンズユニット７４を操作することで変化させることができる。また、可動型小反射蛍光７６を光路上に移動させることで、試料６８からの透過Ｘ線像を三眼鏡筒６６で目視観察することができる。また、試料筒６９のＸＹ方向への走査、ならびに回転走査(θ方向)により、３Ｄ透視Ｘ線像の観察が可能となる。
【００３６】
なお、Ｘ線源としては、公知のＸ線源を用いることができるが、チップ化されたものを用いることが好ましい。
【００３７】
本実施の形態で用いる蛍光板は、試料を透過した電子線や電磁波のエネルギーを吸収して蛍光を発生させるものである。蛍光板には試料透過部の拡大像が形成され、その拡大像はＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器により撮影される。従来、電子顕微鏡にはＰ２２粉末蛍光体からなる蛍光板が使用され、Ｘ線顕微鏡には微量の銀の入った硫化亜鉛等の蛍光板が使用されていた。電子顕微鏡用の蛍光板の検出波長域は、０．００３７ｎｍ〜０．００２５ｎｍであるのに対し、Ｘ線顕微鏡の蛍光板の検出波長域は０．０７ｎｍ〜０．１５ｎｍであり、共通に使用できるものではなかった。これに対し、本実施の形態では、蛍光板にセリウムドープＹＡＧを用いている。このセリウムドープＹＡＧは、０．００２〜７００ｎｍの検出波長域を有しているため、１種の蛍光板で電子顕微鏡観察とＸ線顕微鏡観察を行うことが可能である。
【００３８】
セリウムドープＹＡＧは、例えば、以下の文献に記載された方法で作製された単結晶を用いる。
1. "Evaluation of properties of YAG (Ce) poly-crystal scintillator with APD" Takayuki Yanagida, Hiromitsu Takahashi, Daisuke Kasama, Takeshi Ito, Hisako Niko, Motohide Kokubun, Kazuo Makishima, Takagimi Yanagitani, Hideki Yagi,Takashi Shigeta, and Takashi Ito Proceedings of Scintillating Crystals and their Applications at KEK, p111-116.
2. Tadayuki Takahashi: Future Prospects on X-ray and Gamma-ray Mission: 17th Annual October Astrophysics Conference in Maryland, Radiation Backgrounds from the First Stars, Galaxies and Black Holes: (2006)).
その方法によれば、チョクラルスキー法（Cz法）、又は、フローティングゾーン法（FZ法）によって単結晶のインゴットが作製可能である。また、セリウムのドープ量は、０．００５〜０．５ｍｏｌ％である。
【００３９】
ここで、電子顕微鏡画像と、レーザ顕微鏡画像及び／又はＸ線顕微鏡画像との重ね合わせについて説明する。
例えば、透過電子顕微鏡画像とレーザ顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
試料からの透過電子は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、レーザ顕微鏡は、蛍光選択フィルタ６７と外部ＣＣＤカメラ６５を有しており、蛍光選択フィルタでの波長選択により目的の波長で表示された蛍光画像をＣＣＤカメラで検出し、システム制御部１へデジタル信号として送る。送られた透過電子顕微鏡画像と蛍光画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
【００４０】
また、透過電子顕微鏡画像とＸ線顕微鏡画像の場合は以下の通りである。
試料からの透過電子は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過電子顕微鏡画像が得られる。また、試料からの透過Ｘ線は検出部７０で検出されて光電変換され、システム制御部５１でＡ・Ｄ変換されて、透過Ｘ線顕微鏡画像が得られる。送られた透過電子顕微鏡画像と透過Ｘ線顕微鏡画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
【００４１】
また、透過電子顕微鏡画像と、レーザ顕微鏡画像と、Ｘ線顕微鏡画像とを重ね合わせる場合、送られた透過電子顕微鏡画像と、蛍光画像と、透過Ｘ線顕微鏡画像は、システム制御部１により、画像合成システムソフトウェアを用いて合成（重ね合わせ）が実行される。
【００４２】
なお、本実施の形態に用いる観察用試料の作製方法は、実施の形態１で用いたと同様の作製方法を用いることができる。
【００４３】
本実施の形態によれば、検出部の蛍光板にセリウムドープＹＡＧを用いるようにしたので、試料を移動させることなく、１台の装置で電子顕微鏡観察とＸ線顕微鏡観察、そしてレーザ顕微鏡観察が可能である。それにより、試料の収納、取り出しによる位置ズレ並びに物理的、化学的変化の影響を受けることなく、同一位置で試料の観察並びに分析が可能であり、フットスペースも軽減される。それにより標識部位の同定確認を迅速に行うことができる。
【実施例】
【００４４】
以下、実施例を用いて本発明についてさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４５】
