Ｎｒｆ２活性化剤
【課題】Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる化合物及び組成物の提供。
【解決手段】ブナハリタケ由来の化合物を含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物が提供される。具体的に例示すると次の化合物が挙げられる。４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン、５−ヒドロキシ−３，４，５−トリメチル−５−Ｈ−フラン−２−オン、酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル、（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸。
【解決手段】ブナハリタケ由来の化合物を含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物が提供される。具体的に例示すると次の化合物が挙げられる。４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン、５−ヒドロキシ−３，４，５−トリメチル−５−Ｈ−フラン−２−オン、酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル、（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブナハリタケ由来の天然化合物を含んでなる、Ｎｒｆ２活性化剤およびＮｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスが老化を促進させるという考えは、１９５６年にＤｅｎｈａｍ ＨａｒｍａｎによってＴｈｅ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇとして提唱されたもので、高齢化社会を迎えた近年再認識されている（Harman D., J., Gerontol. 11, 298-300 (1956)）。この説は、酸素呼吸を行う中で発生した生体内の活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ））による組織細胞障害が老化を引き起こすというものである。近年、ＲＯＳの発生系とその消去系の研究が進展し、ＲＯＳが細胞障害ばかりでなく、細胞内情報伝達も含めた細胞機能の制御に関連しており、その制御機能の破綻が老化を促進するという研究が進んでいる。
【０００３】
ＲＯＳとは不対電子を配したフリーラジカルを持つ酸素のことである。生体内で発生するＲＯＳとしては、スーパーオキシド（Ｏ２−）、ハイドロキシラジカル（ＨＯ−）、ハイドロゲンペルオキシド（Ｈ２Ｏ２）、やパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）などが挙げられる（Shimosawa T., Nippon Rinsho. 2005 Jun;63(6):994-9.）。ＲＯＳは、生理的にはミトコンドリアなどの細胞内小器官や、細胞膜、細胞質などで産生され、酸化ストレスとしてタンパク質、脂質、核酸などを酸化修飾する。その結果、例えば、タンパク質は酸化修飾されることにより、変性や酵素の不活性化を引き起こし、核酸の酸化はＤＮＡの翻訳障害や分解を引き起こす。これらの酸化修飾された生体構成成分の蓄積が細胞組織での障害を引き起こし、ひいては老化、発ガン等の数々の疾病の促進に繋がる。従って、酸化ストレスからの防御能を高めることは、これらの疾病の予防や進行の遅延に有効である（Ferrari CK et al., Biomed Pharmacother. 2003 Jul-Aug;57(5-6):251-60 吉川敏一ら 先端医学社刊 「抗酸化物質のすべて」（１９９８））。
【０００４】
また、近年、環境汚染物質などの本来生体にない様々な化合物（生体異物）が増加し、人体に影響を与えるようになってきた。これらの生体異物は通常、体内に吸収されると、生体異物代謝系酵素群による代謝（解毒）を受けて排出される。しかし、その代謝活性が悪くなると、生体異物（特に、人体に影響を及ぼすもの）が人体に蓄積され、親電子性物質への代謝や肝機能の低下等が引き起こされ、ひいては発ガン、呼吸器疾患、肝機能障害等の数々な疾患に繋がる。（Panuganti SD et al., J Pharmacol Exp Ther. 2006 Jul;318(1):26-34. Epub 2006 Mar 28. Miller JA et al., Cancer Res. 1970 Mar;30(3):559-76 Kohle C et al., Biochem Pharmacol. 2006 Sep 28;72(7):795-805. Epub 2006 Apr 29）。従って、生体異物の解毒能を高めることは、これらの疾病の予防や進行の遅延に有効である。
【０００５】
近年、第二相酵素と呼ばれる一連のタンパク質群が、生体の酸化ストレスからの防御や生体異物の解毒を連携して担っていることが明らかとなってきた。第二相酵素としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素１（ＮＱＯ１）、グルタミルシステインリガーゼ（ＧＣＬ）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ１）、チオレドキシン還元酵素１（ＴＸＮＲＤ１）等が知られている。例えば、ＧＳＴは生体内でグルタチオンと生体異物化合物との複合体の生成を触媒し、親電子性化学物質に対する防御に働く。また、ＮＱＯ１はキノンの２電子還元反応に関与し、キノンの１電子還元に伴って生ずる酸化障害を回避することができる。さらに、ＴＸＮＲＤ１はチオレドキシンの酸化型から還元型への転換を司る酵素であり、還元型チオレドキシンはチオール基を介してＲＯＳ消去や細胞内レドックス制御に関わる。（吉川敏一ら 先端医学社刊 「抗酸化物質のすべて」（１９９８）、井上正康ら 医薬ジャーナル社刊 「レドックス制御と抗酸化治療戦略」）。これら第二相酵素の遺伝子のプロモーターには、抗酸化応答配列（Antioxidant responsive element（ＡＲＥ））と呼ばれる共通の配列が存在し、転写因子NF-E2 related factor 2（Ｎｒｆ２）によってその発現が誘導されることが解明されつつある（Nguyen T et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43:233-60 (2003)、Itoh K et al., Free Radic Biol Med. 2004 May 15;36(10):1208-13）。
【０００６】
Ｎｒｆ２は、非ストレス条件下ではＫｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体として細胞質に局在し、そこに親電子性物質、活性酸素、重金属などの活性化物質が作用すると核内へ移行し、small mafとヘテロ二量体を形成してＡＲＥに結合し、第二相酵素の発現を誘導する（Itoh K et al., Seikagaku. 2006 Feb;78(2):79-92）。
【０００７】
実際、Ｎｒｆ２を欠損したマウス個体や細胞では酸化ストレスや発がん物質への耐性が低くなることが報告されている（Ramos-Gomez M et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Mar 13;98(6):3410-5, Ishii T et al., J Biol Chem. 2000 May 26;275(21):16023-9）。
【０００８】
このように、転写因子Ｎｒｆ２を活性化し、Ｎｒｆ２によって制御されている第二相酵素群の活性を高めることにより、酸化ストレスに対する防御機能を高めて酸化ストレスに起因する各種疾患を治療することができ、また生体異物解毒系を亢進し生体異物が引き起こす発ガンなどのリスクを減らすことができる。従って、転写因子Ｎｒｆ２を活性化することができ、かつ生体にとって安全性の高い医薬品または食品の開発が強く望まれている。
【０００９】
Ｎｒｆ２の活性化物質としては、アブラナ科の野菜に多く含まれるイソチオシアネート系化合物（中でも特にスルフォラファン）が有名である（Zhang Y et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 15;89(6):2399-403）。他のＮｒｆ２の活性化物質としては、１５−デオキシ−Ｄ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄＰＧＪ２）（Itoh T et al., Mol Cell Biol. 2004 Jan;24(1):36-45）、ホップに含まれるキサントフモール（Dietz BM et al., Chem Res Toxicol. 2005 Aug;18(8):1296-305）、ショウガに含まれるショウガオール類縁化合物（特開２００６−１８８４４４号公報）、茶に含まれるエピガロカテキンガレート（Chen C et al., Arch Pharm Res. 2000 Dec;23(6):605-12）などが知られている。
【００１０】
ところで、ブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii） は、９―１１月上旬にブナやミズナラの倒木に群生する白色腐朽菌である。本キノコは、傘の直径は３〜１０ｃｍ、半円形で白色、後に黄色味を帯び、裏面は白く針状で、表面同様、後に黄色味を帯び、肉は白くて軟らかく吸水性があり、独特の香気と呈味を持つことが知られ、食用として珍重されている。主に、東北地方で食されており、別名カミハリタケとも称されている。人工栽培方法としては、これまでに特開２００６−６１６４号公報や特開２００４−３５０５８９号公報等で報告されている。ブナハリタケの持つ生理作用としてこれまでに、糖尿病の予防・改善作用（特許文献１）、抗腫瘍作用（特許文献２）、脳機能改善作用（特許文献３）、血圧降下作用（特許文献４）、血栓溶解作用（特許文献５）などが報告されている。しかしながら、ブナハリタケがＮｒｆ２活性化作用を有すること、ひいては第二相酵素群を誘導し、酸化ストレスからの防御系や生体異物の解毒系を亢進させることについてはこれまで報告されていない。また、これまでに、（Ｅ）−２−デセン−二酸（化合物６）のロイヤルゼリーの成分としての知見（特開昭４８−８７２３号公報）、２−フェニル−５，６−ジヒドロ−γ−ピロン（化合物１０）のキノコフレーバーとしての知見（特許第２９４８８７０号公報）、２−（２−ホルミルピロール−１−イル）−４−メチル吉草酸（化合物１１）のタバコ葉成分としての知見（特開昭５１−１２３８９９号公報）が報告されているが、これらの化合物がＮｒｆ２活性化能を有することは報告されていない。
【特許文献１】特開２００２−１８７８５１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８７８５０号公報
【特許文献３】特開２００２−０８０３９０号公報
【特許文献４】特開２００２−０２９９９５号公報
【特許文献５】特開２００６−１３１５５０号公報
【発明の概要】
【００１１】
本発明者は、ブナハリタケ酢酸エチル画分から精製された化合物がＮｒｆ２活性化作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１２】
本発明は、Ｎｒｆ２の活性化に有用な新規化合物およびＮｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物の提供を目的とする。
【００１３】
本発明によれば、式（Ｉ）で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物（以下、「本発明による新規化合物」という）が提供される：
【化１】
［上記式中、
Ｒ１は、酸素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ３は、水素原子、水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、またはＣ１−４アルキル基、Ｃ１−４アシル基、カルボキシル基、およびＣ１−４アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニルオキシＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ４は、水素原子またはカルボキシルＣ１−６アルキル基を表し、
- -は、単結合または二重結合を表し、
但し、Ｒ１が酸素原子である場合は- - -は二重結合であり、Ｒ１がＣ１−６アルキル基である場合は- - -は単結合である。］。
【００１４】
本発明によれば、前記式（Ｉ）、あるいは下記式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩＩ）で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物（以下、「本発明によるＮｒｆ２活性化化合物」という）を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物が提供される。
【００１５】
式（ＩＩ）の化合物：
【化２】
［上記式中、
Ｒ１０１は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０２は、水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルカルボニル基；Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アシル基、カルボキシル基、およびＣ１−４アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニルオキシＣ１−６アルキル基；またはフェニル基を表し、Ｒ１０３は、水素原子、水酸基、またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０４は、水素原子、水酸基、またはＣ１−６アルキル基を表し、
- - -は、単結合または二重結合を表す。］。
【００１６】
式（ＩＩＩ）の化合物：
【化３】
［上記式中、
Ｒ１０５は、Ｃ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０６は、カルボキシルＣ１−６アルキル基を表す。］。
【００１７】
式（ＩＶ）の化合物：
【化４】
［上記式中、
ｍは、３から９の整数を表す。］。
【００１８】
式（Ｖ）の化合物：
【化５】
［上記式中、
Ｒ１０７は、１以上の水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基を表す。］。
【００１９】
式（ＶＩ）の化合物：
【化６】
［上記式中、
Ｈｅｔは、異種の環員原子として１つの酸素原子を有する５〜６員の飽和または不飽和複素環式基を表す。］。
式（ＶＩａ）の化合物：
【化７】
［上記式中、
Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚのうち、いずれか１つが酸素原子を表し、それ以外が−ＣＨ２−、＞ＣＨ−、−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−を表す（但し、Ｗが酸素原子である場合は、Ｘ、Ｙ、およびＺが、−ＣＨ２−または＞ＣＨ−であり、Ｚが酸素原子である場合は、Ｗ、Ｘ、およびＹが、−ＣＨ２−または＞ＣＨ−であり、Ｘが酸素原子である場合は、Ｗが−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−、または＞ＣＨ−であり、Ｙが酸素原子である場合は、Ｚが−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−、または＞ＣＨ−である）。］。
【００２０】
式（ＶＩＩ）の化合物：
【化８】
［上記式中、
Ｒ１０８は、Ｃ１−６アルキル基を表す。］
【００２１】
本発明によれば、ブナハリタケ子実体の抽出物（以下、「本発明による抽出物」という）を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物が提供される（以下、これらの組成物を併せて「本発明による組成物」ということがある）。
【００２２】
本発明によれば、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の製造方法であって、本発明による抽出物を精製し、得られた画分についてＮｒｆ２活性化能を測定する工程を含んでなる、方法が提供される。
【００２３】
本発明による新規化合物、Ｎｒｆ２活性化化合物、および抽出物は、古来より食してきたブナハリタケから得られるものである。従って、本発明による新規化合物、Ｎｒｆ２活性化化合物、および抽出物は、安全性が高いＮｒｆ２活性化剤として用いることができる点で有利である。
【発明の具体的な説明】
【００２４】
新規化合物
本願明細書において、基または基の一部としての「アルキル」、「アルコキシ」、および「アシル」という語は、基が直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルコキシ基、およびアシル基を意味する。
Ｃ１−６アルキルは、好ましくは、Ｃ１−４アルキルである。Ｃ１−４アルキルは、好ましくは、Ｃ１−２アルキルである。
Ｃ１−４アルコキシは、好ましくは、Ｃ１−２アルコキシである。
Ｃ１−４アシルは、好ましくは、Ｃ１−２アシルである。
Ｃ１−６アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、ｉ−ブチル、ｓ‐ブチル、ｔ‐ブチル、ｎ‐ペンチル、ｎ‐ヘキシルが挙げられる。
Ｃ１−４アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ‐ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓ‐ブトキシ、ｔ−ブトキシが挙げられる。
Ｃ１−４アシルの例としては、ホルミル、アセチル、プロピオニリル、ブチリル、イソブチリルが挙げられる。
本明細書において「により置換されていてもよいアルキル」とは、アルキル上の１またはそれ以上の水素原子が１またはそれ以上の置換基（同一または異なっていてもよい）により置換されたアルキルおよび非置換アルキルを意味する。置換基の最大数はアルキル上の置換可能な水素原子の数に依存して決定できることは当業者に明らかであろう。これらはアルキル以外の置換基を有する基についても同様である。
本発明による新規化合物は、前記式（Ｉ）で表される。
【００２５】
式（Ｉ）において、Ｒ１は、好ましくは、酸素原子またはエチル基である。
【００２６】
式（Ｉ）において、Ｒ２は、好ましくは、水素原子またはメチル基である。
【００２７】
式（Ｉ）において、Ｒ３は、好ましくは、水素原子、水酸基で置換されていてもよいエチル基、またはメチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基である。
【００２８】
式（Ｉ）において、Ｒ４は、好ましくは、水素原子またはカルボキシルメチル基である。
【００２９】
本発明による新規化合物の好ましい態様としては、Ｒ１が、酸素原子またはエチル基であり、Ｒ２が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ３が、水素原子、水酸基で置換されていてもよいエチル基、またはメチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基であり、Ｒ４が、水素原子またはカルボキシルメチル基である、式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
【００３０】
本発明において、式（Ｉ）で表される化合物の好適な例としては、４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン（化合物２）、酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル（化合物４）、および（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸（化合物５）が挙げられる。
【００３１】
本発明による新規化合物は、公知の方法に従って、エゾハリタケ科ブナハリタケ属に属するブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）子実体から抽出し、精製することにより製造することができる。
【００３２】
Ｎｒｆ２活性化化合物
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＩＩ）で表すことができる。
【００３３】
式（ＩＩ）において、Ｒ１０１は、好ましくは、水素原子またはメチル基である。さらに好ましくは、Ｒ１０１は、水素原子である。
【００３４】
式（ＩＩ）において、Ｒ１０２は、好ましくは、メチル基、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、メチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基、またはフェニル基である。さらに好ましくは、Ｒ１０２は、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、またはフェニル基である。さらにより好ましくは、Ｒ１０２は、フェニル基である。
【００３５】
式（ＩＩ）において、Ｒ１０３は、好ましくは、水素原子、水酸基、またはメチル基である。さらに好ましくは、Ｒ１０３は水素原子である。
【００３６】
式（ＩＩ）において、Ｒ１０４は、好ましくは、水素原子、水酸基、またはメチル基である。さらに好ましくは、Ｒ１０４は水素原子である。
【００３７】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｒ１０１が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ１０２が、メチル基、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、メチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基、またはフェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子、水酸基、またはメチル基であり、Ｒ１０４が、水素原子、水酸基、またはメチル基である、式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００３８】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物のさらに好ましい態様としては、Ｒ１０１が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ１０２が、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、またはフェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子であり、Ｒ１０４が、水素原子である、式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００３９】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物のさらにより好ましい態様としては、Ｒ１０１は、水素原子であり、Ｒ１０２は、フェニル基であり、Ｒ１０３は、水素原子であり、Ｒ１０４は、水素原子である、式（ＩＩ）で表される化合物（化合物９）が挙げられる。
【００４０】
本発明において、式（ＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、４−アセチル−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン（化合物１）、４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン（化合物２）、５−ヒドロキシ−３，４，５−トリメチル−５−Ｈ−フラン−２−オン（化合物３）、酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル（化合物４）、ジヒドロ−４−フェニル−２（３Ｈ）−フラノン（化合物９）が挙げられる。
【００４１】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＩＩＩ）で表すことができる。
【００４２】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１０５は、好ましくは、エチル基である。
【００４３】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１０６は、好ましくは、カルボキシルメチル基である。
【００４４】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｒ１０５が、エチル基であり、Ｒ１０６が、カルボキシルメチル基である、式（ＩＩＩ）で表される化合物（化合物５）が挙げられる。
【００４５】
本発明において、式（ＩＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸（化合物５）が挙げられる。
【００４６】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＩＶ）で表すことができる。
【００４７】
式（ＩＶ）において、ｍは、好ましくは、５から７の整数である。さらに好ましくは、ｍは６である。
【００４８】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、ｍが６である、式（ＩＶ）で表される化合物（化合物６）が挙げられる。
【００４９】
本発明において、式（ＩＶ）で表される化合物の好適な例としては、（Ｅ）−２−デセン−二酸（化合物６）が挙げられる。
【００５０】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、式（Ｖ）で表すことができる。
【００５１】
式（Ｖ）において、Ｒ１０７は、好ましくは、１以上の水酸基で置換されていてもよいペンチル基であり、より好ましくは、１または２個の水酸基により置換されたペンチル基である。
【００５２】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｒ１０７が、１以上の水酸基で置換されていてもよいペンチル基である、式（Ｖ）で表される化合物が挙げられる。
【００５３】
本発明において、式（Ｖ）で表される化合物の好適な例としては、１−フェニル−ペンタン―１，３−ジオール（化合物７）が挙げられる。
【００５４】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＶＩ）で表すことができる。
【００５５】
式（ＶＩ）の化合物は、好ましくは、前記式（ＶＩａ）で表すことができる。
【００５６】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｗが酸素原子であり、Ｘ、Ｙ、およびＺが−ＣＨ２−または＞ＣＨ−である式（ＶＩａ）で表される化合物、およびＺが酸素原子であり、Ｗ、Ｘ、およびＹが−ＣＨ２−または＞ＣＨ−である式（ＶＩａ）で表される化合物が挙げられる。
