原生動物寄生虫に関連する疾患の治療のためのＲＨＯ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３／ＡＫＴキナーゼ阻害剤
本発明は原生動物寄生虫による感染に関連する病理の予防又は治療のために意図される医薬の製造のためのＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は原生動物寄生虫疾患の治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリア及びアフリカトリパノソーマ症（睡眠病）は２の主要な熱帯のベクター伝染原生動物感染を代表する17。例えば、マラリアは現在危険性のある１０７の国に住む３２億人の公衆衛生に対する主要な脅威のままである。毎年３〜５億の臨床事例が報告されており、及び１００万人超の人が多器官不全（腎臓、肝臓、肺、すい臓）又は大脳マラリア（ＣＭ）と呼ばれる急性神経学的症候群の如き、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染（重篤なマラリア）1に関連する重篤な合併症で亡くなる。
【０００３】
大脳マラリアはサハラ以南のアフリカにおいて幼い子供及び妊婦に主として影響し、一方で多器官不全は東南アジアにおいて主に成人で見られる。重篤なマラリア事例はその後すばやく、しばしば２４時間以内に、昏睡に進行し、及び処置されないままの場合死に至りうる。ＣＭは広範囲に研究されているが、その病因は明らかにされないままであり、及び上記疾患の開始を予想する方法はない。さらに、大脳合併症及び発作を導く事件の連続は十分に確立されていない。脳障害の他の原因が除外されたとき、ＣＭは（損なわれた意識からひきつけ又は昏睡までの）急性神経学的症候群及びＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリア寄生虫の陽性末梢血スミアを示す、マラリア地方病領域に住む又は上記領域を最近旅行した患者において診断される2。
【０００４】
これまで、重篤なマラリアのための緊急処置は主にキニンの静脈内投与から成っていたが、研究及び臨床試験は現在アルテミシニン及び誘導体の如き他の抗マラリア薬を用いることについて行われている3-5。寄生虫から血液を洗浄することにおけるそれらの分子の高い効率にもかかわらず、１５〜２０％の死亡率がまだ観察されており、及び遅延した小脳性運動失調又は他の認知の神経学的後遺症のいくつかの事例は昏睡回復後の処置された患者において報告されている6-8。したがって、主に直接的な抗寄生虫策に頼る、現在の重篤なマラリア治療は十分でないようであり、及び他の追加のアプローチは上記疾患の結果を改善するために必要とされる。
【０００５】
小ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのメンバーはさまざまな膜受容体のシグナル伝達において中枢の役割を果たすことが知られる。それらはＧＴＰ−結合のとき活性であり、及びＧＤＰ−結合のとき不活性である分子スイッチとしてはたらき、及び下流のエフェクターＲｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）を伴う細胞内シグナルカスケードのはじめの媒介物である10。Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫＩ）は血管及び神経保護治療のために現在調査されている。ファスヂルは臨床使用に入手可能なＲｈｏ−キナーゼ阻害剤である。それは市場に出ており、及びクモ膜下出血後の患者における大脳血管痙攣に対して１９９５年以来日本において広く使用されており、及び安定なアンギナ16又は大脳虚血卒中11の患者のためのフェーズ２臨床試験において安全で及び有効であることが近頃示されている。
本発明の目的は寄生虫感染に関連する病理のための処置を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要約
本発明は、ファスヂルはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発細胞死、内皮破壊、及び内皮活性化を予防する傾向があるという、本発明者による予想外の発見から生ずる。
【０００７】
したがって、本発明は治療的に有効な量のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターを個体に投与することを含む、個体において原生動物寄生虫による感染に関連する病理を予防する及び／又は治療するための方法に関連する。
上記に定義される方法の態様は抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物を投与することをさらに含む。
【０００８】
本発明はまた原生動物寄生虫による感染に関連する病理の予防及び／又は治療のために意図される医薬の製造のためのＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターの使用にも関する。
上記に定義される使用の態様において、上記医薬は抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物をさらに含む。
本発明はまた医薬として許容される担体と共に、活性物質として：
−少なくとも１のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、及び
−抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物
を含む医薬組成物にも関する。
【０００９】
本発明はまた原生動物寄生虫による感染に関連する病理の予防又は治療のための同時の、別々の又は連続の使用のための混合された調製物として
−少なくとも１のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、及び
−抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物
を含む製品にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター
本明細書中で意図されるように、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路はＲｈｏ ＧＴＰ−結合タンパク質、好ましくはＲｈｏＡ；Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）、好ましくはＲｈｏＡキナーゼ；フォスファチヂルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）；Ａｋｔキナーゼ；内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の如きＡｋｔキナーゼの細胞標的；及び膜伝達接着分子の如きＲｈｏタンパク質と相互作用することによりＲｈｏタンパク質を活性化する傾向がある細胞膜成分を含む。この経路はＷｏｌｆｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． ２４：１８４２−１８４７において特に定義される。本発明者は、この経路が寄生虫細胞接着の結果として細胞、詳細には内皮細胞において活性化されうることを示した。より正確には、感染した生物の感染していない標的細胞の表面での寄生された細胞の又は寄生虫の接着は、これらの標的細胞において、膜伝達接着分子をとおしてＲｈｏの活性化を誘発する；活性化されたＲｈｏはその後いくつかの他の標的のうち、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔキナーゼを阻害するＲｈｏ−キナーゼを活性化する。感染した赤血球により接着された内皮細胞において、例えば、Ａｋｔキナーゼ阻害は今度はｅＮＯＳ阻害の原因であることができ、それは特にアポトーシスに対する負の制御のｅＮＯＳの発揮を緩和し、それにより内皮の接着された細胞のアポトーシス及び内皮破壊を誘発する。
【００１１】
本明細書中で意図されるように、「Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター」は、上記経路の結果がＲｈｏタンパク質の活性化に際して通常起こることと反対であるように、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性を調節する傾向がある化合物に関連する。明らかなように、上記モヂュレーターは原生動物寄生虫により感染される危険性のある又は感染される個体の細胞のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を調節することをねらう。詳細には、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは（ｉ）Ｒｈｏ及びＲｈｏキナーゼのうちの少なくとも１を阻害する、及び／又は（ｉｉ）ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔキナーゼ及びｅＮＯＳのうちの少なくとも１を活性化する傾向がある。好ましくは、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターはその標的タンパク質（例えば、Ｒｈｏ、Ｒｈｏキナーゼ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔキナーゼ又はｅＮＯＳ）への結合により活動する。上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは詳細には感染した生物において寄生虫の細胞接着の負の結果を予防するために有用である。
【００１２】
好ましくは、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターはＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫＩ）である。ＲＯＣＫＩｓはＴａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｈｏ−ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２００５；１７５４：２４５−２５２中に特に示される。他のＲＯＣＫＩｓはまたＥＰ １２５６５７４、ＥＰ １２７０５７０、及びＥＰ １５５０６６０中に示される。
【００１３】
より好ましくは、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは以下の式の化合物：
【化１】
【化２】
又はその医薬として許容される塩から成る群から選択されるＲＯＣＫＩである。
【００１４】
最も好ましくは、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは以下の式の化合物：
【化３】
又はその医薬として許容される塩から選択されるＲＯＣＫＩである。
【００１５】
これらの後者の２の化合物はそれぞれ、（ＨＡ−１０７７又はＡＴ８７７としても知られる）ファスヂル及び（Ｈ−４４１３としても知られる）ヒドロキシファスヂルである。ヒドロキシファスヂルはファスヂルの活性代謝産物である。
【００１６】
本明細書中で意図されるとき、医薬として許容される塩は上記に挙げられる化合物の比較的非毒性の無機及び有機酸添加塩、及び塩基添加塩に関する。例示的な塩は臭化水素酸、塩酸、硫酸、重硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、シュウ酸、吉草酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリル酸、ホウ酸、安息香酸、乳酸、リン酸、トシル酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、ナフチル酸、メシル酸、グルコヘプトン酸、ラクチオビオン酸、スルファミン酸、マロン酸、サリチル酸、プロピオン酸、メチレン−ビス−ｂ−ヒドロキシナフトール酸（ヒドロキシナフトアート）、ゲンチジン酸、イセチオン酸、ヂ−ｐ−トルオイル酒石酸、メタン−スルフォン酸、エタンスルフォン酸、ベンゼンスルフォン酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナテスラウリルスルフォン酸、アミン、及び金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、マグネシウム又はアルミニウム）塩等を含む（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）《Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ》 Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６６：１−１９を参照のこと）。
ファスヂルの塩酸塩は好ましい。
【００１７】
病理
本明細書中で意図されるとき、「原生動物寄生虫による感染に関連する病理」は直接的に又は間接的に原生動物寄生虫による感染の結果である障害、疾患又は症候群に関する。本発明にしたがう病理は好ましくは、それ自体寄生虫細胞接着から特に生じうる、寄生虫誘発アポトーシス、細胞活性化、詳細には内皮活性化、及び／又は内皮破壊から部分的に又は全体的に生じる。
【００１８】
好ましくは、上記原生動物寄生虫はＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐから成る群から選択される。詳細には、上記原生動物寄生虫はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅの如き、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｓｐｐから成る群から選択されうる。
