カナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物
本発明は、カナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物に関し、より詳細にはカナクギノキをエタノールで抽出して得たエタノール抽出物、それから得た溶媒分画物または、それから分離精製した化合物を有効成分とする皮膚美白用組成物に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物に関し、より詳細にはカナクギノキをエタノールで抽出して得たエタノール抽出物、それから得た溶媒分画物または、それから分離精製した化合物を有効成分とする皮膚美白用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物からの生理活性物質に関する研究が活発に進行しており、疾病に対する治療および予防剤または、健康補助剤として植物資源が広く用いられている。天然抗酸化剤としては、α−トコフェロール、ビタミンＣ、カロテノイド、フラボノイドなどが知られているが、このような抗酸化効果がある物質などは、動植物に広く分布しており、特に多くの研究が行われた分野は、植物由来物質である。植物由来の２次代謝産物などは、自由遊離基(free radical)と活性酸素の生成を抑制且つ除去して酸化による細胞損傷を防止するということが生体実験の結果、明らかになった。
【０００３】
現在まで報告された殆どの天然抗酸化剤は、植物から由来したものであって、主にポリフェノール化合物であると知られており、特にフラボノイドは、脂質の酸化、活性酸素の消去および酸化的ストレスを防ぐ役割をすることによって、老化防止、癌および心臓疾患などを予防且つ遅延する効果があるため、現時の食品、医薬品、化粧品など多くの分野で活用されている。また、メラニン(melanin)は、紫外線から生体を保護する重要な防御手段として動物、植物、および微生物に広く存在するフェノール類の高分子天然色素である。
【０００４】
メラニンは、紫外線、乾燥、極限温度などに対する生存能力を高め、コーヒー、お茶、タバコなどの品質を向上させるが、過度なメラニン合成は、人体にシミ、ソバカス、皮膚斑点を形成し、皮膚老化を促進し、皮膚癌の誘発に関与するものとして知られている。メラニン色素の生合成は、チロシナーゼ酵素をはじめとして様々な酵素などによって調節されており、そのうち、チロシナーゼは、チロシンを基質としてＬ−ドパキノンに転移する初期生合成の過程以後にジヒドロキシインドールの酸化に作用する。したがって、チロシナーゼ活性抑制剤を見付ける研究が美白剤の開発において重要な部分を占めており、現在に続けて知られているチロシナーゼ阻害剤として、ヒドロキノン(hydroquinone)、４−ヒドロキシアニソール(4-hydroxyanisole)、アスコルビン酸誘導体、コウジ酸、アゼライン酸(azelaic acid)、コルチコステロイド(corticosteroid)、レチノイド類、アルブチン(arbutin)、カテキン、３，４，５−トリメトキシシンナマートチモールエステル(3,4,5-trimethoxy cinnamate thymol ester)などがあるが、それらの安全性と経済性などに問題が多くて使用において困難さがある。
【０００５】
カナクギノキ(Lindera erythrocarpa)は、クスノキ科(Lauraceae)の植物であって、世界的に４５属１，５００種余りが分布し、大韓民国には６属１２種が自生していることが知られている。カナクギノキは、雌雄異株で４月から５月に淡い黄色の花が咲き、９月に８ｍｍ程度の赤色実が実る。大韓民国の南部地方をはじめとして日本、中国の暖かい地域に自生する高さ５ｍの落葉樹である。乾燥された実は、特異な芳香と苦味を有しており、日本では胃腸薬と神経痛の鎮痛剤として使用されている。また、カナクギノキの葉と実から抽出したエタノール抽出物と、シクロペンタジオン系化合物中の一つであるルシドン(lucidone)は、高い抗炎効果を奏すると報告され(Wang et al.，2008)、カナクギノキから分離したシクロペンタジオン化合物は、抗癌効果を有すると報告された(Oh et al.,2005；大韓民国特許10-0658519号)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、カナクギノキ抽出物、その溶媒分画物または、それから分離精製したシクロペンタジオン化合物または、その誘導体を有効成分として含有する皮膚美白用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これに本発明者らは、前記のようなことに鑑みて大韓民国の済州道のカナクギノキ(Lindera erythrocarpa)を用いてエタノール抽出物、溶媒による順次分画物およびシクロペンタジオン化合物または、その誘導体を得て抗酸化活性を検索し、Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞およびＲＡＷ２６４．７細胞を処理してメラニン生合成抑制活性を調査することによって、それらが皮膚美白機能性化粧料、食品または、薬学的組成物の有用資源として活用可能性があることを確認することによって本発明を完成することになった。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のカナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物は、シクロペンタジオン化合物または、その誘導体を有効成分として含有することによって、既に美白剤として知られていたアルブチン(arbutin)より更に高いメラニン阻害活性を見せる非常に優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明によりカナクギノキからエタノール抽出物およびその溶媒分画物を得る過程を簡略に示したフローチャートである。
【図２】図２は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図３】図３は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物のｎ−ヘキサン分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図４】図４は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物の塩化メチレン分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図５】図５は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物のエチルアセテート分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図６】図６は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物のｎ−ブタノール分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図７】図７は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物の水分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図８】図８は、化合物１の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図９】図９は、化合物１の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１０】図１０は、化合物２の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１１】図１１は、化合物２の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１２】図１２は、化合物３の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１３】図１３は、化合物３の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１４】図１４は、化合物４の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１５】図１５は、化合物４の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１６】図１６は、化合物５の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１７】図１７は、化合物５の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１８】図１８は、化合物６の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１９】図１９は、化合物６の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図２０】図２０は、化合物７の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図２１】図２１は、化合物７の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図２２】図２２は、化合物８の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図２３】図２３は、化合物８の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図２４】図２４は、化合物９の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図２５】図２５は、化合物９の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図２６】図２６は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギノキエタノール抽出物とその溶媒分画物が表する細胞生存率を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図２７】図２７は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギノキエタノール抽出物とその溶媒分画物が表するメラニン生成阻害活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図２８】図２８は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギノキエタノール抽出物とその溶媒分画物が表する細胞チロシナーゼ阻害活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図２９】図２９は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でルシドンが表する細胞生存率を示したグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３０】図３０は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でメチルリンデロンが表する細胞生存率を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３１】図３１は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギオールが表する細胞生存率を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３２】図３２は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でルシドンが表するメラニン生成抑制活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３３】図３３は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でメチルリンデロンが表するメラニン生成抑制活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３４】図３４は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギオールが表するメラニン生成抑制活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３５】図３５は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でルシドンが表するチロシナーゼ阻害活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３６】図３６は、本発明のカナクギノキ由来の化学式１０の化合物がＢ１６Ｆ１０細胞の細胞生存率に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３７】図３７は、本発明のカナクギノキ由来の化学式１０の化合物がＢ１６Ｆ１０細胞でメラニン生成抑制に及ぼす影響を示したグラフである。
【図３８】図３８は、本発明のカナクギノキ由来の化学式１０の化合物がＢ１６Ｆ１０細胞でチロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２遺伝子の発現を抑制する様相を示したものである。この時、Ｃは対照区を、Ａｒｂはアルブチンを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一つの態様として、本発明は、カナクギノキ抽出物または、その溶媒分画物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物を提供する。