【００５７】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、また、Ｘが酸素原子であり、Ｗが−ＣＨ＝ＣＨ−または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ＝または＞Ｃ＝である式（ＶＩａ）で表される化合物、およびＹが酸素原子であり、Ｚが−ＣＨ＝ＣＨ−または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ＝または＞Ｃ＝である式（ＶＩａ）で表される化合物が挙げられる。
【００５８】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、また、Ｘが酸素原子であり、Ｗが−ＣＨ２−ＣＨ２−または＞ＣＨ−ＣＨ２−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ＝または＞Ｃ＝である式（ＶＩａ）で表される化合物、Ｘが酸素原子であり、Ｗが−ＣＨ＝ＣＨ−または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ２−または＞ＣＨ−である式（ＶＩａ）で表される化合物、Ｙが酸素原子であり、Ｚが−ＣＨ２−ＣＨ２−または＞ＣＨ−ＣＨ２−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ＝または＞Ｃ＝である式（ＶＩａ）で表される化合物、およびＹが酸素原子であり、Ｚが−ＣＨ＝ＣＨ−または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ２−または＞ＣＨ−である式（ＶＩａ）で表される化合物が挙げられる。
【００５９】
本発明において、式（ＶＩ）で表される化合物の好適な例としては、２−フェニル−ピラン−４−オン（化合物８）、ジヒドロ−４−フェニル−２（３Ｈ）−フラノン（化合物９）、および２−フェニル−５，６−ジヒドロ−γ−ピロン（化合物１０）が挙げられる。
【００６０】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＶＩＩ）で表すことができる。
【００６１】
式（ＶＩＩ）において、Ｒ１０８は、好ましくは、分岐鎖のＣ１−６アルキル基であり、より好ましくは分岐鎖のブチル基である。
【００６２】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｒ１０８が、分岐鎖のＣ１−６アルキル基である、式（ＶＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００６３】
本発明において、式（ＶＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、２−（２−ホルミルピロール−１−イル）−４−メチル吉草酸（化合物１１）が挙げられる。
【００６４】
本発明においては、式（Ｉ）で表される新規化合物もＮｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いることができる。
【００６５】
式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の化合物は、薬学上許容される塩とすることができ、例えば、酸付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩等の無機酸塩；クエン酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、サリチル酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、カルボキシル基を有する化合物は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の金属との塩、リジン等のアミノ酸との塩とすることもできる。
【００６６】
式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のいずれかで表される化合物およびその塩は、薬学上許容される溶媒和物とすることができ、例えば、水和物、アルコール和物（例えば、メタノール和物、エタノール和物）、エーテル和物が挙げられる。
【００６７】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、市販されているものを入手することができる。
【００６８】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、公知の方法に従って製造することもできる。
【００６９】
例えば、化合物１は、特開昭５１−０４１３５０号公報、Forzato C et al., Tetrahedron Asymmetry (2005), 16(18), 3011-3023、Piskov V. B., Zhurnal Obshchei Khimii (1960), 30 1390-5に従って製造することができる。
【００７０】
化合物３は、Fabian W M et al., Eur. J. Org. Chem. (2001), 2 303-309、Scheffold R at al., Helv. Chim. Acta (1967) 50(3) 798-807に従って製造することができる。
【００７１】
化合物６は、Noda N et al., Lipids (2005), 40(8), 833-838、Fujisawa T et al., Chem. Lett. (1982), (2) 219-20に従って製造することができる。
【００７２】
化合物７は、Bartoli G et al., Eur. J. Org. Chem. (2001), 24 4679-4684、Emerson W S et al., J. Org. Chem. (1945), 10 464-9に従って製造することができる。
【００７３】
化合物８は、Groundwater P W et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, (1997), (2), 163-169、Koreeda M et al., Tetrahedron Lett. (1980), 21(13), 1197-200に従って製造することができる。
【００７４】
化合物９は、特開２００４−２６９４９０号公報、Bolm C et al., Synlett (2004), (9), 1619-1621、Pharm I et al., Archiv der Pharmazie (Weinheim, Germany) (1993), 326(12), 941-5に従って製造することができる。
【００７５】
化合物１０は、特許２９４８８７０号公報、Centro N C et al., Gazzetta Chimica Italiana (1966), 96(8-9), 1073-83に従って製造することができる。
【００７６】
化合物１１は、Abell A D et al., Tetrahedron Letters (1992), 33(39), 5831-2、特開昭５１−１２３８９９号公報に従って製造することができる。
【００７７】
本発明において有効成分として用いられる化合物は、ブナハリタケ子実体から精製された化合物を使用することができる。各種キノコ類について、ＱＲ活性誘導能を評価したところ、ブナハリタケは高いＱＲ活性誘導能を有した。また、ブナハリタケは食用キノコであり、人工栽培が可能である。従って、本発明においては、ブナハリタケ子実体を利用するものである。
【００７８】
ブナハリタケ子実体から精製された化合物としては、ブナハリタケ子実体由来であってＮｆｒ２活性化作用を有する化合物であればどのようなものでもよいが、好ましくは、式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）のいずれかで表される化合物である。本発明においては、有効成分としてブナハリタケ子実体をそのまま使用することもできるし、ブナハリタケ子実体抽出物を使用することもできる。
【００７９】
本発明において使用されるブナハリタケ子実体は、ヒダナシタケ目（Aphyllophorales）エゾハリタケ科（Climacodontaceae）に属するブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）の子実体である。
【００８０】
ブナハリタケ子実体としては、自然界に自生する天然の子実体、人工栽培された子実体が挙げられるが、成分含量等が生息地域や気候等により影響されないため品質が安定している点、周年安定的に収穫することができる点で人工栽培されたブナハリタケ子実体が好ましい。
【００８１】
人工栽培方法としては、菌床栽培、原木栽培等が挙げられるが、成分含量等の品質が安定したブナハリタケを安価かつ周年安定的に収穫することができる点で菌床栽培が好ましい。
【００８２】
ここで、「菌床栽培」とは、原木を用いることなく、保水体と栄養源からなる素材に種菌を接種し、温度、湿度、照度などを制御した環境下で栽培する方法を意味し、具体的な菌床栽培方法としては、特開２００３−０２４０４６号公報に記載されている方法などが挙げられるがこれらの方法に限定されない。
【００８３】
ブナハリタケ子実体をそのまま有効成分として使用する場合は、ブナハリタケ子実体をそのまま使用してもよいし、ブナハリタケ子実体を風乾、熱風乾燥または凍結乾燥後に粉砕した粉砕物を使用してもよい。また該粉砕物を常法により顆粒化、カプセル化、錠剤化したもの、ペーストなどを使用してもよい。また、このように粉砕した粉砕物の懸濁液または懸濁物であっても、Ｎｒｆ２活性化作用を有している限り使用することができる。
【００８４】
本発明において有効成分として用いられるブナハリタケ子実体抽出物は、公知の方法に従って抽出し、調製することができる。
【００８５】
ブナハリタケ子実体抽出物は、ブナハリタケ子実体をそのまま抽出操作に供することができるが、乾燥工程を経てから抽出操作に供することもできる。例えば凍結乾燥したブナハリタケ子実体を粉砕した後、抽出操作に供することにより、調製することができる。抽出操作は、例えば、溶媒中にブナハリタケ子実体を懸濁し、そのまま攪拌もしくは、超音波処理、磨砕、フレンチプレス等により菌体を破砕して行うことができる。これら抽出操作によって得られた粗抽出物は、必要に応じて、遠心分離、濾過等の固液分離操作を単独又は複数組み合わせて固形物を除去することができる。得られた液はさらに、エタノール等に対する溶解度の差による分離や酢酸エチル等を用いた液液分配によって分離することもできる。得られたブナハリタケ子実体抽出物（液体）をさらに処理したもの、例えば、濃縮物、凍結乾燥物、部分精製物などの液体または固体形態として使用してもよい。
【００８６】
抽出において使用可能な溶媒としては、０℃〜１００℃の水、適当な緩衝液、適当な有機溶媒（例えばメタノール、エタノールなどのアルコール類）、または適当な有機溶媒と水との混合液（例えばエタノール水）等が挙げられるが、好ましくは熱水、より好ましくは１００℃の熱水である。抽出時間は、特に制限されるものではないが、５分間以上、好ましくは３０分間程度である。次いで遠心分離またはろ過することによってブナハリタケ子実体の抽出液を得ることができる。抽出液量は、特に制限されるものではないが、コスト面、抽出効率面等からして乾燥キノコ重量に対して１０倍量程度の水を用いることが好ましい。抽出溶媒として、エタノールなどの溶媒を適宜添加することもできるが、コスト面や製造現場での扱いやすさの点で、水のみで抽出したほうが望ましい。
【００８７】
子実体は生のまま抽出してもよいが、乾燥させて保存可能とした子実体から抽出した方が、品質の優れた抽出液もしくは抽出物が得られる点で好ましい。また、乾燥させた子実体を粉砕した後、抽出する方が抽出率が向上するので好ましい。
【００８８】
乾燥方法としては、熱風乾燥方法、風乾、スプレードライ、真空（もしくは減圧）乾燥、凍結乾燥方法等公知の乾燥方法であれば特に制限されるものではないが、Ｎｒｆ２活性化作用の低下を抑制する点で凍結乾燥法が好ましい。
【００８９】
本発明の好ましい態様によれば、凍結乾燥ブナハリタケ粉砕物を、１００℃の熱水中に懸濁し、攪拌しながら抽出を行い、濾過にて固液分離し、エタノール溶液に対する溶解度の差によって分離した後、さらに酢酸エチルで分配することによりブナハリタケ子実体抽出物を得ることができる。
【００９０】
抽出物に存在するＮｒｆ２活性化能を有する物質をさらに精製してもよく、この場合、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。
【００９１】
活性物質のさらなる精製のために使用できる方法として、例えば、液液分配および有機溶媒沈澱のような溶解性を利用する方法、ゲルろ過のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、再結晶処理方法、再沈殿処理方法、冷却により生じた析出物を回収する処理方法、酸塩基分配、密度勾配を利用した分離方法、蒸気圧に基づく分離方法等が挙げられる。また、抽出、精製後の濃縮についても、公知の方法であればどのような方法でもよく、減圧加熱濃縮などを具体的に例示することができる。さらに抽出、精製後の乾燥についても、公知の方法であればどのような方法でもよく、風乾法、加熱乾燥法、スプレードライ法、凍結乾燥法などを具体的に例示することができる。
【００９２】
製造方法
本発明による製造方法は、好ましくは、Ｎｒｆ２活性化化合物を製造する方法であって、下記工程：
（ａ）抽出溶媒を用いてブナハリタケ子実体を抽出する工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られた抽出物を分画する工程；
（ｃ）工程（ｂ）により得られた画分について、Ｎｒｆ２活性化能を測定する工程；および
（ｄ）Ｎｒｆ２活性化能を有すると判定された画分を精製する工程
を含んでなる方法である。
【００９３】
工程（ｃ）において、例えば、ＱＲ活性、ＡＲＥプロモーター活性、各種第二相酵素の発現等を測定することにより、得られた画分がＮｒｆ２活性化能を有するか否か判定することができる（後記実施例５〜７を参照）。ここで、例えば、ＱＲ活性の上昇、ＡＲＥプロモーター活性の増加、各種第二相酵素の発現の増加が確認された場合に、得られた画分Ｎｒｆ２活性化能を有する、すなわち本発明によるＮｒｆ２活性化化合物を含む画分である、と判定することができる。
【００９４】
工程（ｄ）において、精製は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、得られた画分を濃縮、結晶化することによって本発明によるＮｒｆ２活性化化合物を得ることができる。
【００９５】
用途
転写因子Ｎｒｆ２は、生体の酸化ストレスに対する防御能や生体異物の解毒と深く関連していることが知られている。具体的には、転写因子Ｎｒｆ２は、第二相酵素群に対し、プロモーター中のＡＲＥに結合することで該遺伝子の発現を誘導することが知られており、このＮｒｆ２活性化にともなう一連の第二相酵素群の発現増加が、酸化ストレスからの防御や生体異物の解毒を亢進することが知られている。
【００９６】
Ｎｒｆ２は、酸化ストレス状態になると、酸化ストレスに応答して細胞質より核に移行し、ＡＲＥに結合し、酸化ストレス防御や抗酸化に有効に働く第二相酵素の発現を誘導することにより酸化ストレス防御系を亢進する。酸化ストレス防御系が亢進されると酸化ストレス状態が改善され、酸化ストレスに起因する各種疾患が改善されることが期待される。例えば、加齢に伴う慢性疾患の一つである加齢性黄斑変性症は、老化に伴って発症し、老齢者で失明を引き起こす代表的な疾患である。この疾患の原因としては網膜色素上皮細胞に対する光酸化ストレスが示唆されており、脂質およびタンパク質の酸化産物の蓄積が危険因子として知られている。光酸化ストレスを網膜色素上皮細胞に与えると、細胞内の過酸化脂質量が増大して細胞は死滅するが、第二相酵素の誘導能をもつスルフォラファンやビス（２−ヒドロキシベンジリデン）アセトンはこれを抑制することが示されている（Gao X et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jul 13;101(28):10446-51）。また、グルタチオン量の低下などによって引き起こされる、生体の酸化ストレスに対する防御能の低下は、血中においてＲＯＳを増加させ、高血圧を引き起すことがある。ＲＯＳの一種であるペルオキシナイトライトは強い炎症惹起物質でもあり、その生成は動脈硬化巣の形成にも繋がる可能性が指摘されている。しかしながら、脳卒中易発高血圧自然発症ラット（ＳＨＲsp）において、グルコラファニン（スルフォラファンの代謝前駆体）を多量に含むブロッコリースプラウトを投与することによって、血圧上昇の抑制、血管内皮機能の改善が可能であることが示されている（Wu L et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 May 4;101(18):7094-9）。このことは、グルタチオン量の増加および第二相酵素の誘導が高血圧の改善に有効であることが示されている。
【００９７】
Ｎｒｆ２はまた、酸化ストレス防御系に加えて、解毒系も亢進する。薬剤や環境化学物質などの生体にとって異物となる物質が代謝される生体異物代謝系（解毒系）は、転写因子ＡｈＲ、ＣＡＲなどによって制御される第一相酵素群と、Ｎｒｆ２によって制御される第二相酵素群から構成されている。生体異物は第一相酵素群によってオキソ中間体に変換された後、第二相酵素群によってより水溶性の高い誘導体に変化されて体外へ排出される（Rushmore TH et al., Curr Drug Metab. 2002 Oct;3(5):481-90）。この際、第一相酵素反応後のオキソ中間体は非常に強い毒性物質である場合が多い。例えば、発ガン性物質として知られるベンゾピレンは、ＣＹＰ１Ａ１などの第一相酵素群により代謝された後、ベンゾピレンジオールエポキシドとなり、次いでＧＳＴなどの第二相酵素群によってグルタチオンやグルクロン酸抱合され、体外に排出される。この際、中間体であるベンゾピレンジオールエポキシドはＤＮＡに結合しＤＮＡの複製過程に障害を引き起こしてガン化の原因になると言われている（Motohashi H et al., Trends Mol Med. 2004 Nov;10(11):549-57）。このことから、第二相酵素群の活性を高め、有害な中間体をより早く代謝して体外へ排出することができれば、発ガンを抑制することができると考えられる。また、ディーゼルエンジンが排気する粒子状汚染物質で生体異物の一種であるＤＥＰ（diesel exhaust particles）は、呼吸器疾患などの症状を引き起こすことが知られているが、Ｎｒｆ２活性化によって誘導されるＧＳＴ、ＮＱＯ１、ＨＯ１は、ＤＥＰによる酸化ストレスやＤＥＰ中のキノンの毒性に対する防御を担っていることが報告されている（Li N et al., J Immunol. 2004 Sep 1;173(5):3467-81）。このことから、環境汚染物質等によって引き起こされる各種疾患の予防、改善に、Ｎｒｆ２活性化物質が有効であると考えられている。
【００９８】
上記以外にも、Ｎｒｆ２の活性化物質が、酸化ストレスまたは生体異物により引き起こされる疾患、例えば、炎症（Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 May 4;101(18):7094-9）、発ガン（Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 15;89(6):2399-403 Carcinogenesis. 2000 Dec;21(12):2287-91 Fahey Jwet al., Food Chem Toxicol. 1999 Sep-Oct;37(9-10):973-9）、皮膚障害（J Clin Invest. 2004 Jan;113(1):65-73）、ピロリ菌防御（Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 May 28;99(11):7610-5）、神経変性疾患（Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2005 Jun;4(3):267-81）、環境化学物質解毒（Toxicol Sci. 2006 Mar;90(1):111-9. Epub 2005 Dec 13）、肝機能障害（Toxicol Sci. 2006 Mar;90(1):111-9. Epub 2005 Dec 13）、自己免疫疾患（Am J Pathol. 2006 Jun;168(6):1960-74）、糖尿病（Transplant Proc. 2006 Jan-Feb;38(1):282-3）等の症状を改善することがこれまでに報告されている。
【００９９】
実施例によれば、本発明において有効成分として用いられるブナハリタケ酢酸エチル画分は、第二相酵素であるＮＱＯ１の発現増加により上昇することが知られているキノン還元酵素（ＱＲ）の活性（実施例５）、ＡＲＥプロモーター活性（実施例６）、各種第二相酵素の遺伝子発現（実施例７）をそれぞれ増加させた。また、本発明によるブナハリタケ酢酸エチル画分は、活性酸素による細胞死滅を抑制した（実施例８）。さらに、本発明によるブナハリタケ酢酸エチル画分が経口投与されたマウスの肝臓および小腸上皮において、第二相酵素群の発現（実施例９）、肝臓におけるＱＲ活性（実施例１０）が増加した。これらの結果から、ブナハリタケ酢酸エチル画分が、転写因子Ｎｒｆ２を活性化する機能を有することが示された。
【０１００】
実施例によれば、また、本発明において有効成分として用いられるブナハリタケ抽出物から単離、精製された化合物１〜１１が、ＱＲ活性を増加させた（実施例５）。これらの結果から、化合物１〜１１が、転写因子Ｎｒｆ２を活性化する機能を有することが示された。
【０１０１】
従って、本発明による有効成分、すなわち、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物および本発明による抽出物は、転写因子Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いることができる。
【０１０２】
本願明細書において、「Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患」としては、酸化ストレスにより引き起こされる疾患および生体異物により引き起こされる疾患が挙げられる。
【０１０３】
本願明細書において、「酸化ストレス」とは生体内において発生したＲＯＳなどが有する酸化損傷力が、生体内の抗酸化システムが有する抗酸化ポテンシャルを上回った状態を意味する。「酸化ストレスにより引き起こされる疾患」としては、加齢に伴う慢性疾患（例えば、加齢性黄斑変性症等）、動脈硬化、高血圧、糖尿病、発ガン、肝機能障害、潰瘍、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、自己免疫疾患、シミ、シワ、眼疾患、呼吸器疾患（例えば、気管支炎等）、喘息、炎症（例えば、胃炎、肝炎、皮膚炎等）、脳梗塞、心筋梗塞等が挙げられる。
【０１０４】
本願明細書において、「生体異物」とは本来生体には存在しない物質を意味し、特に生体にとって有害な化合物を意味する。「生体異物により引き起こされる疾患」としては呼吸器疾患（例えば、気管支炎等）、肝機能障害、発ガン、自己免疫疾患等が挙げられる。
【０１０５】
本願明細書において、「治療」とは、予防および改善を含む意味で用いられるものとする。
【０１０６】
本願明細書において、「疾患」とは、状態を含む意味で用いられるものとする。
【０１０７】
本願明細書において、「疾患の治療」は、疾患または状態の、調節、進行の遅延、緩和、発症予防、再発予防、抑制などを含む意味で使用される。
【０１０８】
本発明によれば、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を含んでなる、Ｎｒｆ２活性化剤が提供される。
【０１０９】
本発明によれば、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を含んでなる、酸化ストレス防御剤、抗酸化剤、および生体異物の解毒剤が提供される。
【０１１０】
本発明によれば、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療剤の製造のための、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物の使用が提供される。
【０１１１】
本発明によれば、また、Ｎｒｆ２活性化剤の製造のための、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物の使用が提供される。
【０１１２】
本発明によれば、また、酸化ストレス防御剤、抗酸化剤、または生体異物の解毒剤の製造のための、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物の使用が提供される。
【０１１３】
本発明によれば、治療上の有効量の本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療方法が提供される。
【０１１４】
本発明によれば、また、有効量の本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化方法が提供される。
【０１１５】
本発明によれば、また、有効量の本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、酸化ストレス防御方法、抗酸化方法、および生体異物の解毒方法が提供される。
【０１１６】
医薬組成物および食品
本発明による組成物および用剤を医薬として用いる場合には、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を有効成分として用い、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製造できる。
【０１１７】
有効成分としては、例えば子実体の粉砕物（例えば、粉末）、懸濁液、抽出物、またはその抽出物をさらに精製したものでもよく、あるいは有効成分を含む混合物でもよいし、または実質的に単一になるまで精製された物でもよい。
【０１１８】
本発明による組成物および用剤は、経口または非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、溶液剤、丸剤、軟質または硬質カプセル剤、シロップ剤、ペースト剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）、点眼剤等が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される担体（例えば、賦形剤、添加剤）とともに製剤化することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、湿潤剤、滑沢剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
【０１１９】
製剤は、例えば下記のようにして製造できる。
【０１２０】
経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。
【０１２１】
注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【０１２２】