【００１９】
上記病理は好ましくはマラリア、及びアフリカトリパノソーマ症（睡眠病）から成る群から選択される。
より好ましくは、上記病理は重篤なマラリア、大脳マラリア、多器官不全症候群、及び進行した段階のアフリカトリパノソーマ症から成る群から選択される。
【００２０】
抗寄生虫活性を有する化合物
本明細書中で意図されるとき、「抗寄生虫活性を有する化合物」は原生動物寄生虫による感染又はそれらの病理学的結果の治療の過程において使用されるどんな化合物にも関する。抗寄生虫活性を有する化合物は好ましくは感染した生物において寄生虫ロードを減少させるために使用される化合物に関する。
【００２１】
Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは寄生虫疾患における補助治療として有用である。そのように、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターの及び抗寄生虫活性を有する化合物の関連は、それは寄生虫細胞接着により誘発される細胞活性化、詳細には内皮活性化、内皮破壊、及びアポトーシスの如き寄生虫感染の結果を予防する及び／又は治療する一方で寄生虫自体を破壊するので、本発明の枠組内で有益である。
【００２２】
好ましくは、抗寄生虫活性を有する上記化合物は抗マラリア活性を有する化合物である。
好ましくは、抗マラリア活性を有する上記化合物はキニン（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、キニヂン（Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ）、キニン−ドキシサイクリン（Ｑｕｉｎｉｎｅ−ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アルテメテール（Ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）、アルテモチル（Ａｒｔｅｍｏｔｉｌ）、アルテスネート（Ａｒｔｅｓｕｎａｔｅ）、アルテエーテル（Ａｒｔｅｅｔｈｅｒ）、メフロキン（Ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ）、アモヂアキン（Ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）、ヂヒドロアルテミシニン（Ｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｅ）、ピペラキン（Ｐｉｐｅｒａｑｕｉｎｅ）、ハロファントリン（Ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ）、アトヴァクオン（Ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）、クロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、ダプソン（Ｄａｐｓｏｎｅ）、ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎｅ）、ルメファントリン（Ｌｕｍｅｆａｎｔｈｒｉｎｅ）、プログアニル（Ｐｒｏｇｕａｎｉｌ）、ピリメタミン（Ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、ピロナリヂン（Ｐｙｒｏｎａｒｉｄｉｎｅ）、スルファドキシン（Ｓｕｌｆａｄｏｘｉｎｅ）、ヂアミヂン（Ｄｉａｍｉｄｉｎｅ）、フェロキン（Ｆｅｒｒｏｑｕｉｎｅ）、フルオロキノロン（Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）、フォスミドマイシン（Ｆｏｓｍｉｄｏｍｙｃｉｎｅ）、タフェノキン（Ｔａｆｅｎｏｑｕｉｎｅ）、及びトリオキサキン（Ｔｒｉｏｘａｑｕｉｎｅ）から成る群において選択される。
【００２３】
投与
本発明にしたがうＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、抗寄生虫活性を有する化合物、医薬、医薬組成物又は製品は経口、皮内、静脈内、筋内又は直腸内経路により投与されうる。
【００２４】
本発明にしたがうＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、抗寄生虫活性を有する化合物、医薬、医薬組成物又は製品は溶液、懸濁物、錠剤又はカプセルの形態で投与されうる。
【００２５】
「医薬として許容される担体」の選択は当業者によりルーチンで決定されうる。それは一般的に上記活性物質の溶解性及び化学特性にしたがって決定される。例えば、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウムの如き賦形剤及びステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクの如き潤滑剤と混合されたデンプン、アルギン酸及びいくつかのケイ酸塩複合体の如き崩壊剤は錠剤を調製するために使用されうる。カプセルを調製するために、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールを使用することは有益である。水性懸濁物が使用されるとき、それらは乳化剤又は懸濁を促進する剤を含みうる。スクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール及びクロロフォルム又はそれらの混合物の如き希釈剤もまた使用されうる。
【００２６】
本発明にしたがうＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、抗寄生虫活性を有する化合物、医薬、医薬組成物又は製品がその必要のある個体に投与されうる用量は当業者によりルーチンで決定されうる。詳細には、抗寄生虫活性を有する上記化合物はそれが本発明にしたがうＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターと関連して使用されないときと同じ用量で投与されうる。
例のために、ファスヂルは５０ｍｇ〜５００ｍｇ、詳細には８０ｍｇの単位用量で、５０ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日の投与量で、詳細には２４０ｍｇ／日で投与されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は：（Ｅ）接触（黒色カラム）又は非接触（白色カラム）状態下でのコントロール内皮細胞；（ＲＢＣ）コントロール赤血球により接触された（黒色カラム）又は接触されない（白色カラム）内皮細胞；（３Ｄ７）３Ｄ７クローンに寄生された赤血球により接触された（黒色カラム）又は接触されない（白色カラム）内皮細胞；（Ｆ１２）Ｆ１２クローンに寄生された赤血球により接触された（黒色カラム）又は接触されない（白色カラム）内皮細胞からの内皮細胞抽出物についての活性化されたＲｈｏＡの細胞質濃度（［Ｒｈｏ−ＧＴＰ］、垂直軸、任意の単位）を示す。結果は［Ｒｈｏ−ＧＴＰ］を示す細胞抽出物の４９０ｎｍでの光学濃度の計測後に得られた。データは３の独立した実験の平均＋／−ＳＤを表す。**Ｐ＜０．０１。
【図２】図２は：（ＲｈｏＡ）Ｇ−ＬＩＳＡ（商標）キット中に提供される精製ＲｈｏＡタンパク質から成る陽性コントロール；（溶解緩衝液）Ｇ−ＬＩＳＡ（商標）細胞抽出緩衝液；（Ｅ）コントロール内皮細胞からの内皮細胞抽出物；（ＲＢＣ）コントロール赤血球により接触された内皮細胞からの内皮細胞抽出物；（ＲＢＣ＋ＨＦ２）コントロール赤血球により及び３７℃で２４時間３０μＭのファスヂルで接触された内皮細胞からの内皮細胞抽出物；（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球により接触された内皮細胞からの内皮細胞抽出物；（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２）寄生された赤血球により及び３７℃で２４時間３０μＭのファスヂルで接触された内皮細胞からの内皮細胞抽出物についての活性化されたＲｈｏＡの細胞質濃度（［Ｒｈｏ−ＧＴＰ］、垂直軸、任意の単位）を示す。結果は［Ｒｈｏ−ＧＴＰ］を示す細胞抽出物の４９０ｎｍでの光学濃度の計測後に得られた。データは３の独立した実験の平均＋／−ＳＤを表す。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１。
【図３】図３はアポトーシス細胞により取り込まれるＡｐｏｐｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）紫色素の存在下での（パネルＡ）非暴露内皮細胞；（パネルＢ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞；（パネルＣ）寄生された赤血球に暴露された内皮細胞；（パネルＤ）寄生された赤血球に及び３０μＭのファスヂルに暴露された内皮細胞の逆相コントラスト顕微鏡写真を示す。矢印は紫色素の取り込みを示す。
【図４】図４は（Ｅ）非暴露内皮細胞、（ＲＢＣ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球に暴露され、及び０μＭ（黒色カラム）、１μＭ（灰色カラム）又は３０μＭ（水玉カラム）ファスヂルと共にインキュベートされた内皮細胞についての図３中に示される逆相コントラスト顕微鏡写真についての紫色素ピクセル数（Ａｐｏｐ％、垂直軸）を示す。ピクセル数はＡｄｏｂｅ（商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）を用いて決定された。データは３の独立した実験の代表的な範囲の４の写真からのピクセル数の平均＋／−ＳＤを表す。
【図５】図５は（Ｅ）非暴露内皮細胞、（ＲＢＣ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ｚ−ｖａｄ １０μＭ）寄生された赤血球に暴露された及び１０μＭの広範囲キャスパーゼ阻害剤ｚ−ｖａｄと共にインキュベートされた内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ｚ−ｖａｄ １００μＭ）寄生された赤血球に暴露された及び１００μＭのｚ−ｖａｄと共にインキュベートされた内皮細胞についての内皮の境界完全（６３０ｎｍのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅマーカーの光学濃度（ＯＤ）、垂直軸、×１０-3）を示す。データは３の独立した実験及びそれぞれの条件についての６の繰返しからの１０-3光学濃度値の平均＋／−ＳＤを表す。**Ｐ＜０．０１。
【図６】図６は（Ｅ）非暴露内皮細胞、（ＲＢＣ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ＨＦ１）寄生された赤血球に暴露された及び続いて１μＭのファスヂルで２０時間処理された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２）寄生された赤血球に暴露された及び続いて３０μＭのファスヂルで２０時間処理された内皮細胞についての内皮の境界完全（６３０ｎｍのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅマーカーの光学濃度（ＯＤ）、垂直軸、×１０-3）を示す。データは３の独立した実験及びそれぞれの条件当たり６の繰返しからの１０-3光学濃度値の平均＋／−ＳＤを表す。**Ｐ＜０．０１。
【図７】図７は（Ｅ）非暴露内皮細胞、（ＲＢＣ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２）寄生された赤血球に暴露された及び続いて３０μＭのファスヂルで２０時間処理された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２＋ＬＹ）寄生された赤血球に暴露された及び続いて３０μＭのファスヂル及び１５μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で２０時間処理された内皮細胞についての内皮の境界完全（６３０ｎｍのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅマーカーの光学濃度（ＯＤ）、垂直軸、×１０-3）を示す。データは３の独立した実験及びそれぞれの条件当たり３の繰返しからの１０-3光学濃度値の平均＋／−ＳＤを表す。**Ｐ＜０．０１。
【図８】図８は非暴露（コントロール）又は非感染赤血球（ＲＢＣ）、ＴＮＦα、寄生された赤血球（ｐＲＢＣ）及び寄生された赤血球＋３０μＭのファスヂル（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２）に暴露された活性化ＨＬＥＣ（完全であり、部分的でない移動核ＮＦ−カッパーＢ Ｐ６５サブユニット染色を伴う細胞）の数がカウントされたことを示す。データは陽性核Ｐ６５細胞の％の平均＋／−ＳＤを示す。**Ｐ＜０．００５。
【実施例】
【００２８】
実施例
材料及び方法：
ヒト肺内皮細胞（ＨＬＥＣ）の培養