【００１１】
本発明において、前記カナクギノキ抽出物は、水、エタノール、メタノールのような低級アルコールまたは、それらの混合溶媒から選択された溶媒、好ましくは、エタノールで抽出したものを含む。また、本発明において、前記抽出物には、抽出処理によって得られる抽出液、抽出液の希釈液または、濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、または、それらの粗精製物または、精製物のうち、いずれか一つも含むことにする。
【００１２】
本発明の一実施例として、前記カナクギノキ抽出物は、カナクギノキを熱風乾燥し、粉砕して得た粉砕物を７０％のエタノールに沈積させて３日間室温で撹拌して浸出し、ろ過した後、減圧濃縮することによって収得することができる。
【００１３】
本発明において、カナクギノキ抽出物の溶媒分画物は、カナクギノキ抽出物を蒸溜水に懸濁した後、非極性溶媒からｎ−ヘキサン(n-hexane；n-Hex)、塩化メチレン(methylene chloride；CH2Cl2)、エチルアセテート(ethyl acetate；EtOAc)、およびｎ−ブタノール(n-butanol；n-BuOH)を用いて分画することによって収得することができる。
【００１４】
本発明の一実施例として、カナクギノキ抽出物の溶媒分画物は、カナクギノキエタノール抽出物を蒸溜水に懸濁し、分液ロートで非極性溶媒からｎ−ヘキサン(n-Hex)、塩化メチレン(CH2Cl2)、エチルアセテート(EtOAc)、ｎ−ブタノール(n-BuOH)を用いて分画した後、ろ過、減圧濃縮して、それぞれ溶媒別に分画物を得た。
【００１５】
他の一つの態様として、本発明は、下記化学式１〜１０で表される化合物よりなる群から選択される１種以上の化合物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物を提供する。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
【化３】
【００１９】
【化４】
【００２０】
【化５】
【００２１】
【化６】
【００２２】
【化７】
【００２３】
【化８】
【００２４】
【化９】
【００２５】
【化１０】
【００２６】
本発明において、前記化合物などは、カナクギノキから分離精製して使用することができる。また、本発明において、前記化合物のうち、化学式１０の化合物を除いては市販の製品を入手して使用するか、公知の合成方法によって製造して使用することもできる。
【００２７】
本発明の好ましい態様として、本発明の組成物は、化粧料組成物である。
【００２８】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてのカナクギノキ抽出物、その溶媒分画物または、それから分離した化合物以外に化粧品組成物に通常的に用いられる成分などを含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料および香料のような通常的な補助剤、および、担体を含むことができる。また、前記化粧料組成物は、その効果を増進させるために皮膚吸収促進物質を更に含むことができる。
【００２９】
本発明の化粧料組成物は、当業界における通常的に製造されるどんな剤形としても製造されることができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、および、スプレーなどで剤形化されることができ、これに限られない。具体的には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたは、パウダーの剤形で製造され得る。
【００３０】
本発明の剤形がペースト、クリームまたは、ゲルの場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは、酸化亜鉛などが利用され得る。
【００３１】
本発明の剤形がパウダーまたは、スプレーの場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、ケイ酸カルシウムまたは、ポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーの場合には、更にフロン(chlorofluorohydrocarbon)、プロパン／ブタンまたは、ジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
【００３２】
本発明の剤形が溶液または、乳濁液の場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤または、乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカルボナート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタン脂肪酸エステルがある。
【００３３】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として水、エタノールまたは、プロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガントなどが利用され得る。
【００３４】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルフォコハク酸モノエステル、イセチオン酸塩、イミダゾールリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシン、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用され得る。
【００３５】
本発明の好ましい態様として、本発明の組成物は、薬剤学的組成物である。
【００３６】
本発明の組成物が薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含み、これに限られない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分など以外に潤滑剤、湿潤制、甘美剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。
【００３７】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または、非経口などの様々な経路で投与することができ、例えば、経口または、経皮によって投与することができる。しかし、好ましくは、非経口投与のうち、経皮投与、より好ましくは、塗布による局所投与(topical application)経路に適用される。
【００３８】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因などに応じて様々に処方され得る。本発明のカナクギノキ抽出物、その溶媒分画物または、それから分離した化合物は、経口型剤形の場合、成人基準として５〜３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇの量で１日当り１回〜数回投与することができ、外用剤の場合には、成人基準として１日当り１．０〜３．０ｍｌの量で１日当り１回〜５回塗布して１ヶ月以上続けるのが良い。
【００３９】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法により、薬剤学的に許容される担体および／または、賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量形態で製造されるかまたは、多容量容器内に内入させて製造され得る。この時、剤形は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルション、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、軟膏、クリームなどの外用剤などをはじめとして薬剤学的製剤に適合したどんな形態でも使用することができ、分散剤または、安定化剤を更に含むことができる。
【００４０】
本発明の好ましい態様として、本発明の組成物は、食品組成物である。
【００４１】
本発明の組成物が食品組成物として製造される場合、有効成分としてカナクギノキ抽出物、その分画物または、それから分離した化合物だけでなく、食品製造時に通常的に添加される成分を含み、例えば、蛋白質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤および香味剤を含む。前述した炭水化物の例としては、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；およびポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリジンなど）］および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。
【００４２】
他の一つの態様として、本発明は、下記化学式１０の化合物を提供する。
【００４３】
【化１１】
【００４４】
本発明において、前記化学式１０の化合物は、カナクギノキから分離することができ、好ましくはカナクギノキの薄皮部分から分離することができる。
【００４５】
他の一つの態様として、本発明は、カナクギノキから化学式１０の化合物の分離方法を提供する。
【００４６】
【化１２】
【００４７】
好ましい態様として、前記化学式１０の化合物の分離方法は、下記の段階を含むことができる：
カナクギノキを水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコールまたは、それらの混合溶媒から選択された溶媒で抽出してカナクギノキ抽出物を得る段階；
前記カナクギノキ抽出物をヘキサン、塩化メチレン、エチルアセテートおよびブタノールで分画して各溶媒分画物を得る段階；
前記カナクギノキ溶媒分画物を、溶出溶媒としてヘキサンとエチルアセテートを溶媒グラジエントとして用いて、１次シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って分画する段階；および
前記１次シリカゲルカラムクロマトグラフィー分画物を、溶出溶媒としてヘキサンとエチルアセテートとの混合溶媒を用いて２次シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って、化学式１０の新規ポリメトキシフェノール化合物を分離する段階。
【００４８】
本発明において、前記カナクギノキは、カナクギノキの薄皮部分である。
【００４９】
本発明において、前記カナクギノキ抽出物は、水、エタノール、メタノールのようなＣ１〜Ｃ４の低級アルコールまたは、それらの混合溶媒から選択された溶媒、好ましくはエタノールで抽出して得ることができる。また、本発明において、前記抽出物には、抽出処理によって得られる抽出液、抽出液の希釈液または、濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、または、それらの粗精製物または、精製物のうち、いずれか一つを含むことができる。
【００５０】
本発明の一実施例として、前記カナクギノキ抽出物は、カナクギノキを熱風乾燥し、粉砕して得た粉砕物を７０％のエタノールに沈積させて３日間室温で撹拌して浸出し、ろ過した後、減圧濃縮することによって収得することができる。
【００５１】
本発明において、カナクギノキ抽出物の溶媒分画物は、カナクギノキ抽出物を蒸溜水に懸濁した後、非極性溶媒からｎ−ヘキサン(n-hexane；n-Hex)、塩化メチレン(methylene chloride；CH2Cl2)、エチルアセテート(ethyl acetate；EtOAc)、およびｎ−ブタノール(n-butanol；n-BuOH)を用いて分画することによって収得することができる。
【００５２】
本発明の一実施例として、カナクギノキ抽出物の溶媒分画物は、カナクギノキエタノール抽出物を蒸溜水に懸濁し、分液ロートで非極性溶媒からｎ−ヘキサン(n-Hex)、塩化メチレン(CH2Cl2)、エチルアセテート(EtOAc)、ｎ−ブタノール(n-BuOH)を用いて分画した後、ろ過、減圧濃縮して、それぞれ溶媒別に分画物を得た。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を介して本発明の構成および効果をさらに具体的に説明しようとするが、これらの実施例は本発明の例示的な記載だけであり、本発明の範囲がこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５４】
実施例１：カナクギノキ抽出物の製造
本実施例において用いられた植物試料のカナクギノキ(Lindera erythrocarpa)は、大韓民国の（財）済州ハイテク産業振興院抽出物銀行から分譲を受けて使用した。
先ず、カナクギノキ(Lindera erythrocarpa Makino.)を流水で洗浄した後、３日間４０℃で熱風乾燥して粉砕機で粉砕した。乾燥された試料２００ｇを７０％エタノールに沈積させて３日間室温で撹拌して浸出し、この浸出物をろ過器でろ過し、浸出ろ過過程を３回再び繰り返した後、このろ過液を減圧濃縮することによって６０ｇのエタノール抽出物を収得した。
【００５５】
実施例２：カナクギノキ抽出物由来溶媒分画物の分離
本実施例において試料の抽出に用いた溶媒などは、Ｍｅｒｋ Ｃｏ．、Ｊｕｎｓｅｉ Ｃｏ．、Ｈｙｍａｎ Ｃｏ．社の製品を使用した。
カナクギノキのエタノール抽出物に対する溶媒分画は、下記のように行った。
先ず、前記実施例１で製造したカナクギノキエタノール抽出物(70% ethanol extract)６０ｇのうち、４２ｇを蒸溜水に懸濁して、分液ロートを用い、ｎ−ヘキサン(n-Hex)、塩化メチレン(CH2Cl2)、エチルアセテート(EtOAc)、ｎ−ブタノール(n-BuOH)を使用して分画した後、ろ過、減圧濃縮して、それぞれ溶媒別に分画物ｎ−Ｈｅｘ ８．５６ｇ、ＣＨ２Ｃｌ２ １．４７ｇ、ＥｔＯＡｃ ４．１４ｇ、ｎ−ＢｕＯＨ １０．２ｇ、Ｈ２Ｏ １４．５８ｇを得た（図１参照）．