製剤化に当たっては、本発明による有効成分以外の１種以上の有効成分を更に配合してもよい。また本発明による有効成分の投与に当たっては、本発明による有効成分以外の１種またはそれ以上の医療上有効な有効成分を組み合わせて投与してもよい。
【０１２３】
本発明による組成物および用剤は、医薬品への適用のみならず、食品への適用も意図されている。従って、本発明による組成物および用剤の食品への適用に当たっては、後述するような食品に関する記述を参照することができる。
【０１２４】
本発明による食品は、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を有効量含有した食品である。ここで「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に、後述するような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。本発明による食品には、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物をそのままあるいは上記のような組成物の形態で、食品に配合することができる。より具体的には、本発明による食品は、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物をそのまま、食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、ペースト状のもの、一般の食品へ添加したものであってもよい。本発明による食品は、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物と、アブラナ科植物、ホップ、ショウガ、茶等のＮｒｆ２活性化が報告されている食品、ワイン、茶、ハーブ等の抗酸化活性が報告されている食品、コーヒー、瓜類、ハーブティー等の利尿効果が高い食品とを組み合わせて使用してもよい。本発明において「食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が摂取可能なものであればその形態に特に制限はない。
【０１２５】
本発明において「食品」とは、健康食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品）、機能性食品、病者用食品を含む意味で用いられる。
【０１２６】
上記健康食品はまた、通常の食品の形状であっても、栄養補助食品の形状（例えば、サプリメント）であってもよい。
【０１２７】
また「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であってもよい。
【０１２８】
本発明による食品は、Ｎｒｆ２活性化機能、Ｎｒｆ２の活性化に伴い改善または緩和される状態の改善または緩和機能を期待する消費者に適した食品、すなわち、特定保健用食品、として提供することができる。ここでいう「特定保健用食品」とは、Ｎｒｆ２活性化、Ｎｒｆ２の活性化に伴い改善または緩和される状態の改善または緩和等を目的として食品の製造または販売等を行う場合に、保健上の観点から法上の何らかの制限を受けることがある食品をいう。
【０１２９】
本発明によれば、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物またはブナハリタケ抽出物を有効量含んでなる食品であって、Ｎｒｆ２活性化機能、Ｎｒｆ２の活性化に伴い改善または緩和される状態の改善または緩和機能が表示された食品が提供される。ここで、上記の各種機能は、食品の本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかに表示することができる。
【０１３０】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物の添加・配合の対象である日常摂取する飲食品としては、例えば、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類（アルコール性飲料）、コーヒー、紅茶、茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、プリン、ゼリー、アイスクリーム類などの冷菓、チューインガム、キャンディ等の菓子類や、クラッカー、チップス等のスナック類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、つけもの、酢づけ、アルコールづけ、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ、スープ、シチュー等の各種総菜などを例示することができるが、これらに特に制限されない。
【０１３１】
本発明のより好ましい態様によれば、添加・配合の対象である食品としては、野菜搾汁液と混合した飲料、茶系飲料が挙げられる。
【０１３２】
本発明において提供される飲料（飲料形態の健康食品や機能性食品を含む）の製造に当たっては、通常の飲料の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品添加剤などを適宜添加することができる。飲料の製造に当たってはまた、当業界に公知の製造技術を参照することができ、例えば、「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）を参考とすることができる。
【０１３３】
本発明による組成物の有効成分である、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物は、人類が食品として長年摂取してきたブナハリタケに含まれるものであることから、毒性も低く、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いられる。本発明による有効成分の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に応じて適宜決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、成人１人当たり、乾燥子実体換算で約１００ｍｇ〜約２０ｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１ｇ〜５ｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与することができる。本発明による有効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜決定できる。また、食品として摂取する場合には、成人１人１日当たり０．１〜１００ｇ、好ましくは１〜１０ｇ程度の摂取量となるよう本発明による有効成分を食品に配合することができる。
【実施例】
【０１３４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０１３５】
実施例１：菌床栽培法を用いたブナハリタケ子実体乾燥粉末の調製
ブナオガクズ３８０ｇ、乾燥ビール粕３７．５ｇ、乾燥おから３７．５ｇ、水道水５４５ｇを混合した計１０００ｇを、１．２ｋｇ用ＰＰ（ポリプロピレン）製袋に詰めて培地を作製した。さらにこの袋にフィルターをはさんだポリプロピレン製キャップをして１２１℃、５０分加圧滅菌し、滅菌後の培地を冷却した後、特許生物寄託センターにＦＥＲM ＢＰ−６６９７として寄託されているブナハリタケの種菌を接種し、暗所にて温度２３〜２５℃、湿度６０〜８０％の条件で４０日間前培養を行い、次に中培養工程へ移行した。中培養工程では、温度１３〜１５℃、湿度８０〜９５％、照度２００ルックスの条件下で、３０日間培養するとブナハリタケ原基が形成された。袋内に直径約３ｃｍ程度の原基が認められる部分の袋部の１箇所を切り取り、次いで後培養工程へ移行した。後培養工程では、温度１３〜１５℃、湿度８０〜９５％、照度２００ルックスの条件下で、１７日間培養すると１株のブナハリタケ子実体へと成長した。得られたブナハリタケ子実体は２３２．５ｇで、栽培に要した総日数は８７日であった。
【０１３６】
上記菌床栽培にて得られたブナハリタケ子実体３ｋｇを、収穫後直ちに４℃にて最長１週間まで冷蔵保存しておき、熱風乾燥機にて６５℃で６時間乾燥処理を行い、ブナハリタケ子実体乾燥品０．３ｋｇを得た。ブナハリタケ子実体乾燥品を、粉砕機を用いて粉砕し、ブナハリタケ子実体乾燥粉末とした。
【０１３７】
実施例２：ブナハリタケ子実体乾燥粉末熱水抽出物を出発物質とした粗抽出プロセス
実施例１の方法を用いて調製した５３０ｇのブナハリタケ子実体乾燥粉末を１０倍量の精製水を用いて３０分間熱水抽出し、ろ紙にてろ過したものをロータリーエバポレーター中で減圧濃縮し、ブナハリタケ子実体乾燥粉末の熱水抽出物２０８ｇを得た。この抽出物に１０倍量の８０％エタノール溶液を加え攪拌した後、５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、上清を回収し、エバポレーター中で減圧濃縮した。この抽出物を５倍量の精製水に再溶解し、続いて酢酸エチルで３回液液分配を行い、その後濃縮した。さらに抽出物を８０％メタノール溶液に再溶解し、ヘキサンで3回液液分配を行った後、８０％メタノール層を減圧濃縮して６．０ｇの乾燥物を得た。
【０１３８】
実施例３：活性化合物の単離
実施例２で得られた乾燥物をクロロホルム：メタノール＝５０：１溶液に再溶解しシリカゲル（ワコーゲル：和光純薬社製）を充填したカラムに付し、クロロホルムに対するメタノール含量を、クロロホルム：メタノール＝５０：１、２０：１、１：１、メタノール１００％と順次増やして溶出した。このうち、クロロホルム：メタノール＝５０：１の混合溶液で溶出されてきた画分を集めて減圧濃縮し、クロロホルム：メタノール＝４０：１溶液に再溶解し、シリカゲルを充填したカラムに再度付した。クロロホルム：メタノール＝４０：１溶液をシリカゲル容量の５倍量カラムに添加し、溶出されてきた画分を５ｍｌずつ回収した。各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し、リンモリブテン酸（シグマ社製）にて呈色させ、その結果によって６画分（Ｆ１〜Ｆ６）に大別した。
【０１３９】
上記６画分についてＱＲアッセイを行い、その中で最も強い活性を示した画分Ｆ２を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりさらに精製した。まず、下記溶出条件（１）で粗精製し、化合物１，２については（２），（３）、化合物３については（４）、化合物４，５については（５），（６）、化合物６については（５）、化合物７については（７），（８）、化合物８については（７）、化合物９，１０については（９）、化合物１１については（１０），（１１）で引き続き精製した。
（１）カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ−１８（１０×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）、流速：１．５ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）３５−１００％
（２）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（１０×２５０ｍｍ、資生堂社製）、流速：４．７ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器（共に島津製作所社製）、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）メタノール、溶出条件：Ｂ）５％一定
（３）カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０（４．６×２５０ｍｍ、東ソー社製）、流速：１．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器、溶媒：Ａ）アセトニトリル、溶出条件：Ａ）１００％一定
（４）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（１０×２５０ｍｍ）、流速：３．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）１０％一定
（５）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（１０×２５０ｍｍ）、流速：４．７ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）２０％一定
（６）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：１．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）１０％一定
（７）カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ ＰＥＧ（１０×２５０ｍｍ、ＳＵＰＥＬＣＯ社製）、流速：２．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）１０％一定
（８）カラム：Ｘｔｅｒｒａ ｐｈｅｎｙｌ（４．６×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）、流速：１．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）メタノール、溶出条件：Ｂ）１８％一定
（９）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：１．５ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．２％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）１８％一定
（１０）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＭＧ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：１．２ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．２％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）４５％一定
（１１）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＭＧ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：１．２ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．２％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）３０％一定
【０１４０】
実施例４：単離した化合物の構造決定
単離した化合物の各種スペクトルデータは以下の通りである。
【０１４１】
化学式１：４−アセチル−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン
【化９】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ4.52（1H, t, J=9.0），4.20（1H, t, J=9.0），3.27（1H, q, J=9.3），2.85（1H, dq），2.22（3H, s），1.29（3H, d, J=6.7）
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ206.8，180.7，68.0，56.3，38.0，29.4，15.1
ESI-MS：m/z 142.9[M+H]+
[α]20D = -28.7（c 0.035, CH3OH）
【０１４２】
化合物２：４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン
【化１０】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ4.33（1H, t, J=8.6），3.96（1H, t, J=8.9），3.77（1H, m），2.59（1H, dq），2.26-2.17（1H, m），1.30（3H, d, J=7.6），1.17(1H, d, J=6.5)
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ182.9，69.7，69.3，51.3，38.4，21.5，16.6
ESI-MS：m/z 145.0[M+H]+
[α]20D = 15.9（c 0.013, CH3OH）
【０１４３】
化合物３：５−ヒドロキシ−３，４，５−トリメチル−５−Ｈ−フラン−２−オン
【化１１】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ1.97（3H, s），1.79（3H, s），1.62（3H, s）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ172.3，158.8，124.3，105.6，23.4，10.5，8.4
ESI-MS：m/z 142.9[M+H]+
【０１４４】
化合物４：酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル
【化１２】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ4.54-4.51（1H, m），4.28（1H, m），4.08（1H, m），2.99-2.97（1H, m），2.50-2.49（1H, m），2.02（3H, s），1.39（3H, d, J=5.9），1.18(3H, d, J=6.7)
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ181.7，172.4，79.4，63.6，45.3，36.8，20.6，20.3，10.3
ESI-MS：m/z 186.9[M+H]+
[α]20D = -3.7（c 0.013, CH3OH）
【０１４５】
化合物５：（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸
【化１３】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ4.35-4.32（1H, m），3.91-3.88（1H, m），2.54-2.38（2H, m），2.14-2.02（2H, m），1.66-1.40（4H, m），0.90（3H, t, J=7.5）
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ175.7，81.1，76.7，42.3，32.8，32.2，29.6，10.4
ESI-MS：m/z 156.8[M-H]-
[α]20D = 2.3（c 0.021, CH3OH）
【０１４６】
化合物６：（Ｅ）−２−デセン−二酸
【化１４】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ6.97-6.89（1H, m），5.79（1H, d, J=15.6），2.29-2.19（4H, m），1.62-1.58（2H, m），1.49-1.46（2H, m），1.38-1.34（4H, m）
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ178.2，170.9，151.3，123.3，35.5，33.5，30.5，30.4，29.6，26.5
ESI-MS：m/z 198.9[M-H]-
【０１４７】
化合物７：１−フェニル−ペンタン―１，３−ジオール
【化１５】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.39-7.26（5H, m），4.95（1H, dd, J=8.8, 4.4），3.90-3.89（1H, m），1.84-1.80（2H, m），1.62-1.51（2H, m），0.94（3H, t, J=7.4）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ144.5，128.5, 125.7，127.6，75.5，74.1，44.9，30.9，9.6
ESI-MS：m/z 203.1[M+Na]+
【０１４８】
化合物８：２−フェニル−ピラン−４−オン
【化１６】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.82（1H, d, J=6.4），7.73（2H, dd），7.50-7.43（3H, m），6.77（1H, d, J=2.4），6.36（1H, dd, J=2.5, 6.1）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ179.2，164.0, 154.8，131.5，131.2，129.1，125.8，117.1，112.4
ESI-MS：m/z 173.0[M+H]+
【０１４９】
化合物９：ジヒドロ−４−フェニル−２（３Ｈ）−フラノン
【化１７】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.39（2H, dd, J=7.0, 7.1），7.31（1H, dd, J=7.0, 7.0），7.24（2H, d, J=7.1），4.68（1H, dd, J=8.0, 9.2），4.28（1H, dd, J=8.0, 8.9），3.80（1H, m），2.94（1H, dd, J=8.3, 17.5），2.69（1H, dd, J=9.1, 17.5）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ176.4，139.4, 129.1，127.7，126.7，74.0，41.1，35.7
ESI-MS：m/z 163.0[M+H]+
【０１５０】
化合物１０：２−フェニル−５，６−ジヒドロ−γ−ピロン
【化１８】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.74（2H, d, J=7.8），7.48（1H, dd, J=7.7, 7.7），7.42（2H, dd, J=7.7, 7.8），6.03（1H, s），4.67（2H, t, J=6.6），2.67（2H, t, J=6.6）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ192.7，170.6, 132.7，131.7，128.7，126.5，102.5，68.2，36.0
ESI-MS：m/z 175.0[M+H]+
【０１５１】
化合物１１：２−（２−ホルミルピロール−１−イル）−４−メチル吉草酸
【化１９】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ9.48（1H, s），7.17（1H, m），6.99（1H, m），6.32（1H, m），5.98（1H, m），2.00（2H, m），1.41（1H, m），0.92（3H, d, J=7.2），0.90（3H, d, J=7.6）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ180.0，175.1, 131.7，130.0，126.0，110.7，57.8，40.8，24.8，22.9，21.4
EI-MS：m/z 209 [M]+
【０１５２】
実施例５：キノン還元酵素活性試験
キノン還元酵素（ＱＲ）活性は、Ｎｒｆ２活性化によるＮＱＯ１の発現増加によって上昇することが知られている（Proc Natl Acad Sci U S A. 101 10446-51 (2004)）。そこで、実施例２で調製したブナハリタケ酢酸エチル画分（以下、「ブナハリタケ酢酸エチル画分」という。）が、Ｎｒｆ２活性化能を有するか否かについて、ＱＲ活性を指標として測定を行った。
【０１５３】
ＱＲ活性の測定は、Prochaska HJ et al., Anal Biochem. 1988 Mar;169(2):328-36に記載の方法に従って実施した。
【０１５４】
マウス肝ガン細胞Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞（大日本住友製薬より入手）を９６穴マイクロプレートに、７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％牛胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）とペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、シグマ社製）とを含有するα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）を５０μｌ加えて、３７℃でかつ５％ＣＯ２条件下で１晩培養した。次いで、この培養培地を、実施例２で調製したブナハリタケ酢酸エチル画分と実施例３で単離された化合物１〜１１がそれぞれ１００μｇ／ｍｌの濃度となるように調製した培地に交換し、さらに４８時間培養した。その後、０．０８％ジギトニン、および、２ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて各ウェルの細胞を破砕し、マイクロプレートリーダーを用いて、メナディオン−ホルマザン系による６１０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１５５】
ＱＲ誘導活性は、無添加の細胞の活性を１とする相対活性として算出した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。ポジティブコントロールとしては、Ｎｒｆ２の活性化物質であるスルフォラファン（３μＭ）（シグマ社製）を使用した。また、ｔ検定を用いて有意差を判定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０１５６】
その結果、ブナハリタケ酢酸エチル画分および化合物１〜１１の添加によるＱＲ活性の上昇が認められた（図１）。特に、化合物９が最も高いＱＲ活性化能を示した。
【０１５７】
実施例６：ＡＲＥレポーターアッセイ系におけるＮｒｆ２活性化能評価
Ｎｒｆ２は、ＡＲＥに結合し、第二相酵素の発現を誘導することが知られている（Itoh K et al., Seikagaku. 2006 Feb;78(2):79-92）。そこで、ブナハリタケ酢酸エチル画分が、Ｎｒｆ２活性化能を有するか否かについて、ＡＲＥプロモーター活性を指標として測定を行った。
【０１５８】
ＡＲＥプロモーター活性の測定は、ＡＲＥレポーターアッセイ系を用いて実施した。
【０１５９】
レポータープラスミドｐＧＬ３−ｍＡＲＥ３は、Ｎｒｆ２が結合するとされるマウスＮＱＯ１由来ＡＲＥ（antioxidant response element）を３回繰り返した二本鎖オリゴＤＮＡを作製し、これを、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターpGL3-promoter vector（プロメガ社より入手可能）のＭｌｕＩ−ＮｈｅＩ部位に挿入することによって構築した。
【０１６０】
ＡＲＥを含む二本鎖オリゴＤＮＡは
