紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤
【課題】本発明は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善し、コラーゲンの生成低下を防ぐことでシワの形成や弾力性の低下を予防、改善する紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及び抗老化皮膚外用剤を提供する。
【解決手段】本発明の紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤及びコラーゲンの生成低下改善剤は、ザイモモナス菌の培養物を含むことを特徴とする。抗老化皮膚外用剤は、ザイモモナス菌の培養物とヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を含むことを特徴とする。
【効果】紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を抑制することで、コラーゲン生成量の減少を防ぎ、光老化皮膚にみられるシワの形成や弾力性の低下を予防、改善する。さらにザイモモナス菌の培養物とヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を併用することで、シワの形成や弾力性の低下を改善する。
【解決手段】本発明の紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤及びコラーゲンの生成低下改善剤は、ザイモモナス菌の培養物を含むことを特徴とする。抗老化皮膚外用剤は、ザイモモナス菌の培養物とヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を含むことを特徴とする。
【効果】紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を抑制することで、コラーゲン生成量の減少を防ぎ、光老化皮膚にみられるシワの形成や弾力性の低下を予防、改善する。さらにザイモモナス菌の培養物とヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を併用することで、シワの形成や弾力性の低下を改善する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及び抗老化皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）は、生体内に広く存在する多機能サイトカインであり、線維芽細胞におけるコラーゲンなどのマトリックス成分の生成を促進することが知られている（非特許文献１）。ＴＧＦ−βのマトリックス生成促進作用は、細胞表面の特異的レセプターに結合することから始まり、転写因子であるＳｍａｄを介してマトリックス成分の遺伝子発現を調節することにより発揮される（非特許文献２）。一方、紫外線を照射された皮膚では、線維芽細胞のＴＧＦ−βレセプターの産生が低下し、ＴＧＦ−βレセプター／Ｓｍａｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇが阻害されることによりＴＧＦ−βの作用が発揮されず、コラーゲン生成量が減少することが知られており（非特許文献３）、これが光老化皮膚にみられるコラーゲンの減少の一因と考えられる。
【非特許文献１】Ｍａｓｓａｇｕｅ Ｊ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６７：７５３−７９１，１９９８．
【非特許文献２】Ｐｉｅｋ Ｅ，ＥＭＢＯ Ｊ，１３：２１０５−２１２４，１９９９．
【非特許文献３】Ｑｕａｎ Ｔ，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１６５：７４１−７５１，２００４．
【０００３】
紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下により引き起こされる真皮細胞外マトリックス成分であるコラーゲンの減少は、皮膚の光老化現象のひとつであるシワの発生や弾力性の低下につながると考えられる。従来、このような皮膚症状を抑制する手段として、コラーゲンを配合した化粧料を塗布することが主流であったが、一時的に角層表面に水分を補うものであることから、十分な効果を有するものではなかった。また、ＴＧＦ−βの産生を増強しコラーゲン生成を促進する組成物が報告されているが（特許文献１）、ＴＧＦ−βレセプターが減少した状態では充分な効果は期待できない。そこで紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善する安全性の高い有効成分が望まれている。
【特許文献１】特開２００３−１７１２９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下とそれにより引き起こされるコラーゲンの生成低下に対する優れた改善剤及び光老化の予防、改善に有効な抗老化皮膚外用剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明者らは、ザイモモナス菌の培養物に紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善し、コラーゲン生成量の減少を防ぐ作用を見出した。また、セリンプロテアーゼ阻害効果によりコラーゲンの過剰な分解を抑制するヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物（特許文献２）とザイモモナス菌の培養物を併用することにより、特に顕著な光老化皮膚にみられるコラーゲンの減少に対する改善効果を見出し、本発明を完成するに至った。
【特許文献２】特許第３２６１０８６号
【０００６】
本発明で用いられるザイモモナス菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）は、グラム陰性細菌に属するアルコール発酵性の細菌であり、メキシコの竜舌蘭、アガーベの汁液から作るプルケという酒の中や、ヨーロッパのｓｐｏｉｌｅｄ ｂｅｅｒ、ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ（ｃｉｄｅｒ）やｐｅａｒ ｊｕｉｃｅ（ｐｅｒｒｙ）の中に、その他、熱帯地方のｐａｌｍ ｗｉｎｅやブラジルではｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｊｕｉｃｅからも分離されている。ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｈｏｎｅｙの中にもいる。ザイモモナス菌は野生のものも入手でき、または、独立行政法人・製品評価技術基盤機構・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）や米国アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）からも分譲株を入手できる。
【０００７】
ザイモモナス菌の培養物は、特許第３１０３７４７号の方法により得られる液体培養後の菌体を含む培養液、それから菌体を除いた培養抽出液、培養液及び培養抽出液の精製物、その濃縮もしくは希釈物、またはそれらの乾燥物を意味する。
【０００８】
本発明で用いられるヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物は、特開平０１−４４２９７の方法により作出した雑種細胞のカルスを用いて調製した。
【０００９】
ヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物は、上記の雑種細胞を抽出溶媒と共に浸漬又は加熱した後、濾過し、必要ならば濃縮して得られる。抽出溶媒としては、例えば、水、低級１価アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等）、炭化水素（ヘキサン、ペンタン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）、アセトニトリル等があげられる。これらの溶媒は単独で用いても２種以上を混合して用いてもよい。好ましくは、水あるいは水溶性溶媒（水と任意の割合で混合可能な溶媒。例えば、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等）のうち１種又は２種以上の溶媒を用いるのがよい。抽出物はそのまま用いてもよいし、溶媒を一部、又は全部留去して用いてもよい。
【００１０】
本発明の紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及び抗老化皮膚外用剤には、上記ザイモモナス菌の培養物及びヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物をそのまま使用しても良く、効果を損なわない範囲内で、通常の外用剤に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を配合することもできる。
【００１１】
本発明に用いる紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及び抗老化皮膚外用剤は、化粧品、医薬部外品又は医薬品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅等があげられる。
【００１２】
本発明に用いるザイモモナス菌の培養物及びヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物の配合量は特に限定されないが、乾燥物として０．０００１〜１０重量％の範囲が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜５重量％である。０．０００１重量％以下では効果が低く、また１０重量％を超えても効果に大きな増強はみられにくく、効率的でない。また、添加の方法については、予め加えておいても製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すればよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善することで、コラーゲン生成の低下を防ぎ、光老化皮膚にみられるシワの形成や弾力性の低下を予防、改善するザイモモナス菌の培養物を含有することを特徴とする紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、そのＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤を含有することを特徴とする紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及びコラーゲンの生成低下改善剤あるいはコラーゲンの生成低下改善剤とヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を含有することを特徴とする抗老化皮膚外用剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる培養物及び抽出物の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量は重量％を示す。
【実施例１】
【００１５】
製造例１ ザイモモナス菌の培養物１
ザイモモナス菌（ＮＢＲＣ １３７５６株）を下記液体培地で３日間培養し予め前培養を行い、さらに前培養で得られた培養液を液体培地に１００分の１量接種して、温度３０℃、ｐＨ６．０、４日間、静置培養した。その後、培養液から遠心分離（×５０００ｇ）によりザイモモナス菌の菌体を除去し、その上清を濃縮し、凍結乾燥してザイモモナス菌の培養物を１１ｇ得た。
【００１６】
液体培地
ブドウ糖 ５０ｇ
リン酸二水素カリウム ２ｇ
硫酸マグネシウム ０．５ｇ
酵母エキス １ｇ
大豆ペプチド １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
ＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨ６．０に調製後、高圧蒸気滅菌（１２０℃、２０分）
【００１７】
製造例２ ザイモモナス菌の培養物２
ザイモモナス菌（ＡＴＣＣ ３１８２１株）を下記液体培地で３日間培養し予め前培養を行い、さらに前培養で得られた培養液を液体培地に１００分の１量接種して、温度３０℃、ｐＨ６．０、４日間、静置培養した。その後、培養液から遠心分離（×５０００ｇ）によりザイモモナス菌の菌体を除去し、その上清を濃縮し、凍結乾燥してザイモモナス菌の培養物を１２ｇ得た。
【００１８】
液体培地
ショ等 ５０ｇ
リン酸二水素カリウム ２ｇ
酵母エキス １０ｇ
ポリペプトン １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
ＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨ６．０に調製後、高圧蒸気滅菌（１２０℃、２０分）
【００１９】
製造例３ ザイモモナス菌の培養物３
ザイモモナス菌（ＮＢＲＣ １３７５７株）を下記液体培地で３日間培養し予め前培養を行い、さらに前培養で得られた培養液を液体培地に１００分の１量接種して、温度３０℃、ｐＨ６．０、４日間、静置培養した。その後、培養液から遠心分離（×５０００ｇ）によりザイモモナス菌の菌体を除去し、その上清を濃縮し、凍結乾燥してザイモモナス菌の培養物を１３ｇ得た。
【００２０】
液体培地
果糖 ５０ｇ
リン酸二水素カリウム ２ｇ
硫酸マグネシウム ０．５ｇ
硫酸アンモニウム ５ｇ
麦芽エキス １０ｇ
ポテトエキス １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
ＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨ６．０に調製後、高圧蒸気滅菌（１２０℃、２０分）
【００２１】
製造例４ ヘチマとアマチャヅルの雑種細胞熱水抽出物
ヘチマとアマチャヅルの雑種細胞（Ｆ３）１００ｇに３００ｍＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してヘチマとアマチャヅルの雑種細胞の熱水抽出物を６ｇ得た。
【実施例２】
【００２２】
次に、本発明に係る実施例の処方を示す。
【００２３】
処方例１ クリーム１
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物１（製造例１） ０．５
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．１，３−ブチレングリコール ８．５
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．精製水 ６７．６５
［製造方法］成分２〜９を加熱して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００２４】
処方例２ クリーム２
処方例１において、ザイモモナス菌の培養物１をヘチマとアマチャヅルの雑種細胞熱水抽出物に置き換えたものをクリーム２とした。
【００２５】
処方例３ クリーム３
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物１（製造例１） ０．２５
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ０．２５
３．スクワラン ５．５
４．オリーブ油 ３．０
５．ステアリン酸 ２．０
６．ミツロウ ２．０
