がんを処置するためのＨＡＭＬＥＴ及びＨＤＡＣ阻害剤の治療的組み合わせ物
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物学的に活性な修飾物又はこれらのいずれかの生物学的に活性な断片である構成要素（ｉ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である構成要素（ｉｉ）の組み合わせ。この組み合わせは、例えば増殖性疾患、例えば腫瘍を産生する疾患の処置に相乗効果を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性疾患、例えばがんのような腫瘍を発生させる疾患の処置に特に有効であることが見出された生物学的に活性な構成要素の組み合わせ物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＭＬＥＴ（Ｈｕｍａｎ α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｍａｄｅ ｌｅｔｈａｌ ｔｏ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ）は、腫瘍細胞の細胞死を誘導する分子複合体である。実際にこの効果は、腫瘍細胞及び一部の未熟細胞に選択的であり、そして健康な分化した細胞は、ＨＡＭＬＥＴに反応して細胞死を受けることはない。この選択性は、ＨＡＭＬＥＴが腫瘍細胞に独特な標的に到達するが、抵抗性細胞には到達しないことを意味している。
【０００３】
類似の活性を有するこの複合体の生物学的に活性な変異体又は誘導体は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０３／０１２９３号に記載されている。
【０００４】
ＨＡＭＬＥＴの細胞標的は、共焦点顕微鏡法及び細胞下分画法（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）を組み合わせることによって調べられている［Ｈａｋａｎｓｓｏｎら、１９９９ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２４６、４５１−６０］。ＨＡＭＬＥＴは細胞表面に結合し、そして細胞質に入り、ここでミトコンドリアと相互作用し、そしてミトコンドリアを活性化する。最終的に、このタンパク質は細胞核に入り、ここに蓄積する。
【０００５】
本発明者らは耐性細胞及び感受性細胞が、同様の効率でその細胞表面にＨＡＭＬＥＴを結合することを見出し、これは際立った事象ではないことを示唆している。対照的に核での蓄積は、瀕死の細胞にしか生じておらず、この段階が感受性細胞と抵抗性細胞とを区別していることを示唆している。共焦点顕微鏡法によれば、この核での蓄積は不可逆的なようであり、核分画においてＨＡＭＬＥＴを結合しそしてＨＡＭＬＥＴを保持する核標的の存在を示唆している。
【０００６】
本発明者らは、ＨＡＭＬＥＴの核内分布をより精密に試験し、そしてこのタンパク質が、核小体に対応する領域に選択的に局在化することを見出し、これはＨＡＭＬＥＴが、クロマチン構造の調節に関与する分子と相互作用することを意味していると結論付けた。
【０００７】
さらなる研究の結果として、ＨＡＭＬＥＴの核標的が同定された。驚くべきことに、ヒストンテールの存在とは無関係の様式で、ＨＡＭＬＥＴは特異的なヒストンタンパク質と相互作用することが見出された（ＷＯ２００３／０９８２２３を参照のこと）。従って、この相互作用は、細胞を死の経路に不可逆的に閉じ込める事象であり得るようである。ＨＡＭＬＥＴは、抗腫瘍分野においてこの作用様式を有する点で独特なようである。
【０００８】
しかし、その作用機構、及び特にクロマチン摂動（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｅ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）の機構については何もわかっておらず、そして細胞生存能に対する効果もわかっていない。
【０００９】
ヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、それぞれヒストンテールのリジン残基のアセチル化及び脱アセチル化を調節する。ヒストンアセチル化の増大は、負荷電塩基との静電相互作用を減弱させ、ヒストンとＤＮＡとの相互作用を減少させ、そして転写因子が標的遺伝子に接近できるようにする。
【００１０】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、がん抑制遺伝子を含む複数の遺伝子の転写を抑制するので、多発性がんに関与している。
【００１１】
ＨＤＡＣは、ヒトのがんを処置する酵素的阻害剤の開発のための分子標的として浮上してきた。ＨＤＡＣは一般に、腫瘍で過剰発現され、そしてｐ２１ＷＡＦ１及びＰ２７ＫＩＰ１のような抗腫瘍遺伝子の転写を遮断することにより、腫瘍細胞が長く生きることを促進している。多くのＨＤＡＣ阻害剤が、種々のヒト悪性腫瘍に対するその活性により、インビボ及びインビトロで現在使用されている。
【００１２】
例えば、ＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、インビボ及びインビトロの両方で、それぞれ乳癌及び前立腺癌に対して活性を有することが示されており、また最近デプシペプチドも、早期の第一相／第二相試験において、Ｔ細胞リンパ腫の処置中に臨床活性を有することが示された。
【００１３】
さらに、ＨＤＡＣ阻害剤は、がん治療において他の抗腫瘍薬と併用して使用されており、様々な程度で成功を収めている。例えば化学療法剤とともに使用されるとき、併用効果は、相乗的から拮抗的、すなわち毒性を増大するまでに変動する。
【００１４】
ＨＤＡＣ阻害剤を、脱メチル化剤、核内受容体リガンド、シグナル伝達阻害剤及びＨｓｐ９０アンタゴニスト並びにプロテアソーム阻害剤と併用したときの、増強効果又は相乗効果が注目された（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、前出）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ＨＤＡＣ阻害剤が他の処置を促進する相互作用は、完全には理解されていない。しかし、公知の治療薬のいずれか、例えばＨＡＭＬＥＴとは完全に異なる作用様式を有する分子を扱うとき、特に両方の薬剤が同じ標的に、すなわちヒストンに、たとえヒストン分子内の異なる部位であっても、直接相互作用するようである場合には、どのようにＨＤＡＣ阻害剤との併用治療が作用するかは予測不可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
しかし、ＨＡＭＬＥＴはＨＤＡＣ阻害剤ではないにもかかわらず、ＨＤＡＣ阻害剤と一緒に使用すると、ＨＡＭＬＥＴ誘導性の細胞死を相乗的な様式で増強し、新しい併用治療アプローチをもたらすことが本発明者らによって見出された。
【００１７】
本発明によれば、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物学的に活性な修飾物又はこれらのいずれかの生物学的に活性な断片である構成要素（ｉ）、及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である構成要素（ｉｉ）の組み合わせ物が提供される。
【００１８】
本明細書で使用される用語「ＨＡＭＬＥＴ」は、α−ラクトアルブミン（これは、ヒト起源であってもヒト起源ではなくてもよい）の生物学的に活性な複合体をいい、これは例えばＥＰ−Ａ−０７７６２１４に記載されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーとゲルクロマトグラフィーを組み合わせることによってｐＨ４.６で沈殿している乳汁のカゼイン画分から単離するか、又はＷＯ９９／２６９７９に記載されるように、Ｃ１８：１脂肪酸として特徴付けられるヒト乳汁カゼイン由来の補因子の存在下でα−ラクトアルブミンをイオン交換クロマトグラフィーに付すのいずれかによって得られ得る。
【００１９】
生物学的に活性な複合体を形成するために、α−ラクトアルブミンは一般に、コンホメーション変化またはフォールディング変化及び脂質補因子の存在の両方を必要とする。このコンホメーション変化は、α−ラクトアルブミンからカルシウムイオンを除去することによって適切に誘起される。好ましい実施態様において、これは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミンの変異体を使用することで、適切に促進される。
【００２０】
このような変異体を含む生物学的に活性な複合体は、本明細書で使用される用語ＨＡＭＬＥＴの「修飾物」に包含される。しかし、一旦形成されれば、機能的なカルシウム結合部位及び／又はカルシウムが存在しても、この複合体の安定性にも生物学的活性にも影響を及ぼさないことが本発明者らによって見出された。生物学的に活性な複合体は、活性を損なうことなくカルシウムに対する親和性を保持することが見出された。従って、本発明の複合体は、カルシウムイオンをさらに含み得るものである。
【００２１】
従って特に本発明は、生物学的に活性な複合体を使用するものであり、これはアポフォールディング状態のα−ラクトアルブミン若しくはα−ラクトアルブミンの変異体、又はこれらのいずれか一方の断片、及びこの複合体を生物学的に活性な形態で安定化する補因子を含むものであり、但し、α−ラクトアルブミン又はその変異体のすべての断片は、αドメインとβドメインとの間の界面を形成するα−ラクトアルブミンの領域に対応する領域を含むものとする。
【００２２】
好適には、この補因子は、シスＣ１８：１：９若しくはＣ１８：１：１１脂肪酸であるか、又は類似の立体配置を有する異なる脂肪酸である。
【００２３】
特に都合の良い実施態様において、本発明で使用される生物学的に活性な複合体は、以下
（ｉ）シスＣ１８：１：９若しくはＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なる脂肪酸；及び
（ｉｉ）カルシウムイオンが除去されているα−ラクトアルブミン、又はカルシウムイオンが遊離しているか若しくは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミンの変異体；又はこれらのいずれか一方の断片を含むものであり、但しすべての断片はαドメインとβドメインとの間の界面を形成するα−ラクトアルブミンの領域に対応する領域を含むものとする。
【００２４】
本明細書で使用される表現「変異体」は、基礎となるタンパク質（好適には、ヒト又はウシのα−ラクトアルブミン）に相同であるが、由来している塩基配列とは、配列内の１つ又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換される点が異なるポリペプチド又はタンパク質をいう。アミノ酸が、概して類似の性質を有する異なるアミノ酸で置換される場合、アミノ酸置換は「保存的」とされ得る。非保存的置換とは、アミノ酸が、異なるタイプのアミノ酸で置換される場合である。大まかに言って、非保存的置換がより少ないと、ポリペプチドの生物学的活性を変化させずにすむことが可能である。好適には変異体は、少なくとも６０％同一であり、好ましくは少なくとも７０％同一であり、なおより好ましくは８０％若しくは８５％同一であり、そして特に好ましくは９０％、９５％若しくは９８％又はそれ以上の同一性である。
【００２５】
この場合の同一性は、例えばＢＬＡＳＴプログラム又はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎのアルゴリズムを、Ｋｔｕｐｌｅ：２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ：４、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ：１２という標準的なＰＡＭスコアリングマトリックスとともに用いて判定され得る（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．、Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｓｅａｒｃｈｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、第２２７巻、１４３５−１４４１）。
【００２６】
用語「その断片」は、完全なα−ラクトアルブミンアミノ酸配列を含む複合体と類似の活性を有する複合体を形成することになる、所定のアミノ酸配列の任意の部分をいう。断片は、全長タンパク質のうちの２以上の部分が互いに結合されたものを含み得る。部分は好適には、基礎となる配列から少なくとも５つ及び好ましくは少なくとも１０の連続したアミノ酸を含むものである。
【００２７】
好適な断片は、欠失変異体であり、好適には少なくとも２０のアミノ酸長、及びより好ましくは少なくとも１００のアミノ酸長を含むものである。この断片は、タンパク質由来の小さな領域又はこれらの組み合わせを含むものである。
【００２８】
αドメインとβドメインとの間の界面を形成する領域は、ヒトα−ラクトアルブミンにおいては、この構造中のアミノ酸３４〜３８及び８２〜８６で画成される。従って好適な断片は、これらの領域、及び好ましくはネイティブタンパク質のアミノ酸３４〜８６の全体の領域を含むものである。
【００２９】
特に好ましい実施態様において、生物学的に活性な複合体は、カルシウムに対する親和性が減少するか、又はもはや機能的ではないようにカルシウム結合部位が修飾されているα−ラクトアルブミンの変異体を含むものである。
【００３０】
ウシα−ラクトアルブミンにおいて、カルシウム結合部位は、残基Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７及びＤ８８によって配位されることが見出された。従って、例えば１つ又はそれ以上の酸性残基を除去することによるこの部位の修飾物又は非ウシα−ラクトアルブミンでのその等価物は、この部位のカルシウム親和性を減少し得るか、又は機能を完全に排除し得ることになり、そしてこのタイプの突然変異体は、本発明の好ましい側面である。
【００３１】
ウシα−ラクトアルブミンのＣａ2+結合部位は、３10へリックス及びα−へリックスからなり、短いターン領域が２つのへリックスを隔てている（Ａｃｈａｒｙａ Ｋ．Ｒ．ら（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２１、５７１−５８１）。これは、２つのジスルフィド架橋が側面に位置しており、分子のこの部分を相当に固定している。Ｃａ2+を配位する７つの酸素基のうち５つは、Ａｓｐ８２、８７及び８８の側鎖のカルボキシレート、又はＬｙｓ７９及びＡｓｐ８４のカルボニル酸素基によって与えられる。２つの水分子が、残りの２つの酸素基を供給する（Ａｃｈａｒｙａ Ｋ．Ｒ．ら、（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２１、５７１−５８１）。
【００３２】
８７番目のアスパラギン酸からアラニンへの部位特異的突然変異誘発（Ｄ８７Ａ）は、カルシウム結合部位を強力に不活性化することが以前に示されており（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、１１６４８−１１６５４）、そしてこの突然変異体タンパク質は、アポコンホメーションをとった。
【００３３】
従って特定の実施態様において、ウシα−ラクトアルブミンタンパク質配列内のアミノ酸８７番目のアスパラギン酸残基は、非酸性残基で、特に非極性側鎖又は非荷電の極性側鎖に突然変異される。
【００３４】
非極性側鎖残基としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインが挙げられる。特に好ましい例はアラニンである。
【００３５】
非荷電の極性側鎖残基としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン又はチロシンが挙げられる。
【００３６】
突然変異体タンパク質の構造のひずみを最小限にするために、Ｄ８７はまた、アスパラギン（Ｎ）で置き換えられており（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ Ｓ．Ｅ．ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １４、７８５−７８９）、これは、カルボキシレート基の補償されていない（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）負電荷を欠失するが、同じ側鎖体積及び幾何構造を有している。この突然変異体タンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、低い親和性でしかカルシウムを結合しないことが示された（Ｋ−Ca２×１０5Ｍ-1）（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ Ｓ．Ｅ．ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １４、７８５−７８９）。このような突然変異体は、本発明のさらに好ましい実施態様において、生物学的に活性な複合体の要素を形成している。
【００３７】
従って、本発明の複合体で使用するのに特に好ましい変異体は、α−ラクトアルブミンのＤ８７Ａ変異体及びＤ８７Ｎ変異体、又はこの突然変異を含む断片である。
【００３８】
分子のこの領域は、ウシとヒトとのタンパク質間で異なっており、３つの塩基性アミノ酸のうちの１つ（Ｒ７０）が、ウシα−ラクトアルブミンではＳ７０に変化しており、従って配位している側鎖が１つ脱離している。従って、ウシα−ラクトアルブミンが本発明の複合体に使用される場合、すなわちＳ７０Ｒ突然変異体が使用される場合が好ましいものであり得る。
【００３９】
Ｃａ2+結合部位は、いろいろな種由来のα−ラクトアルブミンにおいて、１００％保存されており（Ａｃｈａｒｙａ Ｋ．Ｒ．ら、（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２１、５７１−５８１）、タンパク質にとってこの機能が重要であることを明らかにしている。これには、５つの異なるアミノ酸及び２つの水分子が配位している。Ｄ８７の側鎖カルボキシレートは、Ｄ８８と一緒になって最初にカルシウムイオンを陽イオン結合領域にドッキングさせ、そして構造を安定化させる分子内水素結合を形成する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、１１６４８−１１６５４）。Ｄ８７又はＤ８８のいずれかが欠失すると、Ｃａ２＋結合が弱まり、そして部分的にアンフォールディングな状態で分子を安定化することが示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、１１６４８−１１６５４）。
【００４０】