初代内皮細胞（ＨＬＥＣ）を以前に示されるように12酵素消化後にヒト肺から単離し、及び連続勾配及び免疫磁気精製技術を用いて選択した。１のバッチに由来する９代目から１２代目の内皮細胞を実験に使用した。使用前に、細胞を以前に示されるようにＩＣＡＭ−１、ＣＤ３６、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ３１、Ｅ／Ｐ−セレクチン及びＣＳＡのそれらの発現について確認した。ＨＬＥＣを１０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長サプリメント（ＥＣＧＳ）（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）及び１０％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ｏｒｉｇｉｎ）で補充したＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃で５％ＣＯ2で、８のチャンバーｌａｂ−ｔｅｋ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎａｐｅｒｖｉｌ， Ｉ１１）、６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）又はＴｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて育てた。
【００２９】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ培養
Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ３Ｄ７14及びＦ１２9クローンを私たちの実験のために使用した。Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球（ｐＲＢＣｓ）を８．３ｇ．ｌ-1のＨｅｐｅｓ、２．１ｇ．ｌ-1のＮａＨＣＯ、０．１ｍｇ．ｍｌ-1のジェンタマイシン及び２ｇ．ｌ-1のデキストロース及び０．４％のＡｌｂｕｍａｘ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で補充されたＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中の赤血球（ＲＢＣ）の懸濁物中でＴｒａｇｅｒ及びＪｅｎｓｅｎの技術にしたがって培養中で維持した13。上記３Ｄ７クローンは以前に示されるように14接着表現型について特徴づけられ、及びＩＣＡＭ−１及びＣＤ３６についてそれぞれ３０％及び４５％でＨＬＥＣに接着する。その派生型Ｆ１２クローンはその乏しい接着特性のために使用された9（最大で１ｐＲＢＣ／２０ ＨＬＥＣ、＞１ ｐＲＢＣ／ＨＬＥＣが通常観察される３Ｄ７クローンと比較して）。それぞれの実験について、寄生虫培養物をＰｌａｓｍａｇｅｌフローティングにより成熟形でリッチにした15。簡単に記述すると、赤血球を５〜１０％の寄生培養物で収穫し、及び２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞をＰｌａｓｍｉｏｎ（商標）（ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ ｋａｂｉ、Ｆｒａｎｃｅ）中に再懸濁し、及び３７℃で２５分間インキュベートした。成熟トロフォゾイト（栄養体）及びシゾント（栄養体から生じた娘個体）を含む上側画分をその後集め、及びＲＰＭＩ中で３回洗浄した。寄生された赤血球懸濁物をその後１％のヘマトクリット及び５０％の寄生虫血に合わせた。
【００３０】
試薬
凍結乾燥Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ファスヂル（ＨＡ−１０７７）をＢｉａｆｆｉｎ（Ｋａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、及びＰＢＳ中で再構成した。ファスヂルを１μＭ（ＨＦ１）、３０μＭ（ＨＦ２）又は１００μＭ（ＨＦ３）で使用した。フォスファチヂルイノシトール３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、及び１５μＭでの使用前に１５ｍＭストック溶液でエタノール中に可溶化した（ＬＹ）。キャスパーゼの広範囲阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋをＳｉｇｍａから購入した。全ての試薬を−２０℃で貯蔵した。
【００３１】
内皮の境界完全の分析
事前に暴露されたｐＲＢＣｓ内皮細胞に対する処理の効果を計測するために、私たちは内皮単層をとおしたＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅ拡散に基づいた方法を開発した。簡単に記述すると、ＨＬＥＣをＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ（ポリエステル膜、３μｍポアサイズ、６．５ｍｍ直径、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＭ１９９培地中でコンフルエントになるまで育てた。３Ｄ７ Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍクローンの成熟形をその後培養物から収穫し、及び１％のヘマトクリット及び５０％の寄生虫血に合わせ、その後３７℃、５％ＣＯ2で４時間共−インキュベートした。ｐＲＢＣ暴露後、内皮細胞単層をファスヂル（１μＭ又は３０μＭ）で２０時間処理した。非感染赤血球との同様のインキュベーション又は内皮細胞単独をコントロールとしてとった。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ区画をその後ＲＰＭＩに基づく接着培地で３回洗浄した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓをＰＢＳで満たした新しいプレートに移した；０．５ｍｇ／ｍＬのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）の溶液をその後上側区画に添加し、及び３７℃、５％ＣＯ2で５分間インキュベートした。下側区画を標準のマイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（商標）ＥＬ３１１ＳＸ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ）を用いた拡散されたＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅの６３０ｎｍでの光学濃度分析のために最後に回収した。
【００３２】
定量的アポトーシス分析
内皮アポトーシスをＢｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ．（Ｂｅｌｆａｓｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｒｅｌａｎｄ）から購入したＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）色素を用いて定量的に評価した。上記分析はアポトーシス細胞には選択的に組み込まれるが壊死細胞には組み込まれない赤紫色色素を使用する。上記色素の一方だけの取り込みはアポトーシスを経験する細胞の外側の膜のフォスファチヂルセリンをとおして起こる。内皮細胞をコンフルエントになるまで６ウェルプレート中で培養し、その後Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球に２４時間暴露した。ＨＬＥＣを共−インキュベーション時間が達成される前にＡｐｏｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ色素（１／２０）と共に１時間インキュベートし、及び注意深くＰＢＳで３回洗浄した。アポトーシスをその後Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＡＤＰ）により定量した：それぞれの実験について、細胞培養物のそれぞれのウェルの４の代表的な範囲をデジタルカメラとカップリングした逆相コントラスト顕微鏡を用いて写真に撮った。イメージをその後コンピューターに移し、及びアポトーシスの値をＡｄｏｂｅ（商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）によりカウントされる赤色ピクセル数として表した。
【００３３】
ＲｈｏＡ／Ｒｈｏキナーゼ経路活性化分析
ＲｈｏＡ及びその下流のエフェクターＲｈｏキナーゼの活性をＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）から購入したＧ−ＬＩＳＡ（商標）ＲｈｏＡ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｋｉｔを用いて評価した。上記分析の原理はＲｈｏ−ＧＴＰ結合タンパク質コーティングされた９６ウェルプレート及び免疫試薬での最終的な検出で培養細胞から抽出された活性ＧＴＰ結合ＲｈｏＡの量を決定することである。簡単に記述すると、ＨＬＥＣを製造業者により推奨されるように５０〜７０％コンフルエントになるまで６ウェルプレート中で培養し、及び１％のヘマトクリット及び５０％の寄生虫血でＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球又は非感染赤血球に暴露した。使用されるとき、ファスヂルを３０μＭで寄生虫と付随して添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、及びプロテアーゼ阻害剤を含むリン酸緩衝塩水中に氷冷溶解した。細胞溶解物をその後タンパク質濃度の計測前に４℃、１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により不純物除去した。細胞抽出物を溶解緩衝液で等しくして同一のタンパク質濃度を与え、Ｒｈｏ−ＧＴＰアフィニティプレート中で４℃で３０分間インキュベートした。Ｇ−ＬＩＳＡ（商標）キット中に提供される抗体検出試薬（第一抗ＲｈｏＡ抗体、第二抗体、ＨＲＰ検出試薬）を添加し、及びシグナルをルミノメトリー分析（４９０ｎｍ）で発展した。接触なし分析において、ＨＬＥＣをＴｒａｎｓｗｅｌｌ（０．４μＭポアのポリエステル膜）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の下側区画中でコンフルエントになるまでサブ培養した。ｐＲＢＣ及びコントロールＲＢＣをその後上側区画に添加し、及び３７℃で２４時間インキュベートし、その後上記に示されるようにＧ−ＬＩＳＡ（商標）試験を行った。
【００３４】
統計分析
それぞれの実験を独立に３回行い、及びそれぞれの共−培養条件から回収したデータを平均±ＳＤとして表す。結果を一方向ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ多比較試験を用いて統計的有意差について分析した。ｐ＜０．０５の値は有意と考えられた。
【００３５】
実施例１
ファスヂルはヒト内皮細胞においてＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ接触により誘発されるＲｈｏＡ／Ｒｈｏ−キナーゼ経路活性化を妨げうる
本発明者はＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが内皮細胞においてＲｈｏＡ／Ｒｈｏ−キナーゼ経路を誘発することができることをはじめて確立した。
簡単に記述すると、Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球（ｐＲＢＣ）又は非感染赤血球（ＲＢＣ）と共に２４時間共−インキュベートされたＨＬＥＣにおけるＲｈｏＡ活性を材料及び方法の節において示されるようにＧ−ＬＩＳＡ（商標）ＲｈｏＡ活性化キット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ， Ｄｅｎｖｅｒ ＣＯ）を用いて計測した。
図１中に見られるように、感染した赤血球と共に２４時間共−インキュベートされたＨＬＥＣは非感染赤血球に暴露されたＨＬＥＣ（ｐ＜０．０１）又は非暴露ＨＬＥＣ（ｐ＜０．０１）に比較して細胞活性化ＲｈｏＡ濃度における顕著な増大を示した。
さらに、本発明者は、ＨＬＥＣ及び感染した赤血球（ｐＲＢＣ）の間の物理的接触がＲｈｏＡ活性に必要とされることを示した。
【００３６】
簡単に記述すると、ＨＬＥＣを細胞接着を避けるために「接触なし」分析におけるｐＲＢＣ又はコントロールＲＢＣと共にトランスウェルにおいて共−インキュベートした（材料及び方法の節）。この状態において、区画は赤血球が内皮細胞に接着することを妨げるが巨大分子及び培地の通過を妨げない多孔性膜（０．４μｍポア）により分離された。接触なし分析におけるｐＲＢＣとの共−インキュベーションは基底値と同様の活性化ＲｈｏＡ濃度を示した。
これはｐＲＢＣｓを調製するためにＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ３Ｄ７クローンの代わりに細胞接着性のないＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｆ１２クローンを用いてさらに確認された。Ｆ１２はＲｈｏＡ／Ｒｈｏ−キナーゼ経路を誘発することができなかった。
本発明者はその後、２４時間のｐＲＢＣ接触共−インキュベーションにおける３０μＭの既知のＲｈｏＡ／Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤、ファスヂルはｐＲＢＣのみ（ｐ＜０．０５）に比較して活性化ＲｈｏＡ濃度における顕著な減少を誘発する傾向があることを示した（図２）。
【００３７】
実施例２
Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤ファスヂルはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮細胞アポトーシスを減少させる
本発明者はそれから、ファスヂルはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発アポトーシスから内皮細胞を保護する傾向があることを示した。
簡単に記述すると、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＡＤＰ）を用いてアポトーシスＨＬＥＣによる赤紫色素の放出を定量的に評価することにより、ＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）を誘発されたアポトーシス及びｐＲＢＣ／ＨＬＥＣ共−インキュベーション中の細胞生存に対するファスヂルの効果を定量するための手段として使用した。ＨＬＥＣは暴露されなかった（図３、パネルＡ）、ＲＢＣと共に共−インキュベートされた（図３、パネルＢ）又はｐＲＢＣのみと共に（図３、パネルＣ）、１μＭのファスヂルと共に（図３、パネルＤ）又は３０μＭのファスヂルと共に（図４）共−インキュベートされた。
【００３８】
したがって、本発明者は、ｐＲＢＣはＲＢＣに比較されるときＨＬＥＣアポトーシスを誘発することができることを観察した（９．５倍）。しかしながら、細胞が１μＭのファスヂルで処理されるとき、非処理細胞と比較してｐＲＢＣ暴露ＨＬＥＣのアポトーシスにおける減少が観察される（１．４倍減少）。アポトーシスにおけるこの減少は細胞がより高い濃度のファスヂル（３０μＭ）で処理されるとき増強される（４．１倍減少）。
【００３９】
実施例３
Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤でのＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮浸透性の復帰
本発明者は、Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、おそらく細胞アポトーシスのために、境界完全の喪失を導く内皮浸透性に対する強烈な効果を有しうることを示した。
簡単に記述すると、内皮境界機能に対するＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ細胞接着効果をコンフルエントになるまでＴｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓにおいてＨＬＥＣを培養し、その後上記のようにｐＲＢＣの成熟形にそれらを４時間暴露することにより評価した。下側区画において回収されたＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅの量はコントロールＲＢＣ／ＨＬＥＣ（ｐ＜０．０１）又は非暴露内皮細胞条件（ｐ＜０．０１）におけるよりｐＲＢＣ／ＨＬＥＣ共−インキュベーション条件において顕著に高かった。それらのコントロールにおいて回収されたＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅは同等の値のままであり、及びＲＢＣ共−インキュベーションの場合において観察されたわずかな増大は顕著でない。さらに、ｐＲＢＣ／ＨＬＥＣ共−インキュベーション条件における下側区画中のＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅの量は広範囲キャスパーゼ阻害剤ｚ−ｖａｄの存在下で顕著に減少された（図５）。したがって、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅの通過は比較的妨げられ、アポトーシス阻害をとおした単層浸透性の改善を反映した。
【００４０】
本発明者はそれから、ファスヂルはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮浸透性を妨げうることを示した。
簡単に記述すると、ＨＬＥＣをコンフルエントになるまでＴｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓにおいて培養した。得られた細胞単層をその後ｐＲＢＣ接着に４時間暴露し、続いて１μＭ又は３０μＭのファスヂルで（図６）及び／又は１５μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で（図７）２０時間処理した。内皮境界完全を上記に示されるように評価した。
【００４１】
上記インキュベーションをＨＬＥＣ、ｐＲＢＣ及び３０μＭのファスヂルと共に行ったとき、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅマーカーの量はインキュベーションがＨＬＥＣ及びｐＲＢＣと共に行われたとき（ｐ＜０．０１）より顕著に低いことがわかった（図６）。そのうえ、ファスヂルの効果はＬＹ２９４００２により逆転されることができ、そのことはファスヂルの効果は少なくとも部分的にはＲｈｏキナーゼ阻害に続いて起こるＰＩ３Ｋ活性化に由来することを示す（図７）。
【００４２】
実施例４
Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発ＮＦ−カッパーＢ内皮活性化に対するファスヂルの効果
内皮活性化はＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリア急性相の重篤さにおいて重要な役割を果たすと考えられている18。Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ細胞接着はＮＦ−カッパーＢ転写因子を暗示するシグナルカスケードを介して前炎症性内皮応答を誘発することが知られる19,20。それらの刺激に際して、ＮＦ−カッパーＢは特定の残基上でリン酸化され、活性化された状態になり、及び核へ移行する。
本発明者はそれゆえ、ファスヂルがまたＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮活性化を調節しうるかどうかを試験した。
【００４３】
簡単に記述すると、ＨＬＥＣを８チャンバーＬａｂｔｅｋプレート中で培養し、及び１％のヘマトクリット及び５０％の寄生虫血でｐＲＢＣに６時間暴露した。Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤ファスヂルを３０μＭでｐＲＢＣと同時に添加した。２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαをＮＦ−カッパーＢ核移行の陽性コントロールとして使用した。細胞をその後固定し、及び第一抗ＮＦ−カッパーＢ Ｐ６５サブユニット抗体及び第二ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ抗体での免疫染色に浸透させた。核をヂアミヂノ−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。ＮＦ−カッパーＢ Ｐ６５サブユニットの免疫染色後、結果を蛍光顕微鏡により分析し、及びそれぞれの条件（ｎ＝４）当たりの活性化されたＨＬＥＣ（完全であり、部分的でない核移行Ｐ６５染色を有する細胞）の数をカウントした（図８）。
【００４４】
結果は、ファスヂルはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発ＮＦ−カッパーＢ核移行の阻害により示されるようにＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮活性化を顕著に減少させることを示す。
【００４５】
引用文献
【化４】
【化５】
【技術分野】
【０００１】
本発明は原生動物寄生虫疾患の治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
マラリア及びアフリカトリパノソーマ症（睡眠病）は２の主要な熱帯のベクター伝染原生動物感染を代表する17。例えば、マラリアは現在危険性のある１０７の国に住む３２億人の公衆衛生に対する主要な脅威のままである。毎年３〜５億の臨床事例が報告されており、及び１００万人超の人が多器官不全（腎臓、肝臓、肺、すい臓）又は大脳マラリア（ＣＭ）と呼ばれる急性神経学的症候群の如き、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染（重篤なマラリア）1に関連する重篤な合併症で亡くなる。
【０００３】
大脳マラリアはサハラ以南のアフリカにおいて幼い子供及び妊婦に主として影響し、一方で多器官不全は東南アジアにおいて主に成人で見られる。重篤なマラリア事例はその後すばやく、しばしば２４時間以内に、昏睡に進行し、及び処置されないままの場合死に至りうる。ＣＭは広範囲に研究されているが、その病因は明らかにされないままであり、及び上記疾患の開始を予想する方法はない。さらに、大脳合併症及び発作を導く事件の連続は十分に確立されていない。脳障害の他の原因が除外されたとき、ＣＭは（損なわれた意識からひきつけ又は昏睡までの）急性神経学的症候群及びＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリア寄生虫の陽性末梢血スミアを示す、マラリア地方病領域に住む又は上記領域を最近旅行した患者において診断される2。
【０００４】
これまで、重篤なマラリアのための緊急処置は主にキニンの静脈内投与から成っていたが、研究及び臨床試験は現在アルテミシニン及び誘導体の如き他の抗マラリア薬を用いることについて行われている3-5。寄生虫から血液を洗浄することにおけるそれらの分子の高い効率にもかかわらず、１５〜２０％の死亡率がまだ観察されており、及び遅延した小脳性運動失調又は他の認知の神経学的後遺症のいくつかの事例は昏睡回復後の処置された患者において報告されている6-8。したがって、主に直接的な抗寄生虫策に頼る、現在の重篤なマラリア治療は十分でないようであり、及び他の追加のアプローチは上記疾患の結果を改善するために必要とされる。
【０００５】
小ＧＴＰアーゼのＲｈｏファミリーのメンバーはさまざまな膜受容体のシグナル伝達において中枢の役割を果たすことが知られる。それらはＧＴＰ−結合のとき活性であり、及びＧＤＰ−結合のとき不活性である分子スイッチとしてはたらき、及び下流のエフェクターＲｈｏ−キナーゼ（ＲＯＣＫ）を伴う細胞内シグナルカスケードのはじめの媒介物である10。Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫＩ）は血管及び神経保護治療のために現在調査されている。ファスヂルは臨床使用に入手可能なＲｈｏ−キナーゼ阻害剤である。それは市場に出ており、及びクモ膜下出血後の患者における大脳血管痙攣に対して１９９５年以来日本において広く使用されており、及び安定なアンギナ16又は大脳虚血卒中11の患者のためのフェーズ２臨床試験において安全で及び有効であることが近頃示されている。
本発明の目的は寄生虫感染に関連する病理のための処置を提供することである。
【発明の概要】
【０００６】
発明の要約
本発明は、ファスヂルはＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発細胞死、内皮破壊、及び内皮活性化を予防する傾向があるという、本発明者による予想外の発見から生ずる。
【０００７】
したがって、本発明は治療的に有効な量のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターを個体に投与することを含む、個体において原生動物寄生虫による感染に関連する病理を予防する及び／又は治療するための方法に関連する。
上記に定義される方法の態様は抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物を投与することをさらに含む。
【０００８】
本発明はまた原生動物寄生虫による感染に関連する病理の予防及び／又は治療のために意図される医薬の製造のためのＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターの使用にも関する。
上記に定義される使用の態様において、上記医薬は抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物をさらに含む。
本発明はまた医薬として許容される担体と共に、活性物質として：
−少なくとも１のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、及び
−抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物
を含む医薬組成物にも関する。
【０００９】
本発明はまた原生動物寄生虫による感染に関連する病理の予防又は治療のための同時の、別々の又は連続の使用のための混合された調製物として
−少なくとも１のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、及び
−抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物
を含む製品にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター
本明細書中で意図されるように、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路はＲｈｏ ＧＴＰ−結合タンパク質、好ましくはＲｈｏＡ；Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）、好ましくはＲｈｏＡキナーゼ；フォスファチヂルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）；Ａｋｔキナーゼ；内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の如きＡｋｔキナーゼの細胞標的；及び膜伝達接着分子の如きＲｈｏタンパク質と相互作用することによりＲｈｏタンパク質を活性化する傾向がある細胞膜成分を含む。この経路はＷｏｌｆｒｕｍ ｅｔ ａｌ．（２００４） Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｖａｓｃ． Ｂｉｏｌ． ２４：１８４２−１８４７において特に定義される。本発明者は、この経路が寄生虫細胞接着の結果として細胞、詳細には内皮細胞において活性化されうることを示した。より正確には、感染した生物の感染していない標的細胞の表面での寄生された細胞の又は寄生虫の接着は、これらの標的細胞において、膜伝達接着分子をとおしてＲｈｏの活性化を誘発する；活性化されたＲｈｏはその後いくつかの他の標的のうち、ＰＩ３Ｋ及びＡｋｔキナーゼを阻害するＲｈｏ−キナーゼを活性化する。感染した赤血球により接着された内皮細胞において、例えば、Ａｋｔキナーゼ阻害は今度はｅＮＯＳ阻害の原因であることができ、それは特にアポトーシスに対する負の制御のｅＮＯＳの発揮を緩和し、それにより内皮の接着された細胞のアポトーシス及び内皮破壊を誘発する。
【００１１】
本明細書中で意図されるように、「Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター」は、上記経路の結果がＲｈｏタンパク質の活性化に際して通常起こることと反対であるように、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性を調節する傾向がある化合物に関連する。明らかなように、上記モヂュレーターは原生動物寄生虫により感染される危険性のある又は感染される個体の細胞のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路を調節することをねらう。詳細には、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは（ｉ）Ｒｈｏ及びＲｈｏキナーゼのうちの少なくとも１を阻害する、及び／又は（ｉｉ）ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔキナーゼ及びｅＮＯＳのうちの少なくとも１を活性化する傾向がある。好ましくは、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターはその標的タンパク質（例えば、Ｒｈｏ、Ｒｈｏキナーゼ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔキナーゼ又はｅＮＯＳ）への結合により活動する。上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは詳細には感染した生物において寄生虫の細胞接着の負の結果を予防するために有用である。
【００１２】
好ましくは、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターはＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫＩ）である。ＲＯＣＫＩｓはＴａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｈｏ−ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ２００５；１７５４：２４５−２５２中に特に示される。他のＲＯＣＫＩｓはまたＥＰ １２５６５７４、ＥＰ １２７０５７０、及びＥＰ １５５０６６０中に示される。
【００１３】
より好ましくは、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは以下の式の化合物：
【化１】
【化２】
又はその医薬として許容される塩から成る群から選択されるＲＯＣＫＩである。
【００１４】
最も好ましくは、上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは以下の式の化合物：
【化３】
又はその医薬として許容される塩から選択されるＲＯＣＫＩである。
【００１５】
これらの後者の２の化合物はそれぞれ、（ＨＡ−１０７７又はＡＴ８７７としても知られる）ファスヂル及び（Ｈ−４４１３としても知られる）ヒドロキシファスヂルである。ヒドロキシファスヂルはファスヂルの活性代謝産物である。
【００１６】
本明細書中で意図されるとき、医薬として許容される塩は上記に挙げられる化合物の比較的非毒性の無機及び有機酸添加塩、及び塩基添加塩に関する。例示的な塩は臭化水素酸、塩酸、硫酸、重硫酸、リン酸、硝酸、酢酸、シュウ酸、吉草酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリル酸、ホウ酸、安息香酸、乳酸、リン酸、トシル酸、クエン酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、ナフチル酸、メシル酸、グルコヘプトン酸、ラクチオビオン酸、スルファミン酸、マロン酸、サリチル酸、プロピオン酸、メチレン−ビス−ｂ−ヒドロキシナフトール酸（ヒドロキシナフトアート）、ゲンチジン酸、イセチオン酸、ヂ−ｐ−トルオイル酒石酸、メタン−スルフォン酸、エタンスルフォン酸、ベンゼンスルフォン酸、ｐ−トルエンスルフォン酸、シクロヘキシルスルファミン酸、キナテスラウリルスルフォン酸、アミン、及び金属（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、マグネシウム又はアルミニウム）塩等を含む（例えば、Ｂｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９７７）《Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ》 Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ６６：１−１９を参照のこと）。
ファスヂルの塩酸塩は好ましい。
【００１７】
病理
本明細書中で意図されるとき、「原生動物寄生虫による感染に関連する病理」は直接的に又は間接的に原生動物寄生虫による感染の結果である障害、疾患又は症候群に関する。本発明にしたがう病理は好ましくは、それ自体寄生虫細胞接着から特に生じうる、寄生虫誘発アポトーシス、細胞活性化、詳細には内皮活性化、及び／又は内皮破壊から部分的に又は全体的に生じる。
【００１８】
好ましくは、上記原生動物寄生虫はＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐから成る群から選択される。詳細には、上記原生動物寄生虫はＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、及びＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅの如き、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ ｓｐｐから成る群から選択されうる。
【００１９】
上記病理は好ましくはマラリア、及びアフリカトリパノソーマ症（睡眠病）から成る群から選択される。
より好ましくは、上記病理は重篤なマラリア、大脳マラリア、多器官不全症候群、及び進行した段階のアフリカトリパノソーマ症から成る群から選択される。
【００２０】
抗寄生虫活性を有する化合物
本明細書中で意図されるとき、「抗寄生虫活性を有する化合物」は原生動物寄生虫による感染又はそれらの病理学的結果の治療の過程において使用されるどんな化合物にも関する。抗寄生虫活性を有する化合物は好ましくは感染した生物において寄生虫ロードを減少させるために使用される化合物に関する。
【００２１】
Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは寄生虫疾患における補助治療として有用である。そのように、Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターの及び抗寄生虫活性を有する化合物の関連は、それは寄生虫細胞接着により誘発される細胞活性化、詳細には内皮活性化、内皮破壊、及びアポトーシスの如き寄生虫感染の結果を予防する及び／又は治療する一方で寄生虫自体を破壊するので、本発明の枠組内で有益である。
【００２２】
好ましくは、抗寄生虫活性を有する上記化合物は抗マラリア活性を有する化合物である。
好ましくは、抗マラリア活性を有する上記化合物はキニン（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、キニヂン（Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ）、キニン−ドキシサイクリン（Ｑｕｉｎｉｎｅ−ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アルテメテール（Ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）、アルテモチル（Ａｒｔｅｍｏｔｉｌ）、アルテスネート（Ａｒｔｅｓｕｎａｔｅ）、アルテエーテル（Ａｒｔｅｅｔｈｅｒ）、メフロキン（Ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ）、アモヂアキン（Ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）、ヂヒドロアルテミシニン（Ｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｅ）、ピペラキン（Ｐｉｐｅｒａｑｕｉｎｅ）、ハロファントリン（Ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ）、アトヴァクオン（Ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）、クロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、ダプソン（Ｄａｐｓｏｎｅ）、ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎｅ）、ルメファントリン（Ｌｕｍｅｆａｎｔｈｒｉｎｅ）、プログアニル（Ｐｒｏｇｕａｎｉｌ）、ピリメタミン（Ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、ピロナリヂン（Ｐｙｒｏｎａｒｉｄｉｎｅ）、スルファドキシン（Ｓｕｌｆａｄｏｘｉｎｅ）、ヂアミヂン（Ｄｉａｍｉｄｉｎｅ）、フェロキン（Ｆｅｒｒｏｑｕｉｎｅ）、フルオロキノロン（Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）、フォスミドマイシン（Ｆｏｓｍｉｄｏｍｙｃｉｎｅ）、タフェノキン（Ｔａｆｅｎｏｑｕｉｎｅ）、及びトリオキサキン（Ｔｒｉｏｘａｑｕｉｎｅ）から成る群において選択される。
【００２３】
投与
本発明にしたがうＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、抗寄生虫活性を有する化合物、医薬、医薬組成物又は製品は経口、皮内、静脈内、筋内又は直腸内経路により投与されうる。
【００２４】
本発明にしたがうＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、抗寄生虫活性を有する化合物、医薬、医薬組成物又は製品は溶液、懸濁物、錠剤又はカプセルの形態で投与されうる。
【００２５】
「医薬として許容される担体」の選択は当業者によりルーチンで決定されうる。それは一般的に上記活性物質の溶解性及び化学特性にしたがって決定される。例えば、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウムの如き賦形剤及びステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルクの如き潤滑剤と混合されたデンプン、アルギン酸及びいくつかのケイ酸塩複合体の如き崩壊剤は錠剤を調製するために使用されうる。カプセルを調製するために、ラクトース及び高分子量ポリエチレングリコールを使用することは有益である。水性懸濁物が使用されるとき、それらは乳化剤又は懸濁を促進する剤を含みうる。スクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール及びクロロフォルム又はそれらの混合物の如き希釈剤もまた使用されうる。
【００２６】
本発明にしたがうＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、抗寄生虫活性を有する化合物、医薬、医薬組成物又は製品がその必要のある個体に投与されうる用量は当業者によりルーチンで決定されうる。詳細には、抗寄生虫活性を有する上記化合物はそれが本発明にしたがうＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターと関連して使用されないときと同じ用量で投与されうる。