７．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
８．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
９．ベヘニルアルコール １．５
１０．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１１．香料 ０．１
１２．１，３−ブチレングリコール ８．５
１３．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１４．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１５．精製水 ６７．６５
［製造方法］成分３〜１０を加熱して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び１２〜１５を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１１を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００２６】
比較例１ 従来のクリーム
処方例１において、ザイモモナス菌の培養物１を精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。
【００２７】
処方例４ 化粧水
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物２（製造例２） ０．１
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ０．１
３．１，３−ブチレングリコール ８．０
４．グリセリン ２．０
５．キサンタンガム ０．０２
６．クエン酸 ０．０１
７．クエン酸ナトリウム ０．１
８．エタノール ５．０
９．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
１０．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１１．香料 ０．１
１２．精製水 ８４．３７
［製造方法］成分１〜７及び１２と、成分８〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００２８】
処方例５ 乳液
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物３（製造例３） ０．０５
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ０．０５
３．スクワラン ５．０
４．オリーブ油 ５．０
５．ホホバ油 ５．０
６．セタノール １．５
７．モノステアリン酸グリセリン ２．０
８．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
９．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート ２．０
１０．香料 ０．１
１１．プロピレングリコール １．０
１２．グリセリン ２．０
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．精製水 ７３．１
［製造方法］成分３〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００２９】
処方例６ 軟膏
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物１（製造例１） １．０
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） １．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
４．モノステアリン酸グリセリン １０．０
５．流動パラフィン ５．０
６．セタノール ６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
８．プロピレングリコール １０．０
９．精製水 ６４．９
［製造方法］成分３〜６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７〜９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３０】
処方例７ ファンデーション
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物２（製造例２） ０．５
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ０．５
３．ステアリン酸 ２．４
４．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート １．０
（２０Ｅ．Ｏ．）
５．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
６．セタノール １．０
７．液状ラノリン ２．０
８．流動パラフィン ３．０
９．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
１０．パラオキシ安息香酸ブチル ０．１
１１．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１２．ベントナイト ０．５
１３．プロピレングリコール ４．０
１４．トリエタノールアミン １．１
１５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１６．二酸化チタン ８．０
１７．タルク ４．０
１８．ベンガラ １．０
１９．黄酸化鉄 ２．０
２０．香料 ０．１
２１．精製水 ６０．０
［製造方法］成分３〜１０を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分２１に成分１１をよく膨潤させ、続いて、成分１、２及び１２〜１５を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１６〜１９を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この水相に油相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃で成分２０を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３１】
処方例８ 浴用剤
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物３（製造例３） ５．０
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ５．０
３．炭酸水素ナトリウム ５０．０
４．黄色２０２号（１） ０．０５
５．香料 ０．２５
６．無水硫酸ナトリウム ３９．７
［製造方法］成分１〜６を均一に混合し製品とする。
【実施例３】
【００３２】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例をあげる。
【００３３】
実験例１ 紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善試験
紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下に対する改善効果をＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量を指標として評価した。
【００３４】
ＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量の測定法