さらに、ウシα−ラクトアルブミンのカルシウム結合部位に２つの異なる点突然変異を有する突然変異体タンパク質が使用され得る。例えば、８７番目のアスパラギン酸がアラニンで置換されると（Ｄ８７Ａ）、カルシウム結合が完全に消失し、そしてタンパク質の三次構造が崩壊することが見出されている。アスパラギンによるアスパラギン酸の置換、すなわちタンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、なおカルシウムを結合するが、親和性がより低く、そして三次構造の消失を示すが、Ｄ８７Ａ突然変異体ほど顕著ではない（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ Ｓ．Ｅ．ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １４、７８５−７８９）。この突然変異体タンパク質は、両方のアミノ酸が同じ平均体積１２５Å3を有するため充填体積が最小限の変化しか示さず、そしてアスパラギンなどのカルボキシレート側鎖によりタンパク質がカルシウムを配位するのを可能にするが、効率はより悪い（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ Ｓ．Ｅ．ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １４、７８５−７８９）。両方の突然変異体タンパク質は、生理的温度でアポ−コンホメーションで安定であるが、このコンホメーション変化にもかかわらず、これらは生物学的に不活性であった。この結果は、アポ−コンホメーションへのコンホメーション変化だけでは生物学的活性を誘導するのに十分ではないことを示している。
【００４１】
α−ラクトアルブミンの構造は当該分野で公知であり、そして本明細書で言及される残基の正確なアミノ酸番号付けは、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎら、前出及びＰｅｒｍｙａｋｏｖら、前出に示される構造を参照することにより同定され得る。
【００４２】
しかし特に好ましい実施態様において、組み合わせの構成要素（ｉ）は、ヒト乳汁から得られ得るＨＡＭＬＥＴである。
【００４３】
構成要素（ｉｉ）に関して、公知のＨＤＡＣ阻害剤の６つの主要なクラスが存在しており、そしてこれらは、以下に要約され得る：
Ａ．低分子量（例えば、１５０未満の分子量）のＨＤＡＣ阻害性カルボン酸又はその薬学的に受容可能な塩若しくは薬学的に受容可能なエステル、例えば酪酸塩（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸又はその薬学的に受容可能な塩若しくは薬学的に受容可能なエステル、フェニル酪酸又はその薬学的に受容可能な塩若しくは薬学的に受容可能なエステル（例えば、フェニル酪酸ナトリウム又は酪酸ピバリルオキシメチル（ＡＮ９））。
【００４４】
Ｂ．ヒドロキサム酸、例えば以下の構造（ｉ）のスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）
【化１】
【００４５】
以下の構造（ｉｉ）のＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４
【化２】
【００４６】
以下の構造（ｉｉｉ）のｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸（ＣＢＨＡ）
【化３】
【００４７】
以下の構造（ｉｖ）のスベリン酸ビスヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）
【化４】
【００４８】
以下の構造（ｖ）のＪＮＪ１６２４１１９９
【化５】
【００４９】
以下の構造（ｖｉ）のプロキサミド（Ｐｒｏｘａｍｉｄｅ）
【化６】
【００５０】
以下の構造（ｖｉｉ）のスクリプタイド（Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）
【化７】
【００５１】
以下の構造（ｖｉｉｉ）のオキサムフラチン（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）
【化８】
【００５２】
以下の構造（ｉｘ）のトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）
【化９】
【００５３】
以下の構造（ｘ）のツバシン（Ｔｕｂａｃｉｎ）
【化１０】
【００５４】
以下の構造（ｘｉ）の６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロン酸ヒドロキサム酸（３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ）
【化１１】
及び以下の構造（ｘｉｉｉ）のＡ−１６１９０６
【化１２】
【００５５】
Ｃ．ベンズアミド、例えば以下の構造（ｘｉｖ）のＭＳ−２７５
【化１３】
又は以下の構造（ｘｖ）のＮ−アセチルジナリン（ＣＩ−９９４）
【化１４】
【００５６】
Ｄ．エポキシケトン、例えば以下の構造（ｘｖｉ）の２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸（ＡＯＥ）
【化１５】
又は以下の構造（ｘｖｉｉ）のトラポキシン（Ｔｒａｐｏｘｉｎ）（ＴＰＸ）
【化１６】
【００５７】
Ｅ．環状ペプチド、例えばアピシジン（Ａｐｉｃｉｄｉｎ）若しくはデプシペプチド；又は
Ｆ．ハイブリッド分子、例えば環状ヒドロキサム酸含有ペプチド（ＣＨＡＰ３１）若しくはＣＨＡＰ５０。
【００５８】
構成要素（ｉｉ）は、好適には上記の群Ａ〜Ｅに入る１つ又はそれ以上の阻害剤を含むものである。
【００５９】
特に、本発明の組み合わせ物は、構成要素（ｉｉ）のようなＨＤＡＣ阻害性ヒドロキサム酸を含み、そしてこれは、好適にはＳＡＨＡ又はＴＳＡから選択される。
【００６０】
本発明の組み合わせ物の構成要素は、好適には薬学的に受容可能なキャリア又は賦形剤をさらに含む薬学的組成物の形態で与えられる。
【００６１】
これらは、単一製剤に一緒に組み合わせることもできるが、好ましくは、構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が別々に投与できるように包装され、例えば逐次的に、構成要素（ｉｉ）が前処置として使用され、そして構成要素（ｉ）がその次に投与される。
【００６２】
このように、個々の構成要素の投与様式は異なり得る。例えば、構成要素（ｉ）は一般に、腫瘍部位に直接適用される必要があり、従って好適にはこれを容易にする方法で製剤化される。例えば構成要素（ｉ）は、処置されている腫瘍の位置に応じて局所組成物、注入、坐剤又は吸入若しくは吹入用組成物の形態であり得る。
【００６３】
構成要素（ｉｉ）は、全身的に活性であり得るものであり、従ってより広範な経路、例えば経口又は非経口、及び構成要素（ｉ）に関する使用についての上記の経路を用いて投与され得る。
【００６４】
構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）を互いに混合する場合、これらは構成要素（ｉ）に関する上記の方法による投与用に適切に製剤化してもよい。
【００６５】
従って、意図される投与様式如何により、組成物は、経口使用（例えば、錠剤、ロゼンジ剤、硬カプセル剤若しくは軟カプセル剤、水性懸濁剤若しくは油性懸濁剤、エマルジョン剤、分散性散剤若しくは顆粒剤、シロップ剤又はエリキシル剤として）、局所使用（例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤又は水性若しくは油性の液剤若しくは懸濁剤として）、吸入による投与（例えば、微粉化散剤又は液体エアゾール剤として）、吹入による投与（例えば、微粉化散剤として）又は非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与若しくは筋肉内投薬のための滅菌水性液剤若しくは滅菌油性液剤、又は直腸投薬のための坐剤として）に適する形態であり得る。
【００６６】
好適な薬学的に受容可能なキャリア又は賦形剤は、当該分野でよく理解されている。これらは、薬学的に受容可能な固体又は液体の賦形剤を含む。
【００６７】
特に好ましい実施態様において、組成物は、局所使用に好適な形態、例えばクリーム剤、軟膏剤、ゲル剤又は水性若しくは油性の液剤若しくは懸濁剤としての薬学的組成物である。これらは、薬学的に受容可能な一般に知られたキャリア、増量剤及び／又は添加剤（ｅｘｐｅｄｉｅｎｔ）を含み得る。
【００６８】
局所液剤又はクリーム剤は、好適には、賦形剤又はクリーム基剤と一緒のタンパク質複合体用の乳化剤を含んでいる。
【００６９】
活性化合物の日用量は変動するものであり、そして通常の実際の臨床に従って、処置されている患者、疾患状態の性質などに左右される。原則として、各投与につき構成要素（ｉ）は用量当たり２〜２００ｍｇ使用される。
【００７０】
構成要素（ｉｉ）は、好適には標準的な治療量で投与される。例えば、体重１ｋｇ当たり０.５ｍｇ〜７５ｍｇの範囲の日用量を投与する。
【００７１】
本発明によればさらに、増殖性疾患、例えば腫瘍及び特にがんの処置における使用のため、並びに前腫瘍状態、例えばウイルスによる形質転換を通じて引き起こされ得る疾患状態の処置において使用するための上記のような組み合わせを提供する。
【００７２】
上記のような組み合わせは、腫瘍又は他の増殖性疾患、例えばがん、及び乳頭腫及びウイルス感染、例えばＨＰＶ、特に子宮頸がんに関連したＨＰＶ型（ＨＰＶ１６及び１８）の感染の結果として形質転換されている細胞の処置に特に好適である。
【００７３】
特にこの組み合わせは、悪性の粘膜腫瘍又はがん、例えば膀胱がん、メラノーマ、器官のがん、特に脳腫瘍、及び血管新生の阻害が望ましいあらゆる他の疾患状態、例えばがんの処置に使用され得るものである。
【００７４】
好適には、この組み合わせ物は、構成要素（ｉｉ）が第一に投与され、そして構成要素（ｉ）がその次、例えば構成要素（ｉｉ）の投与後１時間と２４時間との間、好適にはおよそ２〜１２時間後に投与される逐次処置に使用される。この場合、構成要素（ｉｉ）は、上記のように全身投与され得るし、そして構成要素（ｉ）は、その後腫瘍部位に投与され得る。
【００７５】
しかし、この組み合わせ物のそれら構成要素は、共投与（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）、特に単一製剤で腫瘍部位に共投与してもよい。
【００７６】
本発明のさらなる側面は、腫瘍若しくは他の増殖性疾患、例えばがん、又は前腫瘍疾患状態を処置する方法を提供するものであり、この方法は、上記の組み合わせ物をこの処置を必要とする患者に投与することを含む。特に、組み合わせ物の構成要素（ｉｉ）は、前処置として投与され、そして構成要素（ｉ）は、その次に投与される。
【００７７】
本発明者らは、ヒストンアセチル化が、ＨＡＭＬＥＴの結合に影響を及ぼすか否か、そしてクロマチンとのＨＡＭＬＥＴの相互作用が、アセチル化によって修飾されるか否かを見出す研究を行った。
【００７８】
ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡ及びＳＡＨＡを用いて、アセチル化クロマチンを有する細胞は、ＨＡＭＬＥＴにより感受性であるが、これは、ヒストン尾部とのＨＡＭＬＥＴの相互作用に起因していないことが見出された。しかしこの研究過程の間に、ＨＤＡＣ阻害剤がＨＡＭＬＥＴの効果を有意に促進することがさらに注目された。細胞死反応の顕著な増大が注目された。
【００７９】
特に、ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡ及びＳＡＨＡで前処理された細胞は、ＨＡＭＬＥＴにはるかに感受性であることが見出された。この前処理は、断片化ＤＮＡを示す細胞の増大を引き起こしている。
【００８０】
一般にＨＤＡＣ阻害剤に長期曝露された後に得られたこの効果は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与後短時間で（２時間）ＨＡＭＬＥＴを投与したときでさえも観察され、これはＨＡＭＬＥＴの機構がタンパク質（ｐ２１ＷＡＦ１及びｐ２７ＫＩＰ１）新合成とは独立しているということを示し得るものである。しかし細胞感受性の増大は、ＨＡＭＬＥＴでの処理の前にＨＤＡＣ阻害剤を長期使用した後でさえも持続した。
【００８１】
これは、ＨＡＭＬＥＴが、がん細胞のＤＮＡ断片化の強力な誘発物質であり、これは、ＨＤＡＣ阻害剤により予想されるレベルよりも高いレベルまで増強され得ることを示している。
【００８２】
クロマチンは、一定の構造修飾を受けており、そしてこの動的プロセスは、遺伝子発現の制御に不可欠である。真核生物系において、この転写プロセスは、主に標的ＤＮＡへの転写因子の接近によって厳重に制御されている。ヌクレオソームは、１４６ｂｐのＤＮＡ及びヒストン八量体を形成する２つの四量体、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４によって形成されるクロマチンの基本的な構造要素である。
【００８３】
ヒストンの翻訳後修飾は、「ヒストンコード（ｃｏｄｅ）」を形成するリン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化及びＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を通じてクロマチン構造に影響を及ぼしている｛Ｄｒｕｍｍｏｎｄ、２００５ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４５：４９５−５２８｝。
【００８４】
特に、ヒストンアセチル化は、転写因子にクロマチンを開放することが示されており、一方脱アセチル化クロマチンは、コンパクトになっていて遺伝子転写が減少している。
【００８５】
ＨＡＭＬＥＴは、ヒストン及びＤＮＡからのヌクレオソームの集合にインビトロで影響を及ぼすため、ヒストンに対するＨＡＭＬＥＴの親和性が確認された。さらにＨＡＭＬＥＴは、前もって作られたヌクレオソームと相互作用し、そして高濃度のＨＡＭＬＥＴは、クロマチンを崩壊させた。ＨＡＭＬＥＴのこのインビボ効果は、クロマチンアセチル化の状態にある程度依存していることが見出された。
【００８６】
しかし、ＨＡＭＬＥＴ自体はクロマチンのアセチル化を減少させることが示されているが、アセチル化を増大させるＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて使用するとき、ＨＡＭＬＥＴに応答した強力に増強された細胞死を生じた。ヒストンテールは、ＨＡＭＬＥＴへの結合に関与しておらず、これは、テールを欠失する突然変異体ヒストンを用いて確認された。
【００８７】
ＨＡＭＬＥＴ及びＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンアセチル化に関して反対の効果を有することが実施された研究から明らかであり、従って細胞死効果の増強は驚くべきことである。ＨＡＭＬＥＴは、ＨＡＴ／ＨＤＡＣ系を介して作用せず、そしてＨＡＭＬＥＴがアセチル化を変化させる機構は、ＨＤＡＣ阻害剤とは異なっている可能性があるようである。
【００８８】
これは、これらの分子間の標的が異なっていることに関連し得る。ＨＤＡＣは、ヒストンテールと相互作用するが、ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンテールが存在しなくてもまたヒストンに結合することが示された。
【００８９】
ＨＡＭＬＥＴは、アセチル化が生じるヒストンテールと相互作用せずにクロマチンアセチル化を修飾する物質の最初の例のようである。アセチル化の減少は、ＨＡＭＬＥＴとヌクレオソームとの間の極めてタイトな集合体の形成と矛盾がない。これらの大きな集合体において、ＨＡＴ／ＨＤＡＣがヒストンテールを利用できる可能性は減少し得る。従ってアセチル化の減少は、特異的な酵素経路での特異的な干渉よりもむしろ接近能が疑われ得る。
【００９０】
アセチル化に起因して開いたクロマチンを有する細胞は、ＨＡＭＬＥＴの効果を受けやすく、一方閉じた脱アセチル化クロマチンを有する細胞は、観察された相乗作用を導くこれらの作用に対してより抵抗性である。
【００９１】
ＨＡＭＬＥＴに応答した細胞死に関するＨＤＡＣ阻害剤の効果を調べるために、一連の実験を行った。この場合、ＨＤＡＣ阻害剤を最初に適用し、そしてクロマチンアセチル化が増大した。コントロール実験は、タンパク質アセチル化が３時間以内に増大したことを示した。一実験において、短い前処理間隔を用いて、転写並びにｐ２１ＷＡＦ１及びＰ２７ＫＩＰ１のようなタンパク質の新合成を通じたＨＤＡＣ阻害剤の非特異的効果を排除した。ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンに加えていくつかのタンパク質のアセチル化を刺激するので、これは重要であった。
【００９２】
その後、ＨＡＭＬＥＴに応答したＤＮＡ断片化は、ヒストンアセチル化レベルに相関し、これはヒストンがアセチル化されると、クロマチンへのＨＡＭＬＥＴの接近能が増大することを示唆している。
【００９３】
両方の異なるＨＤＡＣ阻害剤を用いて、ＤＮＡ断片化に対する顕著な効果が観察された。興味深いことに、これらの阻害剤で細胞を前処理した後に、ＤＮＡ断片化が劇的に増大しそしてより迅速に生じ、そしてＨＡＭＬＥＴに対する反応は、スタウロスポリン又はエトポシドのようなアポトーシス促進剤に曝露された細胞のＤＮＡ断片化よりも迅速であった。
【００９４】
添付の図面を参照して実施例で本発明を特に説明する：
図１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるヒストンアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴの効果を示している。
Ａ．ヒストンＨ４のアセチル化を、細胞数測定及びＮＵ−ＰＡＧＥの両方によって追跡した。この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡなし（ＣＴＬ及びＨＡＭ）又はＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに（ＴＳＡ及びＴＳＡ＋ＨＡＭ）２時間インキュベートし、次いで１時間の間にいくつかの条件で培地にＨＡＭＬＥＴ １２μＭを添加した（ＨＡＭ及びＴＳＡ＋ＨＡＭ）。Ｂ．ヒストンＨ４のアセチル化を、ＮＵ−ＰＡＧＥ分析によって追跡した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ライン１）を、ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌ（ライン２）、エトポシド２０μＭ（ライン３）、ＨＡＭＬＥＴ ３μＭ（ライン４）、６μＭ（ライン５）及び１２μＭ（ライン６）の存在下で１時間処理した。
【００９５】
図２は、ＨＡＭＬＥＴ誘導性の迅速なＤＮＡ断片化が、ＨＤＡＣ阻害剤によって増強されることを示している。ＤＮＡ断片化を、フローサイトメトリーの両方によって追跡した。この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡなし（ＣＴＬ及びＨＡＭ）又はＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌ（ＴＳＡ及びＴＳＡ＋ＨＡＭ）又はＳＡＨＡ ２.５μＭ（ＳＡＨＡ及びＳＡＨＡ＋ＨＡＭ）とともに２時間インキュベートし、次いで１時間の間にいくつかの条件で培地にＨＡＭＬＥＴ １２μＭを添加した（ＨＡＭ、ＴＳＡ＋ＨＡＭ及びＳＡＨＡ＋ＨＡＭ）。ＰＩ染色後（材料及び方法を参照のこと）、サブＧ１集団を定量し、そして集団全体のパーセントとして示した。