実施例１．
（試料作製）
ラットの神経組織であるアストロサイトに対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）4%パラフォルムアルデヒドを含む0.1M PB(Phosphate Buffer)で還流固定後、浸漬固定した（３時間）。
２）20%シュークロースを含む0.1M PBで洗浄した（４℃、一晩）。
３）ａ．カミソリによる切断、ｂ．ＳＥＭ用凍結割断、ｃ．１０μｍ凍結切片作製などの、各用途に応じた技法により神経(脊髄)組織を小さな試料に分けた。図２（ａ）にはｃ、図２（ｂ）にはａの方法を用いた。
４）0.1M PB洗浄（５分×３回）
５）0.8% fish gelatin、１％ 牛血清アルブミン, 0.2%Triton X-100を含む0.1M PBS(PBSTBF)でブロッキングした（室温、１時間）。
６）抗グリア線維性酸性蛋白Glial fibrillary acidic protein (GFAP)マウスモノクローナル抗体(1: 20,000; Sigma) in PBSTBF（４℃、１４時間）。コントロールはPBSTBFのみでインキュベートした。
７）0.1M PB洗浄（５分×３回）
８）ビオチン標識抗マウス抗体(1: 400; Jackson Lab) in PBSTBF（室温、９０分）
９）0.1M PB洗浄（５分×３回）
１０）Fluolid-labeled streptavidin in 10m M HEPES, 0.15M NaCl (pH7.3), 室温, 90分AMCA(7-amino-4-methylcoumarine-3-acetic acid)標識ストレプトアビジン(1: 200; Jackson Lab) in PBSTBF, 室温,９０分。
但し、希釈倍率はFluolidの製作過程により変動する。
１１)0.1M PB洗浄（５分×３回）
なお、本実施例及び以下の実施例中、Fluolidとは、前記国際公開に記載された蛍光色素を指す。
【００４６】
（顕微鏡観察方法）
ＳＥＭ部と光学顕微鏡部を備えた日本電子（株）製の波長分散型元素分析装置ＪＸＡ−８６００の光学顕微鏡部の光学系を改造したものを用いた。
【００４７】
（結果）
図２（ａ）に蛍光顕微鏡画像を、そして（ｂ）に本発明の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。本発明の蛍光ＳＥＭシステムを用いることにより、アストロサイトのみが染色された鮮明な画像が得られた。
【００４８】
実施例２．
（試料作製）
ラットの腎(尿細管)に対し、以下の手順により免疫染色を行った。
１）2.8％パラホルムアルデヒド−0.2％ピクリン酸−0.06％グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、4%パラホルムアルデヒドin PBにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１ｍｍの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した（４℃、１日）。
３) Biotinylated Peanut Agglutinin（PNA）(Vector)in PBS （４℃、４日）（1：100）
４）PBS洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
Streptavidin-Fluolid-W-Orange in PBS（1：10）
６）PBS洗浄（４℃,２０分×３）
７）アセトン脱水 （50-75-85-95-100 %上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行った。
【００４９】
（結果）
図３（ａ）にＳＥＭ画像、（ｂ）に蛍光画像、そして（ｃ）に本発明の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。蛍光ＳＥＭ画像により、尿細管断面のブラッシュボーダーが選択的に染色されていることを確認できた。また、蛍光顕微鏡では観察不可能な尿細管内壁の絨毛を詳細に観察することができた。
【００５０】
実施例３．
（試料作製）
１）2.8％パラホルムアルデヒド−0.2％ピクリン酸−0.06％グルタールアルデヒド−0.1MPBで還流固定後、４％パラホルムアルデヒドPBにて後固定を行い、４℃で保存した。
２）ビブラトームで１mmの試料を作製し、PBS (0.01M)で洗浄した（４℃、１日）。
３)Biotinylated Peanut Agglutinin（PNA）(Vector)in PBS （４℃、４日）（1：100）
４）PBS洗浄（４℃、２０分×３）
５）蛍光色素付加（４℃、１日）
Streptavidin-Fluolid-W-Orange（IST）in PBS（1：10）
６）PBS洗浄（４℃,２０分×３）
７）アセトン脱水 （50-75-85-95-100 %上昇系脱水）
８）標識・脱水後の試料を親水性プラスチック（テクノビット８１００）にて包埋後、光顕用ダイヤモンドナイフとウルトラミクロトームを用い約５μｍ厚の切片を作製した。
９）試料搭載用の板に、ウェハ用Ｓｉ基板を８ｍｍ角程度に割ったものを用い、その上に試料を載せた。
１０）基板試料にイオンエッチングを行い切片試料とした。イオンエッチングは、真空デバイス社製ＰＩＢ−１０を用い、１３ｍＡ／８分で行った。
【００５１】
（結果）