正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで東芝ＦＬ２０Ｓ・Ｅランプを用い３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射し、その直後に０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度の試料を添加したＤＭＥＭ培地にてさらに８時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡの抽出にはＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いた。線維芽細胞から抽出した総ＲＮＡを基にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用い、ＴＧＦ−βレセプターII用のｐｒｉｍｅｒとしては５’ＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＡ３’及び５’ＴＣＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＴＣＡ３’を用いた。また、内部標準としてはＧＡＰＤＨを用いた。その他の操作は定められた方法にしたがい、ＴＧＦ−βレセプターIIのｍＲＮＡ発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。ＵＶＢの照射によりＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量の低下がみられるが、その値とＵＶＢ照射後に試料を添加した際のＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量の値からＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善率を算出した。
【００３５】
これらの試験結果を表１に示した。その結果、ザイモモナス菌の培養物には優れた紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善作用が認められた。
【００３６】
【表１】
【００３７】
実験例２ 紫外線によるコラーゲン生成低下改善試験
紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下にともなうコラーゲン生成の低下に対する改善効果をコラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量を指標として評価した。
【００３８】
コラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量の測定法
正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで東芝ＦＬ２０Ｓ・Ｅランプを用い３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射し、その直後に０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度の試料を添加したＤＭＥＭ培地にてさらに８時間培養した。その後、１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦ−βを添加し２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡの抽出にはＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いた。線維芽細胞から抽出した総ＲＮＡを基にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりコラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用い、コラーゲン（Ｉ）用のｐｒｉｍｅｒとしては５’ＧＣＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧ３’及び５’ＴＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣ３’を用いた。また、内部標準としてはＧＡＰＤＨを用いた。その他の操作は定められた方法にしたがい、コラーゲン（Ｉ）のｍＲＮＡ発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。ＵＶＢの照射によりコラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量の低下がみられるが、その値とＵＶＢ照射後に試料を添加した際のコラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量の値からコラーゲン生成低下改善率を算出した。
【００３９】
これらの試験結果を表２に示した。その結果、ザイモモナス菌の培養物には優れた紫外線によるコラーゲン生成の低下に対する改善作用が認められた。したがって、ザイモモナス菌の培養物は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善することでコラーゲン生成量の減少を防ぎ、光老化皮膚にみられるシワの形成や弾力性の低下を予防、改善することが示唆された。
【００４０】
【表２】
【００４１】
実験例３ 使用試験
処方例１〜３のクリーム、比較例１の従来のクリームを用いて、シワや肌の弾力性の低下に悩む女性３０人（４０〜５０才）を対象に２ヶ月間の使用試験を行った。使用前後に肌の弾力性をキュートメーター（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）を用いて測定した。使用前の弾力性の値を１００％とした時の使用後の値を求め、弾力性改善効果を評価した。また、使用後、肌のハリや弾力の改善効果についてのアンケート調査を行った。アンケートの評価基準は、有効なものを「優」、やや有効なものを「良」、わずかに有効なものを「可」、無効なものを「不可」として評価した。
【００４２】
弾力性改善効果の結果を表３に示した。処方例１のザイモモナス菌の培養物を配合したクリーム及び処方例２のヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を配合したクリームは優れた肌の弾力性改善効果を示した。また、処方例３のザイモモナス菌の培養物及びヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を配合したクリームは、さらに優れた肌の弾力性改善効果を示した。
【００４３】
【表３】
【００４４】
アンケート調査の結果を表４に示した。処方例１および２のクリームは優れた肌のハリ及び弾力性の改善効果を示した。また、処方例３のクリームは、さらに優れた肌のハリ及び弾力性の改善効果を示した。なお、試験期間中皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。
【００４５】
【表４】
【００４６】