【００９６】
図３は、ＨＡＭＬＥＴの増強された活性が、ヒストンアセチル化に相関することを示している。この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡなし（ＣＴＬ）又はＴＳＡ ５０ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌとともに（ＴＳＡ５０、ＴＳＡ１００）２時間インキュベートし、次いで１時間の間にいくつかの条件で培地にＨＡＭＬＥＴ １２μＭを添加した（黒色ヒストグラム）。次いで、異なる条件でのヒストンＨ４のアセチル化を、細胞数測定により定量し、そして集団の幾何平均として示した（ヒストグラム、左のスケール）。ＨＡＭＬＥＴで処理された集団のＤＮＡ断片化を、サブＧ１の定量化を用いて分析し、そして集団全体のパーセントとして示した（直線、右のスケール）。
【００９７】
図４は、テールのないヒストン及びＤＮＡの混合物に対するＨＡＭＬＥＴの効果を示している。ＨＡＭＬＥＴを、放射能標識された１４６ｂｐのＤＮＡ断片及びテールのないヒストンの混合物に添加した。ＨＡＭＬＥＴが存在しないと、ヌクレオソームは形成されない（レーン１）。最初のＨＡＭＬＥＴの添加により、ヌクレオソームの集合が生じた（レーン２）。１４６ｂｐの断片へのヌクレオソームの集合は、ただ１つのヌクレオソーム種を生じ、Ｎと命名した。より高濃度のＨＡＭＬＥＴでは、より多くのヌクレオソームが形成され、そしてＨＡＭＬＥＴがこれらと会合して、ゲル中に第二のバンドを形成した。ＨＡＭＬＥＴはまた、ウェル中に見られる非特異的なヒストン−ＤＮＡ集合体を溶解した。
【００９８】
図５は、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴ誘導性のＤＮＡ断片化を増強することを示している。ＤＮＡ含量を、フローサイトメトリーによって追跡した。この実験において、材料及び方法の節に記載されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに又はＴＳＡなしで３時間又は１８時間最初に前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。サブＧ１集団を定量し、そしてパーセントで示した。
【００９９】
図６は、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴ誘発性の細胞死を増強することを示している。Ａ．この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度のＴＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ若しくは２００ｎｇ／ｍｌとともに、又はＴＳＡなしで最初に３時間前処理し、次いで漸増濃度のＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。サブＧ１集団を定量し、そして集団全体のパーセントで示した。Ｂ．Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度のＴＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ若しくは２００ｎｇ／ｍｌとともに、又はＴＳＡなしで最初に３時間前処理し、次いで漸増濃度のＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。ＡＴＰレベルを、材料及び方法の節に記載されるように定量した。未処理集団と比較した結果を得た。Ｃ．Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに又はＴＳＡなしで最初に３時間又は１８時間前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。生存能を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ ＸＲ装置を用いたトリパンブルー排除法によって評価した。
【０１００】
図７は、ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理した細胞において、アセチル化及び細胞死が増大したことを示している。Ａ．これらの実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに又はＴＳＡなしで最初に３時間又は一晩（ＯＮ）前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。Ａ．アセチル化レベルを、ヒストグラムプロットにより細胞集団全体についてフローサイトメトリーによって定量化した。Ｂ．ヒストンＨ４のＤＮＡ含量及びアセチル化を、フローサイトメトリーによって追跡した。結果を、Ｙ軸がＤＮＡ含量であり、そしてＸ軸がヒストンアセチル化の密度プロットにより追跡した。
【０１０１】
図８は、ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理した細胞において、アセチル化及び細胞死が増大したことを示している。Ａ．Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度のＴＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ若しくは２００ｎｇ／ｍｌとともに、又はＴＳＡなしで最初に３時間前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。結果を、種々の「インタクトな」集団対未処理の「インタクトな」集団の平均の倍増（ｆｏｌｄ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅ）で示す（＊はｐ＜０.００１）。Ｂ．この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＨＡＭＬＥＴとともに又はＨＡＭＬＥＴなしで最初に３時間前処理し、次いで１００ｎｇ／ｍｌとともに又はＨＡＭＬＥＴなしで３時間処理した（＊はｐ＜０.００１）。
【０１０２】
図９は、ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理されたアセチル化細胞の形態を示している。ＧＦＰタグ化ヒストンＨ４ ＨｅＬａ細胞を、未処理（Ａ）、又はＨＡＭＬＥＴで処理（Ｂ）、又はＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌで処理（Ｃ）、又はＴＳＡで前処理及びＨＡＭＬＥＴで処理（Ｄ）した。最初の欄は、光透過率を表し、第二の欄は、ヒストンＨ４のアセチル化を表し、そして第三の欄は、細胞におけるヒストンＨ４の発現を表している。Ｅ．それぞれ、核サイズの定量化（μｍ2）、ヒストンＨ４発現レベル及びアセチルヒストンＨ４発現レベル。アセチルＨ４及びヒストンＨ４の強度に関して、結果を、コントロール集団の倍増で示す。すべての結果を、各実験につき少なくとも３０個の細胞の計数後に表す。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
ヒストンアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴの効果
材料及び方法
試薬−ＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）又はＡｌｅｘｉｓ（Ｌａｕｓｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供され、そしてそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ及び２.５μＭの濃度で用いた。ＡＴＰモニタリング試薬（ＡＭＲ）を、ＶｉａＬｉｇｈｔTM ＨＳキットの形態でＣａｍｂｒｅｘ（Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、Ｕ．Ｋ．）から購入し、そして製造業者のガイドラインに従って再構成した。
【０１０４】
α−ラクトアルブミンの精製及びＨＡＭＬＥＴへの転換−ＨＡＭＬＥＴは、Ｃ１８：１脂肪酸補因子によって安定化されるヒトα−ラクトアルブミンのフォールディング変異体である。この研究において、ネイティブのα−ラクトアルブミンを、以前に記載されるように、ヒト乳汁から精製し、そしてオレイン酸馴化イオン交換マトリックス上でＨＡＭＬＥＴに転換した（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、２０００）。
【０１０５】
細胞培養−Ｊｕｒｋａｔ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、番号８８０４２８０３）を、記載通りに培養した（Ｈａｋａｎｓｓｏｎら、１９９５）。
【０１０６】
ヒストン−ネイティブのフォールドしたヒストンを、アヒル赤血球核から得た（Ｓｉｍｏｎ及びＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄ、１９７９）。ネイティブ又はテールのないＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒヒストンを、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、精製し、そして八量体に集合させた（Ｈａｍｉｃｈｅら、２００１）。ヒストンのフォールド及び機能の完全性を、ＤＮＡへのヌクレオソーム集合によって確認した（データは示さず）。
【０１０７】
ＤＮＡ−ウニ５Ｓ ＲＮＡ遺伝子を含む２５６ｂｐ断片（Ｓｉｍｐｓｏｎ及びＳｔａｆｆｏｒｄ、１９８３）を、プラスミドｐＬＶ４０５−１０のＥｃｏＲ１又はＮｃｉ１消化からゲル精製した（Ｓｉｍｐｓｏｎら、１９８５）。このＤＮＡを、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで末端標識した（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）。
【０１０８】
細胞数測定による細胞周期分析−細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、次いで４℃で少なくとも２時間、７５％冷エタノールの懸濁液に固定した。次いでこのサンプルを遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして室温で１０分間、０.２５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。細胞を再び洗浄し、ＰＢＳ中の２.５μｇ／ｍｌ ＰＩ及び２５０μｇ／ｍｌ Ｒｎａｓｅ Ａに再懸濁し、そして測定前に４℃で一晩インキュベートした。細胞の蛍光を、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて測定した。単一の細胞集団を、それらの蛍光強度値ＦＬ２−Ａ及びＦＬ２−Ｗに基づいて決定した。
【０１０９】
細胞数測定によるアセチルヒストンＨ４及び細胞周期分析−細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、次いで４℃で少なくとも２時間、７５％冷エタノールの懸濁液に固定した。次いでこのサンプルを遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして室温で１０分間、０.２５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。ＰＢＳ ３ｍｌの添加及び遠心分離後、ＰＢＳ中のブタ血清１％（ＤＡＫＯ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中で少なくとも３０分間細胞をインキュベートした。ＰＢＳ ３ｍｌの添加及び遠心分離後、１％ ＢＳＡを含み１／５００希釈されたヒトアセチルヒストンＨ４に対するウサギポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）の存在下、室温で３時間細胞をインキュベートした。次いで細胞を洗浄し、そして１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中１／２０希釈されたＦＩＴＣ接合ブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともに２時間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、ＰＢＳ中の２.５μｇ／ｍｌ ＰＩ及び２５０μｇ／ｍｌ Ｒｎａｓｅ Ａに再懸濁し、そして測定前に４℃で一晩インキュベートした。ヒストン抗体が存在しないコントロールを、上記と同様に調製した。細胞の蛍光を、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて測定した。単一の細胞集団を、それらの蛍光強度値ＦＬ２−Ａ及びＦＬ２−Ｗに基づいて決定した。次いで、各細胞からの赤色発光及び緑色発光を分離し、そしてサイトメーター（ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）の標準的な光学を用いて定量化した。
【０１１０】
共焦点顕微鏡法によるアセチルヒストンＨ４−Ｈｅｌａ細胞を、Ｌａｂ−Ｔｅｋ Ｃｈａｍｂｅｒスライドで増殖させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでＰＢＳホルムアルデヒド４％中で１０分間固定した。次いでこのサンプルを遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして室温で２分間、０.１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。洗浄後、ＰＢＳ中のブタ血清１％（ＤＡＫＯ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中で少なくとも３０分間細胞をインキュベートした。次いで、１％ ＢＳＡを含み１／５００希釈されたヒトアセチルヒストンＨ４に対するウサギポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）の存在下、室温で３時間細胞をインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、そして１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中１／２００希釈されたＡｌｅｘａ６３３接合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに２時間インキュベートした。６３×対物レンズを用いてＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で評価する前に、細胞をＰＢＳ中で３×５分間洗浄した。各クロマチンパターンの頻度を、各実験において最低３０個の細胞を計数した後に、染色したコントロール細胞の倍数で示した。
【０１１１】
免疫ブロット−ＪＵＲＫＡＴ細胞を、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてプロテアーゼ阻害剤を補充した溶解緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ７.５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０］（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中で溶解した。４℃で３０分間連続して撹拌した後、４℃で１５分間、１２,０００ｇで遠心分離する前に、溶解物をＨ2ＳＯ4（０.４Ｎ）に１時間供した。タンパク質抽出物５０μｇを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そしてポリフッ化ビニリデン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気的に移した。この膜を、４℃で一晩、抗アセチルヒストンＨ４（１／２０００）（Ｕｐｓｔａｔｅ）とともにインキュベートした。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体（１：１０,０００）（Ｄａｋｏ Ａ／Ｓ Ｄｅｎｍａｒｋ）を、室温で１時間適用した。免疫反応性のバンドを、高感度（ｅｎｈａｎｃｅｄ）化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって明らかにした。
【０１１２】
ＤＮＡ断片化−高分子量のＤＮＡ断片を、記載される通りに（Ｚｈｉｖｏｔｏｖｓｋｙ １９９３ ２０７ １６３）フィールド・インバージョンゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）によって検出した。手短に言えば、細胞（２×１０6）を、プロテイナーゼＫによって処理された低融点アガロースゲルに埋め込んだ。サンプルを、１２℃で０.５ ３ ＴＢＥ（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１.２５ｍＭ ＥＤＴＡ、４５ｍＭホウ酸、ｐＨ ８.０）中１％アガロースゲルにおいて１８０Ｖでの電気泳動に供し、２４時間で０.８秒から３０秒に変化するランピング速度で、３：１のフォワード対リバース比を用いた。高分子断片化ＤＮＡバンドの定量化を、ｉｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。
【０１１３】
ヒストンアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴの効果
Ｊｕｒｋａｔ細胞のクロマチンアセチル化レベルを、アセチル化ヒストンＨ４に特異的な抗体を用いて、フローサイトメトリーにより定量した（図１）。アセチル化を増大させるために、細胞を、ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡで処理した（図１Ｃ、図１Ｅライン３）。最大効果が２時間後に見られた。アセチル化の増大を、ＴＳＡ処理細胞由来の核抽出物をウエスタンブロット分析することによって確認した。
【０１１４】
Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して低濃度のＨＡＭＬＥＴは、培地コントロールと比較して、ヒストンＨ４アセチル化の減少を引き起こした（図１Ｂ、図Ｅ ライン２）（図１Ａ、図１Ｅライン１）。このアセチル化の減少を、ウエスタンブロット分析によって確認した。
【０１１５】
結果は、ＨＡＭＬＥＴが低濃度でアセチル化阻害剤として作用し得るものであるか、又はＨＡＭＬＥＴがＪｕｒｋａｔ細胞においてアセチル化が低い細胞のみ残してアセチル化クロマチンを有する細胞を殺傷し得ることが示唆された。
【０１１６】
Ｈ４アセチル化に対するＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの組み合わせ効果が示された（図１Ｄ、図１Ｅライン４）（図１Ｃ、図１Ｅライン３）。ＨＡＭＬＥＴによるアセチル化の減少は、ＨＡＭＬＥＴだけで処理した後よりもＴＳＡで前処理した細胞の方が大きかった。