前記のように得た各抽出物および分画物に対してＨＰＬＣ分析を行った。 その結果を図２〜図７に示した。
【００５６】
以後の実験では、粉末としたヘキサンと塩化メチレン、エチルアセテートの分画物は、１００％エタノールに溶かし、ブタノールおよび水分画物は、１００％エタノールと１×リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate Buffered Saline:PBS，pH 7.4)を１：１で混合した溶媒を加えて完全に溶解させた後、ろ過して使用した。
【００５７】
実施例３：カナクギノキエタノール抽出物の溶媒分画物から化合物の分離および構造の同定
エチルアセテート分画層（４．０ｇ）を、セライトを用い、塩化メチレン、エチルエーテル、エチルアセテート、アセトンを用いて分画を分け、そのうち、エチルエーテル分画物を用いて、順相シリカゲルにてクロロホルムとメタノールを展開溶媒として使用して分画を分け、そのうち、分画−５より順相シリカゲルにてクロロホルムとメタノールを用いて分画−１で化合物１を、分画−３で化合物２を得た。分画−２より、Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣを用いて３０％メタノール水溶液を使用して化合物３と化合物４を得た。
【００５８】
塩化メチレン分画層（２．５３ｇ）を持って順相シリカゲルにてヘキサンとエチルアセテートを溶媒グラジエント条件として使用して、１０個の分画を得た。分画−２を、順相シリカゲルを使用してヘキサンとエチルアセテートを展開溶媒として精製して、化合物５を得、分画−５より順相シリカゲルを使用してクロロホルムとメタノールを展開溶媒として化合物６を得た。分画−６より再結晶法を用いて化合物７を得、分画−７より再結晶法を用いて化合物８を得た。分画−８より順相シリカゲルを使用してクロロホルムとメタノールを展開溶媒として２個の分画を得、そのうち、分画−８−２で化合物９を得た。得られた９個の化合物はＨＰＬＣ分析およびＮＭＲを用いて確認した結果、純粋に分離されたことを確認した。
【００５９】
最終的に、カナクギノキの葉２００ｇを７０％エタノールで抽出して抽出物６０ｇを得て、それから９個の化合物を純粋に分離精製した。
【００６０】
分離した各分画物および化合物に対する収率は下記の表１の通りであった。
【００６１】
【表１】
【００６２】
核磁気共鳴器(Bruker Co.500MHz，NMR)を用いて１Ｈ、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトラムを得、それらのスペクトラムを総合的に分析して構造を決め、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて定量分析を行った。
各化合物の高性能液体クロマトグラフィーの結果と１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを図８〜図２５に示した。
その結果、化合物１は、下記化学式１のケルセチン（quercetin）と同定された。
【００６３】
【化１３】
【００６４】
化合物２は、下記化学式２のクエルシトリン（quercitrin）と同定された。
【００６５】
【化１４】
【００６６】
化合物３は、下記化学式３のケンフェロール３−Ｏ−ラムノピラノシド （kaempferol-3-O-rhamnopyranoside）と同定された。
【００６７】
【化１５】
【００６８】
化合物４は、下記化学式４のケルセチン３−Ｏ−アラビノフラノシド（quercetin-3-O-arabinofuranoside）と同定された。
【００６９】
【化１６】
【００７０】
化合物５は、下記化学式５のコーヒー酸エチルエステル（caffeic acid ethyl ester）と同定された。
【００７１】
【化１７】
【００７２】
化合物６は、下記化学式６の桂皮酸メチルエステル（cinamic acid methyl ester）と同定された。
【００７３】
【化１８】
【００７４】
化合物７は、下記化学式７のルシドン（lucidone）と同定された。
【００７５】
【化１９】
【００７６】
化合物８は、下記化学式８のメチルリンデロン（methyl linderone）と同定された。
【００７７】
【化２０】
【００７８】
化合物９は、下記化学式９のカナクギオール（kanakugiol）と同定された。
【００７９】
【化２１】
【００８０】
実験例１：本発明のカナクギノキ抽出物および分画物の抗酸化活性測定
１）１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル(DPPH)自由遊離基消去実験
電子供与能(electron donating ability)測定は、Ｂｌｏｓｉｓ方法によるＤＰＰＨ自由遊離基消去法に応じて測定した。すなわち、エタノールに溶かした様々な濃度の試料を９６ウェルプレート(Well Plate)に１００μｌずつ分取し、０．４ｍＭのＤＰＰＨ溶液を同量添加して室温で１０分間放置した後、５１７ｎｍで吸光度を測定した。この時、陽性対照群としては、ブチル化ヒドロキシアニソール (butylated hydroxy anisole，BHA)を使用した。ＤＰＰＨ自由遊離基消去活性は下記の数学式１から算出し、ＤＰＰＨの吸光度が５０％減少する時に表される試料の濃度(IC50)で示した。
【００８１】
【数１】
【００８２】
前記の式において、
Ａsample＝試料を添加した反応液の吸光度であり、
Ａcontrol＝試料の代わりにエタノールを添加した反応液の吸光度である。
【００８３】
カナクギノキのエタノール抽出物と順次分画物の抗酸化活性に対する結果を下記の表２に示した。ＤＰＰＨの自由遊離基消去活性は、エタノール抽出物と順次分画物のいずれも処理濃度に応じて濃度依存的に増加した。順次分画物のうち、エチルアセテート分画物でＤＰＰＨの自由遊離基消去活性の対照群であるＢＨＡより高い活性を示し、塩化メチレンとヘキサン分画物を除いた残りの分画物なども顕著に良い活性を有しており、この時のＩＣ５０値は、それぞれ７．４３μｇ／ｍｌ（エチルアセテート）、１６．８８μｇ／ｍｌ（エタノール）、１８．５４μｇ／ｍｌ（ブタノール）、６６．７７μｇ／ｍｌ（水）と示された（表２）。
【００８４】
２）キサンチン酸化酵素抑制および過酸化物消去活性測定
キサンチン酸化酵素(xanthine oxidase)による尿酸(uric acid)生成は、２９０ｎｍで増加した吸光度によって測定し、対照群としてアロプリノール(allopurinol)(Sigma)を使用した。過酸化物(superoxide)の量は、ニトロブルーテトラゾリウム(nitroblue tetrazolium，NBT)還元方法によって５６０ｎｍで測定した。反応液は、各試料の様々な濃度と０．５ｍＭのキサンチンと１ｍＭのＥＤＴＡを２００ｍＭのリン酸塩緩衝液(phosphate buffer)(pH 7.5)１００μｌで用意し、５０ｍＵ／ｍｌキサンチン酸化酵素を添加して尿酸の生成を誘導した。過酸化物消去活性は、前記の反応液に０．５ｍＭのＮＢＴを添加して反応させた。キサンチン酸化酵素抑制および過酸化物消去活性は、それぞれ生成された尿酸と過酸化物の吸光度が５０％減少する時に表される試料の濃度(IC50)で示し、各試料は、３回繰返し実験の後に平均値を求めた。
【００８５】
カナクギノキエタノール抽出物および順次分画物のキサンチン酸化酵素抑制活性および過酸化物ラジカル(superoxide radical)消去活性に対する結果も表２に示した。カナクギノキエタノール抽出物および順次分画物のいずれも濃度依存的にキサンチン酸化酵素抑制活性を示し、ヘキサン分画物(>1000ug/ml)と塩化メチレン(IC5086.21μg/ml)は、多少低い活性を示したが、他の分画物などのＩＣ５０値は５．５５〜９．７９μｇ／ｍｌで高い抑制活性を示した（表２）。また、過酸化物ラジカル消去活性においてもＩＣ５０値は、それぞれ１６．８６μｇ／ｍｌ（エチルアセテート）と示され、対照群のアロプリノール（ＩＣ５０＝３．８２μｇ／ｍｌ）に比べて僅かに低い活性を示した（表２）。
【００８６】
このような効果は、すでに報告されたように、脂質の酸化、活性酸素の消去および酸化的ストレスを防ぐ役割をすることによって、老化防止、癌および心臓疾患などを予防且つ遅延する効果で、現時の食品、医薬品、化粧品など多くの分野においてこれらの効果を活用している。したがって、カナクギノキは抗酸化効果を基にして判断すると、生体内で生じる多くの酸化的なストレスおよび損傷の予防に有用に使用され得る。
【００８７】
【表２】
【００８８】
実験例２：本発明のカナクギノキ抽出物および分画物のＭＴＴアッセイ(assay)を用いた細胞毒性測定
本実験例に使用されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞は、米国細胞株銀行(ATCC)から分譲を受けた。Ｂ１６Ｆ１０細胞を１０％ウシ胎児血清(fetal bovine serum)(FBS，Gibco)、１％抗生剤(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)、Ｌ−グルタミンと炭酸水素ナトリウム(sodium bicarbonate)が含有されたＤＭＥＭ培地(Gibco)を使用して３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した。また、ＲＡＷ ２６４．７細胞は、マウスの大食細胞細胞株(murine macrophage cell line)であって、ＫＣＬＢ(Korean Cell Line Bank)から分譲を受けて１０％ＦＢＳと１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地(Gibco)を使用して３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した。
【００８９】
Ｂ１６Ｆ１０細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個の細胞を接種し、２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルに１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理して７２時間培養した。それに２ｍｇ／ｍｌの濃度で製造したＭＴＴ溶液２００μｌを添加して同様の培養条件で４時間培養し、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェル当たりＤＭＳＯ２００μｌを加えてＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９０】
カナクギノキ(Lindera erythrocarpa)エタノール抽出物および順次分画物がＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および、１００μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して培養した後、ＭＴＴ方法によって細胞の生存率を観察した。図２からわかるように対照群の細胞生存率を１００％とした際に、カナクギノキエタノール抽出物およびそれぞれの順次分画物濃度などのうち、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌ濃度でほとんど８１〜１０３％で、対照群に比べて僅かに減少するか増加した。このように対照群に比べて、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度などでは、僅かの差があるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明のカナクギノキエタノール抽出物および順次分画物は細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９１】
実験例３：本発明のカナクギノキ抽出物および分画物のメラニン生成阻害活性測定
２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種して、２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルに１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理して３日間試料処理後、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェル当たり５００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えて５６℃で３０分溶解した後、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００９２】
前記の実験例２で細胞毒性のないものとして観察されたカナクギノキエタノール抽出物および順次分画物の１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理した後、メラニン生成阻害活性を測定した。図３からわかるように対照群であって美白剤として知られている合成物質のアルブチン(Arbutin)１００μｇ／ｍｌ処理時に３１％のメラニン生成抑制活性を示し、それぞれ１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ濃度までの処理時に、カナクギノキエタノール抽出物は、０．６％、７．９％、３１．６％、４５．８％の阻害活性を示した。また、それぞれの順次分画物などの１００μｇ／ｍｌ濃度において３３％、４９％、２４％、３１％、２８％と、対照群より高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として極めて卓越した結果を示した。したがって、本発明のカナクギノキエタノール抽出物および順次分画物は、メラニン生成を減らしながら細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９３】
実験例４：本発明のカナクギノキ抽出物および分画物のチロシナーゼ阻害活性測定