処方例４〜８の化粧水、乳液、軟膏、ファンデーション、浴用剤の使用試験を行ったところ、いずれも安全で優れた肌のハリ及び弾力性の改善効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の活用例として、化粧品、医薬部外品又は医薬品のいずれにも用いることができる。その剤型としては、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅等が挙げられ、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を抑制することで、コラーゲン生成量の減少を防ぎ、光老化皮膚にみられるシワの形成や弾力性の低下を予防、改善する効果が得られる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及び抗老化皮膚外用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）は、生体内に広く存在する多機能サイトカインであり、線維芽細胞におけるコラーゲンなどのマトリックス成分の生成を促進することが知られている（非特許文献１）。ＴＧＦ−βのマトリックス生成促進作用は、細胞表面の特異的レセプターに結合することから始まり、転写因子であるＳｍａｄを介してマトリックス成分の遺伝子発現を調節することにより発揮される（非特許文献２）。一方、紫外線を照射された皮膚では、線維芽細胞のＴＧＦ−βレセプターの産生が低下し、ＴＧＦ−βレセプター／Ｓｍａｄ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇが阻害されることによりＴＧＦ−βの作用が発揮されず、コラーゲン生成量が減少することが知られており（非特許文献３）、これが光老化皮膚にみられるコラーゲンの減少の一因と考えられる。
【非特許文献１】Ｍａｓｓａｇｕｅ Ｊ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６７：７５３−７９１，１９９８．
【非特許文献２】Ｐｉｅｋ Ｅ，ＥＭＢＯ Ｊ，１３：２１０５−２１２４，１９９９．
【非特許文献３】Ｑｕａｎ Ｔ，Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ，１６５：７４１−７５１，２００４．
【０００３】
紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下により引き起こされる真皮細胞外マトリックス成分であるコラーゲンの減少は、皮膚の光老化現象のひとつであるシワの発生や弾力性の低下につながると考えられる。従来、このような皮膚症状を抑制する手段として、コラーゲンを配合した化粧料を塗布することが主流であったが、一時的に角層表面に水分を補うものであることから、十分な効果を有するものではなかった。また、ＴＧＦ−βの産生を増強しコラーゲン生成を促進する組成物が報告されているが（特許文献１）、ＴＧＦ−βレセプターが減少した状態では充分な効果は期待できない。そこで紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善する安全性の高い有効成分が望まれている。
【特許文献１】特開２００３−１７１２９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下とそれにより引き起こされるコラーゲンの生成低下に対する優れた改善剤及び光老化の予防、改善に有効な抗老化皮膚外用剤を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明者らは、ザイモモナス菌の培養物に紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善し、コラーゲン生成量の減少を防ぐ作用を見出した。また、セリンプロテアーゼ阻害効果によりコラーゲンの過剰な分解を抑制するヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物（特許文献２）とザイモモナス菌の培養物を併用することにより、特に顕著な光老化皮膚にみられるコラーゲンの減少に対する改善効果を見出し、本発明を完成するに至った。
【特許文献２】特許第３２６１０８６号
【０００６】
本発明で用いられるザイモモナス菌（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）は、グラム陰性細菌に属するアルコール発酵性の細菌であり、メキシコの竜舌蘭、アガーベの汁液から作るプルケという酒の中や、ヨーロッパのｓｐｏｉｌｅｄ ｂｅｅｒ、ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ａｐｐｌｅ ｊｕｉｃｅ（ｃｉｄｅｒ）やｐｅａｒ ｊｕｉｃｅ（ｐｅｒｒｙ）の中に、その他、熱帯地方のｐａｌｍ ｗｉｎｅやブラジルではｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｊｕｉｃｅからも分離されている。ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｈｏｎｅｙの中にもいる。ザイモモナス菌は野生のものも入手でき、または、独立行政法人・製品評価技術基盤機構・生物遺伝資源部門（ＮＢＲＣ）や米国アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）からも分譲株を入手できる。
【０００７】
ザイモモナス菌の培養物は、特許第３１０３７４７号の方法により得られる液体培養後の菌体を含む培養液、それから菌体を除いた培養抽出液、培養液及び培養抽出液の精製物、その濃縮もしくは希釈物、またはそれらの乾燥物を意味する。
【０００８】
本発明で用いられるヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物は、特開平０１−４４２９７の方法により作出した雑種細胞のカルスを用いて調製した。
【０００９】
ヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物は、上記の雑種細胞を抽出溶媒と共に浸漬又は加熱した後、濾過し、必要ならば濃縮して得られる。抽出溶媒としては、例えば、水、低級１価アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等）、炭化水素（ヘキサン、ペンタン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）、アセトニトリル等があげられる。これらの溶媒は単独で用いても２種以上を混合して用いてもよい。好ましくは、水あるいは水溶性溶媒（水と任意の割合で混合可能な溶媒。例えば、エタノール、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール等）のうち１種又は２種以上の溶媒を用いるのがよい。抽出物はそのまま用いてもよいし、溶媒を一部、又は全部留去して用いてもよい。
【００１０】
本発明の紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及び抗老化皮膚外用剤には、上記ザイモモナス菌の培養物及びヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物をそのまま使用しても良く、効果を損なわない範囲内で、通常の外用剤に用いられる成分である油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、アルコール類、エステル類、界面活性剤、金属石鹸、ｐＨ調整剤、防腐剤、香料、保湿剤、粉体、紫外線吸収剤、増粘剤、色素、酸化防止剤、美白剤、キレート剤等の成分を配合することもできる。
【００１１】
本発明に用いる紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及び抗老化皮膚外用剤は、化粧品、医薬部外品又は医薬品のいずれにも用いることができ、その剤型としては、例えば、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅等があげられる。
【００１２】