【０１１７】
実施例２
ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＡＭＬＥＴに応答してＤＮＡ断片化を増大する。
【０１１８】
ＤＮＡ断片化に対するＨＡＭＬＥＴの効果を、未処理細胞とアセチル化を増大するＴＳＡで前処理された細胞との間で比較した。サブＧ０／Ｇ１ ＤＮＡ断片化を、実施例１に記載の方法論を用いてフローサイトメトリーによって定量化した。
【０１１９】
ＨＡＭＬＥＴが、１時間後にＪｕｒｋａｔ細胞のＤＮＡ断片化を誘導することが示されたが（図４Ａ）、ＴＳＡ処理は、ＤＮＡ断片化を刺激しなかった。しかし、ＴＳＡ前処理は、ＨＡＭＬＥＴへの感受性を増大し、そしてＨＡＭＬＥＴ誘導性のＤＮＡ断片化を増強した。
【０１２０】
細胞のＨＡＭＬＥＴへの感受性は、ＴＳＡ濃度に直接関連しており、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴにより誘発される腫瘍細胞死を増大することを示唆している（図２）。
【０１２１】
ＨＤＡＣ阻害剤の効果を、ＴＳＡとＳＡＨＡ、すなわち別のＨＤＡＣ阻害剤とを比較することによってさらに調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＳＡＨＡ（２.５μＭ）で２時間前処理し、そしてＨＡＭＬＥＴに１時間曝露し、そしてサブＧ０／Ｇ１ ＤＮＡ断片化を、フローサイトメトリーによって定量した（図３Ｂ）。ＨＡＭＬＥＴに応答したＤＮＡ断片化は、ＳＡＨＡによって増強されたが（図３Ｄ）、この物質自体は、ＤＮＡ断片化を引き起こさなかった（図３Ｃ）。
【０１２２】
さらに、コンフルエントではないＡ４５９細胞を、一晩ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに又はＴＳＡなしで処理した。次いでＨＡＭＬＥＴを、３０μＭで１時間添加した。上記のように、ＤＮＡ断片化を両方ともフローサイトメトリーによって追跡した。ＰＩ染色後（材料及び方法を参照のこと）、サブＧ１集団を定量し、そして集団全体のパーセントとして示した。
【０１２３】
先と同様に、ＴＳＡへ長く曝露すると、細胞死を有意に増大することが明らかになった（データは示さず）。
【０１２４】
実施例３
ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンコアと相互作用する。
ヒストンは、２０アミノ酸のヒストンテールを通じて多くの効果を発揮し、このテールは、他のヒストンドメインよりも接近しやすく、そして種々の刺激によって修飾され得る。ＨＡＭＬＥＴの結合を、野生型ヒストンと、ヒストンテールを欠失する突然変異体との間で比較した。
【０１２５】
ヒストン−ネイティブのフォールドしたヒストンを、アヒル赤血球核から得た。ネイティブ又はテールのないＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒヒストンを、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、精製し、そして八量体に集合させた。ヒストンのフォールド及び機能の完全性を、ＤＮＡへのヌクレオソーム集合によって確認した。
【０１２６】
ＤＮＡ−ウニ５Ｓ ＲＮＡ遺伝子を含む２５６ｂｐ断片（Ｓｉｍｐｓｏｎ及びＳｔａｆｆｏｒｄ、１９８３）を、プラスミドｐＬＶ４０５−１０のＥｃｏＲ１又はＮｃｉ１消化からゲル精製した（Ｓｉｍｐｓｏｎら、１９８５）。このＤＮＡを、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで末端標識した（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）。
【０１２７】
クロマチン集合−ヌクレオソームを生成させるために、ヒストン八量体（組換え又は細胞から精製）を、「ソルトジャンプ（ｓａｌｔ ｊｕｍｐ）」方法に従って、線状ＤＮＡ上に集合させた（Ｓｔｅｉｎ、１９７９）。32Ｐ標識された２５６ｂｐの断片及びキャリアＤＮＡ（超らせんプラスミドＤＮＡ、最終ＤＮＡ濃度は２００μｇ／ｍｌ）を、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）中でヒストンと混合した（ヒストン：ＤＮＡの質量比０.４〜０.６）。この混合物を、３７℃で１０分間インキュベートし、０.５Ｍ ＮａＣｌに希釈し、同じ温度で３０分間インキュベートし、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡに対して４℃で２時間透析した。ゲルのＳＹＢＲグリーン染色を伴う実験のために、このキャリアプラスミドＤＮＡを、非放射性の２５６ｂｐ ＤＮＡ断片で置換した。クロマチンを４℃で保管した。
【０１２８】
実施例４
ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＡＭＬＥＴ誘発性の細胞死を増強する。
ＨＤＡＣ阻害剤が、腫瘍細胞の生存能に対するＨＡＭＬＥＴの効果に影響を及ぼし得るか否かを調べるために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡで３時間又は１８時間前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴに曝露した（図５）。この組み合わせ処理に対する細胞反応を、ＴＳＡ単独（３時間又は１８時間）及びＨＡＭＬＥＴ（３時間）に対する反応と比較した。培地の細胞を、コントロールとして使用した。細胞反応を、フローサイトメトリーによって定量し、そしてサブＧ１集団を、クロマチン断片化及び細胞死の基準として使用した（図５及び６Ａ）。同時に、細胞生存能を、ＡＴＰレベル（図６Ｂ）及びトリパンブルー排除法（図６Ｃ）によって評価した。
【０１２９】
ＨＤＡＣ阻害剤への短期間の曝露（ＴＳＡ、３時間）は、コントロールと比較して検出可能なＤＮＡ断片化の変化を引き起こさなかったが（３.６６％対２.８０％）、ＴＳＡへの１８時間の曝露は、予想されたサブＧ１集団の増大を引き起こした（２６.１３対２.８０）。ＴＳＡ単独及びＨＡＭＬＥＴ単独の両方に関して、サブＧ１集団の増大は、細胞生存能の減少を伴った（図６Ｂ及び図６Ｃ）。ＨＡＭＬＥＴ濃度を漸増すると、細胞のＡＴＰレベルの減少が誘導された（９.２％対４１.１７％対８５.７１％は、ＨＡＭＬＥＴでの曝露から３時間後にそれぞれ０.１ｍｇ／ｍｌ、０.２ｍｇ／ｍｌ及び０.３ｍｇ／ｍｌに減少した）（図６Ｂ）。トリパンブルー排除法により、生存能の減少は、コントロールと比較して、ＨＡＭＬＥＴでの処理から３時間後に１９.７％であった。ＴＳＡ処理後の生存能の減少は、曝露から１８時間後にのみ検出することができ、コントロールと比較して、２４.９％の減少であった（図６Ｃ）。
【０１３０】
ＴＳＡでの前処理は、ＨＡＭＬＥＴに応答して細胞死を増強した（図５、図６）。サブＧ１集団は、ＴＳＡ処理細胞（３時間）の７.６８％からＴＳＡ＋ＨＡＭＬＥＴ処理細胞の１４.５８％まで増大した。サブＧ１の蓄積は、ＴＳＡでの１８時間の曝露によってさらに増強された（ＴＳＡ＋ＨＡＭＬＥＴでの５１.４３％対ＴＳＡ処理での２６.１３％対ＨＡＭＬＥＴでの１４.５８％）。この効果は、ＴＳＡを５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌへと増大することによって示されるように、濃度依存的であった（図６Ａ）。サブＧ１集団の増大は、ＴＳＡ前処理の時間又は用量を増大して曝露したＪｕｒｋａｔ細胞の生存能の漸増に相関した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。ＨＡＭＬＥＴでの処理前に漸増濃度のＴＳＡで前処理すると、ＨＡＭＬＥＴ単独又はＴＳＡ単独により細胞中で観察されたＡＴＰレベルの減少を増強した（ＴＳＡ ５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ及び２００ｎｇ／ｍｌでの３時間の前処理、その後のＨＡＭＬＥＴでの処理（０.２ｍｇ／ｍｌ）は、コントロール細胞と比較して、それぞれＡＴＰレベルを５４.３８％、６３.０３％及び７０.６１％に減少させ、一方ＨＡＭＬＥＴ単独での処理は４１.１７％であった。）（図６Ｂ）。トリパンブルー排除法によって、生存能の減少は、ＴＳＡでの前処理時間を増大し、その後ＨＡＭＬＥＴで３時間処理した後に増強された。（コントロールと比較して、ＴＳＡで３時間の前処理及びＨＡＭＬＥＴでの処理後は３６％、そしてＴＳＡで１８時間の前処理及びＨＡＭＬＥＴでの処理後は５１.７％であり、ＨＡＭＬＥＴ単独では１９.７％、ＴＳＡ単独で１８時間では２４.９％であった。）
結果は、ＨＤＡＣ阻害剤が、腫瘍細胞に対するＨＡＭＬＥＴの致死性を増大することを示した。
【０１３１】
実施例５
ヒストンＨ４アセチル化に対する効果
ＨＤＡＣの阻害は、アセチル化ヒストンの蓄積を引き起こす。Ｊｕｒｋａｔ細胞のアセチルヒストンＨ４レベルを、特異的抗体での染色後にフローサイトメトリーによって定量した。クロマチンレベルの変化を可視化するために、細胞をヨウ化プロピジウムで対比染色した。結果を、密度プロット図で示し、Ｙ軸は、４つの細胞集団（サブ１、Ｇ１、Ｓ及びＧ２）間のＤＮＡ含量を表し、そしてＸ軸は、ヒストンＨ４のアセチル化の程度を表した。４つの細胞集団（サブ１、Ｇ１、Ｓ及びＧ２）は、Ｙ軸上で区別することができた。
【０１３２】
ＴＳＡは、時間依存的なヒストンアセチル化の増大を引き起こした（図７）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡに３時間又は１８時間曝露し、そしてアセチル化の増大を、上記のように定量した。対照的に、ＨＡＭＬＥＴ単独は、アセチル化の程度を変化させなかったが、ＴＳＡと組み合わせると有意な増大が観察された。アセチル化の増大は、ＴＳＡ単独に曝露した後よりもＴＳＡ及びＨＡＭＬＥＴに曝露した細胞でより迅速かつ高かった。
【０１３３】
種々の細胞集団のアセチル化の分析により、ＨＡＭＬＥＴはヒストンＨ４のアセチル化の増大を誘発すること、そしてヒストンＨ４のアセチル化は、細胞に対して行われた処理とは無関係の静止しているすなわち「インタクトな」集団と比較して、すべてのサブＧ１集団において常に重要性が低いことが明らかになった（図７）。さらに、細胞集団全体を「インタクトな細胞」に対して比較することにより、結果は、サブＧ１集団の蓄積が、集団全体のアセチル化の平均に干渉し得ることを示した（図７）。
【０１３４】
次いで、サブＧ１集団を分析から除くことにより、ヒストンＨ４のアセチル化の増大が、ＴＳＡ単独で処理されたものと比較して、ＴＳＡ及びＨＡＭＬＥＴの両方で処理した静止している「インタクトな」細胞集団に見られた（図８Ａ）。ＴＳＡでの処理から３時間後、ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンアセチル化の２倍の増大を誘導した。ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡによって誘導された３時間後のこのアセチル化程度は、ＴＳＡでの一晩の曝露によって誘導されたアセチル化程度よりも高かった（図８Ａ）。さらに、ＴＳＡの存在下でのＨＡＭＬＥＴは、ＴＳＡへの一晩の曝露の後でさえもクロマチンのアセチル化をなお促進することができた（図８Ａ）。別のＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡをＨＡＭＬＥＴ処理と組み合わせると、類似の結果が見出された（データは示さず）。興味深いことに、ＨＡＭＬＥＴを含まない漸増濃度のＴＳＡに細胞をさらすことによっても、アセチル化の割合は、なおコントロールの２倍の増大を有するＪＵＲＫＡＴ細胞の割合と同じであった。ＨＡＭＬＥＴを添加すると、ＴＳＡ用量依存的なヒストンＨ４のアセチル化の増大が見られ、アセチル化は、コントロールの２.７倍から４.３倍へと増大した（図８Ａ）。
【０１３５】
これらの結果は、高濃度のＨＡＭＬＥＴをＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせると、細胞のアセチル化の増大を促進することを示した。
【０１３６】
次いで、ＨＡＭＬＥＴで処理する前に、Ｊｕｒｋａｔリンパ球をＨＤＡＣ阻害剤で前処理することがどれくらい重要かを分析した。次にＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴの前後で、どちらが使用できるかを比較した。第一の実験において、細胞を、ＨＤＡＣ阻害剤で前処理し、そしてＨＡＭＬＥＴで処理した。上記のように、アセチル化の増強は、組み合わせた方法で見出された（図８Ａ）。次に、細胞を最初にＨＡＭＬＥＴで処理し、次いでＴＳＡを添加した。興味深いことに、アセチル化のレベルは今度は減少し（図８Ｂ）、これは、アセチルヒストンＨ４のアセチル化増強のためには、細胞がＨＤＡＣ阻害剤によって逐次的に前処理され、そしてＨＡＭＬＥＴで処理されなければならないことが示された。
【０１３７】
これらの結果により、リンパ球のアセチル化に関して相乗的な効果を得るためには処理の順序が極めて重要であることが示された。
【０１３８】
実施例６
ＨＡＭＬＥＴは、ＴＳＡ誘導性のクロマチン修飾に影響を及ぼす。
ヒストンＨ４のアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの効果を、ＧＦＰタグ化ヒストンＨ４を発現する付着性のＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡法によってさらに調べた。コントロール細胞は、Ｈ４−ＧＦＰ染色によって示されるようにいくつかの核小体を有する核を示した。コントロール細胞のヒストンＨ４のアセチル化レベルは、極めて弱かった（図９Ａ）。ＨＡＭＬＥＴ処理細胞は、異なる形状を内部に有し（ａｒｂｏｒ）、核サイズは著しく減少し、そしてＧＦＰ染色の強度は増大した。興味深いことに、ＨＡＭＬＥＴは、上皮細胞においてヒストンＨ４のアセチル化の増大を誘導した（図９Ｂ及びＥ）。ＴＳＡ処理細胞は、核サイズ及びＧＦＰ染色のわずかな増大を示し、そして予想されるように、ヒストンＨ４のアセチル化の染色が増大することを示した（図９Ｃ及びＥ）。たとえアセチル化の増大が、これらの細胞においてこの時点でＨＡＭＬＥＴとＴＳＡとの間で同じであっても、２つの異なる条件での核の形状は、完全に逆の種類の反応を示した（図９Ｂ及びＣ及びＥ）。さらに、細胞をＴＳＡで前処理し、そしてＨＡＭＬＥＴで処理すると、ＨＡＭＬＥＴ様反応が見出され、核サイズは減少し、そしてＧＦＰ染色は増大した。この条件において、アセチル化のレベルは、組み合わせ処理で相乗的に増強され（図９Ｄ及びＥ）、上皮細胞型に対して、サイトメトリー分析によってＪｕｒｋａｔリンパ球で見出された相乗効果が確認された。
【０１３９】
これらの結果は、ＨＡＭＬＥＴをＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせることはまた、上皮細胞のアセチル化の増大を促進することを示した。さらに、核の形状を見ることにより、ＨＡＭＬＥＴ誘導性のアセチル化の増大は、ＨＤＡＣ阻害剤反応に相関しないが、むしろ収縮して変形した核のストレスに相関していると結論付けられた。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるヒストンアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴの効果を示している。
【図２】ＨＡＭＬＥＴ誘導性の迅速なＤＮＡ断片化が、ＨＤＡＣ阻害剤によって増強されることを示している。
【図３】ＨＡＭＬＥＴの増強された活性が、ヒストンアセチル化に相関することを示している。
【図４】尾部のないヒストン及びＤＮＡの混合物に対するＨＡＭＬＥＴの効果を示している。
【図５】ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴ誘導性のＤＮＡ断片化を増強することを示している。
【図６】ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴ誘導性の細胞死を増強することを示している。
【図７】ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理した細胞において、アセチル化及び細胞死が増大したことを示している。
【図８】ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理した細胞において、アセチル化及び細胞死が増大したことを示している。
【図９】ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理されたアセチル化細胞の形態を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖性疾患、例えばがんのような腫瘍を発生させる疾患の処置に特に有効であることが見出された生物学的に活性な構成要素の組み合わせ物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＡＭＬＥＴ（Ｈｕｍａｎ α−ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｍａｄｅ ｌｅｔｈａｌ ｔｏ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌｓ）は、腫瘍細胞の細胞死を誘導する分子複合体である。実際にこの効果は、腫瘍細胞及び一部の未熟細胞に選択的であり、そして健康な分化した細胞は、ＨＡＭＬＥＴに反応して細胞死を受けることはない。この選択性は、ＨＡＭＬＥＴが腫瘍細胞に独特な標的に到達するが、抵抗性細胞には到達しないことを意味している。
【０００３】
類似の活性を有するこの複合体の生物学的に活性な変異体又は誘導体は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０３／０１２９３号に記載されている。
【０００４】
ＨＡＭＬＥＴの細胞標的は、共焦点顕微鏡法及び細胞下分画法（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）を組み合わせることによって調べられている［Ｈａｋａｎｓｓｏｎら、１９９９ Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２４６、４５１−６０］。ＨＡＭＬＥＴは細胞表面に結合し、そして細胞質に入り、ここでミトコンドリアと相互作用し、そしてミトコンドリアを活性化する。最終的に、このタンパク質は細胞核に入り、ここに蓄積する。
【０００５】
本発明者らは耐性細胞及び感受性細胞が、同様の効率でその細胞表面にＨＡＭＬＥＴを結合することを見出し、これは際立った事象ではないことを示唆している。対照的に核での蓄積は、瀕死の細胞にしか生じておらず、この段階が感受性細胞と抵抗性細胞とを区別していることを示唆している。共焦点顕微鏡法によれば、この核での蓄積は不可逆的なようであり、核分画においてＨＡＭＬＥＴを結合しそしてＨＡＭＬＥＴを保持する核標的の存在を示唆している。
【０００６】
本発明者らは、ＨＡＭＬＥＴの核内分布をより精密に試験し、そしてこのタンパク質が、核小体に対応する領域に選択的に局在化することを見出し、これはＨＡＭＬＥＴが、クロマチン構造の調節に関与する分子と相互作用することを意味していると結論付けた。