5'-TCGACGCGTAGAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATTAGAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATTAGAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATTGCTAGCTAG-3’（配列番号：１）、および
5'-CTAGCTAGCAATTTTGCCGACTCACTGTGACTCTAATTTTGCCGACTCACTGTGACTCTAATTTTGCCGACTCACTGTGACTCTACGCGTCGA-3'（配列番号：２）
の２本の一本鎖オリゴＤＮＡを化学合成し、アニーリングさせて調製した。また、目的のプラスミドであることは塩基配列解析により確認した。
【０１６１】
次に、１２穴マイクロプレートに４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのマウス・マクロファージ系細胞ＲＡＷ２６４．７（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を播種し、１０％牛胎仔血清、およびペニシリン-ストレプトマイシン（それぞれ１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）０．８ｍｌを加えて、３７℃でかつ５％ＣＯ２条件下で１晩培養した。この細胞に１．０μｇのｐＧＬ３−ｍＡＲＥ３と０．０１μｇの補正用ウミシイタケ由来ルシフェラーゼレポーターベクターｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）をSuperFect Transfection試薬（キアゲン社製）を用いてトランスフェクションした。３時間トランスフェクションした後、培地を新しいものに交換し、ここにブナハリタケ酢酸エチル画分（１００、２００μｇ／ｍｌ）と、ポジティブコントロールとしてスルフォラファン（８μＭ）を添加して２４時間培養した後、細胞を回収した。デュアルルシフェランス・レポーター・アッセイ・システム（Ｄual-Luciferase reporter assay system）（プロメガ社製）を用いて細胞破砕した後、ホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、ルミノメーター（ARVO Light Luminescence Counter、パーキンエルマー社製）により測定した。
【０１６２】
ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性で除した値を相対ルシフェラーゼ活性とした（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。
【０１６３】
その結果、ブナハリタケ酢酸エチル画分の添加により、濃度依存的にＡＲＥプロモーター活性が増加されることが確認された（図２）。従って、実施例５で確認されたブナハリタケ酢酸エチル画分が有するＱＲ活性誘導能はＮｒｆ２活性化を介して起きていることが示唆された。
【０１６４】
実施例７：Ｎｒｆ２によって制御される各種遺伝子の発現量解析
Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を９６穴マイクロプレートに、７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％牛胎仔血清とペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）とを含有するα−ＭＥＭ培地を５０μｌ加えて、３７℃でかつ５％ＣＯ２条件下で１晩培養した。次いで、この培養培地を、実施例２で調製した酢酸エチル画分がそれぞれ５０、１００、２００μｇ／ｍｌの濃度となるように調製した培地と、ポジティブコントロールとしてスルフォラファン（３μＭ）を含んだ培地にそれぞれ交換し、さらに１２時間培養した。
【０１６５】
その後、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を用いてtotal ＲＮＡを調製し、RNeasy Mini（キアゲン社製）およびRNase-Free DNase Set（キアゲン社製）を用いて精製した。さらに、精製された５μｇのtotal ＲＮＡからThermo Script RT-PCRシステム（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、SYBR(R) Premix Ex TaqTM reagent（タカラバイオ社製）およびライトサイクラー（ロシュ社製）を使用して、各種第二相酵素遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。
【０１６６】
各遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨの発現量で補正し、相対発現量を算出した（ｎ＝２、平均値±標準偏差）。
【０１６７】
なお、遺伝子発現解析に使用したＤＮＡプライマーは、
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼｍｕ１（Glutathione S-transferase mu1（ＧＳＴＭ１））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5’-TGCCCGAAAGCACCACCTGGAT-3’（配列番号：３）、および
5’-ACCATGGCCTCTTGCCCAGGAA-3’（配列番号：４）、
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素（NAD(P)H:quinone oxidoreductase (ＮＱＯ１)）のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5’-ACAGCATTGGCCACACTCCACCA-3’（配列番号：５）、および
5’-TGATGGCCCACAGAGAGGCCAAA-3’（配列番号：６）、
グルタメートシステインリガーゼ触媒サブユニット（Glutamate cysteine ligase catalytic subunit（ＧＣＬＣ））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5'-TCTGCAAAGGCGGCAACGCTGT-3' （配列番号：７）、および
5'-GCATCGGGTGTCCACATCAACTTCC-3' （配列番号：８）、
グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（ＧＡＰＤＨ））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5'-TCTGCCGATGCCCCCATGTTTG-3' （配列番号：１３）
5'-TGGGTGGCAGTGATGGCATGGA-3' （配列番号：１４）
であり、全てインビトロジェン社で合成した。ＧＳＴＭ１やＮＱＯ１は解毒に関する酵素であり、ＧＣＬＣは抗酸化物質のグルタチオンの合成を司る酵素である。
【０１６８】
その結果、実施例５においてＱＲ活性誘導能を示したブナハリタケ酢酸エチル画分について、Ｎｒｆ２によって制御される各種遺伝子の発現量変動を調べたところ、Ｎｒｆ２によって発現増加することが知られる標的遺伝子ＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、ＧＣＬＣの発現を、ポジティブコントロールとして使用したスルフォラファンと同様に増加させた（図３）。従って、ブナハリタケ酢酸エチル画分は、Ｎｒｆ２を活性化し、それにより第二相酵素と呼ばれる一連の遺伝子群の発現を増加させて抗酸化や解毒系を亢進させることが明らかとなった。
【０１６９】
実施例８：過酸化水素による細胞死の抑制作用
９６穴マイクロプレートにおいて２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＲＡＷ２６４．７細胞を、各サンプル、１０％牛胎仔血清、およびペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）を含有する１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加えて、３７℃でかつ５％ＣＯ２条件下、１晩培養した。ここで、各サンプルは、実施例２で調製した酢酸エチル画分を使用し、濃度が２５、５０、１００μｇ／ｍｌとなるよう添加した、また、ポジディブコントロールとしてスルフォラファン（３μＭ）を使用した。ここに過酸化水素（和光純薬社製）を最終濃度が０．２，０．４，０．８ｍＭとなるように添加してさらに２時間培養した。その後、Cell Counting Kit-8（同仁化学社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し細胞生存率を測定した。細胞生存率は、各サンプルについて過酸化水素無添加を１００％として算出した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。
【０１７０】
その結果、ブナハリタケ酢酸エチル画分は、スルフォラファンと同様に過酸化水素、すなわち活性酸素による細胞の死滅を抑制することが確認された（図４）。
【０１７１】
実施例９：経口強制投与によるマウス肝臓および小腸上皮の遺伝子発現量変化
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ１Ｃｒ１ｊマウス雄性７週齢（チャールス・リバー社より入手、ｎ＝７−８）をＡＩＮ−７６Ａ（エトキシキン不含、リサーチダイエット社製）食で１週間飼育し馴化した。その後、ブナハリタケ酢酸エチル画分を３０ｍｇ／匹／日、または１５ｍｇ／匹／日で３日間、経口強制投与した。同様に対照群として精製水を、ポジティブコントロール群としてスルフォラファン（１ｍｇ／匹／日）をマウスに投与した。
【０１７２】
最終投与２４時間後にエーテル麻酔下で肝臓と小腸上皮を回収し、直ちに液体窒素で凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。各臓器のＲＮＡは、実施例７と同様の方法で精製し、ｃＤＮＡを合成した後、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。
【０１７３】
各遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨの発現量で補正し、相対発現量を算出した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。なお、肝臓ではＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、ＧＣＬＣ、Ｃｙｐ１Ａ１、およびＣｙｐ１Ａ２を、小腸上皮ではＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、およびＧＣＬＣ遺伝子に対して測定を行った。また、遺伝子発現量解析に使用したＤＮＡプライマーは実施例７と同じ物に加え、以下のものをインビトロジェン社で合成して用いた。
【０１７４】
シトクロムＰ４５０ １Ａ１（Cytochrome P450 1A1（Ｃｙｐ１Ａ１））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5'-TGGGGCTTGCCCTTCATTGGTC-3' （配列番号９）、および
5'-TCTGGCCGGCCCTTGAAGTCAT-3' （配列番号１０）
を使用した。
【０１７５】
また、シトクロムＰ４５０ １Ａ２（Cytochrome P450 1A2（Ｃｙｐ１Ａ２））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5'-TCGGCCATCGACAAGACCCAGA-3' （配列番号１１）、および
5'-TGTTCACAGGTCCCGGGCTTCA-3' （配列番号１２）
を使用した。
【０１７６】
また、スティール検定を用いて有意差を判定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０１７７】
その結果を表１に示す。
【表１】
【０１７８】
これにより、ブナハリタケ酢酸エチル画分を投与した群では、第二相酵素として代表的なＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、およびＧＣＬＣの有意な発現増加が認められた。ＧＳＴＭ１やＮＱＯ１は解毒に関する酵素であり、ＧＣＬＣは抗酸化物質のグルタチオンの合成を司る酵素である。このため、ブナハリタケ酢酸エチル画分により解毒作用と抗酸化作用が亢進されたものと考えられる。一方、ブナハリタケ酢酸エチル画分を投与した群では、発がん物質の活性化に関与する第一相酵素として代表的なＣｙｐ１Ａ１やＣｙｐ１Ａ２の発現増大は認められなかった。このことから、ブナハリタケ酢酸エチル画分は、解毒系の代謝において、第二相酵素群の発現を選択的に増加させることも明らかとなった。このことから、ブナハリタケ酢酸エチル画分は、経口で摂取した場合においても体内のＮｒｆ２を活性化し、第二相酵素と呼ばれる一連の遺伝子群の発現を増加させることが示された。なお、各サンプル投与期間中における体重変化、摂餌量、解剖時の肝臓重量において有意な差は認められなかった（データ示さず）。
【０１７９】
実施例１０：経口強制投与によるマウス肝臓のＱＲ活性評価
実施例９と同様の条件で各サンプルを投与したマウスから肝臓を回収した。肝臓１００ｍｇ程度に１０倍量のバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ スクロース、ｐＨ８．８）を加えホモジェナイザー（日立製作所製）で破砕した。１００００×ｇ、２０分、４℃で遠心分離し、上清を回収後、タンパク質濃度をブラッドフォード法にて測定した。各サンプルのタンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなる様に上記バッファーで希釈した後、マイクロプレートリーダーを用いて、メナディオン−ホルマザン系による６１０ｎｍの吸光度を測定してＱＲ活性を評価した。
【０１８０】
ＱＲ活性は、対照群を１とする相対活性として算出した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。なお、実験方法は、Hans J et al., J Biol Chem. 1986 Jan 25;261(3):1372-8に記載の方法に従って実施した。また、スティール検定を用いて有意差を判定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０１８１】
その結果、ブナハリタケ酢酸エチル画分を投与した群では、ＱＲの酵素活性の投与量依存的な増加が有意に認められた（図５）。このことから、ブナハリタケ酢酸エチル画分は経口で摂取した場合においても体内のＮｒｆ２を活性化し、Ｎｒｆ２によって制御される遺伝子の発現量を増加させ、これに伴う酵素活性を上昇させることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】実施例５における、ＱＲ活性に対する本発明によるＮｒｆ２活性化化合物およびブナハリタケ酢酸エチル画分の影響を示した図である。
【図２】実施例６における、プロモーター活性に対するブナハリタケ酢酸エチル画分の影響を示した図である。
【図３】実施例７における、Ｎｒｆ２によって制御されている遺伝子（ＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、ＧＣＬＣ）の発現量に対するブナハリタケ酢酸エチル画分の影響を示した図である。
【図４】実施例８における、Ｈ２Ｏ２によって誘導される細胞死に対するブナハリタケ酢酸エチル画分の影響を示した図である。
【図５】実施例１０における、ブナハリタケ酢酸エチル画分を投与したマウスの肝臓におけるＱＲ活性を示した図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブナハリタケ由来の天然化合物を含んでなる、Ｎｒｆ２活性化剤およびＮｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化ストレスが老化を促進させるという考えは、１９５６年にＤｅｎｈａｍ ＨａｒｍａｎによってＴｈｅ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇとして提唱されたもので、高齢化社会を迎えた近年再認識されている（Harman D., J., Gerontol. 11, 298-300 (1956)）。この説は、酸素呼吸を行う中で発生した生体内の活性酸素種（Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｏｘｙｇｅｎ Ｓｐｅｃｉｅｓ（ＲＯＳ））による組織細胞障害が老化を引き起こすというものである。近年、ＲＯＳの発生系とその消去系の研究が進展し、ＲＯＳが細胞障害ばかりでなく、細胞内情報伝達も含めた細胞機能の制御に関連しており、その制御機能の破綻が老化を促進するという研究が進んでいる。
【０００３】
ＲＯＳとは不対電子を配したフリーラジカルを持つ酸素のことである。生体内で発生するＲＯＳとしては、スーパーオキシド（Ｏ２−）、ハイドロキシラジカル（ＨＯ−）、ハイドロゲンペルオキシド（Ｈ２Ｏ２）、やパーオキシナイトライト（ＯＮＯＯ−）などが挙げられる（Shimosawa T., Nippon Rinsho. 2005 Jun;63(6):994-9.）。ＲＯＳは、生理的にはミトコンドリアなどの細胞内小器官や、細胞膜、細胞質などで産生され、酸化ストレスとしてタンパク質、脂質、核酸などを酸化修飾する。その結果、例えば、タンパク質は酸化修飾されることにより、変性や酵素の不活性化を引き起こし、核酸の酸化はＤＮＡの翻訳障害や分解を引き起こす。これらの酸化修飾された生体構成成分の蓄積が細胞組織での障害を引き起こし、ひいては老化、発ガン等の数々の疾病の促進に繋がる。従って、酸化ストレスからの防御能を高めることは、これらの疾病の予防や進行の遅延に有効である（Ferrari CK et al., Biomed Pharmacother. 2003 Jul-Aug;57(5-6):251-60 吉川敏一ら 先端医学社刊 「抗酸化物質のすべて」（１９９８））。
【０００４】
また、近年、環境汚染物質などの本来生体にない様々な化合物（生体異物）が増加し、人体に影響を与えるようになってきた。これらの生体異物は通常、体内に吸収されると、生体異物代謝系酵素群による代謝（解毒）を受けて排出される。しかし、その代謝活性が悪くなると、生体異物（特に、人体に影響を及ぼすもの）が人体に蓄積され、親電子性物質への代謝や肝機能の低下等が引き起こされ、ひいては発ガン、呼吸器疾患、肝機能障害等の数々な疾患に繋がる。（Panuganti SD et al., J Pharmacol Exp Ther. 2006 Jul;318(1):26-34. Epub 2006 Mar 28. Miller JA et al., Cancer Res. 1970 Mar;30(3):559-76 Kohle C et al., Biochem Pharmacol. 2006 Sep 28;72(7):795-805. Epub 2006 Apr 29）。従って、生体異物の解毒能を高めることは、これらの疾病の予防や進行の遅延に有効である。
【０００５】
近年、第二相酵素と呼ばれる一連のタンパク質群が、生体の酸化ストレスからの防御や生体異物の解毒を連携して担っていることが明らかとなってきた。第二相酵素としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素１（ＮＱＯ１）、グルタミルシステインリガーゼ（ＧＣＬ）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ１）、チオレドキシン還元酵素１（ＴＸＮＲＤ１）等が知られている。例えば、ＧＳＴは生体内でグルタチオンと生体異物化合物との複合体の生成を触媒し、親電子性化学物質に対する防御に働く。また、ＮＱＯ１はキノンの２電子還元反応に関与し、キノンの１電子還元に伴って生ずる酸化障害を回避することができる。さらに、ＴＸＮＲＤ１はチオレドキシンの酸化型から還元型への転換を司る酵素であり、還元型チオレドキシンはチオール基を介してＲＯＳ消去や細胞内レドックス制御に関わる。（吉川敏一ら 先端医学社刊 「抗酸化物質のすべて」（１９９８）、井上正康ら 医薬ジャーナル社刊 「レドックス制御と抗酸化治療戦略」）。これら第二相酵素の遺伝子のプロモーターには、抗酸化応答配列（Antioxidant responsive element（ＡＲＥ））と呼ばれる共通の配列が存在し、転写因子NF-E2 related factor 2（Ｎｒｆ２）によってその発現が誘導されることが解明されつつある（Nguyen T et al., Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43:233-60 (2003)、Itoh K et al., Free Radic Biol Med. 2004 May 15;36(10):1208-13）。
【０００６】
Ｎｒｆ２は、非ストレス条件下ではＫｅａｐ１−Ｎｒｆ２複合体として細胞質に局在し、そこに親電子性物質、活性酸素、重金属などの活性化物質が作用すると核内へ移行し、small mafとヘテロ二量体を形成してＡＲＥに結合し、第二相酵素の発現を誘導する（Itoh K et al., Seikagaku. 2006 Feb;78(2):79-92）。
【０００７】
実際、Ｎｒｆ２を欠損したマウス個体や細胞では酸化ストレスや発がん物質への耐性が低くなることが報告されている（Ramos-Gomez M et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Mar 13;98(6):3410-5, Ishii T et al., J Biol Chem. 2000 May 26;275(21):16023-9）。
【０００８】
このように、転写因子Ｎｒｆ２を活性化し、Ｎｒｆ２によって制御されている第二相酵素群の活性を高めることにより、酸化ストレスに対する防御機能を高めて酸化ストレスに起因する各種疾患を治療することができ、また生体異物解毒系を亢進し生体異物が引き起こす発ガンなどのリスクを減らすことができる。従って、転写因子Ｎｒｆ２を活性化することができ、かつ生体にとって安全性の高い医薬品または食品の開発が強く望まれている。
【０００９】
Ｎｒｆ２の活性化物質としては、アブラナ科の野菜に多く含まれるイソチオシアネート系化合物（中でも特にスルフォラファン）が有名である（Zhang Y et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 15;89(6):2399-403）。他のＮｒｆ２の活性化物質としては、１５−デオキシ−Ｄ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄＰＧＪ２）（Itoh T et al., Mol Cell Biol. 2004 Jan;24(1):36-45）、ホップに含まれるキサントフモール（Dietz BM et al., Chem Res Toxicol. 2005 Aug;18(8):1296-305）、ショウガに含まれるショウガオール類縁化合物（特開２００６−１８８４４４号公報）、茶に含まれるエピガロカテキンガレート（Chen C et al., Arch Pharm Res. 2000 Dec;23(6):605-12）などが知られている。
【００１０】
ところで、ブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii） は、９―１１月上旬にブナやミズナラの倒木に群生する白色腐朽菌である。本キノコは、傘の直径は３〜１０ｃｍ、半円形で白色、後に黄色味を帯び、裏面は白く針状で、表面同様、後に黄色味を帯び、肉は白くて軟らかく吸水性があり、独特の香気と呈味を持つことが知られ、食用として珍重されている。主に、東北地方で食されており、別名カミハリタケとも称されている。人工栽培方法としては、これまでに特開２００６−６１６４号公報や特開２００４−３５０５８９号公報等で報告されている。ブナハリタケの持つ生理作用としてこれまでに、糖尿病の予防・改善作用（特許文献１）、抗腫瘍作用（特許文献２）、脳機能改善作用（特許文献３）、血圧降下作用（特許文献４）、血栓溶解作用（特許文献５）などが報告されている。しかしながら、ブナハリタケがＮｒｆ２活性化作用を有すること、ひいては第二相酵素群を誘導し、酸化ストレスからの防御系や生体異物の解毒系を亢進させることについてはこれまで報告されていない。また、これまでに、（Ｅ）−２−デセン−二酸（化合物６）のロイヤルゼリーの成分としての知見（特開昭４８−８７２３号公報）、２−フェニル−５，６−ジヒドロ−γ−ピロン（化合物１０）のキノコフレーバーとしての知見（特許第２９４８８７０号公報）、２−（２−ホルミルピロール−１−イル）−４−メチル吉草酸（化合物１１）のタバコ葉成分としての知見（特開昭５１−１２３８９９号公報）が報告されているが、これらの化合物がＮｒｆ２活性化能を有することは報告されていない。
【特許文献１】特開２００２−１８７８５１号公報
【特許文献２】特開２００２−１８７８５０号公報
【特許文献３】特開２００２−０８０３９０号公報
【特許文献４】特開２００２−０２９９９５号公報
【特許文献５】特開２００６−１３１５５０号公報
【発明の概要】
【００１１】
本発明者は、ブナハリタケ酢酸エチル画分から精製された化合物がＮｒｆ２活性化作用を有することを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
【００１２】
本発明は、Ｎｒｆ２の活性化に有用な新規化合物およびＮｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物の提供を目的とする。
【００１３】
本発明によれば、式（Ｉ）で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物（以下、「本発明による新規化合物」という）が提供される：
【化１】
［上記式中、
Ｒ１は、酸素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ３は、水素原子、水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、またはＣ１−４アルキル基、Ｃ１−４アシル基、カルボキシル基、およびＣ１−４アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニルオキシＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ４は、水素原子またはカルボキシルＣ１−６アルキル基を表し、
- -は、単結合または二重結合を表し、
但し、Ｒ１が酸素原子である場合は- - -は二重結合であり、Ｒ１がＣ１−６アルキル基である場合は- - -は単結合である。］。
【００１４】
本発明によれば、前記式（Ｉ）、あるいは下記式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩａ）、または式（ＶＩＩ）で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物（以下、「本発明によるＮｒｆ２活性化化合物」という）を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物が提供される。