本発明に用いるザイモモナス菌の培養物及びヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物の配合量は特に限定されないが、乾燥物として０．０００１〜１０重量％の範囲が好ましく、さらに好ましくは０．００１〜５重量％である。０．０００１重量％以下では効果が低く、また１０重量％を超えても効果に大きな増強はみられにくく、効率的でない。また、添加の方法については、予め加えておいても製造途中で添加しても良く、作業性を考えて適宜選択すればよい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善することで、コラーゲン生成の低下を防ぎ、光老化皮膚にみられるシワの形成や弾力性の低下を予防、改善するザイモモナス菌の培養物を含有することを特徴とする紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤、そのＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤を含有することを特徴とする紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及びコラーゲンの生成低下改善剤あるいはコラーゲンの生成低下改善剤とヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を含有することを特徴とする抗老化皮膚外用剤である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いる培養物及び抽出物の製造例、処方例及び実験例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。実施例に示す配合量は重量％を示す。
【実施例１】
【００１５】
製造例１ ザイモモナス菌の培養物１
ザイモモナス菌（ＮＢＲＣ １３７５６株）を下記液体培地で３日間培養し予め前培養を行い、さらに前培養で得られた培養液を液体培地に１００分の１量接種して、温度３０℃、ｐＨ６．０、４日間、静置培養した。その後、培養液から遠心分離（×５０００ｇ）によりザイモモナス菌の菌体を除去し、その上清を濃縮し、凍結乾燥してザイモモナス菌の培養物を１１ｇ得た。
【００１６】
液体培地
ブドウ糖 ５０ｇ
リン酸二水素カリウム ２ｇ
硫酸マグネシウム ０．５ｇ
酵母エキス １ｇ
大豆ペプチド １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
ＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨ６．０に調製後、高圧蒸気滅菌（１２０℃、２０分）
【００１７】
製造例２ ザイモモナス菌の培養物２
ザイモモナス菌（ＡＴＣＣ ３１８２１株）を下記液体培地で３日間培養し予め前培養を行い、さらに前培養で得られた培養液を液体培地に１００分の１量接種して、温度３０℃、ｐＨ６．０、４日間、静置培養した。その後、培養液から遠心分離（×５０００ｇ）によりザイモモナス菌の菌体を除去し、その上清を濃縮し、凍結乾燥してザイモモナス菌の培養物を１２ｇ得た。
【００１８】
液体培地
ショ等 ５０ｇ
リン酸二水素カリウム ２ｇ
酵母エキス １０ｇ
ポリペプトン １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
ＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨ６．０に調製後、高圧蒸気滅菌（１２０℃、２０分）
【００１９】
製造例３ ザイモモナス菌の培養物３
ザイモモナス菌（ＮＢＲＣ １３７５７株）を下記液体培地で３日間培養し予め前培養を行い、さらに前培養で得られた培養液を液体培地に１００分の１量接種して、温度３０℃、ｐＨ６．０、４日間、静置培養した。その後、培養液から遠心分離（×５０００ｇ）によりザイモモナス菌の菌体を除去し、その上清を濃縮し、凍結乾燥してザイモモナス菌の培養物を１３ｇ得た。
【００２０】
液体培地
果糖 ５０ｇ
リン酸二水素カリウム ２ｇ
硫酸マグネシウム ０．５ｇ
硫酸アンモニウム ５ｇ
麦芽エキス １０ｇ
ポテトエキス １０ｇ
蒸留水 １Ｌ
ＮａＯＨ又はＨＣｌでｐＨ６．０に調製後、高圧蒸気滅菌（１２０℃、２０分）
【００２１】
製造例４ ヘチマとアマチャヅルの雑種細胞熱水抽出物
ヘチマとアマチャヅルの雑種細胞（Ｆ３）１００ｇに３００ｍＬの精製水を加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してヘチマとアマチャヅルの雑種細胞の熱水抽出物を６ｇ得た。
【実施例２】
【００２２】
次に、本発明に係る実施例の処方を示す。
【００２３】
処方例１ クリーム１
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物１（製造例１） ０．５
２．スクワラン ５．５
３．オリーブ油 ３．０
４．ステアリン酸 ２．０
５．ミツロウ ２．０
６．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
７．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
８．ベヘニルアルコール １．５
９．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１０．香料 ０．１
１１．１，３−ブチレングリコール ８．５
１２．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．精製水 ６７．６５
［製造方法］成分２〜９を加熱して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００２４】
処方例２ クリーム２
処方例１において、ザイモモナス菌の培養物１をヘチマとアマチャヅルの雑種細胞熱水抽出物に置き換えたものをクリーム２とした。
【００２５】
処方例３ クリーム３
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物１（製造例１） ０．２５
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ０．２５
３．スクワラン ５．５
４．オリーブ油 ３．０
５．ステアリン酸 ２．０
６．ミツロウ ２．０
７．ミリスチン酸オクチルドデシル ３．５
８．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
９．ベヘニルアルコール １．５
１０．モノステアリン酸グリセリン ２．５
１１．香料 ０．１
１２．１，３−ブチレングリコール ８．５
１３．パラオキシ安息香酸エチル ０．０５
１４．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１５．精製水 ６７．６５
［製造方法］成分３〜１０を加熱して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び１２〜１５を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１１を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００２６】
比較例１ 従来のクリーム
処方例１において、ザイモモナス菌の培養物１を精製水に置き換えたものを従来のクリームとした。
【００２７】
処方例４ 化粧水
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物２（製造例２） ０．１
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ０．１
３．１，３−ブチレングリコール ８．０
４．グリセリン ２．０
５．キサンタンガム ０．０２
６．クエン酸 ０．０１
７．クエン酸ナトリウム ０．１
８．エタノール ５．０
９．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
１０．ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（４０Ｅ．Ｏ．） ０．１
１１．香料 ０．１
１２．精製水 ８４．３７
［製造方法］成分１〜７及び１２と、成分８〜１１をそれぞれ均一に溶解し、両者を混合し濾過して製品とする。