【０００７】
さらなる研究の結果として、ＨＡＭＬＥＴの核標的が同定された。驚くべきことに、ヒストンテールの存在とは無関係の様式で、ＨＡＭＬＥＴは特異的なヒストンタンパク質と相互作用することが見出された（ＷＯ２００３／０９８２２３を参照のこと）。従って、この相互作用は、細胞を死の経路に不可逆的に閉じ込める事象であり得るようである。ＨＡＭＬＥＴは、抗腫瘍分野においてこの作用様式を有する点で独特なようである。
【０００８】
しかし、その作用機構、及び特にクロマチン摂動（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｅ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）の機構については何もわかっておらず、そして細胞生存能に対する効果もわかっていない。
【０００９】
ヒストンアセチラーゼ（ＨＡＴ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、それぞれヒストンテールのリジン残基のアセチル化及び脱アセチル化を調節する。ヒストンアセチル化の増大は、負荷電塩基との静電相互作用を減弱させ、ヒストンとＤＮＡとの相互作用を減少させ、そして転写因子が標的遺伝子に接近できるようにする。
【００１０】
ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）は、がん抑制遺伝子を含む複数の遺伝子の転写を抑制するので、多発性がんに関与している。
【００１１】
ＨＤＡＣは、ヒトのがんを処置する酵素的阻害剤の開発のための分子標的として浮上してきた。ＨＤＡＣは一般に、腫瘍で過剰発現され、そしてｐ２１ＷＡＦ１及びＰ２７ＫＩＰ１のような抗腫瘍遺伝子の転写を遮断することにより、腫瘍細胞が長く生きることを促進している。多くのＨＤＡＣ阻害剤が、種々のヒト悪性腫瘍に対するその活性により、インビボ及びインビトロで現在使用されている。
【００１２】
例えば、ＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、インビボ及びインビトロの両方で、それぞれ乳癌及び前立腺癌に対して活性を有することが示されており、また最近デプシペプチドも、早期の第一相／第二相試験において、Ｔ細胞リンパ腫の処置中に臨床活性を有することが示された。
【００１３】
さらに、ＨＤＡＣ阻害剤は、がん治療において他の抗腫瘍薬と併用して使用されており、様々な程度で成功を収めている。例えば化学療法剤とともに使用されるとき、併用効果は、相乗的から拮抗的、すなわち毒性を増大するまでに変動する。
【００１４】
ＨＤＡＣ阻害剤を、脱メチル化剤、核内受容体リガンド、シグナル伝達阻害剤及びＨｓｐ９０アンタゴニスト並びにプロテアソーム阻害剤と併用したときの、増強効果又は相乗効果が注目された（Ｄｒｕｍｍｏｎｄら、前出）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ＨＤＡＣ阻害剤が他の処置を促進する相互作用は、完全には理解されていない。しかし、公知の治療薬のいずれか、例えばＨＡＭＬＥＴとは完全に異なる作用様式を有する分子を扱うとき、特に両方の薬剤が同じ標的に、すなわちヒストンに、たとえヒストン分子内の異なる部位であっても、直接相互作用するようである場合には、どのようにＨＤＡＣ阻害剤との併用治療が作用するかは予測不可能である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
しかし、ＨＡＭＬＥＴはＨＤＡＣ阻害剤ではないにもかかわらず、ＨＤＡＣ阻害剤と一緒に使用すると、ＨＡＭＬＥＴ誘導性の細胞死を相乗的な様式で増強し、新しい併用治療アプローチをもたらすことが本発明者らによって見出された。
【００１７】
本発明によれば、ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物学的に活性な修飾物又はこれらのいずれかの生物学的に活性な断片である構成要素（ｉ）、及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である構成要素（ｉｉ）の組み合わせ物が提供される。
【００１８】
本明細書で使用される用語「ＨＡＭＬＥＴ」は、α−ラクトアルブミン（これは、ヒト起源であってもヒト起源ではなくてもよい）の生物学的に活性な複合体をいい、これは例えばＥＰ−Ａ−０７７６２１４に記載されるように、陰イオン交換クロマトグラフィーとゲルクロマトグラフィーを組み合わせることによってｐＨ４.６で沈殿している乳汁のカゼイン画分から単離するか、又はＷＯ９９／２６９７９に記載されるように、Ｃ１８：１脂肪酸として特徴付けられるヒト乳汁カゼイン由来の補因子の存在下でα−ラクトアルブミンをイオン交換クロマトグラフィーに付すのいずれかによって得られ得る。
【００１９】
生物学的に活性な複合体を形成するために、α−ラクトアルブミンは一般に、コンホメーション変化またはフォールディング変化及び脂質補因子の存在の両方を必要とする。このコンホメーション変化は、α−ラクトアルブミンからカルシウムイオンを除去することによって適切に誘起される。好ましい実施態様において、これは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミンの変異体を使用することで、適切に促進される。
【００２０】
このような変異体を含む生物学的に活性な複合体は、本明細書で使用される用語ＨＡＭＬＥＴの「修飾物」に包含される。しかし、一旦形成されれば、機能的なカルシウム結合部位及び／又はカルシウムが存在しても、この複合体の安定性にも生物学的活性にも影響を及ぼさないことが本発明者らによって見出された。生物学的に活性な複合体は、活性を損なうことなくカルシウムに対する親和性を保持することが見出された。従って、本発明の複合体は、カルシウムイオンをさらに含み得るものである。
【００２１】
従って特に本発明は、生物学的に活性な複合体を使用するものであり、これはアポフォールディング状態のα−ラクトアルブミン若しくはα−ラクトアルブミンの変異体、又はこれらのいずれか一方の断片、及びこの複合体を生物学的に活性な形態で安定化する補因子を含むものであり、但し、α−ラクトアルブミン又はその変異体のすべての断片は、αドメインとβドメインとの間の界面を形成するα−ラクトアルブミンの領域に対応する領域を含むものとする。
【００２２】
好適には、この補因子は、シスＣ１８：１：９若しくはＣ１８：１：１１脂肪酸であるか、又は類似の立体配置を有する異なる脂肪酸である。
【００２３】
特に都合の良い実施態様において、本発明で使用される生物学的に活性な複合体は、以下
（ｉ）シスＣ１８：１：９若しくはＣ１８：１：１１脂肪酸又は類似の立体配置を有する異なる脂肪酸；及び
（ｉｉ）カルシウムイオンが除去されているα−ラクトアルブミン、又はカルシウムイオンが遊離しているか若しくは機能的なカルシウム結合部位を有さないα−ラクトアルブミンの変異体；又はこれらのいずれか一方の断片を含むものであり、但しすべての断片はαドメインとβドメインとの間の界面を形成するα−ラクトアルブミンの領域に対応する領域を含むものとする。
【００２４】
本明細書で使用される表現「変異体」は、基礎となるタンパク質（好適には、ヒト又はウシのα−ラクトアルブミン）に相同であるが、由来している塩基配列とは、配列内の１つ又はそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換される点が異なるポリペプチド又はタンパク質をいう。アミノ酸が、概して類似の性質を有する異なるアミノ酸で置換される場合、アミノ酸置換は「保存的」とされ得る。非保存的置換とは、アミノ酸が、異なるタイプのアミノ酸で置換される場合である。大まかに言って、非保存的置換がより少ないと、ポリペプチドの生物学的活性を変化させずにすむことが可能である。好適には変異体は、少なくとも６０％同一であり、好ましくは少なくとも７０％同一であり、なおより好ましくは８０％若しくは８５％同一であり、そして特に好ましくは９０％、９５％若しくは９８％又はそれ以上の同一性である。
【００２５】
この場合の同一性は、例えばＢＬＡＳＴプログラム又はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎのアルゴリズムを、Ｋｔｕｐｌｅ：２、ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ：４、Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ：１２という標準的なＰＡＭスコアリングマトリックスとともに用いて判定され得る（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．及びＰｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．、Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ Ｓｅａｒｃｈｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８５、第２２７巻、１４３５−１４４１）。
【００２６】
用語「その断片」は、完全なα−ラクトアルブミンアミノ酸配列を含む複合体と類似の活性を有する複合体を形成することになる、所定のアミノ酸配列の任意の部分をいう。断片は、全長タンパク質のうちの２以上の部分が互いに結合されたものを含み得る。部分は好適には、基礎となる配列から少なくとも５つ及び好ましくは少なくとも１０の連続したアミノ酸を含むものである。
【００２７】
好適な断片は、欠失変異体であり、好適には少なくとも２０のアミノ酸長、及びより好ましくは少なくとも１００のアミノ酸長を含むものである。この断片は、タンパク質由来の小さな領域又はこれらの組み合わせを含むものである。
【００２８】
αドメインとβドメインとの間の界面を形成する領域は、ヒトα−ラクトアルブミンにおいては、この構造中のアミノ酸３４〜３８及び８２〜８６で画成される。従って好適な断片は、これらの領域、及び好ましくはネイティブタンパク質のアミノ酸３４〜８６の全体の領域を含むものである。
【００２９】
特に好ましい実施態様において、生物学的に活性な複合体は、カルシウムに対する親和性が減少するか、又はもはや機能的ではないようにカルシウム結合部位が修飾されているα−ラクトアルブミンの変異体を含むものである。
【００３０】
ウシα−ラクトアルブミンにおいて、カルシウム結合部位は、残基Ｋ７９、Ｄ８２、Ｄ８４、Ｄ８７及びＤ８８によって配位されることが見出された。従って、例えば１つ又はそれ以上の酸性残基を除去することによるこの部位の修飾物又は非ウシα−ラクトアルブミンでのその等価物は、この部位のカルシウム親和性を減少し得るか、又は機能を完全に排除し得ることになり、そしてこのタイプの突然変異体は、本発明の好ましい側面である。
【００３１】
ウシα−ラクトアルブミンのＣａ2+結合部位は、３10へリックス及びα−へリックスからなり、短いターン領域が２つのへリックスを隔てている（Ａｃｈａｒｙａ Ｋ．Ｒ．ら（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２１、５７１−５８１）。これは、２つのジスルフィド架橋が側面に位置しており、分子のこの部分を相当に固定している。Ｃａ2+を配位する７つの酸素基のうち５つは、Ａｓｐ８２、８７及び８８の側鎖のカルボキシレート、又はＬｙｓ７９及びＡｓｐ８４のカルボニル酸素基によって与えられる。２つの水分子が、残りの２つの酸素基を供給する（Ａｃｈａｒｙａ Ｋ．Ｒ．ら、（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２１、５７１−５８１）。
【００３２】
８７番目のアスパラギン酸からアラニンへの部位特異的突然変異誘発（Ｄ８７Ａ）は、カルシウム結合部位を強力に不活性化することが以前に示されており（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、１１６４８−１１６５４）、そしてこの突然変異体タンパク質は、アポコンホメーションをとった。
【００３３】
従って特定の実施態様において、ウシα−ラクトアルブミンタンパク質配列内のアミノ酸８７番目のアスパラギン酸残基は、非酸性残基で、特に非極性側鎖又は非荷電の極性側鎖に突然変異される。
【００３４】
非極性側鎖残基としては、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン又はシステインが挙げられる。特に好ましい例はアラニンである。
【００３５】
非荷電の極性側鎖残基としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン又はチロシンが挙げられる。
【００３６】
突然変異体タンパク質の構造のひずみを最小限にするために、Ｄ８７はまた、アスパラギン（Ｎ）で置き換えられており（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ Ｓ．Ｅ．ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １４、７８５−７８９）、これは、カルボキシレート基の補償されていない（ｎｏｎ−ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ）負電荷を欠失するが、同じ側鎖体積及び幾何構造を有している。この突然変異体タンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、低い親和性でしかカルシウムを結合しないことが示された（Ｋ−Ca２×１０5Ｍ-1）（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ Ｓ．Ｅ．ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １４、７８５−７８９）。このような突然変異体は、本発明のさらに好ましい実施態様において、生物学的に活性な複合体の要素を形成している。
【００３７】
従って、本発明の複合体で使用するのに特に好ましい変異体は、α−ラクトアルブミンのＤ８７Ａ変異体及びＤ８７Ｎ変異体、又はこの突然変異を含む断片である。
【００３８】
分子のこの領域は、ウシとヒトとのタンパク質間で異なっており、３つの塩基性アミノ酸のうちの１つ（Ｒ７０）が、ウシα−ラクトアルブミンではＳ７０に変化しており、従って配位している側鎖が１つ脱離している。従って、ウシα−ラクトアルブミンが本発明の複合体に使用される場合、すなわちＳ７０Ｒ突然変異体が使用される場合が好ましいものであり得る。
【００３９】
Ｃａ2+結合部位は、いろいろな種由来のα−ラクトアルブミンにおいて、１００％保存されており（Ａｃｈａｒｙａ Ｋ．Ｒ．ら、（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２１、５７１−５８１）、タンパク質にとってこの機能が重要であることを明らかにしている。これには、５つの異なるアミノ酸及び２つの水分子が配位している。Ｄ８７の側鎖カルボキシレートは、Ｄ８８と一緒になって最初にカルシウムイオンを陽イオン結合領域にドッキングさせ、そして構造を安定化させる分子内水素結合を形成する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、１１６４８−１１６５４）。Ｄ８７又はＤ８８のいずれかが欠失すると、Ｃａ２＋結合が弱まり、そして部分的にアンフォールディングな状態で分子を安定化することが示されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｐ．Ｊ．ら、（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６、１１６４８−１１６５４）。
【００４０】
さらに、ウシα−ラクトアルブミンのカルシウム結合部位に２つの異なる点突然変異を有する突然変異体タンパク質が使用され得る。例えば、８７番目のアスパラギン酸がアラニンで置換されると（Ｄ８７Ａ）、カルシウム結合が完全に消失し、そしてタンパク質の三次構造が崩壊することが見出されている。アスパラギンによるアスパラギン酸の置換、すなわちタンパク質（Ｄ８７Ｎ）は、なおカルシウムを結合するが、親和性がより低く、そして三次構造の消失を示すが、Ｄ８７Ａ突然変異体ほど顕著ではない（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ Ｓ．Ｅ．ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １４、７８５−７８９）。この突然変異体タンパク質は、両方のアミノ酸が同じ平均体積１２５Å3を有するため充填体積が最小限の変化しか示さず、そしてアスパラギンなどのカルボキシレート側鎖によりタンパク質がカルシウムを配位するのを可能にするが、効率はより悪い（Ｐｅｒｍｙａｋｏｖ Ｓ．Ｅ．ら、（２００１）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｅｎｇ １４、７８５−７８９）。両方の突然変異体タンパク質は、生理的温度でアポ−コンホメーションで安定であるが、このコンホメーション変化にもかかわらず、これらは生物学的に不活性であった。この結果は、アポ−コンホメーションへのコンホメーション変化だけでは生物学的活性を誘導するのに十分ではないことを示している。
【００４１】
α−ラクトアルブミンの構造は当該分野で公知であり、そして本明細書で言及される残基の正確なアミノ酸番号付けは、例えばＡｎｄｅｒｓｏｎら、前出及びＰｅｒｍｙａｋｏｖら、前出に示される構造を参照することにより同定され得る。
【００４２】
しかし特に好ましい実施態様において、組み合わせの構成要素（ｉ）は、ヒト乳汁から得られ得るＨＡＭＬＥＴである。
【００４３】
構成要素（ｉｉ）に関して、公知のＨＤＡＣ阻害剤の６つの主要なクラスが存在しており、そしてこれらは、以下に要約され得る：
Ａ．低分子量（例えば、１５０未満の分子量）のＨＤＡＣ阻害性カルボン酸又はその薬学的に受容可能な塩若しくは薬学的に受容可能なエステル、例えば酪酸塩（例えば、酪酸ナトリウム）、バルプロ酸又はその薬学的に受容可能な塩若しくは薬学的に受容可能なエステル、フェニル酪酸又はその薬学的に受容可能な塩若しくは薬学的に受容可能なエステル（例えば、フェニル酪酸ナトリウム又は酪酸ピバリルオキシメチル（ＡＮ９））。
【００４４】
Ｂ．ヒドロキサム酸、例えば以下の構造（ｉ）のスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）
【化１】
【００４５】
以下の構造（ｉｉ）のＮＶＰ−ＬＡＱ−８２４
【化２】
【００４６】
以下の構造（ｉｉｉ）のｍ−カルボキシ桂皮酸ビスヒドロキサム酸（ＣＢＨＡ）
【化３】
【００４７】
以下の構造（ｉｖ）のスベリン酸ビスヒドロキサム酸（ＳＢＨＡ）
【化４】
【００４８】
以下の構造（ｖ）のＪＮＪ１６２４１１９９
【化５】
【００４９】
以下の構造（ｖｉ）のプロキサミド（Ｐｒｏｘａｍｉｄｅ）
【化６】
【００５０】
以下の構造（ｖｉｉ）のスクリプタイド（Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）
【化７】
【００５１】
以下の構造（ｖｉｉｉ）のオキサムフラチン（Ｏｘａｍｆｌａｔｉｎ）
【化８】
【００５２】