【００１５】
式（ＩＩ）の化合物：
【化２】
［上記式中、
Ｒ１０１は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０２は、水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルカルボニル基；Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アシル基、カルボキシル基、およびＣ１−４アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニルオキシＣ１−６アルキル基；またはフェニル基を表し、Ｒ１０３は、水素原子、水酸基、またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０４は、水素原子、水酸基、またはＣ１−６アルキル基を表し、
- - -は、単結合または二重結合を表す。］。
【００１６】
式（ＩＩＩ）の化合物：
【化３】
［上記式中、
Ｒ１０５は、Ｃ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０６は、カルボキシルＣ１−６アルキル基を表す。］。
【００１７】
式（ＩＶ）の化合物：
【化４】
［上記式中、
ｍは、３から９の整数を表す。］。
【００１８】
式（Ｖ）の化合物：
【化５】
［上記式中、
Ｒ１０７は、１以上の水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基を表す。］。
【００１９】
式（ＶＩ）の化合物：
【化６】
［上記式中、
Ｈｅｔは、異種の環員原子として１つの酸素原子を有する５〜６員の飽和または不飽和複素環式基を表す。］。
式（ＶＩａ）の化合物：
【化７】
［上記式中、
Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚのうち、いずれか１つが酸素原子を表し、それ以外が−ＣＨ２−、＞ＣＨ−、−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−を表す（但し、Ｗが酸素原子である場合は、Ｘ、Ｙ、およびＺが、−ＣＨ２−または＞ＣＨ−であり、Ｚが酸素原子である場合は、Ｗ、Ｘ、およびＹが、−ＣＨ２−または＞ＣＨ−であり、Ｘが酸素原子である場合は、Ｗが−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−、または＞ＣＨ−であり、Ｙが酸素原子である場合は、Ｚが−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−、または＞ＣＨ−である）。］。
【００２０】
式（ＶＩＩ）の化合物：
【化８】
［上記式中、
Ｒ１０８は、Ｃ１−６アルキル基を表す。］
【００２１】
本発明によれば、ブナハリタケ子実体の抽出物（以下、「本発明による抽出物」という）を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物が提供される（以下、これらの組成物を併せて「本発明による組成物」ということがある）。
【００２２】
本発明によれば、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の製造方法であって、本発明による抽出物を精製し、得られた画分についてＮｒｆ２活性化能を測定する工程を含んでなる、方法が提供される。
【００２３】
本発明による新規化合物、Ｎｒｆ２活性化化合物、および抽出物は、古来より食してきたブナハリタケから得られるものである。従って、本発明による新規化合物、Ｎｒｆ２活性化化合物、および抽出物は、安全性が高いＮｒｆ２活性化剤として用いることができる点で有利である。
【発明の具体的な説明】
【００２４】
新規化合物
本願明細書において、基または基の一部としての「アルキル」、「アルコキシ」、および「アシル」という語は、基が直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルコキシ基、およびアシル基を意味する。
Ｃ１−６アルキルは、好ましくは、Ｃ１−４アルキルである。Ｃ１−４アルキルは、好ましくは、Ｃ１−２アルキルである。
Ｃ１−４アルコキシは、好ましくは、Ｃ１−２アルコキシである。
Ｃ１−４アシルは、好ましくは、Ｃ１−２アシルである。
Ｃ１−６アルキルの例としては、メチル、エチル、ｎ‐プロピル、イソプロピル、ｎ‐ブチル、ｉ−ブチル、ｓ‐ブチル、ｔ‐ブチル、ｎ‐ペンチル、ｎ‐ヘキシルが挙げられる。
Ｃ１−４アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、ｎ‐プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ‐ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓ‐ブトキシ、ｔ−ブトキシが挙げられる。
Ｃ１−４アシルの例としては、ホルミル、アセチル、プロピオニリル、ブチリル、イソブチリルが挙げられる。
本明細書において「により置換されていてもよいアルキル」とは、アルキル上の１またはそれ以上の水素原子が１またはそれ以上の置換基（同一または異なっていてもよい）により置換されたアルキルおよび非置換アルキルを意味する。置換基の最大数はアルキル上の置換可能な水素原子の数に依存して決定できることは当業者に明らかであろう。これらはアルキル以外の置換基を有する基についても同様である。
本発明による新規化合物は、前記式（Ｉ）で表される。
【００２５】
式（Ｉ）において、Ｒ１は、好ましくは、酸素原子またはエチル基である。
【００２６】
式（Ｉ）において、Ｒ２は、好ましくは、水素原子またはメチル基である。
【００２７】
式（Ｉ）において、Ｒ３は、好ましくは、水素原子、水酸基で置換されていてもよいエチル基、またはメチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基である。
【００２８】
式（Ｉ）において、Ｒ４は、好ましくは、水素原子またはカルボキシルメチル基である。
【００２９】
本発明による新規化合物の好ましい態様としては、Ｒ１が、酸素原子またはエチル基であり、Ｒ２が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ３が、水素原子、水酸基で置換されていてもよいエチル基、またはメチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基であり、Ｒ４が、水素原子またはカルボキシルメチル基である、式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる。
【００３０】
本発明において、式（Ｉ）で表される化合物の好適な例としては、４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン（化合物２）、酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル（化合物４）、および（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸（化合物５）が挙げられる。
【００３１】
本発明による新規化合物は、公知の方法に従って、エゾハリタケ科ブナハリタケ属に属するブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）子実体から抽出し、精製することにより製造することができる。
【００３２】
Ｎｒｆ２活性化化合物
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＩＩ）で表すことができる。
【００３３】
式（ＩＩ）において、Ｒ１０１は、好ましくは、水素原子またはメチル基である。さらに好ましくは、Ｒ１０１は、水素原子である。
【００３４】
式（ＩＩ）において、Ｒ１０２は、好ましくは、メチル基、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、メチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基、またはフェニル基である。さらに好ましくは、Ｒ１０２は、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、またはフェニル基である。さらにより好ましくは、Ｒ１０２は、フェニル基である。
【００３５】
式（ＩＩ）において、Ｒ１０３は、好ましくは、水素原子、水酸基、またはメチル基である。さらに好ましくは、Ｒ１０３は水素原子である。
【００３６】
式（ＩＩ）において、Ｒ１０４は、好ましくは、水素原子、水酸基、またはメチル基である。さらに好ましくは、Ｒ１０４は水素原子である。
【００３７】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｒ１０１が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ１０２が、メチル基、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、メチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基、またはフェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子、水酸基、またはメチル基であり、Ｒ１０４が、水素原子、水酸基、またはメチル基である、式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００３８】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物のさらに好ましい態様としては、Ｒ１０１が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ１０２が、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、またはフェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子であり、Ｒ１０４が、水素原子である、式（ＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００３９】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物のさらにより好ましい態様としては、Ｒ１０１は、水素原子であり、Ｒ１０２は、フェニル基であり、Ｒ１０３は、水素原子であり、Ｒ１０４は、水素原子である、式（ＩＩ）で表される化合物（化合物９）が挙げられる。
【００４０】
本発明において、式（ＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、４−アセチル−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン（化合物１）、４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン（化合物２）、５−ヒドロキシ−３，４，５−トリメチル−５−Ｈ−フラン−２−オン（化合物３）、酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル（化合物４）、ジヒドロ−４−フェニル−２（３Ｈ）−フラノン（化合物９）が挙げられる。
【００４１】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＩＩＩ）で表すことができる。
【００４２】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１０５は、好ましくは、エチル基である。
【００４３】
式（ＩＩＩ）において、Ｒ１０６は、好ましくは、カルボキシルメチル基である。
【００４４】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｒ１０５が、エチル基であり、Ｒ１０６が、カルボキシルメチル基である、式（ＩＩＩ）で表される化合物（化合物５）が挙げられる。
【００４５】
本発明において、式（ＩＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸（化合物５）が挙げられる。
【００４６】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＩＶ）で表すことができる。
【００４７】
式（ＩＶ）において、ｍは、好ましくは、５から７の整数である。さらに好ましくは、ｍは６である。
【００４８】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、ｍが６である、式（ＩＶ）で表される化合物（化合物６）が挙げられる。
【００４９】
本発明において、式（ＩＶ）で表される化合物の好適な例としては、（Ｅ）−２−デセン−二酸（化合物６）が挙げられる。
【００５０】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、式（Ｖ）で表すことができる。
【００５１】
式（Ｖ）において、Ｒ１０７は、好ましくは、１以上の水酸基で置換されていてもよいペンチル基であり、より好ましくは、１または２個の水酸基により置換されたペンチル基である。
【００５２】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｒ１０７が、１以上の水酸基で置換されていてもよいペンチル基である、式（Ｖ）で表される化合物が挙げられる。
【００５３】
本発明において、式（Ｖ）で表される化合物の好適な例としては、１−フェニル−ペンタン―１，３−ジオール（化合物７）が挙げられる。
【００５４】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＶＩ）で表すことができる。
【００５５】
式（ＶＩ）の化合物は、好ましくは、前記式（ＶＩａ）で表すことができる。
【００５６】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｗが酸素原子であり、Ｘ、Ｙ、およびＺが−ＣＨ２−または＞ＣＨ−である式（ＶＩａ）で表される化合物、およびＺが酸素原子であり、Ｗ、Ｘ、およびＹが−ＣＨ２−または＞ＣＨ−である式（ＶＩａ）で表される化合物が挙げられる。
【００５７】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、また、Ｘが酸素原子であり、Ｗが−ＣＨ＝ＣＨ−または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ＝または＞Ｃ＝である式（ＶＩａ）で表される化合物、およびＹが酸素原子であり、Ｚが−ＣＨ＝ＣＨ−または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ＝または＞Ｃ＝である式（ＶＩａ）で表される化合物が挙げられる。
【００５８】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、また、Ｘが酸素原子であり、Ｗが−ＣＨ２−ＣＨ２−または＞ＣＨ−ＣＨ２−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ＝または＞Ｃ＝である式（ＶＩａ）で表される化合物、Ｘが酸素原子であり、Ｗが−ＣＨ＝ＣＨ−または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ２−または＞ＣＨ−である式（ＶＩａ）で表される化合物、Ｙが酸素原子であり、Ｚが−ＣＨ２−ＣＨ２−または＞ＣＨ−ＣＨ２−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ＝または＞Ｃ＝である式（ＶＩａ）で表される化合物、およびＹが酸素原子であり、Ｚが−ＣＨ＝ＣＨ−または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ２−または＞ＣＨ−である式（ＶＩａ）で表される化合物が挙げられる。
【００５９】
本発明において、式（ＶＩ）で表される化合物の好適な例としては、２−フェニル−ピラン−４−オン（化合物８）、ジヒドロ−４−フェニル−２（３Ｈ）−フラノン（化合物９）、および２−フェニル−５，６−ジヒドロ−γ−ピロン（化合物１０）が挙げられる。
【００６０】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、前記式（ＶＩＩ）で表すことができる。
【００６１】
式（ＶＩＩ）において、Ｒ１０８は、好ましくは、分岐鎖のＣ１−６アルキル基であり、より好ましくは分岐鎖のブチル基である。
【００６２】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物の好ましい態様としては、Ｒ１０８が、分岐鎖のＣ１−６アルキル基である、式（ＶＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【００６３】
本発明において、式（ＶＩＩ）で表される化合物の好適な例としては、２−（２−ホルミルピロール−１−イル）−４−メチル吉草酸（化合物１１）が挙げられる。
【００６４】
本発明においては、式（Ｉ）で表される新規化合物もＮｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いることができる。
【００６５】
式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）の化合物は、薬学上許容される塩とすることができ、例えば、酸付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩等の無機酸塩；クエン酸塩、シュウ酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、サリチル酸塩等の有機酸塩が挙げられる。また、カルボキシル基を有する化合物は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の金属との塩、リジン等のアミノ酸との塩とすることもできる。
【００６６】
式（Ｉ）〜（ＶＩＩ）のいずれかで表される化合物およびその塩は、薬学上許容される溶媒和物とすることができ、例えば、水和物、アルコール和物（例えば、メタノール和物、エタノール和物）、エーテル和物が挙げられる。
【００６７】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、市販されているものを入手することができる。
【００６８】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物は、公知の方法に従って製造することもできる。
【００６９】
例えば、化合物１は、特開昭５１−０４１３５０号公報、Forzato C et al., Tetrahedron Asymmetry (2005), 16(18), 3011-3023、Piskov V. B., Zhurnal Obshchei Khimii (1960), 30 1390-5に従って製造することができる。
【００７０】
化合物３は、Fabian W M et al., Eur. J. Org. Chem. (2001), 2 303-309、Scheffold R at al., Helv. Chim. Acta (1967) 50(3) 798-807に従って製造することができる。
【００７１】
化合物６は、Noda N et al., Lipids (2005), 40(8), 833-838、Fujisawa T et al., Chem. Lett. (1982), (2) 219-20に従って製造することができる。
【００７２】
化合物７は、Bartoli G et al., Eur. J. Org. Chem. (2001), 24 4679-4684、Emerson W S et al., J. Org. Chem. (1945), 10 464-9に従って製造することができる。
【００７３】
化合物８は、Groundwater P W et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1, (1997), (2), 163-169、Koreeda M et al., Tetrahedron Lett. (1980), 21(13), 1197-200に従って製造することができる。
【００７４】
化合物９は、特開２００４−２６９４９０号公報、Bolm C et al., Synlett (2004), (9), 1619-1621、Pharm I et al., Archiv der Pharmazie (Weinheim, Germany) (1993), 326(12), 941-5に従って製造することができる。
【００７５】
化合物１０は、特許２９４８８７０号公報、Centro N C et al., Gazzetta Chimica Italiana (1966), 96(8-9), 1073-83に従って製造することができる。
【００７６】
化合物１１は、Abell A D et al., Tetrahedron Letters (1992), 33(39), 5831-2、特開昭５１−１２３８９９号公報に従って製造することができる。
【００７７】
本発明において有効成分として用いられる化合物は、ブナハリタケ子実体から精製された化合物を使用することができる。各種キノコ類について、ＱＲ活性誘導能を評価したところ、ブナハリタケは高いＱＲ活性誘導能を有した。また、ブナハリタケは食用キノコであり、人工栽培が可能である。従って、本発明においては、ブナハリタケ子実体を利用するものである。
【００７８】
ブナハリタケ子実体から精製された化合物としては、ブナハリタケ子実体由来であってＮｆｒ２活性化作用を有する化合物であればどのようなものでもよいが、好ましくは、式（ＩＩ）〜（ＶＩＩ）のいずれかで表される化合物である。本発明においては、有効成分としてブナハリタケ子実体をそのまま使用することもできるし、ブナハリタケ子実体抽出物を使用することもできる。
【００７９】
本発明において使用されるブナハリタケ子実体は、ヒダナシタケ目（Aphyllophorales）エゾハリタケ科（Climacodontaceae）に属するブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）の子実体である。
【００８０】
ブナハリタケ子実体としては、自然界に自生する天然の子実体、人工栽培された子実体が挙げられるが、成分含量等が生息地域や気候等により影響されないため品質が安定している点、周年安定的に収穫することができる点で人工栽培されたブナハリタケ子実体が好ましい。
【００８１】
人工栽培方法としては、菌床栽培、原木栽培等が挙げられるが、成分含量等の品質が安定したブナハリタケを安価かつ周年安定的に収穫することができる点で菌床栽培が好ましい。
【００８２】
ここで、「菌床栽培」とは、原木を用いることなく、保水体と栄養源からなる素材に種菌を接種し、温度、湿度、照度などを制御した環境下で栽培する方法を意味し、具体的な菌床栽培方法としては、特開２００３−０２４０４６号公報に記載されている方法などが挙げられるがこれらの方法に限定されない。
【００８３】
ブナハリタケ子実体をそのまま有効成分として使用する場合は、ブナハリタケ子実体をそのまま使用してもよいし、ブナハリタケ子実体を風乾、熱風乾燥または凍結乾燥後に粉砕した粉砕物を使用してもよい。また該粉砕物を常法により顆粒化、カプセル化、錠剤化したもの、ペーストなどを使用してもよい。また、このように粉砕した粉砕物の懸濁液または懸濁物であっても、Ｎｒｆ２活性化作用を有している限り使用することができる。
【００８４】
本発明において有効成分として用いられるブナハリタケ子実体抽出物は、公知の方法に従って抽出し、調製することができる。
【００８５】
ブナハリタケ子実体抽出物は、ブナハリタケ子実体をそのまま抽出操作に供することができるが、乾燥工程を経てから抽出操作に供することもできる。例えば凍結乾燥したブナハリタケ子実体を粉砕した後、抽出操作に供することにより、調製することができる。抽出操作は、例えば、溶媒中にブナハリタケ子実体を懸濁し、そのまま攪拌もしくは、超音波処理、磨砕、フレンチプレス等により菌体を破砕して行うことができる。これら抽出操作によって得られた粗抽出物は、必要に応じて、遠心分離、濾過等の固液分離操作を単独又は複数組み合わせて固形物を除去することができる。得られた液はさらに、エタノール等に対する溶解度の差による分離や酢酸エチル等を用いた液液分配によって分離することもできる。得られたブナハリタケ子実体抽出物（液体）をさらに処理したもの、例えば、濃縮物、凍結乾燥物、部分精製物などの液体または固体形態として使用してもよい。
【００８６】
抽出において使用可能な溶媒としては、０℃〜１００℃の水、適当な緩衝液、適当な有機溶媒（例えばメタノール、エタノールなどのアルコール類）、または適当な有機溶媒と水との混合液（例えばエタノール水）等が挙げられるが、好ましくは熱水、より好ましくは１００℃の熱水である。抽出時間は、特に制限されるものではないが、５分間以上、好ましくは３０分間程度である。次いで遠心分離またはろ過することによってブナハリタケ子実体の抽出液を得ることができる。抽出液量は、特に制限されるものではないが、コスト面、抽出効率面等からして乾燥キノコ重量に対して１０倍量程度の水を用いることが好ましい。抽出溶媒として、エタノールなどの溶媒を適宜添加することもできるが、コスト面や製造現場での扱いやすさの点で、水のみで抽出したほうが望ましい。
【００８７】
子実体は生のまま抽出してもよいが、乾燥させて保存可能とした子実体から抽出した方が、品質の優れた抽出液もしくは抽出物が得られる点で好ましい。また、乾燥させた子実体を粉砕した後、抽出する方が抽出率が向上するので好ましい。
【００８８】
乾燥方法としては、熱風乾燥方法、風乾、スプレードライ、真空（もしくは減圧）乾燥、凍結乾燥方法等公知の乾燥方法であれば特に制限されるものではないが、Ｎｒｆ２活性化作用の低下を抑制する点で凍結乾燥法が好ましい。
【００８９】
本発明の好ましい態様によれば、凍結乾燥ブナハリタケ粉砕物を、１００℃の熱水中に懸濁し、攪拌しながら抽出を行い、濾過にて固液分離し、エタノール溶液に対する溶解度の差によって分離した後、さらに酢酸エチルで分配することによりブナハリタケ子実体抽出物を得ることができる。
【００９０】
抽出物に存在するＮｒｆ２活性化能を有する物質をさらに精製してもよく、この場合、公知の分離、精製法を適当に組み合わせて行うことができる。
【００９１】
活性物質のさらなる精製のために使用できる方法として、例えば、液液分配および有機溶媒沈澱のような溶解性を利用する方法、ゲルろ過のような分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の差を利用する方法、疎水クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーのような疎水性の差を利用する方法、再結晶処理方法、再沈殿処理方法、冷却により生じた析出物を回収する処理方法、酸塩基分配、密度勾配を利用した分離方法、蒸気圧に基づく分離方法等が挙げられる。また、抽出、精製後の濃縮についても、公知の方法であればどのような方法でもよく、減圧加熱濃縮などを具体的に例示することができる。さらに抽出、精製後の乾燥についても、公知の方法であればどのような方法でもよく、風乾法、加熱乾燥法、スプレードライ法、凍結乾燥法などを具体的に例示することができる。