２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種して２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルに１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理して３日間試料処理後、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ウェルの細胞を遠心分離して細胞沈殿物を作り、リシスバッファー(lysis buffer)(0.1M sodinm phosphate buffer，0.2mM PMSF，1% Triton X-100)を加えた。氷に放置して細胞を破壊して遠心分離した後、上層液を取って酵素活性測定に使用した。各試料を反応液(12.5mM L-Dopa，1.5mM L-Tyrosine，67mM sodium phosphate buffer(pH6.8))に入れて３７℃で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００９４】
カナクギノキエタノール抽出物および順次分画物処理後、最終メラニン量が阻害されたことは、メラニン合成に関与する酵素などの活性と関連があるということを示すので、Ｂ１６Ｆ１０細胞においてチロシナーゼ活性を、それぞれ１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの様々な濃度で３日間処理した結果、図４のように対照群のアルブチン処理時に１９％のチロシナーゼ阻害活性を示し、カナクギノキエタノール抽出物および順次分画物のそれぞれ１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ濃度での処理時に、エタノール抽出物は１３．９％、１５．９％、３６．８％、４２．５％の高い阻害活性を示した。また、それぞれの分画物なども１００μｇ／ｍｌ濃度において４０％、２１％、１９％、４１％、２６％を示して、対照群より高いチロシナーゼ阻害活性を示した。このような結果から見る時、Ｂ１６Ｆ１０細胞株におけるカナクギノキエタノール抽出物および順次分画物などによるメラニン生成減少は、チロシナーゼ阻害活性によるものであることが主要な原因のうちの一つとして判断された。
【００９５】
実験例５：本発明のカナクギノキ由来シクロペンタジオン化合物のＭＴＴアッセイを用いた細胞毒性測定
１）ルシドン(Lucidone)（化合物１）
ルシドンとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して培養した後に、ＭＴＴ方法によって細胞の生存率を観察した。図２９からわかるように対照群の細胞生存率を１００％とした際に、コーヒー酸(caffeic acid)の１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌ濃度においてほとんど９６〜１０６％で、対照群に比べて僅かに減少するか増加した。このように対照群に比べて１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌの濃度などは、僅かの差があるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明のルシドンとして分離した単一物質は、細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９６】
２）メチルリンデロン(Methyllinderone)（化合物２）
メチルリンデロンとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して培養した後に、ＭＴＴ方法によって細胞の生存率を観察した。図３０からわかるように対照群の細胞生存率を１００％とした際に、コーヒー酸(caffeic acid)の１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌ濃度においてほとんど９３〜９９％で、対照群に比べて僅かに減少した。このように対照群に比べて１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌの濃度などは、僅かの差があるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明のメチルリンデロンとして分離した単一物質は、細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９７】
３）カナクギオール(Kanakugiol)（化合物３）
カナクギオールとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して培養した後に、ＭＴＴ方法によって細胞の生存率を観察した。図３１からわかるように対照群の細胞生存率を１００％とした際に、コーヒー酸の１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌの濃度においてほとんど９１〜９６％で、対照群に比べて僅かに減少した。このように対照群に比べて１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌの濃度などは、僅かの差があるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明のカナクギオールとして分離した単一物質は、細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９８】
実験例６：本発明のカナクギノキ由来シクロペンタジオン化合物のメラニン生成抑制効果測定
１）ルシドン(Lucidone)（化合物１）
ルシドンとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株に対するメラニン生成抑制効果を測定するために、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理した後、メラニン生成阻害活性を測定した。
その結果、図３２からわかるように、対照群であって美白剤として知られているアルブチン５０μｇ／ｍｌ処理時に２３．５％のメラニン生成抑制活性を示し、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度までの処理時にルシドンは、３％、１９％、３７％、５３％の高い阻害活性を示した。したがって、対照群であるアルブチンより高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として良い結果を示した。
【００９９】
２）メチルリンデロン(Methyllinderone)（化合物２）
メチルリンデロンとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株に対するメラニン生成抑制効果を測定するために、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理した後、メラニン生成阻害活性を測定した。
その結果、図３３からわかるように、対照群であって美白剤として知られているアルブチン５０μｇ／ｍｌ処理時に２３．５％のメラニン生成抑制活性を示し、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度までの処理時にメチルリンデロンは、１％、１４％、３８％、６２％の高い阻害活性を示した。したがって、対照群であるアルブチンより高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として良い結果を示した。
【０１００】
３）カナクギオール(Kanakugiol)（化合物３）
カナクギオールとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株に対するメラニン生成抑制効果を測定するために、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理した後、メラニン生成阻害活性を測定した。
その結果、図３４からわかるように、対照群であって美白剤として知られているアルブチン５０μｇ／ｍｌ処理時に２３．５％のメラニン生成抑制活性を示し、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度までの処理時にカナクギオールは、２％、１６％、２９％、６１％の高い阻害活性を示した。したがって、対照群であるアルブチンより高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として良い結果を示した。
【０１０１】
実験例７：本発明のカナクギノキ由来シクロペンタジオン化合物のチロシナーゼ阻害活性測定
Ｂ１６Ｆ１０細胞においてチロシナーゼ活性をそれぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの様々な濃度で３日間処理した結果、図３５のように、対照群のアルブチン処理時に１９％のチロシナーゼ阻害活性を示し、ルシドンのそれぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度による処理時に、１０％、１７％、２６．４％、４８．９％と、対照群より高いチロシナーゼ阻害活性を示した。このような結果から見る時、Ｂ１６Ｆ１０細胞株におけるカナクギノキより分離したルシドン単一化合物によるメラニン生成減少は、チロシナーゼ阻害活性によるものであることが主要な原因の一つとして判断された。
【０１０２】
実施例４：カナクギノキの葉と薄皮との抽出物の製造およびそれからの溶媒分画物の分離
本実施例において用いられた陸上植物試料のカナクギノキ(Lindera erythrocarpa)は、大韓民国の（財）済州ハイテク産業振興院抽出物銀行から分譲を受けて使用し、試料の抽出に用いられた溶媒は、Ｍｅｒｋ Ｃｏ．社の製品を使用した。
カナクギノキの生葉を流水で洗浄した後、３日間４０℃で熱風乾燥して粉砕機で粉砕した。乾燥粉末試料２００ｇを７０％エタノールに沈積させて３日間室温で２４時間撹拌して抽出し、この浸出物をろ過器でろ過した。浸出ろ過過程を３回再び繰り返した後、得られたろ過液を減圧濃縮した。得られた抽出物（７０％エタノール抽出物）６０ｇのうち、４２ｇを蒸溜水に懸濁して、分液ロートを用いてｎ−ヘキサン(n-Hex)、塩化メチレン(CH2Cl2)、エチルアセテート(EtOAc)、ｎ−ブタノール(n-BuOH)を使用して分画した後、ろ過、減圧濃縮して、それぞれ溶媒別の分画物ｎ−ヘキサン８．５６ｇ、塩化メチレン１．４７ｇ、エチルアセテート４．１４ｇ、ｎ−ブタノール１０．２ｇ、水１４．５８ｇを得た。
一方、カナクギノキの薄皮も葉と同様な方法によって乾燥した後、粉砕し、乾燥粉末試料５６０ｇを用いて同様な条件で抽出して得た７０％エタノール抽出物６８．２ｇを用いて極性別の溶媒分画を行い、それぞれの分画物を得た。
【０１０３】
実施例５：カナクギノキ溶媒分画物から化合物の分離および構造の同定
本実施例の分離過程で使用された充填剤としては、順相シリカゲル６０(normal-phase silica gel 60)(0.063-0.200mm，Merck Co.)が用いられた。分析過程で使用した機器としては、ＨＰＬＣ(Alliance2695，Waters Co.)を用い、ＸＴｅｒｒａ（登録商標） Ｃ１８ ３．５μｍ ４．６×１００ｍｍを装着して使用し、分析に使用した検出器としては、Ｗａｔｅｒｓ社の２９９８モデルのＰＤＡを用いた。実験に使用した溶媒および試薬としては、ＨＰＬＣ ｇｒａｄｅを用い、構造分析に使用した機器としては、ＮＭＲ(Nuclear Magnetic Resonance)はＢｕｒｋｅｒ(German Co.)のＪＮＭ−ＬＡ５００を用い、ＮＭＲ測定時に使用した溶媒としては、メタノール−ｄ４、クロロホルム−ｄ１を用いた。
【０１０４】
前記の実施例４で得たカナクギノキの葉の塩化メチレン分画層（２．５ｇ）に対して順相シリカゲル（ヘキサン／エチルアセテート）（ｖ／ｖ）、溶媒グラジエント(gradient)条件で分画することによって、１０個の分画を得た。そのうち、分画−６から再結晶法を用いて化合物１０（２１．８ｍｇ）を得た。
一方、前記実施例４で得たカナクギノキの薄皮の塩化メチレン分画層（７．０ｇ）に対して順相シリカゲル（ヘキサン／エチルアセテート）（ｖ／ｖ）、溶媒グラジエント条件で分画することによって、８個の分画を得た。前記分画のうち、分画−２を用いて順相シリカゲル（ヘキサン／エチルアセテート）（３／２）条件でクロマトグラフィーを行い、そのうち、分画−２−２から化合物１２（５９．６ｍｇ）を得、分画−２−３から化合物１１を得た。
【０１０５】
前記のように得られた化合物１０〜１２に対してＨＰＬＣ、ＮＭＲ、（１Ｄ、２Ｄ ＮＭＲ）、ＬＲ／ＨＲ ＦＡＢ−ＭＳを介して化合物分析および構造確認を行い、ＨＰＬＣを用いて化合物の純度およびエタノール抽出物内の含有量を確認した。
その結果、化合物１０はシクロペンタジオン(cyclopentadione)系列のルシドン(lucidone)と同定され、化合物１１は同じ系列のメチルリンデロン(methyllinderone)、化合物１２は下記化学式１０のシクロペンタジオン(cyclopentadione)系列から変形された誘導体化合物である、現在まで報告されたことのない新規化合物（Ｎ２）と同定された。前記新規化合物のＩＵＰＡＣ名は、２，３，４，５−テトラメトキシ−６−(１−メトキシ−３−フェニルプロピル)フェノール[2,3,4,5-tetramethoxy-6-(1-methoxy-3-phenylpropyl)phenol]であり、一般名は、チェジュ−ポリメトキシフェノール(jeju-polymethoxy-phenol)と命名した。化合物１２の１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲデータを下記の表３に示した。
【０１０６】
【化２２】
【０１０７】
化合物の特性