以下の構造（ｉｘ）のトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）
【化９】
【００５３】
以下の構造（ｘ）のツバシン（Ｔｕｂａｃｉｎ）
【化１０】
【００５４】
以下の構造（ｘｉ）の６−（３−クロロフェニルウレイド）カプロン酸ヒドロキサム酸（３−Ｃｌ−ＵＣＨＡ）
【化１１】
及び以下の構造（ｘｉｉｉ）のＡ−１６１９０６
【化１２】
【００５５】
Ｃ．ベンズアミド、例えば以下の構造（ｘｉｖ）のＭＳ−２７５
【化１３】
又は以下の構造（ｘｖ）のＮ−アセチルジナリン（ＣＩ−９９４）
【化１４】
【００５６】
Ｄ．エポキシケトン、例えば以下の構造（ｘｖｉ）の２−アミノ−８−オキソ−９，１０−エポキシデカン酸（ＡＯＥ）
【化１５】
又は以下の構造（ｘｖｉｉ）のトラポキシン（Ｔｒａｐｏｘｉｎ）（ＴＰＸ）
【化１６】
【００５７】
Ｅ．環状ペプチド、例えばアピシジン（Ａｐｉｃｉｄｉｎ）若しくはデプシペプチド；又は
Ｆ．ハイブリッド分子、例えば環状ヒドロキサム酸含有ペプチド（ＣＨＡＰ３１）若しくはＣＨＡＰ５０。
【００５８】
構成要素（ｉｉ）は、好適には上記の群Ａ〜Ｅに入る１つ又はそれ以上の阻害剤を含むものである。
【００５９】
特に、本発明の組み合わせ物は、構成要素（ｉｉ）のようなＨＤＡＣ阻害性ヒドロキサム酸を含み、そしてこれは、好適にはＳＡＨＡ又はＴＳＡから選択される。
【００６０】
本発明の組み合わせ物の構成要素は、好適には薬学的に受容可能なキャリア又は賦形剤をさらに含む薬学的組成物の形態で与えられる。
【００６１】
これらは、単一製剤に一緒に組み合わせることもできるが、好ましくは、構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が別々に投与できるように包装され、例えば逐次的に、構成要素（ｉｉ）が前処置として使用され、そして構成要素（ｉ）がその次に投与される。
【００６２】
このように、個々の構成要素の投与様式は異なり得る。例えば、構成要素（ｉ）は一般に、腫瘍部位に直接適用される必要があり、従って好適にはこれを容易にする方法で製剤化される。例えば構成要素（ｉ）は、処置されている腫瘍の位置に応じて局所組成物、注入、坐剤又は吸入若しくは吹入用組成物の形態であり得る。
【００６３】
構成要素（ｉｉ）は、全身的に活性であり得るものであり、従ってより広範な経路、例えば経口又は非経口、及び構成要素（ｉ）に関する使用についての上記の経路を用いて投与され得る。
【００６４】
構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）を互いに混合する場合、これらは構成要素（ｉ）に関する上記の方法による投与用に適切に製剤化してもよい。
【００６５】
従って、意図される投与様式如何により、組成物は、経口使用（例えば、錠剤、ロゼンジ剤、硬カプセル剤若しくは軟カプセル剤、水性懸濁剤若しくは油性懸濁剤、エマルジョン剤、分散性散剤若しくは顆粒剤、シロップ剤又はエリキシル剤として）、局所使用（例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤又は水性若しくは油性の液剤若しくは懸濁剤として）、吸入による投与（例えば、微粉化散剤又は液体エアゾール剤として）、吹入による投与（例えば、微粉化散剤として）又は非経口投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与若しくは筋肉内投薬のための滅菌水性液剤若しくは滅菌油性液剤、又は直腸投薬のための坐剤として）に適する形態であり得る。
【００６６】
好適な薬学的に受容可能なキャリア又は賦形剤は、当該分野でよく理解されている。これらは、薬学的に受容可能な固体又は液体の賦形剤を含む。
【００６７】
特に好ましい実施態様において、組成物は、局所使用に好適な形態、例えばクリーム剤、軟膏剤、ゲル剤又は水性若しくは油性の液剤若しくは懸濁剤としての薬学的組成物である。これらは、薬学的に受容可能な一般に知られたキャリア、増量剤及び／又は添加剤（ｅｘｐｅｄｉｅｎｔ）を含み得る。
【００６８】
局所液剤又はクリーム剤は、好適には、賦形剤又はクリーム基剤と一緒のタンパク質複合体用の乳化剤を含んでいる。
【００６９】
活性化合物の日用量は変動するものであり、そして通常の実際の臨床に従って、処置されている患者、疾患状態の性質などに左右される。原則として、各投与につき構成要素（ｉ）は用量当たり２〜２００ｍｇ使用される。
【００７０】
構成要素（ｉｉ）は、好適には標準的な治療量で投与される。例えば、体重１ｋｇ当たり０.５ｍｇ〜７５ｍｇの範囲の日用量を投与する。
【００７１】
本発明によればさらに、増殖性疾患、例えば腫瘍及び特にがんの処置における使用のため、並びに前腫瘍状態、例えばウイルスによる形質転換を通じて引き起こされ得る疾患状態の処置において使用するための上記のような組み合わせを提供する。
【００７２】
上記のような組み合わせは、腫瘍又は他の増殖性疾患、例えばがん、及び乳頭腫及びウイルス感染、例えばＨＰＶ、特に子宮頸がんに関連したＨＰＶ型（ＨＰＶ１６及び１８）の感染の結果として形質転換されている細胞の処置に特に好適である。
【００７３】
特にこの組み合わせは、悪性の粘膜腫瘍又はがん、例えば膀胱がん、メラノーマ、器官のがん、特に脳腫瘍、及び血管新生の阻害が望ましいあらゆる他の疾患状態、例えばがんの処置に使用され得るものである。
【００７４】
好適には、この組み合わせ物は、構成要素（ｉｉ）が第一に投与され、そして構成要素（ｉ）がその次、例えば構成要素（ｉｉ）の投与後１時間と２４時間との間、好適にはおよそ２〜１２時間後に投与される逐次処置に使用される。この場合、構成要素（ｉｉ）は、上記のように全身投与され得るし、そして構成要素（ｉ）は、その後腫瘍部位に投与され得る。
【００７５】
しかし、この組み合わせ物のそれら構成要素は、共投与（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）、特に単一製剤で腫瘍部位に共投与してもよい。
【００７６】
本発明のさらなる側面は、腫瘍若しくは他の増殖性疾患、例えばがん、又は前腫瘍疾患状態を処置する方法を提供するものであり、この方法は、上記の組み合わせ物をこの処置を必要とする患者に投与することを含む。特に、組み合わせ物の構成要素（ｉｉ）は、前処置として投与され、そして構成要素（ｉ）は、その次に投与される。
【００７７】
本発明者らは、ヒストンアセチル化が、ＨＡＭＬＥＴの結合に影響を及ぼすか否か、そしてクロマチンとのＨＡＭＬＥＴの相互作用が、アセチル化によって修飾されるか否かを見出す研究を行った。
【００７８】
ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡ及びＳＡＨＡを用いて、アセチル化クロマチンを有する細胞は、ＨＡＭＬＥＴにより感受性であるが、これは、ヒストン尾部とのＨＡＭＬＥＴの相互作用に起因していないことが見出された。しかしこの研究過程の間に、ＨＤＡＣ阻害剤がＨＡＭＬＥＴの効果を有意に促進することがさらに注目された。細胞死反応の顕著な増大が注目された。
【００７９】
特に、ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡ及びＳＡＨＡで前処理された細胞は、ＨＡＭＬＥＴにはるかに感受性であることが見出された。この前処理は、断片化ＤＮＡを示す細胞の増大を引き起こしている。
【００８０】
一般にＨＤＡＣ阻害剤に長期曝露された後に得られたこの効果は、ＨＤＡＣ阻害剤の投与後短時間で（２時間）ＨＡＭＬＥＴを投与したときでさえも観察され、これはＨＡＭＬＥＴの機構がタンパク質（ｐ２１ＷＡＦ１及びｐ２７ＫＩＰ１）新合成とは独立しているということを示し得るものである。しかし細胞感受性の増大は、ＨＡＭＬＥＴでの処理の前にＨＤＡＣ阻害剤を長期使用した後でさえも持続した。
【００８１】
これは、ＨＡＭＬＥＴが、がん細胞のＤＮＡ断片化の強力な誘発物質であり、これは、ＨＤＡＣ阻害剤により予想されるレベルよりも高いレベルまで増強され得ることを示している。
【００８２】
クロマチンは、一定の構造修飾を受けており、そしてこの動的プロセスは、遺伝子発現の制御に不可欠である。真核生物系において、この転写プロセスは、主に標的ＤＮＡへの転写因子の接近によって厳重に制御されている。ヌクレオソームは、１４６ｂｐのＤＮＡ及びヒストン八量体を形成する２つの四量体、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４によって形成されるクロマチンの基本的な構造要素である。
【００８３】
ヒストンの翻訳後修飾は、「ヒストンコード（ｃｏｄｅ）」を形成するリン酸化、メチル化、アセチル化、ユビキチン化及びＳＵＭＯ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）を通じてクロマチン構造に影響を及ぼしている｛Ｄｒｕｍｍｏｎｄ、２００５ Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４５：４９５−５２８｝。
【００８４】
特に、ヒストンアセチル化は、転写因子にクロマチンを開放することが示されており、一方脱アセチル化クロマチンは、コンパクトになっていて遺伝子転写が減少している。
【００８５】
ＨＡＭＬＥＴは、ヒストン及びＤＮＡからのヌクレオソームの集合にインビトロで影響を及ぼすため、ヒストンに対するＨＡＭＬＥＴの親和性が確認された。さらにＨＡＭＬＥＴは、前もって作られたヌクレオソームと相互作用し、そして高濃度のＨＡＭＬＥＴは、クロマチンを崩壊させた。ＨＡＭＬＥＴのこのインビボ効果は、クロマチンアセチル化の状態にある程度依存していることが見出された。
【００８６】
しかし、ＨＡＭＬＥＴ自体はクロマチンのアセチル化を減少させることが示されているが、アセチル化を増大させるＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせて使用するとき、ＨＡＭＬＥＴに応答した強力に増強された細胞死を生じた。ヒストンテールは、ＨＡＭＬＥＴへの結合に関与しておらず、これは、テールを欠失する突然変異体ヒストンを用いて確認された。
【００８７】
ＨＡＭＬＥＴ及びＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンアセチル化に関して反対の効果を有することが実施された研究から明らかであり、従って細胞死効果の増強は驚くべきことである。ＨＡＭＬＥＴは、ＨＡＴ／ＨＤＡＣ系を介して作用せず、そしてＨＡＭＬＥＴがアセチル化を変化させる機構は、ＨＤＡＣ阻害剤とは異なっている可能性があるようである。
【００８８】
これは、これらの分子間の標的が異なっていることに関連し得る。ＨＤＡＣは、ヒストンテールと相互作用するが、ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンテールが存在しなくてもまたヒストンに結合することが示された。
【００８９】
ＨＡＭＬＥＴは、アセチル化が生じるヒストンテールと相互作用せずにクロマチンアセチル化を修飾する物質の最初の例のようである。アセチル化の減少は、ＨＡＭＬＥＴとヌクレオソームとの間の極めてタイトな集合体の形成と矛盾がない。これらの大きな集合体において、ＨＡＴ／ＨＤＡＣがヒストンテールを利用できる可能性は減少し得る。従ってアセチル化の減少は、特異的な酵素経路での特異的な干渉よりもむしろ接近能が疑われ得る。
【００９０】
アセチル化に起因して開いたクロマチンを有する細胞は、ＨＡＭＬＥＴの効果を受けやすく、一方閉じた脱アセチル化クロマチンを有する細胞は、観察された相乗作用を導くこれらの作用に対してより抵抗性である。
【００９１】
ＨＡＭＬＥＴに応答した細胞死に関するＨＤＡＣ阻害剤の効果を調べるために、一連の実験を行った。この場合、ＨＤＡＣ阻害剤を最初に適用し、そしてクロマチンアセチル化が増大した。コントロール実験は、タンパク質アセチル化が３時間以内に増大したことを示した。一実験において、短い前処理間隔を用いて、転写並びにｐ２１ＷＡＦ１及びＰ２７ＫＩＰ１のようなタンパク質の新合成を通じたＨＤＡＣ阻害剤の非特異的効果を排除した。ＨＤＡＣ阻害剤は、ヒストンに加えていくつかのタンパク質のアセチル化を刺激するので、これは重要であった。
【００９２】
その後、ＨＡＭＬＥＴに応答したＤＮＡ断片化は、ヒストンアセチル化レベルに相関し、これはヒストンがアセチル化されると、クロマチンへのＨＡＭＬＥＴの接近能が増大することを示唆している。
【００９３】
両方の異なるＨＤＡＣ阻害剤を用いて、ＤＮＡ断片化に対する顕著な効果が観察された。興味深いことに、これらの阻害剤で細胞を前処理した後に、ＤＮＡ断片化が劇的に増大しそしてより迅速に生じ、そしてＨＡＭＬＥＴに対する反応は、スタウロスポリン又はエトポシドのようなアポトーシス促進剤に曝露された細胞のＤＮＡ断片化よりも迅速であった。
【００９４】
添付の図面を参照して実施例で本発明を特に説明する：
図１は、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるヒストンアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴの効果を示している。
Ａ．ヒストンＨ４のアセチル化を、細胞数測定及びＮＵ−ＰＡＧＥの両方によって追跡した。この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡなし（ＣＴＬ及びＨＡＭ）又はＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに（ＴＳＡ及びＴＳＡ＋ＨＡＭ）２時間インキュベートし、次いで１時間の間にいくつかの条件で培地にＨＡＭＬＥＴ １２μＭを添加した（ＨＡＭ及びＴＳＡ＋ＨＡＭ）。Ｂ．ヒストンＨ４のアセチル化を、ＮＵ−ＰＡＧＥ分析によって追跡した。Ｊｕｒｋａｔ細胞（ライン１）を、ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌ（ライン２）、エトポシド２０μＭ（ライン３）、ＨＡＭＬＥＴ ３μＭ（ライン４）、６μＭ（ライン５）及び１２μＭ（ライン６）の存在下で１時間処理した。
【００９５】
図２は、ＨＡＭＬＥＴ誘導性の迅速なＤＮＡ断片化が、ＨＤＡＣ阻害剤によって増強されることを示している。ＤＮＡ断片化を、フローサイトメトリーの両方によって追跡した。この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡなし（ＣＴＬ及びＨＡＭ）又はＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌ（ＴＳＡ及びＴＳＡ＋ＨＡＭ）又はＳＡＨＡ ２.５μＭ（ＳＡＨＡ及びＳＡＨＡ＋ＨＡＭ）とともに２時間インキュベートし、次いで１時間の間にいくつかの条件で培地にＨＡＭＬＥＴ １２μＭを添加した（ＨＡＭ、ＴＳＡ＋ＨＡＭ及びＳＡＨＡ＋ＨＡＭ）。ＰＩ染色後（材料及び方法を参照のこと）、サブＧ１集団を定量し、そして集団全体のパーセントとして示した。
【００９６】
図３は、ＨＡＭＬＥＴの増強された活性が、ヒストンアセチル化に相関することを示している。この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡなし（ＣＴＬ）又はＴＳＡ ５０ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌとともに（ＴＳＡ５０、ＴＳＡ１００）２時間インキュベートし、次いで１時間の間にいくつかの条件で培地にＨＡＭＬＥＴ １２μＭを添加した（黒色ヒストグラム）。次いで、異なる条件でのヒストンＨ４のアセチル化を、細胞数測定により定量し、そして集団の幾何平均として示した（ヒストグラム、左のスケール）。ＨＡＭＬＥＴで処理された集団のＤＮＡ断片化を、サブＧ１の定量化を用いて分析し、そして集団全体のパーセントとして示した（直線、右のスケール）。
【００９７】
図４は、テールのないヒストン及びＤＮＡの混合物に対するＨＡＭＬＥＴの効果を示している。ＨＡＭＬＥＴを、放射能標識された１４６ｂｐのＤＮＡ断片及びテールのないヒストンの混合物に添加した。ＨＡＭＬＥＴが存在しないと、ヌクレオソームは形成されない（レーン１）。最初のＨＡＭＬＥＴの添加により、ヌクレオソームの集合が生じた（レーン２）。１４６ｂｐの断片へのヌクレオソームの集合は、ただ１つのヌクレオソーム種を生じ、Ｎと命名した。より高濃度のＨＡＭＬＥＴでは、より多くのヌクレオソームが形成され、そしてＨＡＭＬＥＴがこれらと会合して、ゲル中に第二のバンドを形成した。ＨＡＭＬＥＴはまた、ウェル中に見られる非特異的なヒストン−ＤＮＡ集合体を溶解した。
【００９８】
図５は、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴ誘導性のＤＮＡ断片化を増強することを示している。ＤＮＡ含量を、フローサイトメトリーによって追跡した。この実験において、材料及び方法の節に記載されるように、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに又はＴＳＡなしで３時間又は１８時間最初に前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。サブＧ１集団を定量し、そしてパーセントで示した。
【００９９】
図６は、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴ誘発性の細胞死を増強することを示している。Ａ．この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度のＴＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ若しくは２００ｎｇ／ｍｌとともに、又はＴＳＡなしで最初に３時間前処理し、次いで漸増濃度のＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。サブＧ１集団を定量し、そして集団全体のパーセントで示した。Ｂ．Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度のＴＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ若しくは２００ｎｇ／ｍｌとともに、又はＴＳＡなしで最初に３時間前処理し、次いで漸増濃度のＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。ＡＴＰレベルを、材料及び方法の節に記載されるように定量した。未処理集団と比較した結果を得た。Ｃ．Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに又はＴＳＡなしで最初に３時間又は１８時間前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。生存能を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ ＸＲ装置を用いたトリパンブルー排除法によって評価した。
【０１００】