例のために、ファスヂルは５０ｍｇ〜５００ｍｇ、詳細には８０ｍｇの単位用量で、５０ｍｇ／日〜５００ｍｇ／日の投与量で、詳細には２４０ｍｇ／日で投与されうる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は：（Ｅ）接触（黒色カラム）又は非接触（白色カラム）状態下でのコントロール内皮細胞；（ＲＢＣ）コントロール赤血球により接触された（黒色カラム）又は接触されない（白色カラム）内皮細胞；（３Ｄ７）３Ｄ７クローンに寄生された赤血球により接触された（黒色カラム）又は接触されない（白色カラム）内皮細胞；（Ｆ１２）Ｆ１２クローンに寄生された赤血球により接触された（黒色カラム）又は接触されない（白色カラム）内皮細胞からの内皮細胞抽出物についての活性化されたＲｈｏＡの細胞質濃度（［Ｒｈｏ−ＧＴＰ］、垂直軸、任意の単位）を示す。結果は［Ｒｈｏ−ＧＴＰ］を示す細胞抽出物の４９０ｎｍでの光学濃度の計測後に得られた。データは３の独立した実験の平均＋／−ＳＤを表す。**Ｐ＜０．０１。
【図２】図２は：（ＲｈｏＡ）Ｇ−ＬＩＳＡ（商標）キット中に提供される精製ＲｈｏＡタンパク質から成る陽性コントロール；（溶解緩衝液）Ｇ−ＬＩＳＡ（商標）細胞抽出緩衝液；（Ｅ）コントロール内皮細胞からの内皮細胞抽出物；（ＲＢＣ）コントロール赤血球により接触された内皮細胞からの内皮細胞抽出物；（ＲＢＣ＋ＨＦ２）コントロール赤血球により及び３７℃で２４時間３０μＭのファスヂルで接触された内皮細胞からの内皮細胞抽出物；（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球により接触された内皮細胞からの内皮細胞抽出物；（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２）寄生された赤血球により及び３７℃で２４時間３０μＭのファスヂルで接触された内皮細胞からの内皮細胞抽出物についての活性化されたＲｈｏＡの細胞質濃度（［Ｒｈｏ−ＧＴＰ］、垂直軸、任意の単位）を示す。結果は［Ｒｈｏ−ＧＴＰ］を示す細胞抽出物の４９０ｎｍでの光学濃度の計測後に得られた。データは３の独立した実験の平均＋／−ＳＤを表す。*Ｐ＜０．０５；**Ｐ＜０．０１。
【図３】図３はアポトーシス細胞により取り込まれるＡｐｏｐｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）紫色素の存在下での（パネルＡ）非暴露内皮細胞；（パネルＢ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞；（パネルＣ）寄生された赤血球に暴露された内皮細胞；（パネルＤ）寄生された赤血球に及び３０μＭのファスヂルに暴露された内皮細胞の逆相コントラスト顕微鏡写真を示す。矢印は紫色素の取り込みを示す。
【図４】図４は（Ｅ）非暴露内皮細胞、（ＲＢＣ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球に暴露され、及び０μＭ（黒色カラム）、１μＭ（灰色カラム）又は３０μＭ（水玉カラム）ファスヂルと共にインキュベートされた内皮細胞についての図３中に示される逆相コントラスト顕微鏡写真についての紫色素ピクセル数（Ａｐｏｐ％、垂直軸）を示す。ピクセル数はＡｄｏｂｅ（商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）を用いて決定された。データは３の独立した実験の代表的な範囲の４の写真からのピクセル数の平均＋／−ＳＤを表す。
【図５】図５は（Ｅ）非暴露内皮細胞、（ＲＢＣ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ｚ−ｖａｄ １０μＭ）寄生された赤血球に暴露された及び１０μＭの広範囲キャスパーゼ阻害剤ｚ−ｖａｄと共にインキュベートされた内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ｚ−ｖａｄ １００μＭ）寄生された赤血球に暴露された及び１００μＭのｚ−ｖａｄと共にインキュベートされた内皮細胞についての内皮の境界完全（６３０ｎｍのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅマーカーの光学濃度（ＯＤ）、垂直軸、×１０-3）を示す。データは３の独立した実験及びそれぞれの条件についての６の繰返しからの１０-3光学濃度値の平均＋／−ＳＤを表す。**Ｐ＜０．０１。
【図６】図６は（Ｅ）非暴露内皮細胞、（ＲＢＣ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ＨＦ１）寄生された赤血球に暴露された及び続いて１μＭのファスヂルで２０時間処理された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２）寄生された赤血球に暴露された及び続いて３０μＭのファスヂルで２０時間処理された内皮細胞についての内皮の境界完全（６３０ｎｍのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅマーカーの光学濃度（ＯＤ）、垂直軸、×１０-3）を示す。データは３の独立した実験及びそれぞれの条件当たり６の繰返しからの１０-3光学濃度値の平均＋／−ＳＤを表す。**Ｐ＜０．０１。
【図７】図７は（Ｅ）非暴露内皮細胞、（ＲＢＣ）コントロール赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ）寄生された赤血球に暴露された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２）寄生された赤血球に暴露された及び続いて３０μＭのファスヂルで２０時間処理された内皮細胞、（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２＋ＬＹ）寄生された赤血球に暴露された及び続いて３０μＭのファスヂル及び１５μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で２０時間処理された内皮細胞についての内皮の境界完全（６３０ｎｍのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅマーカーの光学濃度（ＯＤ）、垂直軸、×１０-3）を示す。データは３の独立した実験及びそれぞれの条件当たり３の繰返しからの１０-3光学濃度値の平均＋／−ＳＤを表す。**Ｐ＜０．０１。
【図８】図８は非暴露（コントロール）又は非感染赤血球（ＲＢＣ）、ＴＮＦα、寄生された赤血球（ｐＲＢＣ）及び寄生された赤血球＋３０μＭのファスヂル（ｐＲＢＣ＋ＨＦ２）に暴露された活性化ＨＬＥＣ（完全であり、部分的でない移動核ＮＦ−カッパーＢ Ｐ６５サブユニット染色を伴う細胞）の数がカウントされたことを示す。データは陽性核Ｐ６５細胞の％の平均＋／−ＳＤを示す。**Ｐ＜０．００５。
【実施例】
【００２８】
実施例
材料及び方法：
ヒト肺内皮細胞（ＨＬＥＣ）の培養
初代内皮細胞（ＨＬＥＣ）を以前に示されるように12酵素消化後にヒト肺から単離し、及び連続勾配及び免疫磁気精製技術を用いて選択した。１のバッチに由来する９代目から１２代目の内皮細胞を実験に使用した。使用前に、細胞を以前に示されるようにＩＣＡＭ−１、ＣＤ３６、Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ、ＶＣＡＭ−１、ＣＤ３１、Ｅ／Ｐ−セレクチン及びＣＳＡのそれらの発現について確認した。ＨＬＥＣを１０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長サプリメント（ＥＣＧＳ）（Ｕｐｓｔａｔｅ、Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ、ＮＹ）及び１０％のウシ胎児血清（Ｂｉｏｗｅｓｔ、Ｓｏｕｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ ｏｒｉｇｉｎ）で補充したＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、３７℃で５％ＣＯ2で、８のチャンバーｌａｂ−ｔｅｋ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｎａｐｅｒｖｉｌ， Ｉ１１）、６ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）又はＴｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔ ｓｕｐｐｏｒｔｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いて育てた。
【００２９】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ培養
Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ３Ｄ７14及びＦ１２9クローンを私たちの実験のために使用した。Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球（ｐＲＢＣｓ）を８．３ｇ．ｌ-1のＨｅｐｅｓ、２．１ｇ．ｌ-1のＮａＨＣＯ、０．１ｍｇ．ｍｌ-1のジェンタマイシン及び２ｇ．ｌ-1のデキストロース及び０．４％のＡｌｂｕｍａｘ ＩＩ（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で補充されたＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中の赤血球（ＲＢＣ）の懸濁物中でＴｒａｇｅｒ及びＪｅｎｓｅｎの技術にしたがって培養中で維持した13。上記３Ｄ７クローンは以前に示されるように14接着表現型について特徴づけられ、及びＩＣＡＭ−１及びＣＤ３６についてそれぞれ３０％及び４５％でＨＬＥＣに接着する。その派生型Ｆ１２クローンはその乏しい接着特性のために使用された9（最大で１ｐＲＢＣ／２０ ＨＬＥＣ、＞１ ｐＲＢＣ／ＨＬＥＣが通常観察される３Ｄ７クローンと比較して）。それぞれの実験について、寄生虫培養物をＰｌａｓｍａｇｅｌフローティングにより成熟形でリッチにした15。簡単に記述すると、赤血球を５〜１０％の寄生培養物で収穫し、及び２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞をＰｌａｓｍｉｏｎ（商標）（ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ ｋａｂｉ、Ｆｒａｎｃｅ）中に再懸濁し、及び３７℃で２５分間インキュベートした。成熟トロフォゾイト（栄養体）及びシゾント（栄養体から生じた娘個体）を含む上側画分をその後集め、及びＲＰＭＩ中で３回洗浄した。寄生された赤血球懸濁物をその後１％のヘマトクリット及び５０％の寄生虫血に合わせた。
【００３０】
試薬
凍結乾燥Ｒｈｏキナーゼ阻害剤ファスヂル（ＨＡ−１０７７）をＢｉａｆｆｉｎ（Ｋａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、及びＰＢＳ中で再構成した。ファスヂルを１μＭ（ＨＦ１）、３０μＭ（ＨＦ２）又は１００μＭ（ＨＦ３）で使用した。フォスファチヂルイノシトール３キナーゼ阻害剤ＬＹ２９４００２をＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから購入し、及び１５μＭでの使用前に１５ｍＭストック溶液でエタノール中に可溶化した（ＬＹ）。キャスパーゼの広範囲阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋをＳｉｇｍａから購入した。全ての試薬を−２０℃で貯蔵した。
【００３１】
内皮の境界完全の分析
事前に暴露されたｐＲＢＣｓ内皮細胞に対する処理の効果を計測するために、私たちは内皮単層をとおしたＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅ拡散に基づいた方法を開発した。簡単に記述すると、ＨＬＥＣをＴｒａｎｓｗｅｌｌ Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｓｕｐｐｏｒｔｓ（ポリエステル膜、３μｍポアサイズ、６．５ｍｍ直径、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＭ１９９培地中でコンフルエントになるまで育てた。３Ｄ７ Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍクローンの成熟形をその後培養物から収穫し、及び１％のヘマトクリット及び５０％の寄生虫血に合わせ、その後３７℃、５％ＣＯ2で４時間共−インキュベートした。ｐＲＢＣ暴露後、内皮細胞単層をファスヂル（１μＭ又は３０μＭ）で２０時間処理した。非感染赤血球との同様のインキュベーション又は内皮細胞単独をコントロールとしてとった。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ区画をその後ＲＰＭＩに基づく接着培地で３回洗浄した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓをＰＢＳで満たした新しいプレートに移した；０．５ｍｇ／ｍＬのＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）の溶液をその後上側区画に添加し、及び３７℃、５％ＣＯ2で５分間インキュベートした。下側区画を標準のマイクロタイタープレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（商標）ＥＬ３１１ＳＸ、Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ）を用いた拡散されたＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅの６３０ｎｍでの光学濃度分析のために最後に回収した。
【００３２】
定量的アポトーシス分析