１）ＩＵＰＡＣ名：２，３，４，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙ−６−（１−ｍｅｔｈｏｘｙ−３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ
２）色：濃い緑色
３）香り：弱い腐敗性の臭い
４）溶解性：メタノール、アセトン、クロロホルムなどの有機溶媒
５）カナクギノキの薄皮のみに分布
６）一般名：ｊｅｊｕ−ｐｏｌｙｍｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｅｎｏｌ
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
カナクギノキの葉および薄皮のエタノール抽出物と各溶媒別の分画物並びに化学式１０の化合物の収率を下記の表４に示した。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
前記の表４を介してわかるように、化学式１０の化合物は、葉では発見されなかったが、薄皮において０．７１％と高く観察された。
【０１１２】
前記カナクギノキより分離した単一化合物は、ＤＭＳＯ溶媒を加えて完全に溶解させた後、ろ過して以後の実験に使用した。
【０１１３】
実験例８：本発明の化学式１０の化合物のＭＴＴアッセイを用いた細胞毒性測定
現在、知られていない新規化合物を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、下記のような実験を行った。
本実験例に使用されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞は、米国細胞株銀行(ATCC)から分譲を受けた。Ｂ１６Ｆ１０細胞を１０％ウシ胎児血清(FBS，Gibco)、１％抗生剤(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)、Ｌ−グルタミンと炭酸水素ナトリウムが含有されたＤＭＥＭ培地(Gibco)を使用して３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した。
Ｂ１６Ｆ１０細胞を２４ウェルプレートにウェル当り２×１０４個の細胞を接種して２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルにて５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および、３０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して７２時間培養した。それに２ｍｇ／ｍｌの濃度で製造したＭＴＴ溶液２００μｌを添加して同様な培養条件で４時間培養して培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェル当りＤＭＳＯ ２００μｌを加えてＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１４】
その結果、図３６からわかるように、対照群の細胞生存率を１００％とした際に、化学式１０の化合物は、５、１０、２０、３０μｇ／ｍｌの濃度においてほとんど９７〜１０３％と、対照群に比べて僅かに減少させるか増加させた。このように対照群に比べて５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および、３０μｇ／ｍｌの濃度などでは、僅かの差はあるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明の化学式１０の化合物は、細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【０１１５】
実験例９：本発明の化学式１０の化合物のメラニン生成阻害活性測定
２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種して２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルにて処理して３日間試料処理後、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェル当たり５００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えて５６℃で３０分溶解した後、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１６】
その結果、図３７からわかるように、対照群であって美白剤として知られているアルブチン５０μｇ／ｍｌ処理時には３３．６％のメラニン生成抑制活性を示し、本発明の新規化合物は、それぞれ５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌの濃度までによる処理時に、１９％、３２％、５１％、５９％の高い阻害活性を示した。したがって、対照群であるアルブチンより約２倍さらに高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として良い結果を示した。
【０１１７】
実験例１０：本発明の化学式１０の化合物のメラニン生成に関与するｍＲＮＡ発現阻害活性測定
本実験例に使用されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞は、米国細胞株銀行(ATCC)から分譲を受けた。Ｂ１６Ｆ１０細胞を１０％ウシ胎児血清(FBS，Gibco)、１％抗生剤(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)、Ｌ−グルタミンと炭酸水素ナトリウムを含有するＤＭＥＭ培地(Gibco)を使用して３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した。
培養が済んだ細胞を２〜３回ＰＢＳで洗浄した後、総ＲＮＡ(total RNA)抽出は、ＴＲＩｚｏｌ−ｒｅａｇｅｎｔ(Invitrogen，USA)を用いて分離した。細胞にＴＲＩｚｏｌ−ｒｅａｇｅｎｔを添加して均質化した後、クロロホルムを添加して遠心分離(12,000rpm，15min)した。上澄液に同量のイソプロパノールを添加して遠心分離(12,000rpm，10min)してＲＮＡを沈殿させて７５％のジエチルピロカルボネート(diethylpyrocarbonate，DEPC)処理されたエタノールで洗浄した後、乾燥させてＤＥＰＣ処理された蒸溜水に溶かした。２６０ｎｍの吸光度を測定してＲＮＡを定量し、Ａ２６０／Ａ２８０ｎｍの比率が１．６〜１．９の範囲内の値を有するＲＮＡを実験に使用した。ｃＤＮＡ合成は、Ｉｍｐｒｏｍ−IIＴＭ ｃＤＮＡ ｋｉｔ(Promega，USA)を用い、１μｇの総ＲＮＡ(total RNA)をオリゴ（ｄＴ）プライマー(oligo (dT) primer)、ｄＮＴＰ（０．５μＭ）、１ｕｎｉｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、および、Ｉｍｐｒｏｍ−IIＴＭ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２Ｕ）で２５℃で５分、３７℃で６０分、そして、７０℃で１０分間ヒーティングすることによって反応を中止させた。重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction，PCR)は、合成されたｃＤＮＡからチロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、β−アクチンを増幅させるために、１μｌのｃＤＮＡ、４μＭの５’と３’ｐｒｉｍｅｒ、１０×ｂｕｆｆｅｒ (10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，0.1% Triton X-100)、２５０μＭのｄＮＴＰ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｕｎｉｔ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(Promega，USA)を混ぜて、３次蒸溜水で最終２５μｌに合わせた後、パーキンエルマーサーマルサイクラー(Perkin-Elmer Thermal Cycler)を用いて行った。この時、ＰＣＲの条件は、９４℃／３０秒、５０〜５５℃／４５秒、７２℃／４５秒で２０〜２５回であり、ＰＣＲによって生成された産物は１．２％アガロースゲル(agarose gel)で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド(ethidium bromide)で染色して特定バンド(band)を確認した。
メラニン細胞は、紫外線によって角質形成細胞などから生成されたＮＯがｃＧＭＰ経路を通じてメラニン生成を増加させ、チロシナーゼとＴＲＰ−１を増加させ、チロシナーゼ活性のｍＲＮＡ発現を誘導する過程に関与することが知られている。Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞において毒性を見せない濃度でカナクギノキから分離した単一化合物などのメラニン抑制効果がｍＲＮＡ発現抑制によるものであるかを確認するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。メラニン生成の主要な酵素として知られているチロシナーゼ以外のＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２遺伝子の発現抑制の様相を確認した。
【０１１８】
その結果、図３８からわかるように、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１ ｍＲＮＡの発現量が濃度依存的に減少することが示された。通常のメラニン合成過程でＴＲＰ−２は、ドパクロム(dopachrome)をカルボキシル化誘導体(carboxylated derivative)である５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)に転換させる機能を有すると報告されているが、ＴＲＰ−２ ｍＲＮＡ遺伝子の発現を確認した結果、ＴＲＰ−２ ｍＲＮＡ発現は濃度に関係なく一定であった。
したがって、カナクギノキから分離した新規化合物は、ＴＲＰ−２と関係なく、チロシナーゼとＴＲＰ−１のｍＲＮＡ発現を減少させることによって、メラニン合成を阻害することが確認された（図３８）。以上の結果からカナクギノキから分離した新規化合物がＢ１６Ｆ１０黒種細胞に対して優れたメラニン色素生成抑制およびチロシナーゼ抑制効果を有しているものとして確認され、これより美白関連機能性素材としての活用価値のあることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
以上、前記実施例および実験例を介して説明したように、本発明のカナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物は、シクロペンタジオン化合物または、その誘導体を有効成分として含有することによって、優れたメラニン生成阻害活性およびチロシナーゼ阻害活性を表するので、化粧品、製薬および食品産業に有用に使用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物に関し、より詳細にはカナクギノキをエタノールで抽出して得たエタノール抽出物、それから得た溶媒分画物または、それから分離精製した化合物を有効成分とする皮膚美白用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物からの生理活性物質に関する研究が活発に進行しており、疾病に対する治療および予防剤または、健康補助剤として植物資源が広く用いられている。天然抗酸化剤としては、α−トコフェロール、ビタミンＣ、カロテノイド、フラボノイドなどが知られているが、このような抗酸化効果がある物質などは、動植物に広く分布しており、特に多くの研究が行われた分野は、植物由来物質である。植物由来の２次代謝産物などは、自由遊離基(free radical)と活性酸素の生成を抑制且つ除去して酸化による細胞損傷を防止するということが生体実験の結果、明らかになった。
【０００３】
現在まで報告された殆どの天然抗酸化剤は、植物から由来したものであって、主にポリフェノール化合物であると知られており、特にフラボノイドは、脂質の酸化、活性酸素の消去および酸化的ストレスを防ぐ役割をすることによって、老化防止、癌および心臓疾患などを予防且つ遅延する効果があるため、現時の食品、医薬品、化粧品など多くの分野で活用されている。また、メラニン(melanin)は、紫外線から生体を保護する重要な防御手段として動物、植物、および微生物に広く存在するフェノール類の高分子天然色素である。
【０００４】
メラニンは、紫外線、乾燥、極限温度などに対する生存能力を高め、コーヒー、お茶、タバコなどの品質を向上させるが、過度なメラニン合成は、人体にシミ、ソバカス、皮膚斑点を形成し、皮膚老化を促進し、皮膚癌の誘発に関与するものとして知られている。メラニン色素の生合成は、チロシナーゼ酵素をはじめとして様々な酵素などによって調節されており、そのうち、チロシナーゼは、チロシンを基質としてＬ−ドパキノンに転移する初期生合成の過程以後にジヒドロキシインドールの酸化に作用する。したがって、チロシナーゼ活性抑制剤を見付ける研究が美白剤の開発において重要な部分を占めており、現在に続けて知られているチロシナーゼ阻害剤として、ヒドロキノン(hydroquinone)、４−ヒドロキシアニソール(4-hydroxyanisole)、アスコルビン酸誘導体、コウジ酸、アゼライン酸(azelaic acid)、コルチコステロイド(corticosteroid)、レチノイド類、アルブチン(arbutin)、カテキン、３，４，５−トリメトキシシンナマートチモールエステル(3,4,5-trimethoxy cinnamate thymol ester)などがあるが、それらの安全性と経済性などに問題が多くて使用において困難さがある。
【０００５】