図４（ａ）にＳＥＭ画像、（ｂ）に蛍光画像、そして（ｃ）に本発明の蛍光ＳＥＭシステムを用いて得られた蛍光ＳＥＭ画像を示す。試料は、マクロファージを含むラットのリンパ節である。リンパ節組織中にあるマクロファージ(貪食細胞)は、生体内の様々な老廃物を取り込んでいるため、自家蛍光を有すると考えられている。そこで、無染色のまま、本装置にてリンパ節を蛍光観察した結果が（ｂ）であり、この黄色に光る蛍光部と一致してマクロファージの存在を同定することができた。ＳＥＭ像と重ね合わせることにより（ｃ）マクロファージ細胞を他の細胞と区別してＳＥＭにて観察することができた。
【００５２】
これら実施例１から３で説明した蛍光ＳＥＭ画像は、従来全く報告がなく、本発明により初めて観察することが可能となったものである。以上の通り、本発明によれば、迅速に蛍光ＳＥＭ画像を観察することができるので、ＳＥＭと光学顕微鏡とを組み合わせた実用レベルの生体組織分析装置を提供することが可能となる。
【符号の説明】
【００５３】
１ システム制御部
２ ＳＥＭ部
３ 電子発生部
４ 電子線走査部
５ 真空チャンバ
６ 鏡筒
７ 検出器
８ 増幅器
９ 試料ステージ制御部
１０ 試料
１１ 試料ステージ
１２ カセグレン鏡
１２ａ 大鏡
１２ｂ 小鏡
１３ 反射ミラー
２０ 光学顕微鏡部
２１ 光源
２２ 照明部
２３ 観察カメラ
２４ 光ファイバー部
２５ 分光器
５０ 顕微鏡部
５１ システム制御部
５２ 分光器
５３ 光源部
５４，５５，５６ 光源
５７ 光源保持手段
５８ 鏡筒
５９ 仕切板
６０ 光学系
６０ａ 電磁レンズ
６１ 反射電子検出器
６２ 二次電子検出器
６３ ＥＤＸ検出器
６４ 観察部
６５ 外部ＣＣＤカメラ
６６ 三眼鏡筒
６７ 蛍光選択フィルター
６８ 試料
６９ 試料筒
７０ 検出部
７１ 蛍光板
７２ ファイバーテーパー
７３ フィルター
７４ レンズユニット
７５ ＣＣＤ／ＣＭＯＳ検出器
７６ 可動型小反射蛍光板
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、
蛍光を観察するための光学顕微鏡部と走査型電子顕微鏡部とからなり、該走査型電子顕微鏡部の電子ビームの光軸と同軸となるように該光学顕微鏡のカセグレン鏡が該走査型顕微鏡部の鏡筒内に配置されてなり、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いる多光源顕微鏡。
【請求項２】
上記カセグレン鏡が、中央に開口を有する大鏡と、該開口の下方に該大鏡に対向するように配置された小鏡とからなり、大鏡と小鏡の反射面が非球面型である請求項１記載の多光源顕微鏡。
【請求項３】
上記光学顕微鏡部の光源にレーザ光源を用いる請求項１記載の多光源顕微鏡。
【請求項４】
試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、
移動可能に配置された、電子銃と、レーザ光源と、Ｘ線源とを備えた光源部と、
該光源部からの電子線又は電磁波を試料に照射する光学系と、
セリウムドープＹＡＧからなる蛍光板を有し試料を透過した電子線又は電磁波を検出する検出部を少なくとも有する、多光源顕微鏡。
【請求項１】
試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、
蛍光を観察するための光学顕微鏡部と走査型電子顕微鏡部とからなり、該走査型電子顕微鏡部の電子ビームの光軸と同軸となるように該光学顕微鏡のカセグレン鏡が該走査型顕微鏡部の鏡筒内に配置されてなり、反射面が非球面型であるカセグレン鏡を用いる多光源顕微鏡。
【請求項２】
上記カセグレン鏡が、中央に開口を有する大鏡と、該開口の下方に該大鏡に対向するように配置された小鏡とからなり、大鏡と小鏡の反射面が非球面型である請求項１記載の多光源顕微鏡。
【請求項３】
上記光学顕微鏡部の光源にレーザ光源を用いる請求項１記載の多光源顕微鏡。
【請求項４】
試料を同一位置で観察可能な多光源顕微鏡であって、
移動可能に配置された、電子銃と、レーザ光源と、Ｘ線源とを備えた光源部と、
該光源部からの電子線又は電磁波を試料に照射する光学系と、
セリウムドープＹＡＧからなる蛍光板を有し試料を透過した電子線又は電磁波を検出する検出部を少なくとも有する、多光源顕微鏡。
【図１】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−８４０６（Ｐ２０１０−８４０６Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１３０７５４（Ｐ２００９−１３０７５４）
【出願日】平成２１年５月２９日（２００９．５．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年１２月１日 日本顕微鏡学会九州支部主催の「第４９回日本顕微鏡学会九州支部総会・学術講演会」において文書をもって発表
【出願人】（５０３４７４０９８）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２９日（２００９．５．２９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成１９年１２月１日 日本顕微鏡学会九州支部主催の「第４９回日本顕微鏡学会九州支部総会・学術講演会」において文書をもって発表
【出願人】（５０３４７４０９８）
【Ｆターム（参考）】
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