【００９２】
製造方法
本発明による製造方法は、好ましくは、Ｎｒｆ２活性化化合物を製造する方法であって、下記工程：
（ａ）抽出溶媒を用いてブナハリタケ子実体を抽出する工程；
（ｂ）工程（ａ）により得られた抽出物を分画する工程；
（ｃ）工程（ｂ）により得られた画分について、Ｎｒｆ２活性化能を測定する工程；および
（ｄ）Ｎｒｆ２活性化能を有すると判定された画分を精製する工程
を含んでなる方法である。
【００９３】
工程（ｃ）において、例えば、ＱＲ活性、ＡＲＥプロモーター活性、各種第二相酵素の発現等を測定することにより、得られた画分がＮｒｆ２活性化能を有するか否か判定することができる（後記実施例５〜７を参照）。ここで、例えば、ＱＲ活性の上昇、ＡＲＥプロモーター活性の増加、各種第二相酵素の発現の増加が確認された場合に、得られた画分Ｎｒｆ２活性化能を有する、すなわち本発明によるＮｒｆ２活性化化合物を含む画分である、と判定することができる。
【００９４】
工程（ｄ）において、精製は、公知の方法に従って行うことができる。例えば、得られた画分を濃縮、結晶化することによって本発明によるＮｒｆ２活性化化合物を得ることができる。
【００９５】
用途
転写因子Ｎｒｆ２は、生体の酸化ストレスに対する防御能や生体異物の解毒と深く関連していることが知られている。具体的には、転写因子Ｎｒｆ２は、第二相酵素群に対し、プロモーター中のＡＲＥに結合することで該遺伝子の発現を誘導することが知られており、このＮｒｆ２活性化にともなう一連の第二相酵素群の発現増加が、酸化ストレスからの防御や生体異物の解毒を亢進することが知られている。
【００９６】
Ｎｒｆ２は、酸化ストレス状態になると、酸化ストレスに応答して細胞質より核に移行し、ＡＲＥに結合し、酸化ストレス防御や抗酸化に有効に働く第二相酵素の発現を誘導することにより酸化ストレス防御系を亢進する。酸化ストレス防御系が亢進されると酸化ストレス状態が改善され、酸化ストレスに起因する各種疾患が改善されることが期待される。例えば、加齢に伴う慢性疾患の一つである加齢性黄斑変性症は、老化に伴って発症し、老齢者で失明を引き起こす代表的な疾患である。この疾患の原因としては網膜色素上皮細胞に対する光酸化ストレスが示唆されており、脂質およびタンパク質の酸化産物の蓄積が危険因子として知られている。光酸化ストレスを網膜色素上皮細胞に与えると、細胞内の過酸化脂質量が増大して細胞は死滅するが、第二相酵素の誘導能をもつスルフォラファンやビス（２−ヒドロキシベンジリデン）アセトンはこれを抑制することが示されている（Gao X et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Jul 13;101(28):10446-51）。また、グルタチオン量の低下などによって引き起こされる、生体の酸化ストレスに対する防御能の低下は、血中においてＲＯＳを増加させ、高血圧を引き起すことがある。ＲＯＳの一種であるペルオキシナイトライトは強い炎症惹起物質でもあり、その生成は動脈硬化巣の形成にも繋がる可能性が指摘されている。しかしながら、脳卒中易発高血圧自然発症ラット（ＳＨＲsp）において、グルコラファニン（スルフォラファンの代謝前駆体）を多量に含むブロッコリースプラウトを投与することによって、血圧上昇の抑制、血管内皮機能の改善が可能であることが示されている（Wu L et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 May 4;101(18):7094-9）。このことは、グルタチオン量の増加および第二相酵素の誘導が高血圧の改善に有効であることが示されている。
【００９７】
Ｎｒｆ２はまた、酸化ストレス防御系に加えて、解毒系も亢進する。薬剤や環境化学物質などの生体にとって異物となる物質が代謝される生体異物代謝系（解毒系）は、転写因子ＡｈＲ、ＣＡＲなどによって制御される第一相酵素群と、Ｎｒｆ２によって制御される第二相酵素群から構成されている。生体異物は第一相酵素群によってオキソ中間体に変換された後、第二相酵素群によってより水溶性の高い誘導体に変化されて体外へ排出される（Rushmore TH et al., Curr Drug Metab. 2002 Oct;3(5):481-90）。この際、第一相酵素反応後のオキソ中間体は非常に強い毒性物質である場合が多い。例えば、発ガン性物質として知られるベンゾピレンは、ＣＹＰ１Ａ１などの第一相酵素群により代謝された後、ベンゾピレンジオールエポキシドとなり、次いでＧＳＴなどの第二相酵素群によってグルタチオンやグルクロン酸抱合され、体外に排出される。この際、中間体であるベンゾピレンジオールエポキシドはＤＮＡに結合しＤＮＡの複製過程に障害を引き起こしてガン化の原因になると言われている（Motohashi H et al., Trends Mol Med. 2004 Nov;10(11):549-57）。このことから、第二相酵素群の活性を高め、有害な中間体をより早く代謝して体外へ排出することができれば、発ガンを抑制することができると考えられる。また、ディーゼルエンジンが排気する粒子状汚染物質で生体異物の一種であるＤＥＰ（diesel exhaust particles）は、呼吸器疾患などの症状を引き起こすことが知られているが、Ｎｒｆ２活性化によって誘導されるＧＳＴ、ＮＱＯ１、ＨＯ１は、ＤＥＰによる酸化ストレスやＤＥＰ中のキノンの毒性に対する防御を担っていることが報告されている（Li N et al., J Immunol. 2004 Sep 1;173(5):3467-81）。このことから、環境汚染物質等によって引き起こされる各種疾患の予防、改善に、Ｎｒｆ２活性化物質が有効であると考えられている。
【００９８】
上記以外にも、Ｎｒｆ２の活性化物質が、酸化ストレスまたは生体異物により引き起こされる疾患、例えば、炎症（Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 May 4;101(18):7094-9）、発ガン（Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Mar 15;89(6):2399-403 Carcinogenesis. 2000 Dec;21(12):2287-91 Fahey Jwet al., Food Chem Toxicol. 1999 Sep-Oct;37(9-10):973-9）、皮膚障害（J Clin Invest. 2004 Jan;113(1):65-73）、ピロリ菌防御（Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 May 28;99(11):7610-5）、神経変性疾患（Curr Drug Targets CNS Neurol Disord. 2005 Jun;4(3):267-81）、環境化学物質解毒（Toxicol Sci. 2006 Mar;90(1):111-9. Epub 2005 Dec 13）、肝機能障害（Toxicol Sci. 2006 Mar;90(1):111-9. Epub 2005 Dec 13）、自己免疫疾患（Am J Pathol. 2006 Jun;168(6):1960-74）、糖尿病（Transplant Proc. 2006 Jan-Feb;38(1):282-3）等の症状を改善することがこれまでに報告されている。
【００９９】
実施例によれば、本発明において有効成分として用いられるブナハリタケ酢酸エチル画分は、第二相酵素であるＮＱＯ１の発現増加により上昇することが知られているキノン還元酵素（ＱＲ）の活性（実施例５）、ＡＲＥプロモーター活性（実施例６）、各種第二相酵素の遺伝子発現（実施例７）をそれぞれ増加させた。また、本発明によるブナハリタケ酢酸エチル画分は、活性酸素による細胞死滅を抑制した（実施例８）。さらに、本発明によるブナハリタケ酢酸エチル画分が経口投与されたマウスの肝臓および小腸上皮において、第二相酵素群の発現（実施例９）、肝臓におけるＱＲ活性（実施例１０）が増加した。これらの結果から、ブナハリタケ酢酸エチル画分が、転写因子Ｎｒｆ２を活性化する機能を有することが示された。
【０１００】
実施例によれば、また、本発明において有効成分として用いられるブナハリタケ抽出物から単離、精製された化合物１〜１１が、ＱＲ活性を増加させた（実施例５）。これらの結果から、化合物１〜１１が、転写因子Ｎｒｆ２を活性化する機能を有することが示された。
【０１０１】
従って、本発明による有効成分、すなわち、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物および本発明による抽出物は、転写因子Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いることができる。
【０１０２】
本願明細書において、「Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患」としては、酸化ストレスにより引き起こされる疾患および生体異物により引き起こされる疾患が挙げられる。
【０１０３】
本願明細書において、「酸化ストレス」とは生体内において発生したＲＯＳなどが有する酸化損傷力が、生体内の抗酸化システムが有する抗酸化ポテンシャルを上回った状態を意味する。「酸化ストレスにより引き起こされる疾患」としては、加齢に伴う慢性疾患（例えば、加齢性黄斑変性症等）、動脈硬化、高血圧、糖尿病、発ガン、肝機能障害、潰瘍、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、自己免疫疾患、シミ、シワ、眼疾患、呼吸器疾患（例えば、気管支炎等）、喘息、炎症（例えば、胃炎、肝炎、皮膚炎等）、脳梗塞、心筋梗塞等が挙げられる。
【０１０４】
本願明細書において、「生体異物」とは本来生体には存在しない物質を意味し、特に生体にとって有害な化合物を意味する。「生体異物により引き起こされる疾患」としては呼吸器疾患（例えば、気管支炎等）、肝機能障害、発ガン、自己免疫疾患等が挙げられる。
【０１０５】
本願明細書において、「治療」とは、予防および改善を含む意味で用いられるものとする。
【０１０６】
本願明細書において、「疾患」とは、状態を含む意味で用いられるものとする。
【０１０７】
本願明細書において、「疾患の治療」は、疾患または状態の、調節、進行の遅延、緩和、発症予防、再発予防、抑制などを含む意味で使用される。
【０１０８】
本発明によれば、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を含んでなる、Ｎｒｆ２活性化剤が提供される。
【０１０９】
本発明によれば、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を含んでなる、酸化ストレス防御剤、抗酸化剤、および生体異物の解毒剤が提供される。
【０１１０】
本発明によれば、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療剤の製造のための、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物の使用が提供される。
【０１１１】
本発明によれば、また、Ｎｒｆ２活性化剤の製造のための、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物の使用が提供される。
【０１１２】
本発明によれば、また、酸化ストレス防御剤、抗酸化剤、または生体異物の解毒剤の製造のための、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物の使用が提供される。
【０１１３】
本発明によれば、治療上の有効量の本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療方法が提供される。
【０１１４】
本発明によれば、また、有効量の本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化方法が提供される。
【０１１５】
本発明によれば、また、有効量の本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を、ヒトを含む哺乳類に投与する工程を含んでなる、酸化ストレス防御方法、抗酸化方法、および生体異物の解毒方法が提供される。
【０１１６】
医薬組成物および食品
本発明による組成物および用剤を医薬として用いる場合には、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を有効成分として用い、薬学的に許容されうる担体、賦形剤、結合剤、希釈剤などと混合することにより製造できる。
【０１１７】
有効成分としては、例えば子実体の粉砕物（例えば、粉末）、懸濁液、抽出物、またはその抽出物をさらに精製したものでもよく、あるいは有効成分を含む混合物でもよいし、または実質的に単一になるまで精製された物でもよい。
【０１１８】
本発明による組成物および用剤は、経口または非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤（糖衣錠を含む）、溶液剤、丸剤、軟質または硬質カプセル剤、シロップ剤、ペースト剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。非経口剤としては、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、外用剤（例えば、経鼻投与製剤、経皮製剤、軟膏剤）、坐剤（例えば、直腸坐剤、膣坐剤）、点眼剤等が挙げられる。これらの製剤は、当分野で通常行われている手法により、薬学的に許容される担体（例えば、賦形剤、添加剤）とともに製剤化することができる。薬学的に許容される賦形剤や添加剤としては、担体、結合剤、香料、緩衝剤、増粘剤、着色剤、安定剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、湿潤剤、滑沢剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、例えば、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、低融点ワックス、カカオバター等が挙げられる。
【０１１９】
製剤は、例えば下記のようにして製造できる。
【０１２０】
経口剤は、有効成分として、例えば賦形剤（例えば、乳糖、白糖、デンプン、マンニトール）、崩壊剤（例えば、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム）、結合剤（例えば、α化デンプン、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）または滑沢剤（例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００）を添加して圧縮成形し、次いで必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性の目的のため自体公知の方法でコーティングすることにより製造することができる。コーティング剤としては、例えばエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレートおよびオイドラギット（ローム社製、ドイツ、メタアクリル酸・アクリル酸共重合物）などを用いることができる。
【０１２１】
注射剤は、有効成分を分散剤（例えば、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）８０（アトラスパウダー社製、米国）、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール）、等張化剤（例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖、転化糖）などと共に水性溶剤（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液等）あるいは油性溶剤（例えば、オリーブ油、ゴマ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコール）などに溶解、懸濁あるいは乳化することにより製造することができる。この際、所望により溶解補助剤（例えば、サリチル酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）等の添加物を添加してもよい。
【０１２２】
製剤化に当たっては、本発明による有効成分以外の１種以上の有効成分を更に配合してもよい。また本発明による有効成分の投与に当たっては、本発明による有効成分以外の１種またはそれ以上の医療上有効な有効成分を組み合わせて投与してもよい。
【０１２３】
本発明による組成物および用剤は、医薬品への適用のみならず、食品への適用も意図されている。従って、本発明による組成物および用剤の食品への適用に当たっては、後述するような食品に関する記述を参照することができる。
【０１２４】
本発明による食品は、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物を有効量含有した食品である。ここで「有効量含有した」とは、個々の食品において通常喫食される量を摂取した場合に、後述するような範囲で有効成分が摂取されるような含有量をいう。本発明による食品には、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物をそのままあるいは上記のような組成物の形態で、食品に配合することができる。より具体的には、本発明による食品は、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物をそのまま、食品として調製したもの、各種タンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類等を更に配合したもの、液状、半液体状若しくは固体状にしたもの、ペースト状のもの、一般の食品へ添加したものであってもよい。本発明による食品は、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物と、アブラナ科植物、ホップ、ショウガ、茶等のＮｒｆ２活性化が報告されている食品、ワイン、茶、ハーブ等の抗酸化活性が報告されている食品、コーヒー、瓜類、ハーブティー等の利尿効果が高い食品とを組み合わせて使用してもよい。本発明において「食品」は、医薬以外のものであって、哺乳動物が摂取可能なものであればその形態に特に制限はない。
【０１２５】
本発明において「食品」とは、健康食品（例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、栄養補助食品）、機能性食品、病者用食品を含む意味で用いられる。
【０１２６】
上記健康食品はまた、通常の食品の形状であっても、栄養補助食品の形状（例えば、サプリメント）であってもよい。
【０１２７】
また「食品」の形態は特に限定されるものではなく、例えば、飲料の形態であってもよい。
【０１２８】
本発明による食品は、Ｎｒｆ２活性化機能、Ｎｒｆ２の活性化に伴い改善または緩和される状態の改善または緩和機能を期待する消費者に適した食品、すなわち、特定保健用食品、として提供することができる。ここでいう「特定保健用食品」とは、Ｎｒｆ２活性化、Ｎｒｆ２の活性化に伴い改善または緩和される状態の改善または緩和等を目的として食品の製造または販売等を行う場合に、保健上の観点から法上の何らかの制限を受けることがある食品をいう。
【０１２９】
本発明によれば、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物またはブナハリタケ抽出物を有効量含んでなる食品であって、Ｎｒｆ２活性化機能、Ｎｒｆ２の活性化に伴い改善または緩和される状態の改善または緩和機能が表示された食品が提供される。ここで、上記の各種機能は、食品の本体、容器、包装、説明書、添付文書、または宣伝物のいずれかに表示することができる。
【０１３０】
本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物の添加・配合の対象である日常摂取する飲食品としては、例えば、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類（アルコール性飲料）、コーヒー、紅茶、茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、クッキー、パン、ケーキ、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、プリン、ゼリー、アイスクリーム類などの冷菓、チューインガム、キャンディ等の菓子類や、クラッカー、チップス等のスナック類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、つけもの、酢づけ、アルコールづけ、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ、スープ、シチュー等の各種総菜などを例示することができるが、これらに特に制限されない。
【０１３１】
本発明のより好ましい態様によれば、添加・配合の対象である食品としては、野菜搾汁液と混合した飲料、茶系飲料が挙げられる。
【０１３２】
本発明において提供される飲料（飲料形態の健康食品や機能性食品を含む）の製造に当たっては、通常の飲料の処方設計に用いられている糖類、香料、果汁、食品添加剤などを適宜添加することができる。飲料の製造に当たってはまた、当業界に公知の製造技術を参照することができ、例えば、「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）を参考とすることができる。
【０１３３】
本発明による組成物の有効成分である、本発明によるＮｒｆ２活性化化合物または本発明による抽出物は、人類が食品として長年摂取してきたブナハリタケに含まれるものであることから、毒性も低く、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、サル等）に対し安全に用いられる。本発明による有効成分の投与量または摂取量は、受容者、受容者の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、薬剤の組み合わせ等に応じて適宜決定できる。例えば、本発明による有効成分を医薬として経口投与する場合、成人１人当たり、乾燥子実体換算で約１００ｍｇ〜約２０ｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは１ｇ〜５ｇ／ｋｇ体重／日の範囲で投与することができる。本発明による有効成分と組み合わせて用いる他の作用機序を有する薬剤も、それぞれ臨床上用いられる用量を基準として適宜決定できる。また、食品として摂取する場合には、成人１人１日当たり０．１〜１００ｇ、好ましくは１〜１０ｇ程度の摂取量となるよう本発明による有効成分を食品に配合することができる。
【実施例】
【０１３４】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【０１３５】
実施例１：菌床栽培法を用いたブナハリタケ子実体乾燥粉末の調製
ブナオガクズ３８０ｇ、乾燥ビール粕３７．５ｇ、乾燥おから３７．５ｇ、水道水５４５ｇを混合した計１０００ｇを、１．２ｋｇ用ＰＰ（ポリプロピレン）製袋に詰めて培地を作製した。さらにこの袋にフィルターをはさんだポリプロピレン製キャップをして１２１℃、５０分加圧滅菌し、滅菌後の培地を冷却した後、特許生物寄託センターにＦＥＲM ＢＰ−６６９７として寄託されているブナハリタケの種菌を接種し、暗所にて温度２３〜２５℃、湿度６０〜８０％の条件で４０日間前培養を行い、次に中培養工程へ移行した。中培養工程では、温度１３〜１５℃、湿度８０〜９５％、照度２００ルックスの条件下で、３０日間培養するとブナハリタケ原基が形成された。袋内に直径約３ｃｍ程度の原基が認められる部分の袋部の１箇所を切り取り、次いで後培養工程へ移行した。後培養工程では、温度１３〜１５℃、湿度８０〜９５％、照度２００ルックスの条件下で、１７日間培養すると１株のブナハリタケ子実体へと成長した。得られたブナハリタケ子実体は２３２．５ｇで、栽培に要した総日数は８７日であった。
【０１３６】
上記菌床栽培にて得られたブナハリタケ子実体３ｋｇを、収穫後直ちに４℃にて最長１週間まで冷蔵保存しておき、熱風乾燥機にて６５℃で６時間乾燥処理を行い、ブナハリタケ子実体乾燥品０．３ｋｇを得た。ブナハリタケ子実体乾燥品を、粉砕機を用いて粉砕し、ブナハリタケ子実体乾燥粉末とした。
【０１３７】
実施例２：ブナハリタケ子実体乾燥粉末熱水抽出物を出発物質とした粗抽出プロセス
実施例１の方法を用いて調製した５３０ｇのブナハリタケ子実体乾燥粉末を１０倍量の精製水を用いて３０分間熱水抽出し、ろ紙にてろ過したものをロータリーエバポレーター中で減圧濃縮し、ブナハリタケ子実体乾燥粉末の熱水抽出物２０８ｇを得た。この抽出物に１０倍量の８０％エタノール溶液を加え攪拌した後、５０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、上清を回収し、エバポレーター中で減圧濃縮した。この抽出物を５倍量の精製水に再溶解し、続いて酢酸エチルで３回液液分配を行い、その後濃縮した。さらに抽出物を８０％メタノール溶液に再溶解し、ヘキサンで3回液液分配を行った後、８０％メタノール層を減圧濃縮して６．０ｇの乾燥物を得た。
【０１３８】
実施例３：活性化合物の単離
実施例２で得られた乾燥物をクロロホルム：メタノール＝５０：１溶液に再溶解しシリカゲル（ワコーゲル：和光純薬社製）を充填したカラムに付し、クロロホルムに対するメタノール含量を、クロロホルム：メタノール＝５０：１、２０：１、１：１、メタノール１００％と順次増やして溶出した。このうち、クロロホルム：メタノール＝５０：１の混合溶液で溶出されてきた画分を集めて減圧濃縮し、クロロホルム：メタノール＝４０：１溶液に再溶解し、シリカゲルを充填したカラムに再度付した。クロロホルム：メタノール＝４０：１溶液をシリカゲル容量の５倍量カラムに添加し、溶出されてきた画分を５ｍｌずつ回収した。各画分を薄層クロマトグラフィーにて展開し、リンモリブテン酸（シグマ社製）にて呈色させ、その結果によって６画分（Ｆ１〜Ｆ６）に大別した。
【０１３９】
上記６画分についてＱＲアッセイを行い、その中で最も強い活性を示した画分Ｆ２を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりさらに精製した。まず、下記溶出条件（１）で粗精製し、化合物１，２については（２），（３）、化合物３については（４）、化合物４，５については（５），（６）、化合物６については（５）、化合物７については（７），（８）、化合物８については（７）、化合物９，１０については（９）、化合物１１については（１０），（１１）で引き続き精製した。
（１）カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ−１８（１０×２５０ｍｍ、ＹＭＣ社製）、流速：１．５ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）３５−１００％
（２）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（１０×２５０ｍｍ、資生堂社製）、流速：４．７ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器（共に島津製作所社製）、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）メタノール、溶出条件：Ｂ）５％一定