【００２８】
処方例５ 乳液
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物３（製造例３） ０．０５
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ０．０５
３．スクワラン ５．０
４．オリーブ油 ５．０
５．ホホバ油 ５．０
６．セタノール １．５
７．モノステアリン酸グリセリン ２．０
８．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ３．０
９．ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート ２．０
１０．香料 ０．１
１１．プロピレングリコール １．０
１２．グリセリン ２．０
１３．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１４．精製水 ７３．１
［製造方法］成分３〜９を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び１１〜１４を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら冷却し、４５℃で成分１０を加え、更に３０℃まで冷却して製品とする。
【００２９】
処方例６ 軟膏
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物１（製造例１） １．０
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） １．０
３．ポリオキシエチレンセチルエーテル（３０Ｅ．Ｏ．） ２．０
４．モノステアリン酸グリセリン １０．０
５．流動パラフィン ５．０
６．セタノール ６．０
７．パラオキシ安息香酸メチル ０．１
８．プロピレングリコール １０．０
９．精製水 ６４．９
［製造方法］成分３〜６を加熱溶解して混合し、７０℃に保ち油相とする。成分１、２及び７〜９を加熱溶解して混合し、７５℃に保ち水相とする。油相に水相を加えて乳化して、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３０】
処方例７ ファンデーション
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物２（製造例２） ０．５
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ０．５
３．ステアリン酸 ２．４
４．ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート １．０
（２０Ｅ．Ｏ．）
５．ポリオキシエチレンセチルエーテル（２０Ｅ．Ｏ．） ２．０
６．セタノール １．０
７．液状ラノリン ２．０
８．流動パラフィン ３．０
９．ミリスチン酸イソプロピル ６．５
１０．パラオキシ安息香酸ブチル ０．１
１１．カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
１２．ベントナイト ０．５
１３．プロピレングリコール ４．０
１４．トリエタノールアミン １．１
１５．パラオキシ安息香酸メチル ０．２
１６．二酸化チタン ８．０
１７．タルク ４．０
１８．ベンガラ １．０
１９．黄酸化鉄 ２．０
２０．香料 ０．１
２１．精製水 ６０．０
［製造方法］成分３〜１０を加熱溶解し、８０℃に保ち油相とする。成分２１に成分１１をよく膨潤させ、続いて、成分１、２及び１２〜１５を加えて均一に混合する。これに粉砕機で粉砕混合した成分１６〜１９を加え、ホモミキサーで撹拌し７５℃に保ち水相とする。この水相に油相をかき混ぜながら加え、冷却し、４５℃で成分２０を加え、かき混ぜながら３０℃まで冷却して製品とする。
【００３１】
処方例８ 浴用剤
処方 配合量（重量％）
１．ザイモモナス菌の培養物３（製造例３） ５．０
２．ヘチマとアマチャヅルの
雑種細胞熱水抽出物（製造例４） ５．０
３．炭酸水素ナトリウム ５０．０
４．黄色２０２号（１） ０．０５
５．香料 ０．２５
６．無水硫酸ナトリウム ３９．７
［製造方法］成分１〜６を均一に混合し製品とする。
【実施例３】
【００３２】
次に、本発明の効果を詳細に説明するため、実験例をあげる。
【００３３】
実験例１ 紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善試験
紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下に対する改善効果をＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量を指標として評価した。
【００３４】
ＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量の測定法
正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで東芝ＦＬ２０Ｓ・Ｅランプを用い３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射し、その直後に０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度の試料を添加したＤＭＥＭ培地にてさらに８時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡの抽出にはＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いた。線維芽細胞から抽出した総ＲＮＡを基にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用い、ＴＧＦ−βレセプターII用のｐｒｉｍｅｒとしては５’ＣＡＡＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＣＡ３’及び５’ＴＣＧＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＡＣＴＣＡ３’を用いた。また、内部標準としてはＧＡＰＤＨを用いた。その他の操作は定められた方法にしたがい、ＴＧＦ−βレセプターIIのｍＲＮＡ発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。ＵＶＢの照射によりＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量の低下がみられるが、その値とＵＶＢ照射後に試料を添加した際のＴＧＦ−βレセプターII ｍＲＮＡ発現量の値からＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善率を算出した。
【００３５】
これらの試験結果を表１に示した。その結果、ザイモモナス菌の培養物には優れた紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善作用が認められた。
【００３６】
【表１】
【００３７】
実験例２ 紫外線によるコラーゲン生成低下改善試験
紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下にともなうコラーゲン生成の低下に対する改善効果をコラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量を指標として評価した。
【００３８】
コラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量の測定法