内皮アポトーシスをＢｉｏｃｏｌｏｒ Ｌｔｄ．（Ｂｅｌｆａｓｔ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｉｒｅｌａｎｄ）から購入したＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）色素を用いて定量的に評価した。上記分析はアポトーシス細胞には選択的に組み込まれるが壊死細胞には組み込まれない赤紫色色素を使用する。上記色素の一方だけの取り込みはアポトーシスを経験する細胞の外側の膜のフォスファチヂルセリンをとおして起こる。内皮細胞をコンフルエントになるまで６ウェルプレート中で培養し、その後Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球に２４時間暴露した。ＨＬＥＣを共−インキュベーション時間が達成される前にＡｐｏｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ色素（１／２０）と共に１時間インキュベートし、及び注意深くＰＢＳで３回洗浄した。アポトーシスをその後Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＡＤＰ）により定量した：それぞれの実験について、細胞培養物のそれぞれのウェルの４の代表的な範囲をデジタルカメラとカップリングした逆相コントラスト顕微鏡を用いて写真に撮った。イメージをその後コンピューターに移し、及びアポトーシスの値をＡｄｏｂｅ（商標）Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（商標）によりカウントされる赤色ピクセル数として表した。
【００３３】
ＲｈｏＡ／Ｒｈｏキナーゼ経路活性化分析
ＲｈｏＡ及びその下流のエフェクターＲｈｏキナーゼの活性をＣｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）から購入したＧ−ＬＩＳＡ（商標）ＲｈｏＡ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｋｉｔを用いて評価した。上記分析の原理はＲｈｏ−ＧＴＰ結合タンパク質コーティングされた９６ウェルプレート及び免疫試薬での最終的な検出で培養細胞から抽出された活性ＧＴＰ結合ＲｈｏＡの量を決定することである。簡単に記述すると、ＨＬＥＣを製造業者により推奨されるように５０〜７０％コンフルエントになるまで６ウェルプレート中で培養し、及び１％のヘマトクリット及び５０％の寄生虫血でＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球又は非感染赤血球に暴露した。使用されるとき、ファスヂルを３０μＭで寄生虫と付随して添加した。２４時間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、及びプロテアーゼ阻害剤を含むリン酸緩衝塩水中に氷冷溶解した。細胞溶解物をその後タンパク質濃度の計測前に４℃、１０，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離により不純物除去した。細胞抽出物を溶解緩衝液で等しくして同一のタンパク質濃度を与え、Ｒｈｏ−ＧＴＰアフィニティプレート中で４℃で３０分間インキュベートした。Ｇ−ＬＩＳＡ（商標）キット中に提供される抗体検出試薬（第一抗ＲｈｏＡ抗体、第二抗体、ＨＲＰ検出試薬）を添加し、及びシグナルをルミノメトリー分析（４９０ｎｍ）で発展した。接触なし分析において、ＨＬＥＣをＴｒａｎｓｗｅｌｌ（０．４μＭポアのポリエステル膜）（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の下側区画中でコンフルエントになるまでサブ培養した。ｐＲＢＣ及びコントロールＲＢＣをその後上側区画に添加し、及び３７℃で２４時間インキュベートし、その後上記に示されるようにＧ−ＬＩＳＡ（商標）試験を行った。
【００３４】
統計分析
それぞれの実験を独立に３回行い、及びそれぞれの共−培養条件から回収したデータを平均±ＳＤとして表す。結果を一方向ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ多比較試験を用いて統計的有意差について分析した。ｐ＜０．０５の値は有意と考えられた。
【００３５】
実施例１
ファスヂルはヒト内皮細胞においてＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ接触により誘発されるＲｈｏＡ／Ｒｈｏ−キナーゼ経路活性化を妨げうる
本発明者はＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが内皮細胞においてＲｈｏＡ／Ｒｈｏ−キナーゼ経路を誘発することができることをはじめて確立した。
簡単に記述すると、Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ感染赤血球（ｐＲＢＣ）又は非感染赤血球（ＲＢＣ）と共に２４時間共−インキュベートされたＨＬＥＣにおけるＲｈｏＡ活性を材料及び方法の節において示されるようにＧ−ＬＩＳＡ（商標）ＲｈｏＡ活性化キット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ， Ｄｅｎｖｅｒ ＣＯ）を用いて計測した。
図１中に見られるように、感染した赤血球と共に２４時間共−インキュベートされたＨＬＥＣは非感染赤血球に暴露されたＨＬＥＣ（ｐ＜０．０１）又は非暴露ＨＬＥＣ（ｐ＜０．０１）に比較して細胞活性化ＲｈｏＡ濃度における顕著な増大を示した。
さらに、本発明者は、ＨＬＥＣ及び感染した赤血球（ｐＲＢＣ）の間の物理的接触がＲｈｏＡ活性に必要とされることを示した。
【００３６】
簡単に記述すると、ＨＬＥＣを細胞接着を避けるために「接触なし」分析におけるｐＲＢＣ又はコントロールＲＢＣと共にトランスウェルにおいて共−インキュベートした（材料及び方法の節）。この状態において、区画は赤血球が内皮細胞に接着することを妨げるが巨大分子及び培地の通過を妨げない多孔性膜（０．４μｍポア）により分離された。接触なし分析におけるｐＲＢＣとの共−インキュベーションは基底値と同様の活性化ＲｈｏＡ濃度を示した。
これはｐＲＢＣｓを調製するためにＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ３Ｄ７クローンの代わりに細胞接着性のないＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｆ１２クローンを用いてさらに確認された。Ｆ１２はＲｈｏＡ／Ｒｈｏ−キナーゼ経路を誘発することができなかった。
本発明者はその後、２４時間のｐＲＢＣ接触共−インキュベーションにおける３０μＭの既知のＲｈｏＡ／Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤、ファスヂルはｐＲＢＣのみ（ｐ＜０．０５）に比較して活性化ＲｈｏＡ濃度における顕著な減少を誘発する傾向があることを示した（図２）。
【００３７】
実施例２
Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤ファスヂルはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮細胞アポトーシスを減少させる
本発明者はそれから、ファスヂルはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発アポトーシスから内皮細胞を保護する傾向があることを示した。
簡単に記述すると、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＡＤＰ）を用いてアポトーシスＨＬＥＣによる赤紫色素の放出を定量的に評価することにより、ＡＰＯＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ（商標）を誘発されたアポトーシス及びｐＲＢＣ／ＨＬＥＣ共−インキュベーション中の細胞生存に対するファスヂルの効果を定量するための手段として使用した。ＨＬＥＣは暴露されなかった（図３、パネルＡ）、ＲＢＣと共に共−インキュベートされた（図３、パネルＢ）又はｐＲＢＣのみと共に（図３、パネルＣ）、１μＭのファスヂルと共に（図３、パネルＤ）又は３０μＭのファスヂルと共に（図４）共−インキュベートされた。
【００３８】
したがって、本発明者は、ｐＲＢＣはＲＢＣに比較されるときＨＬＥＣアポトーシスを誘発することができることを観察した（９．５倍）。しかしながら、細胞が１μＭのファスヂルで処理されるとき、非処理細胞と比較してｐＲＢＣ暴露ＨＬＥＣのアポトーシスにおける減少が観察される（１．４倍減少）。アポトーシスにおけるこの減少は細胞がより高い濃度のファスヂル（３０μＭ）で処理されるとき増強される（４．１倍減少）。
【００３９】
実施例３
Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤でのＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮浸透性の復帰
本発明者は、Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍは、おそらく細胞アポトーシスのために、境界完全の喪失を導く内皮浸透性に対する強烈な効果を有しうることを示した。
簡単に記述すると、内皮境界機能に対するＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ細胞接着効果をコンフルエントになるまでＴｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓにおいてＨＬＥＣを培養し、その後上記のようにｐＲＢＣの成熟形にそれらを４時間暴露することにより評価した。下側区画において回収されたＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅの量はコントロールＲＢＣ／ＨＬＥＣ（ｐ＜０．０１）又は非暴露内皮細胞条件（ｐ＜０．０１）におけるよりｐＲＢＣ／ＨＬＥＣ共−インキュベーション条件において顕著に高かった。それらのコントロールにおいて回収されたＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅは同等の値のままであり、及びＲＢＣ共−インキュベーションの場合において観察されたわずかな増大は顕著でない。さらに、ｐＲＢＣ／ＨＬＥＣ共−インキュベーション条件における下側区画中のＥｖａｎｓ Ｂｌｕｅの量は広範囲キャスパーゼ阻害剤ｚ−ｖａｄの存在下で顕著に減少された（図５）。したがって、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅの通過は比較的妨げられ、アポトーシス阻害をとおした単層浸透性の改善を反映した。
【００４０】
本発明者はそれから、ファスヂルはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮浸透性を妨げうることを示した。
簡単に記述すると、ＨＬＥＣをコンフルエントになるまでＴｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｓｅｒｔｓにおいて培養した。得られた細胞単層をその後ｐＲＢＣ接着に４時間暴露し、続いて１μＭ又は３０μＭのファスヂルで（図６）及び／又は１５μＭのＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２で（図７）２０時間処理した。内皮境界完全を上記に示されるように評価した。
【００４１】
上記インキュベーションをＨＬＥＣ、ｐＲＢＣ及び３０μＭのファスヂルと共に行ったとき、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅマーカーの量はインキュベーションがＨＬＥＣ及びｐＲＢＣと共に行われたとき（ｐ＜０．０１）より顕著に低いことがわかった（図６）。そのうえ、ファスヂルの効果はＬＹ２９４００２により逆転されることができ、そのことはファスヂルの効果は少なくとも部分的にはＲｈｏキナーゼ阻害に続いて起こるＰＩ３Ｋ活性化に由来することを示す（図７）。
【００４２】
実施例４
Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発ＮＦ−カッパーＢ内皮活性化に対するファスヂルの効果
内皮活性化はＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍマラリア急性相の重篤さにおいて重要な役割を果たすと考えられている18。Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ細胞接着はＮＦ−カッパーＢ転写因子を暗示するシグナルカスケードを介して前炎症性内皮応答を誘発することが知られる19,20。それらの刺激に際して、ＮＦ−カッパーＢは特定の残基上でリン酸化され、活性化された状態になり、及び核へ移行する。
本発明者はそれゆえ、ファスヂルがまたＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮活性化を調節しうるかどうかを試験した。
【００４３】
簡単に記述すると、ＨＬＥＣを８チャンバーＬａｂｔｅｋプレート中で培養し、及び１％のヘマトクリット及び５０％の寄生虫血でｐＲＢＣに６時間暴露した。Ｒｈｏ−キナーゼ阻害剤ファスヂルを３０μＭでｐＲＢＣと同時に添加した。２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαをＮＦ−カッパーＢ核移行の陽性コントロールとして使用した。細胞をその後固定し、及び第一抗ＮＦ−カッパーＢ Ｐ６５サブユニット抗体及び第二ＦＩＴＣ−抗マウスＩｇＧ抗体での免疫染色に浸透させた。核をヂアミヂノ−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。ＮＦ−カッパーＢ Ｐ６５サブユニットの免疫染色後、結果を蛍光顕微鏡により分析し、及びそれぞれの条件（ｎ＝４）当たりの活性化されたＨＬＥＣ（完全であり、部分的でない核移行Ｐ６５染色を有する細胞）の数をカウントした（図８）。