カナクギノキ(Lindera erythrocarpa)は、クスノキ科(Lauraceae)の植物であって、世界的に４５属１，５００種余りが分布し、大韓民国には６属１２種が自生していることが知られている。カナクギノキは、雌雄異株で４月から５月に淡い黄色の花が咲き、９月に８ｍｍ程度の赤色実が実る。大韓民国の南部地方をはじめとして日本、中国の暖かい地域に自生する高さ５ｍの落葉樹である。乾燥された実は、特異な芳香と苦味を有しており、日本では胃腸薬と神経痛の鎮痛剤として使用されている。また、カナクギノキの葉と実から抽出したエタノール抽出物と、シクロペンタジオン系化合物中の一つであるルシドン(lucidone)は、高い抗炎効果を奏すると報告され(Wang et al.，2008)、カナクギノキから分離したシクロペンタジオン化合物は、抗癌効果を有すると報告された(Oh et al.,2005；大韓民国特許10-0658519号)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、カナクギノキ抽出物、その溶媒分画物または、それから分離精製したシクロペンタジオン化合物または、その誘導体を有効成分として含有する皮膚美白用組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これに本発明者らは、前記のようなことに鑑みて大韓民国の済州道のカナクギノキ(Lindera erythrocarpa)を用いてエタノール抽出物、溶媒による順次分画物およびシクロペンタジオン化合物または、その誘導体を得て抗酸化活性を検索し、Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞およびＲＡＷ２６４．７細胞を処理してメラニン生合成抑制活性を調査することによって、それらが皮膚美白機能性化粧料、食品または、薬学的組成物の有用資源として活用可能性があることを確認することによって本発明を完成することになった。
【発明の効果】
【０００８】
本発明のカナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物は、シクロペンタジオン化合物または、その誘導体を有効成分として含有することによって、既に美白剤として知られていたアルブチン(arbutin)より更に高いメラニン阻害活性を見せる非常に優れた効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、本発明によりカナクギノキからエタノール抽出物およびその溶媒分画物を得る過程を簡略に示したフローチャートである。
【図２】図２は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図３】図３は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物のｎ−ヘキサン分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図４】図４は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物の塩化メチレン分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図５】図５は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物のエチルアセテート分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図６】図６は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物のｎ−ブタノール分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図７】図７は、本発明のカナクギノキエタノール抽出物の水分画に対するＨＰＬＣ分析結果を示したものである。
【図８】図８は、化合物１の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図９】図９は、化合物１の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１０】図１０は、化合物２の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１１】図１１は、化合物２の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１２】図１２は、化合物３の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１３】図１３は、化合物３の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１４】図１４は、化合物４の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１５】図１５は、化合物４の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１６】図１６は、化合物５の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１７】図１７は、化合物５の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図１８】図１８は、化合物６の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図１９】図１９は、化合物６の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図２０】図２０は、化合物７の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図２１】図２１は、化合物７の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図２２】図２２は、化合物８の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図２３】図２３は、化合物８の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図２４】図２４は、化合物９の定量分析のための高性能液体クロマトグラフィーの結果である。
【図２５】図２５は、化合物９の１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを示したものである。
【図２６】図２６は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギノキエタノール抽出物とその溶媒分画物が表する細胞生存率を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図２７】図２７は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギノキエタノール抽出物とその溶媒分画物が表するメラニン生成阻害活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図２８】図２８は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギノキエタノール抽出物とその溶媒分画物が表する細胞チロシナーゼ阻害活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図２９】図２９は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でルシドンが表する細胞生存率を示したグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３０】図３０は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でメチルリンデロンが表する細胞生存率を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３１】図３１は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギオールが表する細胞生存率を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３２】図３２は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でルシドンが表するメラニン生成抑制活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３３】図３３は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でメチルリンデロンが表するメラニン生成抑制活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３４】図３４は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でカナクギオールが表するメラニン生成抑制活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３５】図３５は、Ｂ１６Ｆ１０細胞でルシドンが表するチロシナーゼ阻害活性を示すグラフである。この時のデータは、３回測定した後に得た平均±ＳＤ値である。
【図３６】図３６は、本発明のカナクギノキ由来の化学式１０の化合物がＢ１６Ｆ１０細胞の細胞生存率に及ぼす影響を示すグラフである。
【図３７】図３７は、本発明のカナクギノキ由来の化学式１０の化合物がＢ１６Ｆ１０細胞でメラニン生成抑制に及ぼす影響を示したグラフである。
【図３８】図３８は、本発明のカナクギノキ由来の化学式１０の化合物がＢ１６Ｆ１０細胞でチロシナーゼ、ＴＲＰ−１およびＴＲＰ−２遺伝子の発現を抑制する様相を示したものである。この時、Ｃは対照区を、Ａｒｂはアルブチンを意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一つの態様として、本発明は、カナクギノキ抽出物または、その溶媒分画物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物を提供する。
【００１１】
本発明において、前記カナクギノキ抽出物は、水、エタノール、メタノールのような低級アルコールまたは、それらの混合溶媒から選択された溶媒、好ましくは、エタノールで抽出したものを含む。また、本発明において、前記抽出物には、抽出処理によって得られる抽出液、抽出液の希釈液または、濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、または、それらの粗精製物または、精製物のうち、いずれか一つも含むことにする。
【００１２】
本発明の一実施例として、前記カナクギノキ抽出物は、カナクギノキを熱風乾燥し、粉砕して得た粉砕物を７０％のエタノールに沈積させて３日間室温で撹拌して浸出し、ろ過した後、減圧濃縮することによって収得することができる。
【００１３】
本発明において、カナクギノキ抽出物の溶媒分画物は、カナクギノキ抽出物を蒸溜水に懸濁した後、非極性溶媒からｎ−ヘキサン(n-hexane；n-Hex)、塩化メチレン(methylene chloride；CH2Cl2)、エチルアセテート(ethyl acetate；EtOAc)、およびｎ−ブタノール(n-butanol；n-BuOH)を用いて分画することによって収得することができる。
【００１４】
本発明の一実施例として、カナクギノキ抽出物の溶媒分画物は、カナクギノキエタノール抽出物を蒸溜水に懸濁し、分液ロートで非極性溶媒からｎ−ヘキサン(n-Hex)、塩化メチレン(CH2Cl2)、エチルアセテート(EtOAc)、ｎ−ブタノール(n-BuOH)を用いて分画した後、ろ過、減圧濃縮して、それぞれ溶媒別に分画物を得た。
【００１５】
他の一つの態様として、本発明は、下記化学式１〜１０で表される化合物よりなる群から選択される１種以上の化合物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物を提供する。
【００１６】
【化１】
【００１７】
【化２】
【００１８】
【化３】
【００１９】
【化４】
【００２０】
【化５】
【００２１】
【化６】
【００２２】
【化７】
【００２３】
【化８】
【００２４】
【化９】
【００２５】
【化１０】
【００２６】
本発明において、前記化合物などは、カナクギノキから分離精製して使用することができる。また、本発明において、前記化合物のうち、化学式１０の化合物を除いては市販の製品を入手して使用するか、公知の合成方法によって製造して使用することもできる。
【００２７】
本発明の好ましい態様として、本発明の組成物は、化粧料組成物である。
【００２８】
本発明の化粧料組成物に含まれる成分は、有効成分としてのカナクギノキ抽出物、その溶媒分画物または、それから分離した化合物以外に化粧品組成物に通常的に用いられる成分などを含み、例えば、抗酸化剤、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料および香料のような通常的な補助剤、および、担体を含むことができる。また、前記化粧料組成物は、その効果を増進させるために皮膚吸収促進物質を更に含むことができる。
【００２９】
本発明の化粧料組成物は、当業界における通常的に製造されるどんな剤形としても製造されることができ、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファウンデーション、乳濁液ファウンデーション、ワックスファウンデーション、および、スプレーなどで剤形化されることができ、これに限られない。具体的には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、スプレーまたは、パウダーの剤形で製造され得る。
【００３０】
本発明の剤形がペースト、クリームまたは、ゲルの場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルクまたは、酸化亜鉛などが利用され得る。