図７は、ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理した細胞において、アセチル化及び細胞死が増大したことを示している。Ａ．これらの実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに又はＴＳＡなしで最初に３時間又は一晩（ＯＮ）前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。Ａ．アセチル化レベルを、ヒストグラムプロットにより細胞集団全体についてフローサイトメトリーによって定量化した。Ｂ．ヒストンＨ４のＤＮＡ含量及びアセチル化を、フローサイトメトリーによって追跡した。結果を、Ｙ軸がＤＮＡ含量であり、そしてＸ軸がヒストンアセチル化の密度プロットにより追跡した。
【０１０１】
図８は、ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理した細胞において、アセチル化及び細胞死が増大したことを示している。Ａ．Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度のＴＳＡ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ若しくは２００ｎｇ／ｍｌとともに、又はＴＳＡなしで最初に３時間前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴにより３時間処理した。結果を、種々の「インタクトな」集団対未処理の「インタクトな」集団の平均の倍増（ｆｏｌｄ ｏｆ ｉｎｃｒｅａｓｅ）で示す（＊はｐ＜０.００１）。Ｂ．この実験において、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＨＡＭＬＥＴとともに又はＨＡＭＬＥＴなしで最初に３時間前処理し、次いで１００ｎｇ／ｍｌとともに又はＨＡＭＬＥＴなしで３時間処理した（＊はｐ＜０.００１）。
【０１０２】
図９は、ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理されたアセチル化細胞の形態を示している。ＧＦＰタグ化ヒストンＨ４ ＨｅＬａ細胞を、未処理（Ａ）、又はＨＡＭＬＥＴで処理（Ｂ）、又はＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌで処理（Ｃ）、又はＴＳＡで前処理及びＨＡＭＬＥＴで処理（Ｄ）した。最初の欄は、光透過率を表し、第二の欄は、ヒストンＨ４のアセチル化を表し、そして第三の欄は、細胞におけるヒストンＨ４の発現を表している。Ｅ．それぞれ、核サイズの定量化（μｍ2）、ヒストンＨ４発現レベル及びアセチルヒストンＨ４発現レベル。アセチルＨ４及びヒストンＨ４の強度に関して、結果を、コントロール集団の倍増で示す。すべての結果を、各実験につき少なくとも３０個の細胞の計数後に表す。
【実施例】
【０１０３】
実施例１
ヒストンアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴの効果
材料及び方法
試薬−ＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）及びスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）又はＡｌｅｘｉｓ（Ｌａｕｓｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供され、そしてそれぞれ１００ｎｇ／ｍｌ及び２.５μＭの濃度で用いた。ＡＴＰモニタリング試薬（ＡＭＲ）を、ＶｉａＬｉｇｈｔTM ＨＳキットの形態でＣａｍｂｒｅｘ（Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、Ｕ．Ｋ．）から購入し、そして製造業者のガイドラインに従って再構成した。
【０１０４】
α−ラクトアルブミンの精製及びＨＡＭＬＥＴへの転換−ＨＡＭＬＥＴは、Ｃ１８：１脂肪酸補因子によって安定化されるヒトα−ラクトアルブミンのフォールディング変異体である。この研究において、ネイティブのα−ラクトアルブミンを、以前に記載されるように、ヒト乳汁から精製し、そしてオレイン酸馴化イオン交換マトリックス上でＨＡＭＬＥＴに転換した（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら、２０００）。
【０１０５】
細胞培養−Ｊｕｒｋａｔ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、番号８８０４２８０３）を、記載通りに培養した（Ｈａｋａｎｓｓｏｎら、１９９５）。
【０１０６】
ヒストン−ネイティブのフォールドしたヒストンを、アヒル赤血球核から得た（Ｓｉｍｏｎ及びＦｅｌｓｅｎｆｅｌｄ、１９７９）。ネイティブ又はテールのないＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒヒストンを、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、精製し、そして八量体に集合させた（Ｈａｍｉｃｈｅら、２００１）。ヒストンのフォールド及び機能の完全性を、ＤＮＡへのヌクレオソーム集合によって確認した（データは示さず）。
【０１０７】
ＤＮＡ−ウニ５Ｓ ＲＮＡ遺伝子を含む２５６ｂｐ断片（Ｓｉｍｐｓｏｎ及びＳｔａｆｆｏｒｄ、１９８３）を、プラスミドｐＬＶ４０５−１０のＥｃｏＲ１又はＮｃｉ１消化からゲル精製した（Ｓｉｍｐｓｏｎら、１９８５）。このＤＮＡを、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで末端標識した（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）。
【０１０８】
細胞数測定による細胞周期分析−細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、次いで４℃で少なくとも２時間、７５％冷エタノールの懸濁液に固定した。次いでこのサンプルを遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして室温で１０分間、０.２５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。細胞を再び洗浄し、ＰＢＳ中の２.５μｇ／ｍｌ ＰＩ及び２５０μｇ／ｍｌ Ｒｎａｓｅ Ａに再懸濁し、そして測定前に４℃で一晩インキュベートした。細胞の蛍光を、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて測定した。単一の細胞集団を、それらの蛍光強度値ＦＬ２−Ａ及びＦＬ２−Ｗに基づいて決定した。
【０１０９】
細胞数測定によるアセチルヒストンＨ４及び細胞周期分析−細胞を採取し、ＰＢＳで洗浄し、次いで４℃で少なくとも２時間、７５％冷エタノールの懸濁液に固定した。次いでこのサンプルを遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして室温で１０分間、０.２５％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。ＰＢＳ ３ｍｌの添加及び遠心分離後、ＰＢＳ中のブタ血清１％（ＤＡＫＯ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中で少なくとも３０分間細胞をインキュベートした。ＰＢＳ ３ｍｌの添加及び遠心分離後、１％ ＢＳＡを含み１／５００希釈されたヒトアセチルヒストンＨ４に対するウサギポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）の存在下、室温で３時間細胞をインキュベートした。次いで細胞を洗浄し、そして１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中１／２０希釈されたＦＩＴＣ接合ブタ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）とともに２時間インキュベートした。細胞を再び洗浄し、ＰＢＳ中の２.５μｇ／ｍｌ ＰＩ及び２５０μｇ／ｍｌ Ｒｎａｓｅ Ａに再懸濁し、そして測定前に４℃で一晩インキュベートした。ヒストン抗体が存在しないコントロールを、上記と同様に調製した。細胞の蛍光を、Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて測定した。単一の細胞集団を、それらの蛍光強度値ＦＬ２−Ａ及びＦＬ２−Ｗに基づいて決定した。次いで、各細胞からの赤色発光及び緑色発光を分離し、そしてサイトメーター（ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）の標準的な光学を用いて定量化した。
【０１１０】
共焦点顕微鏡法によるアセチルヒストンＨ４−Ｈｅｌａ細胞を、Ｌａｂ−Ｔｅｋ Ｃｈａｍｂｅｒスライドで増殖させた。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでＰＢＳホルムアルデヒド４％中で１０分間固定した。次いでこのサンプルを遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、そして室温で２分間、０.１％ ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で処理した。洗浄後、ＰＢＳ中のブタ血清１％（ＤＡＫＯ、Ｓｏｌｎａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中で少なくとも３０分間細胞をインキュベートした。次いで、１％ ＢＳＡを含み１／５００希釈されたヒトアセチルヒストンＨ４に対するウサギポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ）の存在下、室温で３時間細胞をインキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、そして１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ中１／２００希釈されたＡｌｅｘａ６３３接合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに２時間インキュベートした。６３×対物レンズを用いてＬＳＭ ５１０ ＭＥＴＡ共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で評価する前に、細胞をＰＢＳ中で３×５分間洗浄した。各クロマチンパターンの頻度を、各実験において最低３０個の細胞を計数した後に、染色したコントロール細胞の倍数で示した。
【０１１１】
免疫ブロット−ＪＵＲＫＡＴ細胞を、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、そしてプロテアーゼ阻害剤を補充した溶解緩衝液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ７.５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、０.５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０］（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中で溶解した。４℃で３０分間連続して撹拌した後、４℃で１５分間、１２,０００ｇで遠心分離する前に、溶解物をＨ2ＳＯ4（０.４Ｎ）に１時間供した。タンパク質抽出物５０μｇを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離し、そしてポリフッ化ビニリデン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気的に移した。この膜を、４℃で一晩、抗アセチルヒストンＨ４（１／２０００）（Ｕｐｓｔａｔｅ）とともにインキュベートした。次いで、セイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体（１：１０,０００）（Ｄａｋｏ Ａ／Ｓ Ｄｅｎｍａｒｋ）を、室温で１時間適用した。免疫反応性のバンドを、高感度（ｅｎｈａｎｃｅｄ）化学発光（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって明らかにした。
【０１１２】
ＤＮＡ断片化−高分子量のＤＮＡ断片を、記載される通りに（Ｚｈｉｖｏｔｏｖｓｋｙ １９９３ ２０７ １６３）フィールド・インバージョンゲル電気泳動（ＦＩＧＥ）によって検出した。手短に言えば、細胞（２×１０6）を、プロテイナーゼＫによって処理された低融点アガロースゲルに埋め込んだ。サンプルを、１２℃で０.５ ３ ＴＢＥ（４５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１.２５ｍＭ ＥＤＴＡ、４５ｍＭホウ酸、ｐＨ ８.０）中１％アガロースゲルにおいて１８０Ｖでの電気泳動に供し、２４時間で０.８秒から３０秒に変化するランピング速度で、３：１のフォワード対リバース比を用いた。高分子断片化ＤＮＡバンドの定量化を、ｉｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行った。
【０１１３】
ヒストンアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴの効果
Ｊｕｒｋａｔ細胞のクロマチンアセチル化レベルを、アセチル化ヒストンＨ４に特異的な抗体を用いて、フローサイトメトリーにより定量した（図１）。アセチル化を増大させるために、細胞を、ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡで処理した（図１Ｃ、図１Ｅライン３）。最大効果が２時間後に見られた。アセチル化の増大を、ＴＳＡ処理細胞由来の核抽出物をウエスタンブロット分析することによって確認した。
【０１１４】
Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して低濃度のＨＡＭＬＥＴは、培地コントロールと比較して、ヒストンＨ４アセチル化の減少を引き起こした（図１Ｂ、図Ｅ ライン２）（図１Ａ、図１Ｅライン１）。このアセチル化の減少を、ウエスタンブロット分析によって確認した。
【０１１５】
結果は、ＨＡＭＬＥＴが低濃度でアセチル化阻害剤として作用し得るものであるか、又はＨＡＭＬＥＴがＪｕｒｋａｔ細胞においてアセチル化が低い細胞のみ残してアセチル化クロマチンを有する細胞を殺傷し得ることが示唆された。
【０１１６】
Ｈ４アセチル化に対するＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの組み合わせ効果が示された（図１Ｄ、図１Ｅライン４）（図１Ｃ、図１Ｅライン３）。ＨＡＭＬＥＴによるアセチル化の減少は、ＨＡＭＬＥＴだけで処理した後よりもＴＳＡで前処理した細胞の方が大きかった。
【０１１７】
実施例２
ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＡＭＬＥＴに応答してＤＮＡ断片化を増大する。
【０１１８】
ＤＮＡ断片化に対するＨＡＭＬＥＴの効果を、未処理細胞とアセチル化を増大するＴＳＡで前処理された細胞との間で比較した。サブＧ０／Ｇ１ ＤＮＡ断片化を、実施例１に記載の方法論を用いてフローサイトメトリーによって定量化した。
【０１１９】
ＨＡＭＬＥＴが、１時間後にＪｕｒｋａｔ細胞のＤＮＡ断片化を誘導することが示されたが（図４Ａ）、ＴＳＡ処理は、ＤＮＡ断片化を刺激しなかった。しかし、ＴＳＡ前処理は、ＨＡＭＬＥＴへの感受性を増大し、そしてＨＡＭＬＥＴ誘導性のＤＮＡ断片化を増強した。
【０１２０】
細胞のＨＡＭＬＥＴへの感受性は、ＴＳＡ濃度に直接関連しており、ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴにより誘発される腫瘍細胞死を増大することを示唆している（図２）。
【０１２１】
ＨＤＡＣ阻害剤の効果を、ＴＳＡとＳＡＨＡ、すなわち別のＨＤＡＣ阻害剤とを比較することによってさらに調べた。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＳＡＨＡ（２.５μＭ）で２時間前処理し、そしてＨＡＭＬＥＴに１時間曝露し、そしてサブＧ０／Ｇ１ ＤＮＡ断片化を、フローサイトメトリーによって定量した（図３Ｂ）。ＨＡＭＬＥＴに応答したＤＮＡ断片化は、ＳＡＨＡによって増強されたが（図３Ｄ）、この物質自体は、ＤＮＡ断片化を引き起こさなかった（図３Ｃ）。
【０１２２】
さらに、コンフルエントではないＡ４５９細胞を、一晩ＴＳＡ １００ｎｇ／ｍｌとともに又はＴＳＡなしで処理した。次いでＨＡＭＬＥＴを、３０μＭで１時間添加した。上記のように、ＤＮＡ断片化を両方ともフローサイトメトリーによって追跡した。ＰＩ染色後（材料及び方法を参照のこと）、サブＧ１集団を定量し、そして集団全体のパーセントとして示した。
【０１２３】
先と同様に、ＴＳＡへ長く曝露すると、細胞死を有意に増大することが明らかになった（データは示さず）。
【０１２４】
実施例３
ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンコアと相互作用する。
ヒストンは、２０アミノ酸のヒストンテールを通じて多くの効果を発揮し、このテールは、他のヒストンドメインよりも接近しやすく、そして種々の刺激によって修飾され得る。ＨＡＭＬＥＴの結合を、野生型ヒストンと、ヒストンテールを欠失する突然変異体との間で比較した。
【０１２５】
ヒストン−ネイティブのフォールドしたヒストンを、アヒル赤血球核から得た。ネイティブ又はテールのないＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒヒストンを、Ｅ．ｃｏｌｉで発現させ、精製し、そして八量体に集合させた。ヒストンのフォールド及び機能の完全性を、ＤＮＡへのヌクレオソーム集合によって確認した。
【０１２６】
ＤＮＡ−ウニ５Ｓ ＲＮＡ遺伝子を含む２５６ｂｐ断片（Ｓｉｍｐｓｏｎ及びＳｔａｆｆｏｒｄ、１９８３）を、プラスミドｐＬＶ４０５−１０のＥｃｏＲ１又はＮｃｉ１消化からゲル精製した（Ｓｉｍｐｓｏｎら、１９８５）。このＤＮＡを、［γ−32Ｐ］ＡＴＰで末端標識した（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＫ）。
【０１２７】
クロマチン集合−ヌクレオソームを生成させるために、ヒストン八量体（組換え又は細胞から精製）を、「ソルトジャンプ（ｓａｌｔ ｊｕｍｐ）」方法に従って、線状ＤＮＡ上に集合させた（Ｓｔｅｉｎ、１９７９）。32Ｐ標識された２５６ｂｐの断片及びキャリアＤＮＡ（超らせんプラスミドＤＮＡ、最終ＤＮＡ濃度は２００μｇ／ｍｌ）を、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）中でヒストンと混合した（ヒストン：ＤＮＡの質量比０.４〜０.６）。この混合物を、３７℃で１０分間インキュベートし、０.５Ｍ ＮａＣｌに希釈し、同じ温度で３０分間インキュベートし、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７.５）及び１ｍＭ ＥＤＴＡに対して４℃で２時間透析した。ゲルのＳＹＢＲグリーン染色を伴う実験のために、このキャリアプラスミドＤＮＡを、非放射性の２５６ｂｐ ＤＮＡ断片で置換した。クロマチンを４℃で保管した。
【０１２８】
実施例４
ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＡＭＬＥＴ誘発性の細胞死を増強する。
ＨＤＡＣ阻害剤が、腫瘍細胞の生存能に対するＨＡＭＬＥＴの効果に影響を及ぼし得るか否かを調べるために、Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＨＤＡＣ阻害剤であるＴＳＡで３時間又は１８時間前処理し、次いでＨＡＭＬＥＴに曝露した（図５）。この組み合わせ処理に対する細胞反応を、ＴＳＡ単独（３時間又は１８時間）及びＨＡＭＬＥＴ（３時間）に対する反応と比較した。培地の細胞を、コントロールとして使用した。細胞反応を、フローサイトメトリーによって定量し、そしてサブＧ１集団を、クロマチン断片化及び細胞死の基準として使用した（図５及び６Ａ）。同時に、細胞生存能を、ＡＴＰレベル（図６Ｂ）及びトリパンブルー排除法（図６Ｃ）によって評価した。
【０１２９】
ＨＤＡＣ阻害剤への短期間の曝露（ＴＳＡ、３時間）は、コントロールと比較して検出可能なＤＮＡ断片化の変化を引き起こさなかったが（３.６６％対２.８０％）、ＴＳＡへの１８時間の曝露は、予想されたサブＧ１集団の増大を引き起こした（２６.１３対２.８０）。ＴＳＡ単独及びＨＡＭＬＥＴ単独の両方に関して、サブＧ１集団の増大は、細胞生存能の減少を伴った（図６Ｂ及び図６Ｃ）。ＨＡＭＬＥＴ濃度を漸増すると、細胞のＡＴＰレベルの減少が誘導された（９.２％対４１.１７％対８５.７１％は、ＨＡＭＬＥＴでの曝露から３時間後にそれぞれ０.１ｍｇ／ｍｌ、０.２ｍｇ／ｍｌ及び０.３ｍｇ／ｍｌに減少した）（図６Ｂ）。トリパンブルー排除法により、生存能の減少は、コントロールと比較して、ＨＡＭＬＥＴでの処理から３時間後に１９.７％であった。ＴＳＡ処理後の生存能の減少は、曝露から１８時間後にのみ検出することができ、コントロールと比較して、２４.９％の減少であった（図６Ｃ）。
【０１３０】
ＴＳＡでの前処理は、ＨＡＭＬＥＴに応答して細胞死を増強した（図５、図６）。サブＧ１集団は、ＴＳＡ処理細胞（３時間）の７.６８％からＴＳＡ＋ＨＡＭＬＥＴ処理細胞の１４.５８％まで増大した。サブＧ１の蓄積は、ＴＳＡでの１８時間の曝露によってさらに増強された（ＴＳＡ＋ＨＡＭＬＥＴでの５１.４３％対ＴＳＡ処理での２６.１３％対ＨＡＭＬＥＴでの１４.５８％）。この効果は、ＴＳＡを５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌへと増大することによって示されるように、濃度依存的であった（図６Ａ）。サブＧ１集団の増大は、ＴＳＡ前処理の時間又は用量を増大して曝露したＪｕｒｋａｔ細胞の生存能の漸増に相関した（図６Ｂ及び図６Ｃ）。ＨＡＭＬＥＴでの処理前に漸増濃度のＴＳＡで前処理すると、ＨＡＭＬＥＴ単独又はＴＳＡ単独により細胞中で観察されたＡＴＰレベルの減少を増強した（ＴＳＡ ５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ及び２００ｎｇ／ｍｌでの３時間の前処理、その後のＨＡＭＬＥＴでの処理（０.２ｍｇ／ｍｌ）は、コントロール細胞と比較して、それぞれＡＴＰレベルを５４.３８％、６３.０３％及び７０.６１％に減少させ、一方ＨＡＭＬＥＴ単独での処理は４１.１７％であった。）（図６Ｂ）。トリパンブルー排除法によって、生存能の減少は、ＴＳＡでの前処理時間を増大し、その後ＨＡＭＬＥＴで３時間処理した後に増強された。（コントロールと比較して、ＴＳＡで３時間の前処理及びＨＡＭＬＥＴでの処理後は３６％、そしてＴＳＡで１８時間の前処理及びＨＡＭＬＥＴでの処理後は５１.７％であり、ＨＡＭＬＥＴ単独では１９.７％、ＴＳＡ単独で１８時間では２４.９％であった。）
結果は、ＨＤＡＣ阻害剤が、腫瘍細胞に対するＨＡＭＬＥＴの致死性を増大することを示した。
【０１３１】
実施例５
ヒストンＨ４アセチル化に対する効果
ＨＤＡＣの阻害は、アセチル化ヒストンの蓄積を引き起こす。Ｊｕｒｋａｔ細胞のアセチルヒストンＨ４レベルを、特異的抗体での染色後にフローサイトメトリーによって定量した。クロマチンレベルの変化を可視化するために、細胞をヨウ化プロピジウムで対比染色した。結果を、密度プロット図で示し、Ｙ軸は、４つの細胞集団（サブ１、Ｇ１、Ｓ及びＧ２）間のＤＮＡ含量を表し、そしてＸ軸は、ヒストンＨ４のアセチル化の程度を表した。４つの細胞集団（サブ１、Ｇ１、Ｓ及びＧ２）は、Ｙ軸上で区別することができた。
【０１３２】
ＴＳＡは、時間依存的なヒストンアセチル化の増大を引き起こした（図７）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＴＳＡに３時間又は１８時間曝露し、そしてアセチル化の増大を、上記のように定量した。対照的に、ＨＡＭＬＥＴ単独は、アセチル化の程度を変化させなかったが、ＴＳＡと組み合わせると有意な増大が観察された。アセチル化の増大は、ＴＳＡ単独に曝露した後よりもＴＳＡ及びＨＡＭＬＥＴに曝露した細胞でより迅速かつ高かった。
【０１３３】
種々の細胞集団のアセチル化の分析により、ＨＡＭＬＥＴはヒストンＨ４のアセチル化の増大を誘発すること、そしてヒストンＨ４のアセチル化は、細胞に対して行われた処理とは無関係の静止しているすなわち「インタクトな」集団と比較して、すべてのサブＧ１集団において常に重要性が低いことが明らかになった（図７）。さらに、細胞集団全体を「インタクトな細胞」に対して比較することにより、結果は、サブＧ１集団の蓄積が、集団全体のアセチル化の平均に干渉し得ることを示した（図７）。
【０１３４】
次いで、サブＧ１集団を分析から除くことにより、ヒストンＨ４のアセチル化の増大が、ＴＳＡ単独で処理されたものと比較して、ＴＳＡ及びＨＡＭＬＥＴの両方で処理した静止している「インタクトな」細胞集団に見られた（図８Ａ）。ＴＳＡでの処理から３時間後、ＨＡＭＬＥＴは、ヒストンアセチル化の２倍の増大を誘導した。ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡによって誘導された３時間後のこのアセチル化程度は、ＴＳＡでの一晩の曝露によって誘導されたアセチル化程度よりも高かった（図８Ａ）。さらに、ＴＳＡの存在下でのＨＡＭＬＥＴは、ＴＳＡへの一晩の曝露の後でさえもクロマチンのアセチル化をなお促進することができた（図８Ａ）。別のＨＤＡＣ阻害剤であるＳＡＨＡをＨＡＭＬＥＴ処理と組み合わせると、類似の結果が見出された（データは示さず）。興味深いことに、ＨＡＭＬＥＴを含まない漸増濃度のＴＳＡに細胞をさらすことによっても、アセチル化の割合は、なおコントロールの２倍の増大を有するＪＵＲＫＡＴ細胞の割合と同じであった。ＨＡＭＬＥＴを添加すると、ＴＳＡ用量依存的なヒストンＨ４のアセチル化の増大が見られ、アセチル化は、コントロールの２.７倍から４.３倍へと増大した（図８Ａ）。
【０１３５】
これらの結果は、高濃度のＨＡＭＬＥＴをＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせると、細胞のアセチル化の増大を促進することを示した。
【０１３６】
次いで、ＨＡＭＬＥＴで処理する前に、Ｊｕｒｋａｔリンパ球をＨＤＡＣ阻害剤で前処理することがどれくらい重要かを分析した。次にＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴの前後で、どちらが使用できるかを比較した。第一の実験において、細胞を、ＨＤＡＣ阻害剤で前処理し、そしてＨＡＭＬＥＴで処理した。上記のように、アセチル化の増強は、組み合わせた方法で見出された（図８Ａ）。次に、細胞を最初にＨＡＭＬＥＴで処理し、次いでＴＳＡを添加した。興味深いことに、アセチル化のレベルは今度は減少し（図８Ｂ）、これは、アセチルヒストンＨ４のアセチル化増強のためには、細胞がＨＤＡＣ阻害剤によって逐次的に前処理され、そしてＨＡＭＬＥＴで処理されなければならないことが示された。
【０１３７】
これらの結果により、リンパ球のアセチル化に関して相乗的な効果を得るためには処理の順序が極めて重要であることが示された。
【０１３８】
実施例６
ＨＡＭＬＥＴは、ＴＳＡ誘導性のクロマチン修飾に影響を及ぼす。
ヒストンＨ４のアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの効果を、ＧＦＰタグ化ヒストンＨ４を発現する付着性のＨｅＬａ細胞の共焦点顕微鏡法によってさらに調べた。コントロール細胞は、Ｈ４−ＧＦＰ染色によって示されるようにいくつかの核小体を有する核を示した。コントロール細胞のヒストンＨ４のアセチル化レベルは、極めて弱かった（図９Ａ）。ＨＡＭＬＥＴ処理細胞は、異なる形状を内部に有し（ａｒｂｏｒ）、核サイズは著しく減少し、そしてＧＦＰ染色の強度は増大した。興味深いことに、ＨＡＭＬＥＴは、上皮細胞においてヒストンＨ４のアセチル化の増大を誘導した（図９Ｂ及びＥ）。ＴＳＡ処理細胞は、核サイズ及びＧＦＰ染色のわずかな増大を示し、そして予想されるように、ヒストンＨ４のアセチル化の染色が増大することを示した（図９Ｃ及びＥ）。たとえアセチル化の増大が、これらの細胞においてこの時点でＨＡＭＬＥＴとＴＳＡとの間で同じであっても、２つの異なる条件での核の形状は、完全に逆の種類の反応を示した（図９Ｂ及びＣ及びＥ）。さらに、細胞をＴＳＡで前処理し、そしてＨＡＭＬＥＴで処理すると、ＨＡＭＬＥＴ様反応が見出され、核サイズは減少し、そしてＧＦＰ染色は増大した。この条件において、アセチル化のレベルは、組み合わせ処理で相乗的に増強され（図９Ｄ及びＥ）、上皮細胞型に対して、サイトメトリー分析によってＪｕｒｋａｔリンパ球で見出された相乗効果が確認された。
【０１３９】
これらの結果は、ＨＡＭＬＥＴをＨＤＡＣ阻害剤と組み合わせることはまた、上皮細胞のアセチル化の増大を促進することを示した。さらに、核の形状を見ることにより、ＨＡＭＬＥＴ誘導性のアセチル化の増大は、ＨＤＡＣ阻害剤反応に相関しないが、むしろ収縮して変形した核のストレスに相関していると結論付けられた。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるヒストンアセチル化に対するＨＡＭＬＥＴの効果を示している。
【図２】ＨＡＭＬＥＴ誘導性の迅速なＤＮＡ断片化が、ＨＤＡＣ阻害剤によって増強されることを示している。
【図３】ＨＡＭＬＥＴの増強された活性が、ヒストンアセチル化に相関することを示している。
【図４】尾部のないヒストン及びＤＮＡの混合物に対するＨＡＭＬＥＴの効果を示している。
【図５】ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴ誘導性のＤＮＡ断片化を増強することを示している。
【図６】ＨＤＡＣ阻害剤が、ＨＡＭＬＥＴ誘導性の細胞死を増強することを示している。
【図７】ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理した細胞において、アセチル化及び細胞死が増大したことを示している。
【図８】ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理した細胞において、アセチル化及び細胞死が増大したことを示している。
【図９】ＨＡＭＬＥＴ及びＴＳＡの両方で処理されたアセチル化細胞の形態を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物学的に活性な修飾物又はこれらのいずれかの生物学的に活性な断片である構成要素（ｉ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である構成要素（ｉｉ）の組み合わせ物。
【請求項２】
構成要素（ｉ）がＨＡＭＬＥＴである、請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項３】
構成要素（ｉｉ）が、低分子量のＨＤＡＣ阻害性カルボン酸、ＨＤＡＣ阻害性ヒドロキサム酸、ＨＤＡＣ阻害性ベンズアミド及びＨＤＡＣ阻害性エポキシケトン、並びにＨＤＡＣ阻害性環状ペプチド若しくはハイブリッド、又はこれらのいずれかの混合物である、請求項１又は２に記載の組み合わせ物。
【請求項４】
構成要素（ｉｉ）が、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）又はスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）から選択される、請求項３に記載の組み合わせ物。
【請求項５】
構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が別々に投与され得るように包装される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項６】
構成要素（ｉ）及び（ｉｉ）が一緒に混合される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項７】
腫瘍又は他の増殖性疾患又は前腫瘍状態の処置に使用するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項８】
構成要素（ｉｉ）が第一に投与され、そして構成要素（ｉ）がその次に投与される逐次的な処置に使用するために、構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が別々に投与され得るように包装される、請求項７に記載の組み合わせ物。
【請求項９】
構成要素（ｉ）が、構成要素（ｉｉ）の投与後１時間から２４時間の間に投与される、請求項８に記載の組み合わせ物。
【請求項１０】
構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が共投与される処置に使用するための請求項７に記載の組み合わせ物。
【請求項１１】
構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が、単一製剤で腫瘍部位に共投与される、請求項１０に記載の組み合わせ物。
【請求項１２】
構成要素（ｉ）が腫瘍部位に投与され、そして構成要素（ｉｉ）が全身投与される、請求項１０に記載の組み合わせ物。
【請求項１３】
腫瘍又は他の増殖性疾患又は前腫瘍状態を処置する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組み合わせ物をこの処置を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項１４】
増殖性疾患が腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組み合わせ物の構成要素（ｉｉ）が前処置として投与され、そして構成要素（ｉ）がその次に投与される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１】
ＨＡＭＬＥＴ若しくはその生物学的に活性な修飾物又はこれらのいずれかの生物学的に活性な断片である構成要素（ｉ）及びヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤である構成要素（ｉｉ）の組み合わせ物。
【請求項２】
構成要素（ｉ）がＨＡＭＬＥＴである、請求項１に記載の組み合わせ物。
【請求項３】
構成要素（ｉｉ）が、低分子量のＨＤＡＣ阻害性カルボン酸、ＨＤＡＣ阻害性ヒドロキサム酸、ＨＤＡＣ阻害性ベンズアミド及びＨＤＡＣ阻害性エポキシケトン、並びにＨＤＡＣ阻害性環状ペプチド若しくはハイブリッド、又はこれらのいずれかの混合物である、請求項１又は２に記載の組み合わせ物。
【請求項４】
構成要素（ｉｉ）が、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）又はスベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）から選択される、請求項３に記載の組み合わせ物。
【請求項５】
構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が別々に投与され得るように包装される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項６】
構成要素（ｉ）及び（ｉｉ）が一緒に混合される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項７】
腫瘍又は他の増殖性疾患又は前腫瘍状態の処置に使用するための請求項１〜４のいずれか１項に記載の組み合わせ物。
【請求項８】
構成要素（ｉｉ）が第一に投与され、そして構成要素（ｉ）がその次に投与される逐次的な処置に使用するために、構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が別々に投与され得るように包装される、請求項７に記載の組み合わせ物。
【請求項９】
構成要素（ｉ）が、構成要素（ｉｉ）の投与後１時間から２４時間の間に投与される、請求項８に記載の組み合わせ物。
【請求項１０】
構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が共投与される処置に使用するための請求項７に記載の組み合わせ物。
【請求項１１】
構成要素（ｉ）及び構成要素（ｉｉ）が、単一製剤で腫瘍部位に共投与される、請求項１０に記載の組み合わせ物。
【請求項１２】
構成要素（ｉ）が腫瘍部位に投与され、そして構成要素（ｉｉ）が全身投与される、請求項１０に記載の組み合わせ物。
【請求項１３】
腫瘍又は他の増殖性疾患又は前腫瘍状態を処置する方法であって、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組み合わせ物をこの処置を必要とする患者に投与することを含む方法。
【請求項１４】
増殖性疾患が腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組み合わせ物の構成要素（ｉｉ）が前処置として投与され、そして構成要素（ｉ）がその次に投与される、請求項１３又は１４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００９−５０７９１４（Ｐ２００９−５０７９１４Ａ）
【公表日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３０６４５（Ｐ２００８−５３０６４５）
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００２５３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３１８５３
【国際公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（５０７３６４４４７）ニーア・ハムレット・ファルマ・アー・ベー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月２６日（２００９．２．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００６／００２５３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３１８５３
【国際公開日】平成１９年３月２２日（２００７．３．２２）
【出願人】（５０７３６４４４７）ニーア・ハムレット・ファルマ・アー・ベー (3)
【Ｆターム（参考）】
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