（３）カラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ａｍｉｄｅ−８０（４．６×２５０ｍｍ、東ソー社製）、流速：１．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器、溶媒：Ａ）アセトニトリル、溶出条件：Ａ）１００％一定
（４）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（１０×２５０ｍｍ）、流速：３．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）１０％一定
（５）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（１０×２５０ｍｍ）、流速：４．７ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）２０％一定
（６）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：１．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）１０％一定
（７）カラム：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＨＳ ＰＥＧ（１０×２５０ｍｍ、ＳＵＰＥＬＣＯ社製）、流速：２．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器，示差屈折検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）１０％一定
（８）カラム：Ｘｔｅｒｒａ ｐｈｅｎｙｌ（４．６×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社製）、流速：１．０ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．１％ギ酸 Ｂ）メタノール、溶出条件：Ｂ）１８％一定
（９）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＡＱ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：１．５ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．２％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）１８％一定
（１０）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＭＧ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：１．２ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．２％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）４５％一定
（１１）カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ ＭＧ Ｃ−１８（４．６×２５０ｍｍ）、流速：１．２ｍｌ／分、温度：４０℃、検出：ダイオードアレイ検出器、溶媒：Ａ）０．２％ギ酸 Ｂ）アセトニトリル、溶出条件：Ｂ）３０％一定
【０１４０】
実施例４：単離した化合物の構造決定
単離した化合物の各種スペクトルデータは以下の通りである。
【０１４１】
化学式１：４−アセチル−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン
【化９】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ4.52（1H, t, J=9.0），4.20（1H, t, J=9.0），3.27（1H, q, J=9.3），2.85（1H, dq），2.22（3H, s），1.29（3H, d, J=6.7）
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ206.8，180.7，68.0，56.3，38.0，29.4，15.1
ESI-MS：m/z 142.9[M+H]+
[α]20D = -28.7（c 0.035, CH3OH）
【０１４２】
化合物２：４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン
【化１０】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ4.33（1H, t, J=8.6），3.96（1H, t, J=8.9），3.77（1H, m），2.59（1H, dq），2.26-2.17（1H, m），1.30（3H, d, J=7.6），1.17(1H, d, J=6.5)
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ182.9，69.7，69.3，51.3，38.4，21.5，16.6
ESI-MS：m/z 145.0[M+H]+
[α]20D = 15.9（c 0.013, CH3OH）
【０１４３】
化合物３：５−ヒドロキシ−３，４，５−トリメチル−５−Ｈ−フラン−２−オン
【化１１】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ1.97（3H, s），1.79（3H, s），1.62（3H, s）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ172.3，158.8，124.3，105.6，23.4，10.5，8.4
ESI-MS：m/z 142.9[M+H]+
【０１４４】
化合物４：酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル
【化１２】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ4.54-4.51（1H, m），4.28（1H, m），4.08（1H, m），2.99-2.97（1H, m），2.50-2.49（1H, m），2.02（3H, s），1.39（3H, d, J=5.9），1.18(3H, d, J=6.7)
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ181.7，172.4，79.4，63.6，45.3，36.8，20.6，20.3，10.3
ESI-MS：m/z 186.9[M+H]+
[α]20D = -3.7（c 0.013, CH3OH）
【０１４５】
化合物５：（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸
【化１３】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ4.35-4.32（1H, m），3.91-3.88（1H, m），2.54-2.38（2H, m），2.14-2.02（2H, m），1.66-1.40（4H, m），0.90（3H, t, J=7.5）
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ175.7，81.1，76.7，42.3，32.8，32.2，29.6，10.4
ESI-MS：m/z 156.8[M-H]-
[α]20D = 2.3（c 0.021, CH3OH）
【０１４６】
化合物６：（Ｅ）−２−デセン−二酸
【化１４】
1H-NMR（CD3OD，400 MHz）：δ6.97-6.89（1H, m），5.79（1H, d, J=15.6），2.29-2.19（4H, m），1.62-1.58（2H, m），1.49-1.46（2H, m），1.38-1.34（4H, m）
13C-NMR（CD3OD，100 MHz）：δ178.2，170.9，151.3，123.3，35.5，33.5，30.5，30.4，29.6，26.5
ESI-MS：m/z 198.9[M-H]-
【０１４７】
化合物７：１−フェニル−ペンタン―１，３−ジオール
【化１５】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.39-7.26（5H, m），4.95（1H, dd, J=8.8, 4.4），3.90-3.89（1H, m），1.84-1.80（2H, m），1.62-1.51（2H, m），0.94（3H, t, J=7.4）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ144.5，128.5, 125.7，127.6，75.5，74.1，44.9，30.9，9.6
ESI-MS：m/z 203.1[M+Na]+
【０１４８】
化合物８：２−フェニル−ピラン−４−オン
【化１６】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.82（1H, d, J=6.4），7.73（2H, dd），7.50-7.43（3H, m），6.77（1H, d, J=2.4），6.36（1H, dd, J=2.5, 6.1）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ179.2，164.0, 154.8，131.5，131.2，129.1，125.8，117.1，112.4
ESI-MS：m/z 173.0[M+H]+
【０１４９】
化合物９：ジヒドロ−４−フェニル−２（３Ｈ）−フラノン
【化１７】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.39（2H, dd, J=7.0, 7.1），7.31（1H, dd, J=7.0, 7.0），7.24（2H, d, J=7.1），4.68（1H, dd, J=8.0, 9.2），4.28（1H, dd, J=8.0, 8.9），3.80（1H, m），2.94（1H, dd, J=8.3, 17.5），2.69（1H, dd, J=9.1, 17.5）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ176.4，139.4, 129.1，127.7，126.7，74.0，41.1，35.7
ESI-MS：m/z 163.0[M+H]+
【０１５０】
化合物１０：２−フェニル−５，６−ジヒドロ−γ−ピロン
【化１８】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ7.74（2H, d, J=7.8），7.48（1H, dd, J=7.7, 7.7），7.42（2H, dd, J=7.7, 7.8），6.03（1H, s），4.67（2H, t, J=6.6），2.67（2H, t, J=6.6）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ192.7，170.6, 132.7，131.7，128.7，126.5，102.5，68.2，36.0
ESI-MS：m/z 175.0[M+H]+
【０１５１】
化合物１１：２−（２−ホルミルピロール−１−イル）−４−メチル吉草酸
【化１９】
1H-NMR（CDCl3，400 MHz）：δ9.48（1H, s），7.17（1H, m），6.99（1H, m），6.32（1H, m），5.98（1H, m），2.00（2H, m），1.41（1H, m），0.92（3H, d, J=7.2），0.90（3H, d, J=7.6）
13C-NMR（CDCl3，100 MHz）：δ180.0，175.1, 131.7，130.0，126.0，110.7，57.8，40.8，24.8，22.9，21.4
EI-MS：m/z 209 [M]+
【０１５２】
実施例５：キノン還元酵素活性試験
キノン還元酵素（ＱＲ）活性は、Ｎｒｆ２活性化によるＮＱＯ１の発現増加によって上昇することが知られている（Proc Natl Acad Sci U S A. 101 10446-51 (2004)）。そこで、実施例２で調製したブナハリタケ酢酸エチル画分（以下、「ブナハリタケ酢酸エチル画分」という。）が、Ｎｒｆ２活性化能を有するか否かについて、ＱＲ活性を指標として測定を行った。
【０１５３】
ＱＲ活性の測定は、Prochaska HJ et al., Anal Biochem. 1988 Mar;169(2):328-36に記載の方法に従って実施した。
【０１５４】
マウス肝ガン細胞Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞（大日本住友製薬より入手）を９６穴マイクロプレートに、７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％牛胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）とペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、シグマ社製）とを含有するα−ＭＥＭ培地（インビトロジェン社製）を５０μｌ加えて、３７℃でかつ５％ＣＯ２条件下で１晩培養した。次いで、この培養培地を、実施例２で調製したブナハリタケ酢酸エチル画分と実施例３で単離された化合物１〜１１がそれぞれ１００μｇ／ｍｌの濃度となるように調製した培地に交換し、さらに４８時間培養した。その後、０．０８％ジギトニン、および、２ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用いて各ウェルの細胞を破砕し、マイクロプレートリーダーを用いて、メナディオン−ホルマザン系による６１０ｎｍの吸光度を測定した。
【０１５５】
ＱＲ誘導活性は、無添加の細胞の活性を１とする相対活性として算出した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。ポジティブコントロールとしては、Ｎｒｆ２の活性化物質であるスルフォラファン（３μＭ）（シグマ社製）を使用した。また、ｔ検定を用いて有意差を判定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０１５６】
その結果、ブナハリタケ酢酸エチル画分および化合物１〜１１の添加によるＱＲ活性の上昇が認められた（図１）。特に、化合物９が最も高いＱＲ活性化能を示した。
【０１５７】
実施例６：ＡＲＥレポーターアッセイ系におけるＮｒｆ２活性化能評価
Ｎｒｆ２は、ＡＲＥに結合し、第二相酵素の発現を誘導することが知られている（Itoh K et al., Seikagaku. 2006 Feb;78(2):79-92）。そこで、ブナハリタケ酢酸エチル画分が、Ｎｒｆ２活性化能を有するか否かについて、ＡＲＥプロモーター活性を指標として測定を行った。
【０１５８】
ＡＲＥプロモーター活性の測定は、ＡＲＥレポーターアッセイ系を用いて実施した。
【０１５９】
レポータープラスミドｐＧＬ３−ｍＡＲＥ３は、Ｎｒｆ２が結合するとされるマウスＮＱＯ１由来ＡＲＥ（antioxidant response element）を３回繰り返した二本鎖オリゴＤＮＡを作製し、これを、ホタルルシフェラーゼレポーターベクターpGL3-promoter vector（プロメガ社より入手可能）のＭｌｕＩ−ＮｈｅＩ部位に挿入することによって構築した。
【０１６０】
ＡＲＥを含む二本鎖オリゴＤＮＡは
5'-TCGACGCGTAGAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATTAGAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATTAGAGTCACAGTGAGTCGGCAAAATTGCTAGCTAG-3’（配列番号：１）、および
5'-CTAGCTAGCAATTTTGCCGACTCACTGTGACTCTAATTTTGCCGACTCACTGTGACTCTAATTTTGCCGACTCACTGTGACTCTACGCGTCGA-3'（配列番号：２）
の２本の一本鎖オリゴＤＮＡを化学合成し、アニーリングさせて調製した。また、目的のプラスミドであることは塩基配列解析により確認した。
【０１６１】
次に、１２穴マイクロプレートに４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのマウス・マクロファージ系細胞ＲＡＷ２６４．７（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を播種し、１０％牛胎仔血清、およびペニシリン-ストレプトマイシン（それぞれ１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（シグマ社製）０．８ｍｌを加えて、３７℃でかつ５％ＣＯ２条件下で１晩培養した。この細胞に１．０μｇのｐＧＬ３−ｍＡＲＥ３と０．０１μｇの補正用ウミシイタケ由来ルシフェラーゼレポーターベクターｐｈＲＬ−ＴＫ（プロメガ社）をSuperFect Transfection試薬（キアゲン社製）を用いてトランスフェクションした。３時間トランスフェクションした後、培地を新しいものに交換し、ここにブナハリタケ酢酸エチル画分（１００、２００μｇ／ｍｌ）と、ポジティブコントロールとしてスルフォラファン（８μＭ）を添加して２４時間培養した後、細胞を回収した。デュアルルシフェランス・レポーター・アッセイ・システム（Ｄual-Luciferase reporter assay system）（プロメガ社製）を用いて細胞破砕した後、ホタルルシフェラーゼ活性およびウミシイタケルシフェラーゼ活性を、ルミノメーター（ARVO Light Luminescence Counter、パーキンエルマー社製）により測定した。
【０１６２】
ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性で除した値を相対ルシフェラーゼ活性とした（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。
【０１６３】
その結果、ブナハリタケ酢酸エチル画分の添加により、濃度依存的にＡＲＥプロモーター活性が増加されることが確認された（図２）。従って、実施例５で確認されたブナハリタケ酢酸エチル画分が有するＱＲ活性誘導能はＮｒｆ２活性化を介して起きていることが示唆された。
【０１６４】
実施例７：Ｎｒｆ２によって制御される各種遺伝子の発現量解析
Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞を９６穴マイクロプレートに、７×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％牛胎仔血清とペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）とを含有するα−ＭＥＭ培地を５０μｌ加えて、３７℃でかつ５％ＣＯ２条件下で１晩培養した。次いで、この培養培地を、実施例２で調製した酢酸エチル画分がそれぞれ５０、１００、２００μｇ／ｍｌの濃度となるように調製した培地と、ポジティブコントロールとしてスルフォラファン（３μＭ）を含んだ培地にそれぞれ交換し、さらに１２時間培養した。
【０１６５】
その後、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を用いてtotal ＲＮＡを調製し、RNeasy Mini（キアゲン社製）およびRNase-Free DNase Set（キアゲン社製）を用いて精製した。さらに、精製された５μｇのtotal ＲＮＡからThermo Script RT-PCRシステム（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成し、SYBR(R) Premix Ex TaqTM reagent（タカラバイオ社製）およびライトサイクラー（ロシュ社製）を使用して、各種第二相酵素遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。
【０１６６】
各遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨの発現量で補正し、相対発現量を算出した（ｎ＝２、平均値±標準偏差）。
【０１６７】
なお、遺伝子発現解析に使用したＤＮＡプライマーは、
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼｍｕ１（Glutathione S-transferase mu1（ＧＳＴＭ１））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5’-TGCCCGAAAGCACCACCTGGAT-3’（配列番号：３）、および
5’-ACCATGGCCTCTTGCCCAGGAA-3’（配列番号：４）、
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノン酸化還元酵素（NAD(P)H:quinone oxidoreductase (ＮＱＯ１)）のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5’-ACAGCATTGGCCACACTCCACCA-3’（配列番号：５）、および
5’-TGATGGCCCACAGAGAGGCCAAA-3’（配列番号：６）、
グルタメートシステインリガーゼ触媒サブユニット（Glutamate cysteine ligase catalytic subunit（ＧＣＬＣ））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5'-TCTGCAAAGGCGGCAACGCTGT-3' （配列番号：７）、および
5'-GCATCGGGTGTCCACATCAACTTCC-3' （配列番号：８）、
グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（ＧＡＰＤＨ））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5'-TCTGCCGATGCCCCCATGTTTG-3' （配列番号：１３）
5'-TGGGTGGCAGTGATGGCATGGA-3' （配列番号：１４）
であり、全てインビトロジェン社で合成した。ＧＳＴＭ１やＮＱＯ１は解毒に関する酵素であり、ＧＣＬＣは抗酸化物質のグルタチオンの合成を司る酵素である。
【０１６８】
その結果、実施例５においてＱＲ活性誘導能を示したブナハリタケ酢酸エチル画分について、Ｎｒｆ２によって制御される各種遺伝子の発現量変動を調べたところ、Ｎｒｆ２によって発現増加することが知られる標的遺伝子ＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、ＧＣＬＣの発現を、ポジティブコントロールとして使用したスルフォラファンと同様に増加させた（図３）。従って、ブナハリタケ酢酸エチル画分は、Ｎｒｆ２を活性化し、それにより第二相酵素と呼ばれる一連の遺伝子群の発現を増加させて抗酸化や解毒系を亢進させることが明らかとなった。
【０１６９】
実施例８：過酸化水素による細胞死の抑制作用
９６穴マイクロプレートにおいて２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＲＡＷ２６４．７細胞を、各サンプル、１０％牛胎仔血清、およびペニシリン−ストレプトマイシン（それぞれ１００単位／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ）を含有する１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地を加えて、３７℃でかつ５％ＣＯ２条件下、１晩培養した。ここで、各サンプルは、実施例２で調製した酢酸エチル画分を使用し、濃度が２５、５０、１００μｇ／ｍｌとなるよう添加した、また、ポジディブコントロールとしてスルフォラファン（３μＭ）を使用した。ここに過酸化水素（和光純薬社製）を最終濃度が０．２，０．４，０．８ｍＭとなるように添加してさらに２時間培養した。その後、Cell Counting Kit-8（同仁化学社製）を用いて４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定し細胞生存率を測定した。細胞生存率は、各サンプルについて過酸化水素無添加を１００％として算出した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。
【０１７０】
その結果、ブナハリタケ酢酸エチル画分は、スルフォラファンと同様に過酸化水素、すなわち活性酸素による細胞の死滅を抑制することが確認された（図４）。
【０１７１】
実施例９：経口強制投与によるマウス肝臓および小腸上皮の遺伝子発現量変化
Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒ１Ｃｒ１ｊマウス雄性７週齢（チャールス・リバー社より入手、ｎ＝７−８）をＡＩＮ−７６Ａ（エトキシキン不含、リサーチダイエット社製）食で１週間飼育し馴化した。その後、ブナハリタケ酢酸エチル画分を３０ｍｇ／匹／日、または１５ｍｇ／匹／日で３日間、経口強制投与した。同様に対照群として精製水を、ポジティブコントロール群としてスルフォラファン（１ｍｇ／匹／日）をマウスに投与した。
【０１７２】
最終投与２４時間後にエーテル麻酔下で肝臓と小腸上皮を回収し、直ちに液体窒素で凍結し、使用時まで−８０℃で保存した。各臓器のＲＮＡは、実施例７と同様の方法で精製し、ｃＤＮＡを合成した後、各遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した。
【０１７３】
各遺伝子の発現量はＧＡＰＤＨの発現量で補正し、相対発現量を算出した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。なお、肝臓ではＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、ＧＣＬＣ、Ｃｙｐ１Ａ１、およびＣｙｐ１Ａ２を、小腸上皮ではＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、およびＧＣＬＣ遺伝子に対して測定を行った。また、遺伝子発現量解析に使用したＤＮＡプライマーは実施例７と同じ物に加え、以下のものをインビトロジェン社で合成して用いた。
【０１７４】
シトクロムＰ４５０ １Ａ１（Cytochrome P450 1A1（Ｃｙｐ１Ａ１））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5'-TGGGGCTTGCCCTTCATTGGTC-3' （配列番号９）、および
5'-TCTGGCCGGCCCTTGAAGTCAT-3' （配列番号１０）
を使用した。
【０１７５】
また、シトクロムＰ４５０ １Ａ２（Cytochrome P450 1A2（Ｃｙｐ１Ａ２））のセンスおよびアンチセンスプライマーとして
5'-TCGGCCATCGACAAGACCCAGA-3' （配列番号１１）、および
5'-TGTTCACAGGTCCCGGGCTTCA-3' （配列番号１２）
を使用した。
【０１７６】
また、スティール検定を用いて有意差を判定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０１７７】
その結果を表１に示す。
【表１】
【０１７８】