正常ヒト皮膚線維芽細胞を１０％ ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地にて３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。コンフルエントな状態になったところで東芝ＦＬ２０Ｓ・Ｅランプを用い３０ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢを照射し、その直後に０．０１ｍｇ／ｍｌ濃度の試料を添加したＤＭＥＭ培地にてさらに８時間培養した。その後、１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＴＧＦ−βを添加し２４時間培養した後、総ＲＮＡの抽出を行った。総ＲＮＡの抽出にはＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いた。線維芽細胞から抽出した総ＲＮＡを基にリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法によりコラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量の測定を行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法にはＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ ＥｘＳｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔを用い、コラーゲン（Ｉ）用のｐｒｉｍｅｒとしては５’ＧＣＴＡＣＣＣＡＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＧ３’及び５’ＴＴＣＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＡＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣ３’を用いた。また、内部標準としてはＧＡＰＤＨを用いた。その他の操作は定められた方法にしたがい、コラーゲン（Ｉ）のｍＲＮＡ発現量を内部標準であるＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量に対する割合として求めた。ＵＶＢの照射によりコラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量の低下がみられるが、その値とＵＶＢ照射後に試料を添加した際のコラーゲン（Ｉ） ｍＲＮＡ発現量の値からコラーゲン生成低下改善率を算出した。
【００３９】
これらの試験結果を表２に示した。その結果、ザイモモナス菌の培養物には優れた紫外線によるコラーゲン生成の低下に対する改善作用が認められた。したがって、ザイモモナス菌の培養物は、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を改善することでコラーゲン生成量の減少を防ぎ、光老化皮膚にみられるシワの形成や弾力性の低下を予防、改善することが示唆された。
【００４０】
【表２】
【００４１】
実験例３ 使用試験
処方例１〜３のクリーム、比較例１の従来のクリームを用いて、シワや肌の弾力性の低下に悩む女性３０人（４０〜５０才）を対象に２ヶ月間の使用試験を行った。使用前後に肌の弾力性をキュートメーター（Ｃｏｕｒａｇｅ＋Ｋｈａｚａｋａ社）を用いて測定した。使用前の弾力性の値を１００％とした時の使用後の値を求め、弾力性改善効果を評価した。また、使用後、肌のハリや弾力の改善効果についてのアンケート調査を行った。アンケートの評価基準は、有効なものを「優」、やや有効なものを「良」、わずかに有効なものを「可」、無効なものを「不可」として評価した。
【００４２】
弾力性改善効果の結果を表３に示した。処方例１のザイモモナス菌の培養物を配合したクリーム及び処方例２のヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を配合したクリームは優れた肌の弾力性改善効果を示した。また、処方例３のザイモモナス菌の培養物及びヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を配合したクリームは、さらに優れた肌の弾力性改善効果を示した。
【００４３】
【表３】
【００４４】
アンケート調査の結果を表４に示した。処方例１および２のクリームは優れた肌のハリ及び弾力性の改善効果を示した。また、処方例３のクリームは、さらに優れた肌のハリ及び弾力性の改善効果を示した。なお、試験期間中皮膚トラブルは一人もなく、安全性においても問題なかった。
【００４５】
【表４】
【００４６】
処方例４〜８の化粧水、乳液、軟膏、ファンデーション、浴用剤の使用試験を行ったところ、いずれも安全で優れた肌のハリ及び弾力性の改善効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の活用例として、化粧品、医薬部外品又は医薬品のいずれにも用いることができる。その剤型としては、化粧水、クリーム、乳液、ゲル剤、エアゾール剤、軟膏、パップ剤、ペースト剤、プラスター剤、エッセンス、パック、洗浄剤、浴用剤、ファンデーション、打粉、口紅等が挙げられ、紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下を抑制することで、コラーゲン生成量の減少を防ぎ、光老化皮膚にみられるシワの形成や弾力性の低下を予防、改善する効果が得られる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ザイモモナス菌の培養物を含有することを特徴とする紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤。
【請求項２】
請求項１記載のＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤を含有することを特徴とする紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤。
【請求項３】
請求項２記載の紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤を含有することを特徴とする抗老化皮膚外用剤。
【請求項４】
請求項２記載の紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及びヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を含有することを特徴とする抗老化皮膚外用剤。
【請求項１】
ザイモモナス菌の培養物を含有することを特徴とする紫外線によるＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤。
【請求項２】
請求項１記載のＴＧＦ−βレセプターの産生低下改善剤を含有することを特徴とする紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤。
【請求項３】
請求項２記載の紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤を含有することを特徴とする抗老化皮膚外用剤。
【請求項４】
請求項２記載の紫外線によるコラーゲンの生成低下改善剤及びヘチマとアマチャヅルの雑種細胞抽出物を含有することを特徴とする抗老化皮膚外用剤。
【公開番号】特開２００７−１６１６５９（Ｐ２００７−１６１６５９Ａ）
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６１３１２（Ｐ２００５−３６１３１２）
【出願日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５９２２６２５４３）日本メナード化粧品株式会社 (223)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]