【００３１】
本発明の剤形がパウダーまたは、スプレーの場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、ケイ酸カルシウムまたは、ポリアミドパウダーが用いられ、特にスプレーの場合には、更にフロン(chlorofluorohydrocarbon)、プロパン／ブタンまたは、ジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
【００３２】
本発明の剤形が溶液または、乳濁液の場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤または、乳濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカルボナート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジル安息香酸、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタン脂肪酸エステルがある。
【００３３】
本発明の剤形が懸濁液の場合には、担体成分として水、エタノールまたは、プロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステルおよびポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラガントなどが利用され得る。
【００３４】
本発明の剤形が界面活性剤含有クレンジングの場合には、担体成分として脂肪族アルコールスルフェート、脂肪族アルコールエーテルスルフェート、スルフォコハク酸モノエステル、イセチオン酸塩、イミダゾールリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシン、脂肪酸アミドエーテルスルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが利用され得る。
【００３５】
本発明の好ましい態様として、本発明の組成物は、薬剤学的組成物である。
【００３６】
本発明の組成物が薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものとして、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含み、これに限られない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分など以外に潤滑剤、湿潤制、甘美剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを更に含むことができる。
【００３７】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または、非経口などの様々な経路で投与することができ、例えば、経口または、経皮によって投与することができる。しかし、好ましくは、非経口投与のうち、経皮投与、より好ましくは、塗布による局所投与(topical application)経路に適用される。
【００３８】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性のような要因などに応じて様々に処方され得る。本発明のカナクギノキ抽出物、その溶媒分画物または、それから分離した化合物は、経口型剤形の場合、成人基準として５〜３０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇの量で１日当り１回〜数回投与することができ、外用剤の場合には、成人基準として１日当り１．０〜３．０ｍｌの量で１日当り１回〜５回塗布して１ヶ月以上続けるのが良い。
【００３９】
本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法により、薬剤学的に許容される担体および／または、賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量形態で製造されるかまたは、多容量容器内に内入させて製造され得る。この時、剤形は、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルション、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、軟膏、クリームなどの外用剤などをはじめとして薬剤学的製剤に適合したどんな形態でも使用することができ、分散剤または、安定化剤を更に含むことができる。
【００４０】
本発明の好ましい態様として、本発明の組成物は、食品組成物である。
【００４１】
本発明の組成物が食品組成物として製造される場合、有効成分としてカナクギノキ抽出物、その分画物または、それから分離した化合物だけでなく、食品製造時に通常的に添加される成分を含み、例えば、蛋白質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味剤および香味剤を含む。前述した炭水化物の例としては、モノサッカライド、例えば、ブドウ糖、果糖など；ジサッカライド、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；およびポリサッカライド、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。香味剤として天然香味剤［タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウディオサイドＡ、グリチルリジンなど）］および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を使用することができる。
【００４２】
他の一つの態様として、本発明は、下記化学式１０の化合物を提供する。
【００４３】
【化１１】
【００４４】
本発明において、前記化学式１０の化合物は、カナクギノキから分離することができ、好ましくはカナクギノキの薄皮部分から分離することができる。
【００４５】
他の一つの態様として、本発明は、カナクギノキから化学式１０の化合物の分離方法を提供する。
【００４６】
【化１２】
【００４７】
好ましい態様として、前記化学式１０の化合物の分離方法は、下記の段階を含むことができる：
カナクギノキを水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコールまたは、それらの混合溶媒から選択された溶媒で抽出してカナクギノキ抽出物を得る段階；
前記カナクギノキ抽出物をヘキサン、塩化メチレン、エチルアセテートおよびブタノールで分画して各溶媒分画物を得る段階；
前記カナクギノキ溶媒分画物を、溶出溶媒としてヘキサンとエチルアセテートを溶媒グラジエントとして用いて、１次シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って分画する段階；および
前記１次シリカゲルカラムクロマトグラフィー分画物を、溶出溶媒としてヘキサンとエチルアセテートとの混合溶媒を用いて２次シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って、化学式１０の新規ポリメトキシフェノール化合物を分離する段階。
【００４８】
本発明において、前記カナクギノキは、カナクギノキの薄皮部分である。
【００４９】
本発明において、前記カナクギノキ抽出物は、水、エタノール、メタノールのようなＣ１〜Ｃ４の低級アルコールまたは、それらの混合溶媒から選択された溶媒、好ましくはエタノールで抽出して得ることができる。また、本発明において、前記抽出物には、抽出処理によって得られる抽出液、抽出液の希釈液または、濃縮液、抽出液を乾燥して得られる乾燥物、または、それらの粗精製物または、精製物のうち、いずれか一つを含むことができる。
【００５０】
本発明の一実施例として、前記カナクギノキ抽出物は、カナクギノキを熱風乾燥し、粉砕して得た粉砕物を７０％のエタノールに沈積させて３日間室温で撹拌して浸出し、ろ過した後、減圧濃縮することによって収得することができる。
【００５１】
本発明において、カナクギノキ抽出物の溶媒分画物は、カナクギノキ抽出物を蒸溜水に懸濁した後、非極性溶媒からｎ−ヘキサン(n-hexane；n-Hex)、塩化メチレン(methylene chloride；CH2Cl2)、エチルアセテート(ethyl acetate；EtOAc)、およびｎ−ブタノール(n-butanol；n-BuOH)を用いて分画することによって収得することができる。
【００５２】
本発明の一実施例として、カナクギノキ抽出物の溶媒分画物は、カナクギノキエタノール抽出物を蒸溜水に懸濁し、分液ロートで非極性溶媒からｎ−ヘキサン(n-Hex)、塩化メチレン(CH2Cl2)、エチルアセテート(EtOAc)、ｎ−ブタノール(n-BuOH)を用いて分画した後、ろ過、減圧濃縮して、それぞれ溶媒別に分画物を得た。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を介して本発明の構成および効果をさらに具体的に説明しようとするが、これらの実施例は本発明の例示的な記載だけであり、本発明の範囲がこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【００５４】
実施例１：カナクギノキ抽出物の製造
本実施例において用いられた植物試料のカナクギノキ(Lindera erythrocarpa)は、大韓民国の（財）済州ハイテク産業振興院抽出物銀行から分譲を受けて使用した。
先ず、カナクギノキ(Lindera erythrocarpa Makino.)を流水で洗浄した後、３日間４０℃で熱風乾燥して粉砕機で粉砕した。乾燥された試料２００ｇを７０％エタノールに沈積させて３日間室温で撹拌して浸出し、この浸出物をろ過器でろ過し、浸出ろ過過程を３回再び繰り返した後、このろ過液を減圧濃縮することによって６０ｇのエタノール抽出物を収得した。
【００５５】
実施例２：カナクギノキ抽出物由来溶媒分画物の分離
本実施例において試料の抽出に用いた溶媒などは、Ｍｅｒｋ Ｃｏ．、Ｊｕｎｓｅｉ Ｃｏ．、Ｈｙｍａｎ Ｃｏ．社の製品を使用した。
カナクギノキのエタノール抽出物に対する溶媒分画は、下記のように行った。
先ず、前記実施例１で製造したカナクギノキエタノール抽出物(70% ethanol extract)６０ｇのうち、４２ｇを蒸溜水に懸濁して、分液ロートを用い、ｎ−ヘキサン(n-Hex)、塩化メチレン(CH2Cl2)、エチルアセテート(EtOAc)、ｎ−ブタノール(n-BuOH)を使用して分画した後、ろ過、減圧濃縮して、それぞれ溶媒別に分画物ｎ−Ｈｅｘ ８．５６ｇ、ＣＨ２Ｃｌ２ １．４７ｇ、ＥｔＯＡｃ ４．１４ｇ、ｎ−ＢｕＯＨ １０．２ｇ、Ｈ２Ｏ １４．５８ｇを得た（図１参照）．
前記のように得た各抽出物および分画物に対してＨＰＬＣ分析を行った。 その結果を図２〜図７に示した。
【００５６】
以後の実験では、粉末としたヘキサンと塩化メチレン、エチルアセテートの分画物は、１００％エタノールに溶かし、ブタノールおよび水分画物は、１００％エタノールと１×リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate Buffered Saline:PBS，pH 7.4)を１：１で混合した溶媒を加えて完全に溶解させた後、ろ過して使用した。
【００５７】
実施例３：カナクギノキエタノール抽出物の溶媒分画物から化合物の分離および構造の同定
エチルアセテート分画層（４．０ｇ）を、セライトを用い、塩化メチレン、エチルエーテル、エチルアセテート、アセトンを用いて分画を分け、そのうち、エチルエーテル分画物を用いて、順相シリカゲルにてクロロホルムとメタノールを展開溶媒として使用して分画を分け、そのうち、分画−５より順相シリカゲルにてクロロホルムとメタノールを用いて分画−１で化合物１を、分画−３で化合物２を得た。分画−２より、Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣを用いて３０％メタノール水溶液を使用して化合物３と化合物４を得た。
【００５８】
塩化メチレン分画層（２．５３ｇ）を持って順相シリカゲルにてヘキサンとエチルアセテートを溶媒グラジエント条件として使用して、１０個の分画を得た。分画−２を、順相シリカゲルを使用してヘキサンとエチルアセテートを展開溶媒として精製して、化合物５を得、分画−５より順相シリカゲルを使用してクロロホルムとメタノールを展開溶媒として化合物６を得た。分画−６より再結晶法を用いて化合物７を得、分画−７より再結晶法を用いて化合物８を得た。分画−８より順相シリカゲルを使用してクロロホルムとメタノールを展開溶媒として２個の分画を得、そのうち、分画−８−２で化合物９を得た。得られた９個の化合物はＨＰＬＣ分析およびＮＭＲを用いて確認した結果、純粋に分離されたことを確認した。
【００５９】
最終的に、カナクギノキの葉２００ｇを７０％エタノールで抽出して抽出物６０ｇを得て、それから９個の化合物を純粋に分離精製した。
【００６０】
分離した各分画物および化合物に対する収率は下記の表１の通りであった。
【００６１】
【表１】
【００６２】
核磁気共鳴器(Bruker Co.500MHz，NMR)を用いて１Ｈ、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、ＨＭＱＣ、ＨＭＢＣスペクトラムを得、それらのスペクトラムを総合的に分析して構造を決め、高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いて定量分析を行った。
各化合物の高性能液体クロマトグラフィーの結果と１Ｈ、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトラムを図８〜図２５に示した。
その結果、化合物１は、下記化学式１のケルセチン（quercetin）と同定された。
【００６３】
【化１３】
【００６４】
化合物２は、下記化学式２のクエルシトリン（quercitrin）と同定された。
【００６５】
【化１４】