これにより、ブナハリタケ酢酸エチル画分を投与した群では、第二相酵素として代表的なＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、およびＧＣＬＣの有意な発現増加が認められた。ＧＳＴＭ１やＮＱＯ１は解毒に関する酵素であり、ＧＣＬＣは抗酸化物質のグルタチオンの合成を司る酵素である。このため、ブナハリタケ酢酸エチル画分により解毒作用と抗酸化作用が亢進されたものと考えられる。一方、ブナハリタケ酢酸エチル画分を投与した群では、発がん物質の活性化に関与する第一相酵素として代表的なＣｙｐ１Ａ１やＣｙｐ１Ａ２の発現増大は認められなかった。このことから、ブナハリタケ酢酸エチル画分は、解毒系の代謝において、第二相酵素群の発現を選択的に増加させることも明らかとなった。このことから、ブナハリタケ酢酸エチル画分は、経口で摂取した場合においても体内のＮｒｆ２を活性化し、第二相酵素と呼ばれる一連の遺伝子群の発現を増加させることが示された。なお、各サンプル投与期間中における体重変化、摂餌量、解剖時の肝臓重量において有意な差は認められなかった（データ示さず）。
【０１７９】
実施例１０：経口強制投与によるマウス肝臓のＱＲ活性評価
実施例９と同様の条件で各サンプルを投与したマウスから肝臓を回収した。肝臓１００ｍｇ程度に１０倍量のバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ スクロース、ｐＨ８．８）を加えホモジェナイザー（日立製作所製）で破砕した。１００００×ｇ、２０分、４℃で遠心分離し、上清を回収後、タンパク質濃度をブラッドフォード法にて測定した。各サンプルのタンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌとなる様に上記バッファーで希釈した後、マイクロプレートリーダーを用いて、メナディオン−ホルマザン系による６１０ｎｍの吸光度を測定してＱＲ活性を評価した。
【０１８０】
ＱＲ活性は、対照群を１とする相対活性として算出した（ｎ＝３、平均値±標準偏差）。なお、実験方法は、Hans J et al., J Biol Chem. 1986 Jan 25;261(3):1372-8に記載の方法に従って実施した。また、スティール検定を用いて有意差を判定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。
【０１８１】
その結果、ブナハリタケ酢酸エチル画分を投与した群では、ＱＲの酵素活性の投与量依存的な増加が有意に認められた（図５）。このことから、ブナハリタケ酢酸エチル画分は経口で摂取した場合においても体内のＮｒｆ２を活性化し、Ｎｒｆ２によって制御される遺伝子の発現量を増加させ、これに伴う酵素活性を上昇させることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】実施例５における、ＱＲ活性に対する本発明によるＮｒｆ２活性化化合物およびブナハリタケ酢酸エチル画分の影響を示した図である。
【図２】実施例６における、プロモーター活性に対するブナハリタケ酢酸エチル画分の影響を示した図である。
【図３】実施例７における、Ｎｒｆ２によって制御されている遺伝子（ＧＳＴＭ１、ＮＱＯ１、ＧＣＬＣ）の発現量に対するブナハリタケ酢酸エチル画分の影響を示した図である。
【図４】実施例８における、Ｈ２Ｏ２によって誘導される細胞死に対するブナハリタケ酢酸エチル画分の影響を示した図である。
【図５】実施例１０における、ブナハリタケ酢酸エチル画分を投与したマウスの肝臓におけるＱＲ活性を示した図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
［上記式中、
Ｒ１は、酸素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ３は、水素原子、水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、またはＣ１−４アルキル基、Ｃ１−４アシル基、カルボキシル基、およびＣ１−４アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニルオキシＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ４は、水素原子またはカルボキシルＣ１−６アルキル基を表し、
- - -は、単結合または二重結合を表し、
但し、Ｒ１が酸素原子である場合は- - -は二重結合であり、Ｒ１がＣ１−６アルキル基である場合は- - -は単結合である。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１が、酸素原子またはエチル基であり、Ｒ２が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ３が、水素原子、水酸基で置換されていてもよいエチル基、またはメチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基であり、Ｒ４が、水素原子またはカルボキシルメチル基である、請求項１に記載の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物が、
４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン、
酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル、および
（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物。
【請求項４】
エゾハリタケ科ブナハリタケ属に属するブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）子実体由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物。
【請求項５】
式（ＩＩ）：
【化２】
［上記式中、
Ｒ１０１は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０２は、水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルカルボニル基；Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アシル基、カルボキシル基、およびＣ１−４アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニルオキシＣ１−６アルキル基；またはフェニル基を表し、Ｒ１０３は、水素原子、水酸基、またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０４は、水素原子、水酸基、またはＣ１−６アルキル基を表し、
- - -は、単結合または二重結合を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項６】
Ｒ１０１が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ１０２が、メチル基、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、メチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基、またはフェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子、水酸基、またはメチル基であり、Ｒ１０４が、水素原子、水酸基、またはメチル基である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ１０１が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ１０２が、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、またはフェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子であり、Ｒ１０４が、水素原子である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１０１が、水素原子であり、Ｒ１０２が、フェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子であり、Ｒ１０４が、水素原子である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
［上記式中、
Ｒ１０５は、Ｃ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０６は、カルボキシルＣ１−６アルキル基を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１０】
Ｒ１０５が、エチル基であり、Ｒ１０６が、カルボキシルメチル基である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
式（ＩＶ）：
【化４】
［上記式中、
ｍは、３から９の整数を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１２】
ｍが６である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
式（Ｖ）：
【化５】
［上記式中、
Ｒ１０７は、１以上の水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１４】
Ｒ１０７が、１以上の水酸基で置換されていてもよいペンチル基である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
式（ＶＩ）：
【化６】
［上記式中、
Ｈｅｔは、異種の環員原子として１つの酸素原子を有する５〜６員の飽和または不飽和複素環式基を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１６】
式（ＶＩ）の化合物が、式（ＶＩａ）：
【化７】
［上記式中、
Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚのうち、いずれか１つが酸素原子を表し、それ以外が−ＣＨ２−、＞ＣＨ−、−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−を表す（但し、Ｗが酸素原子である場合は、Ｘ、Ｙ、およびＺが、−ＣＨ２−または＞ＣＨ−であり、Ｚが酸素原子である場合は、Ｗ、Ｘ、およびＹが、−ＣＨ２−または＞ＣＨ−であり、Ｘが酸素原子である場合は、Ｗが−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−、または＞ＣＨ−であり、Ｙが酸素原子である場合は、Ｚが−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−、または＞ＣＨ−である）。］で表される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
式（ＶＩＩ）：
【化８】
［上記式中、
Ｒ１０８は、Ｃ１−６アルキル基を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１８】
Ｒ１０８が、分岐鎖のＣ１−６アルキル基である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項２０】
有効成分が、
４−アセチル−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン、
４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン、
５−ヒドロキシ−３，４，５−トリメチル−５−Ｈ−フラン−２−オン、
酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル、
（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸、
（Ｅ）−２−デセン−二酸、
１−フェニル−ペンタン―１，３−ジオール、
２−フェニル−ピラン−４−オン、
ジヒドロ−４−フェニル−２（３Ｈ）−フラノン、
２−フェニル−５，６−ジヒドロ−γ−ピロン、および
２−（２−ホルミルピロール−１−イル）−４−メチル吉草酸
からなる群から選択される、請求項５〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
有効成分が、ブナハリタケ子実体由来である、請求項５〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ブナハリタケ子実体の抽出物を含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項２３】
ブナハリタケ子実体が、乾燥粉砕物であることを特徴とする、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ブナハリタケ子実体の抽出物が、ブナハリタケ子実体を水性溶媒で抽出することにより得られる抽出物であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
水性溶媒で抽出した後、酢酸エチルで分配することを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患が、酸化ストレスにより引き起こされる疾患である、請求項５〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
酸化ストレスにより引き起こされる疾患が、加齢に伴う慢性疾患、動脈硬化、高血圧、糖尿病、発ガン、肝機能障害、潰瘍、神経変性疾患、自己免疫疾患、シミ、シワ、眼疾患、呼吸器疾患、喘息、炎症、脳梗塞、および心筋梗塞からなる群から選択されるである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患が、生体異物により引き起こされる疾患である、請求項５〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
生体異物により引き起こされる疾患が、呼吸器疾患、肝機能障害、発ガン、および自己免疫疾患からなる群から選択されるである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項５〜２１のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法であって、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のブナハリタケ子実体の抽出物を精製し、得られた画分についてＮｒｆ２活性化能を測定する工程を含んでなる、方法。
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
［上記式中、
Ｒ１は、酸素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ２は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ３は、水素原子、水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、またはＣ１−４アルキル基、Ｃ１−４アシル基、カルボキシル基、およびＣ１−４アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニルオキシＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ４は、水素原子またはカルボキシルＣ１−６アルキル基を表し、
- - -は、単結合または二重結合を表し、
但し、Ｒ１が酸素原子である場合は- - -は二重結合であり、Ｒ１がＣ１−６アルキル基である場合は- - -は単結合である。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１が、酸素原子またはエチル基であり、Ｒ２が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ３が、水素原子、水酸基で置換されていてもよいエチル基、またはメチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基であり、Ｒ４が、水素原子またはカルボキシルメチル基である、請求項１に記載の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物が、
４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン、
酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル、および
（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸
からなる群から選択される、請求項１または２に記載の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物。
【請求項４】
エゾハリタケ科ブナハリタケ属に属するブナハリタケ（Mycoleptodonoides aitchisonii）子実体由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物。
【請求項５】
式（ＩＩ）：
【化２】
［上記式中、
Ｒ１０１は、水素原子またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０２は、水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；Ｃ１−６アルキルカルボニル基；Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アシル基、カルボキシル基、およびＣ１−４アルコキシカルボニル基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキルカルボニルオキシＣ１−６アルキル基；またはフェニル基を表し、Ｒ１０３は、水素原子、水酸基、またはＣ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０４は、水素原子、水酸基、またはＣ１−６アルキル基を表し、
- - -は、単結合または二重結合を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項６】
Ｒ１０１が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ１０２が、メチル基、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、メチル基で置換されていてもよいアセチルオキシメチル基、またはフェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子、水酸基、またはメチル基であり、Ｒ１０４が、水素原子、水酸基、またはメチル基である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ１０１が、水素原子またはメチル基であり、Ｒ１０２が、水酸基で置換されていてもよいエチル基、メチルカルボニル基、またはフェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子であり、Ｒ１０４が、水素原子である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１０１が、水素原子であり、Ｒ１０２が、フェニル基であり、Ｒ１０３が、水素原子であり、Ｒ１０４が、水素原子である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
［上記式中、
Ｒ１０５は、Ｃ１−６アルキル基を表し、Ｒ１０６は、カルボキシルＣ１−６アルキル基を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１０】
Ｒ１０５が、エチル基であり、Ｒ１０６が、カルボキシルメチル基である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
式（ＩＶ）：
【化４】
［上記式中、
ｍは、３から９の整数を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１２】
ｍが６である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
式（Ｖ）：
【化５】
［上記式中、
Ｒ１０７は、１以上の水酸基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１４】
Ｒ１０７が、１以上の水酸基で置換されていてもよいペンチル基である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
式（ＶＩ）：
【化６】
［上記式中、
Ｈｅｔは、異種の環員原子として１つの酸素原子を有する５〜６員の飽和または不飽和複素環式基を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１６】
式（ＶＩ）の化合物が、式（ＶＩａ）：
【化７】
［上記式中、
Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚのうち、いずれか１つが酸素原子を表し、それ以外が−ＣＨ２−、＞ＣＨ−、−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−を表す（但し、Ｗが酸素原子である場合は、Ｘ、Ｙ、およびＺが、−ＣＨ２−または＞ＣＨ−であり、Ｚが酸素原子である場合は、Ｗ、Ｘ、およびＹが、−ＣＨ２−または＞ＣＨ−であり、Ｘが酸素原子である場合は、Ｗが−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＹおよびＺが−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−、または＞ＣＨ−であり、Ｙが酸素原子である場合は、Ｚが−ＣＨ２−ＣＨ２−、＞ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または＞Ｃ＝ＣＨ−であり、ＷおよびＸが−ＣＨ＝、＞Ｃ＝、−ＣＨ２−、または＞ＣＨ−である）。］で表される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
式（ＶＩＩ）：
【化８】
［上記式中、
Ｒ１０８は、Ｃ１−６アルキル基を表す。］
で表される化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項１８】
Ｒ１０８が、分岐鎖のＣ１−６アルキル基である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１または２に記載の式（Ｉ）の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物を有効成分として含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項２０】
有効成分が、
４−アセチル−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン、
４−（１−ヒドロキシ−エチル）−３−メチル−ジヒドロ−フラン−２−オン、
５−ヒドロキシ−３，４，５−トリメチル−５−Ｈ−フラン−２−オン、
酢酸１−（４−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−エチルエステル、
（５−エチル−テトラヒドロ−フラン−２−イル）−酢酸、
（Ｅ）−２−デセン−二酸、
１−フェニル−ペンタン―１，３−ジオール、
２−フェニル−ピラン−４−オン、
ジヒドロ−４−フェニル−２（３Ｈ）−フラノン、
２−フェニル−５，６−ジヒドロ−γ−ピロン、および
２−（２−ホルミルピロール−１−イル）−４−メチル吉草酸
からなる群から選択される、請求項５〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
有効成分が、ブナハリタケ子実体由来である、請求項５〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
ブナハリタケ子実体の抽出物を含んでなる、Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患の治療に用いられる組成物。
【請求項２３】
ブナハリタケ子実体が、乾燥粉砕物であることを特徴とする、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ブナハリタケ子実体の抽出物が、ブナハリタケ子実体を水性溶媒で抽出することにより得られる抽出物であることを特徴とする、請求項２２または２３に記載の組成物。
【請求項２５】
水性溶媒で抽出した後、酢酸エチルで分配することを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患が、酸化ストレスにより引き起こされる疾患である、請求項５〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
酸化ストレスにより引き起こされる疾患が、加齢に伴う慢性疾患、動脈硬化、高血圧、糖尿病、発ガン、肝機能障害、潰瘍、神経変性疾患、自己免疫疾患、シミ、シワ、眼疾患、呼吸器疾患、喘息、炎症、脳梗塞、および心筋梗塞からなる群から選択されるである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｎｒｆ２の活性化が治療に有効である疾患が、生体異物により引き起こされる疾患である、請求項５〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
生体異物により引き起こされる疾患が、呼吸器疾患、肝機能障害、発ガン、および自己免疫疾患からなる群から選択されるである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項５〜２１のいずれか一項に記載の化合物若しくはその薬学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法であって、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載のブナハリタケ子実体の抽出物を精製し、得られた画分についてＮｒｆ２活性化能を測定する工程を含んでなる、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−２０８０３８（Ｐ２００８−２０８０３８Ａ）
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４３７８３（Ｐ２００７−４３７８３）
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２３日（２００７．２．２３）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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