【００４４】
結果は、ファスヂルはＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発ＮＦ−カッパーＢ核移行の阻害により示されるようにＰ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ誘発内皮活性化を顕著に減少させることを示す。
【００４５】
引用文献
【化４】
【化５】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
原生動物寄生虫による感染に関連する病理の予防及び／又は治療のために意図される医薬の製造のためのＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターの使用。
【請求項２】
上記原生動物寄生虫はＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．から成る群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記病理はマラリア及びアフリカトリパノソーマ症（睡眠病）から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
上記病理は重篤なマラリア、大脳マラリア、多器官不全症候群、及びアフリカトリパノソーマ症の進行した段階から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターはＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫＩ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは以下の式の化合物：
【化１】
【化２】
【化３】
又はその医薬として許容される塩から成る群から選択されるＲＯＣＫＩである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは以下の式の化合物：
【化４】
又はその医薬として許容される塩から成る群から選択されるＲＯＣＫＩである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
上記医薬は抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
抗寄生虫活性を有する上記化合物は抗マラリア活性を有する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
抗マラリア活性を有する上記化合物はキニン（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、キニヂン（Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ）、キニン−ドキシサイクリン（Ｑｕｉｎｉｎｅ−ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アルテメテール（Ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）、アルテモチル（Ａｒｔｅｍｏｔｉｌ）、アルテスネート（Ａｒｔｅｓｕｎａｔｅ）、アルテエーテル（Ａｒｔｅｅｔｈｅｒ）、メフロキン（Ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ）、アモヂアキン（Ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）、ヂヒドロアルテミシニン（Ｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｅ）、ピペラキン（Ｐｉｐｅｒａｑｕｉｎｅ）、ハロファントリン（Ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ）、アトヴァクオン（Ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）、クロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、ダプソン（Ｄａｐｓｏｎｅ）、ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎｅ）、ルメファントリン（Ｌｕｍｅｆａｎｔｈｒｉｎｅ）、プログアニル（Ｐｒｏｇｕａｎｉｌ）、ピリメタミン（Ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、ピロナリヂン（Ｐｙｒｏｎａｒｉｄｉｎｅ）、スルファドキシン（Ｓｕｌｆａｄｏｘｉｎｅ）、ヂアミヂン（Ｄｉａｍｉｄｉｎｅ）、フェロキン（Ｆｅｒｒｏｑｕｉｎｅ）、フルオロキノロン（Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）、フォスミドマイシン（Ｆｏｓｍｉｄｏｍｙｃｉｎｅ）、タフェノキン（Ｔａｆｅｎｏｑｕｉｎｅ）、及びトリオキサキン（Ｔｒｉｏｘａｑｕｉｎｅ）から成る群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
医薬として許容される担体と共に、活性物質として：
−請求項１及び５〜７のいずれかにおいて定義される少なくとも１のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、及び
−請求項８〜１０のいずれかにおいて定義される抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物
を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかにおいて定義される病理の予防及び／又は治療のための同時の、別々の又は連続の使用のための混合調製物として：
−請求項１及び５〜７のいずれかにおいて定義される少なくとも１のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、及び
−請求項８〜１０のいずれかにおいて定義される抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物
を含む製品。
【請求項１】
原生動物寄生虫による感染に関連する病理の予防及び／又は治療のために意図される医薬の製造のためのＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターの使用。
【請求項２】
上記原生動物寄生虫はＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．及びＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｓｐｐ．から成る群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記病理はマラリア及びアフリカトリパノソーマ症（睡眠病）から成る群から選択される、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
上記病理は重篤なマラリア、大脳マラリア、多器官不全症候群、及びアフリカトリパノソーマ症の進行した段階から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターはＲｈｏキナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫＩ）である、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは以下の式の化合物：
【化１】
【化２】
【化３】
又はその医薬として許容される塩から成る群から選択されるＲＯＣＫＩである、請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
上記Ｒｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーターは以下の式の化合物：
【化４】
又はその医薬として許容される塩から成る群から選択されるＲＯＣＫＩである、請求項１〜６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
上記医薬は抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
抗寄生虫活性を有する上記化合物は抗マラリア活性を有する、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
抗マラリア活性を有する上記化合物はキニン（Ｑｕｉｎｉｎｅ）、キニヂン（Ｑｕｉｎｉｄｉｎｅ）、キニン−ドキシサイクリン（Ｑｕｉｎｉｎｅ−ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、アルテメテール（Ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）、アルテモチル（Ａｒｔｅｍｏｔｉｌ）、アルテスネート（Ａｒｔｅｓｕｎａｔｅ）、アルテエーテル（Ａｒｔｅｅｔｈｅｒ）、メフロキン（Ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ）、アモヂアキン（Ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ）、ヂヒドロアルテミシニン（Ｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｅ）、ピペラキン（Ｐｉｐｅｒａｑｕｉｎｅ）、ハロファントリン（Ｈａｌｏｆａｎｔｒｉｎｅ）、アトヴァクオン（Ａｔｏｖａｑｕｏｎｅ）、クロロキン（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）、ダプソン（Ｄａｐｓｏｎｅ）、ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、サイクリン（Ｃｙｃｌｉｎｅ）、ルメファントリン（Ｌｕｍｅｆａｎｔｈｒｉｎｅ）、プログアニル（Ｐｒｏｇｕａｎｉｌ）、ピリメタミン（Ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、ピロナリヂン（Ｐｙｒｏｎａｒｉｄｉｎｅ）、スルファドキシン（Ｓｕｌｆａｄｏｘｉｎｅ）、ヂアミヂン（Ｄｉａｍｉｄｉｎｅ）、フェロキン（Ｆｅｒｒｏｑｕｉｎｅ）、フルオロキノロン（Ｆｌｕｏｒｏｑｕｉｎｏｌｏｎｅ）、フォスミドマイシン（Ｆｏｓｍｉｄｏｍｙｃｉｎｅ）、タフェノキン（Ｔａｆｅｎｏｑｕｉｎｅ）、及びトリオキサキン（Ｔｒｉｏｘａｑｕｉｎｅ）から成る群から選択される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
医薬として許容される担体と共に、活性物質として：
−請求項１及び５〜７のいずれかにおいて定義される少なくとも１のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、及び
−請求項８〜１０のいずれかにおいて定義される抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物
を含む医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかにおいて定義される病理の予防及び／又は治療のための同時の、別々の又は連続の使用のための混合調製物として：
−請求項１及び５〜７のいずれかにおいて定義される少なくとも１のＲｈｏ／ＲＯＣＫ／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路モヂュレーター、及び
−請求項８〜１０のいずれかにおいて定義される抗寄生虫活性を有する少なくとも１の化合物
を含む製品。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００９−５４５５４４（Ｐ２００９−５４５５４４Ａ）
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２２１７７（Ｐ２００９−５２２１７７）
【出願日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００６８５７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１５００１
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５０４３１７７４３）ユニベルシテ ピエール エ マリー キュリー（パリ シズエム） (18)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００６８５７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１５００１
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５０４３１７７４３）ユニベルシテ ピエール エ マリー キュリー（パリ シズエム） (18)
【Ｆターム（参考）】
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