【００６６】
化合物３は、下記化学式３のケンフェロール３−Ｏ−ラムノピラノシド （kaempferol-3-O-rhamnopyranoside）と同定された。
【００６７】
【化１５】
【００６８】
化合物４は、下記化学式４のケルセチン３−Ｏ−アラビノフラノシド（quercetin-3-O-arabinofuranoside）と同定された。
【００６９】
【化１６】
【００７０】
化合物５は、下記化学式５のコーヒー酸エチルエステル（caffeic acid ethyl ester）と同定された。
【００７１】
【化１７】
【００７２】
化合物６は、下記化学式６の桂皮酸メチルエステル（cinamic acid methyl ester）と同定された。
【００７３】
【化１８】
【００７４】
化合物７は、下記化学式７のルシドン（lucidone）と同定された。
【００７５】
【化１９】
【００７６】
化合物８は、下記化学式８のメチルリンデロン（methyl linderone）と同定された。
【００７７】
【化２０】
【００７８】
化合物９は、下記化学式９のカナクギオール（kanakugiol）と同定された。
【００７９】
【化２１】
【００８０】
実験例１：本発明のカナクギノキ抽出物および分画物の抗酸化活性測定
１）１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル(DPPH)自由遊離基消去実験
電子供与能(electron donating ability)測定は、Ｂｌｏｓｉｓ方法によるＤＰＰＨ自由遊離基消去法に応じて測定した。すなわち、エタノールに溶かした様々な濃度の試料を９６ウェルプレート(Well Plate)に１００μｌずつ分取し、０．４ｍＭのＤＰＰＨ溶液を同量添加して室温で１０分間放置した後、５１７ｎｍで吸光度を測定した。この時、陽性対照群としては、ブチル化ヒドロキシアニソール (butylated hydroxy anisole，BHA)を使用した。ＤＰＰＨ自由遊離基消去活性は下記の数学式１から算出し、ＤＰＰＨの吸光度が５０％減少する時に表される試料の濃度(IC50)で示した。
【００８１】
【数１】
【００８２】
前記の式において、
Ａsample＝試料を添加した反応液の吸光度であり、
Ａcontrol＝試料の代わりにエタノールを添加した反応液の吸光度である。
【００８３】
カナクギノキのエタノール抽出物と順次分画物の抗酸化活性に対する結果を下記の表２に示した。ＤＰＰＨの自由遊離基消去活性は、エタノール抽出物と順次分画物のいずれも処理濃度に応じて濃度依存的に増加した。順次分画物のうち、エチルアセテート分画物でＤＰＰＨの自由遊離基消去活性の対照群であるＢＨＡより高い活性を示し、塩化メチレンとヘキサン分画物を除いた残りの分画物なども顕著に良い活性を有しており、この時のＩＣ５０値は、それぞれ７．４３μｇ／ｍｌ（エチルアセテート）、１６．８８μｇ／ｍｌ（エタノール）、１８．５４μｇ／ｍｌ（ブタノール）、６６．７７μｇ／ｍｌ（水）と示された（表２）。
【００８４】
２）キサンチン酸化酵素抑制および過酸化物消去活性測定
キサンチン酸化酵素(xanthine oxidase)による尿酸(uric acid)生成は、２９０ｎｍで増加した吸光度によって測定し、対照群としてアロプリノール(allopurinol)(Sigma)を使用した。過酸化物(superoxide)の量は、ニトロブルーテトラゾリウム(nitroblue tetrazolium，NBT)還元方法によって５６０ｎｍで測定した。反応液は、各試料の様々な濃度と０．５ｍＭのキサンチンと１ｍＭのＥＤＴＡを２００ｍＭのリン酸塩緩衝液(phosphate buffer)(pH 7.5)１００μｌで用意し、５０ｍＵ／ｍｌキサンチン酸化酵素を添加して尿酸の生成を誘導した。過酸化物消去活性は、前記の反応液に０．５ｍＭのＮＢＴを添加して反応させた。キサンチン酸化酵素抑制および過酸化物消去活性は、それぞれ生成された尿酸と過酸化物の吸光度が５０％減少する時に表される試料の濃度(IC50)で示し、各試料は、３回繰返し実験の後に平均値を求めた。
【００８５】
カナクギノキエタノール抽出物および順次分画物のキサンチン酸化酵素抑制活性および過酸化物ラジカル(superoxide radical)消去活性に対する結果も表２に示した。カナクギノキエタノール抽出物および順次分画物のいずれも濃度依存的にキサンチン酸化酵素抑制活性を示し、ヘキサン分画物(>1000ug/ml)と塩化メチレン(IC5086.21μg/ml)は、多少低い活性を示したが、他の分画物などのＩＣ５０値は５．５５〜９．７９μｇ／ｍｌで高い抑制活性を示した（表２）。また、過酸化物ラジカル消去活性においてもＩＣ５０値は、それぞれ１６．８６μｇ／ｍｌ（エチルアセテート）と示され、対照群のアロプリノール（ＩＣ５０＝３．８２μｇ／ｍｌ）に比べて僅かに低い活性を示した（表２）。
【００８６】
このような効果は、すでに報告されたように、脂質の酸化、活性酸素の消去および酸化的ストレスを防ぐ役割をすることによって、老化防止、癌および心臓疾患などを予防且つ遅延する効果で、現時の食品、医薬品、化粧品など多くの分野においてこれらの効果を活用している。したがって、カナクギノキは抗酸化効果を基にして判断すると、生体内で生じる多くの酸化的なストレスおよび損傷の予防に有用に使用され得る。
【００８７】
【表２】
【００８８】
実験例２：本発明のカナクギノキ抽出物および分画物のＭＴＴアッセイ(assay)を用いた細胞毒性測定
本実験例に使用されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞は、米国細胞株銀行(ATCC)から分譲を受けた。Ｂ１６Ｆ１０細胞を１０％ウシ胎児血清(fetal bovine serum)(FBS，Gibco)、１％抗生剤(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)、Ｌ−グルタミンと炭酸水素ナトリウム(sodium bicarbonate)が含有されたＤＭＥＭ培地(Gibco)を使用して３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した。また、ＲＡＷ ２６４．７細胞は、マウスの大食細胞細胞株(murine macrophage cell line)であって、ＫＣＬＢ(Korean Cell Line Bank)から分譲を受けて１０％ＦＢＳと１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが含まれたＤＭＥＭ培地(Gibco)を使用して３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した。
【００８９】
Ｂ１６Ｆ１０細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個の細胞を接種し、２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルに１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理して７２時間培養した。それに２ｍｇ／ｍｌの濃度で製造したＭＴＴ溶液２００μｌを添加して同様の培養条件で４時間培養し、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェル当たりＤＭＳＯ２００μｌを加えてＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【００９０】
カナクギノキ(Lindera erythrocarpa)エタノール抽出物および順次分画物がＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および、１００μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して培養した後、ＭＴＴ方法によって細胞の生存率を観察した。図２からわかるように対照群の細胞生存率を１００％とした際に、カナクギノキエタノール抽出物およびそれぞれの順次分画物濃度などのうち、１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍｌ濃度でほとんど８１〜１０３％で、対照群に比べて僅かに減少するか増加した。このように対照群に比べて、１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの濃度などでは、僅かの差があるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明のカナクギノキエタノール抽出物および順次分画物は細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９１】
実験例３：本発明のカナクギノキ抽出物および分画物のメラニン生成阻害活性測定
２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種して、２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルに１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理して３日間試料処理後、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェル当たり５００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えて５６℃で３０分溶解した後、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００９２】
前記の実験例２で細胞毒性のないものとして観察されたカナクギノキエタノール抽出物および順次分画物の１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理した後、メラニン生成阻害活性を測定した。図３からわかるように対照群であって美白剤として知られている合成物質のアルブチン(Arbutin)１００μｇ／ｍｌ処理時に３１％のメラニン生成抑制活性を示し、それぞれ１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ濃度までの処理時に、カナクギノキエタノール抽出物は、０．６％、７．９％、３１．６％、４５．８％の阻害活性を示した。また、それぞれの順次分画物などの１００μｇ／ｍｌ濃度において３３％、４９％、２４％、３１％、２８％と、対照群より高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として極めて卓越した結果を示した。したがって、本発明のカナクギノキエタノール抽出物および順次分画物は、メラニン生成を減らしながら細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９３】
実験例４：本発明のカナクギノキ抽出物および分画物のチロシナーゼ阻害活性測定
２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種して２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルに１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、および、１００μｇ／ｍｌの濃度で処理して３日間試料処理後、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ウェルの細胞を遠心分離して細胞沈殿物を作り、リシスバッファー(lysis buffer)(0.1M sodinm phosphate buffer，0.2mM PMSF，1% Triton X-100)を加えた。氷に放置して細胞を破壊して遠心分離した後、上層液を取って酵素活性測定に使用した。各試料を反応液(12.5mM L-Dopa，1.5mM L-Tyrosine，67mM sodium phosphate buffer(pH6.8))に入れて３７℃で１時間反応させた後、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【００９４】
カナクギノキエタノール抽出物および順次分画物処理後、最終メラニン量が阻害されたことは、メラニン合成に関与する酵素などの活性と関連があるということを示すので、Ｂ１６Ｆ１０細胞においてチロシナーゼ活性を、それぞれ１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌの様々な濃度で３日間処理した結果、図４のように対照群のアルブチン処理時に１９％のチロシナーゼ阻害活性を示し、カナクギノキエタノール抽出物および順次分画物のそれぞれ１２．５μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ濃度での処理時に、エタノール抽出物は１３．９％、１５．９％、３６．８％、４２．５％の高い阻害活性を示した。また、それぞれの分画物なども１００μｇ／ｍｌ濃度において４０％、２１％、１９％、４１％、２６％を示して、対照群より高いチロシナーゼ阻害活性を示した。このような結果から見る時、Ｂ１６Ｆ１０細胞株におけるカナクギノキエタノール抽出物および順次分画物などによるメラニン生成減少は、チロシナーゼ阻害活性によるものであることが主要な原因のうちの一つとして判断された。
【００９５】
実験例５：本発明のカナクギノキ由来シクロペンタジオン化合物のＭＴＴアッセイを用いた細胞毒性測定
１）ルシドン(Lucidone)（化合物１）
ルシドンとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して培養した後に、ＭＴＴ方法によって細胞の生存率を観察した。図２９からわかるように対照群の細胞生存率を１００％とした際に、コーヒー酸(caffeic acid)の１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌ濃度においてほとんど９６〜１０６％で、対照群に比べて僅かに減少するか増加した。このように対照群に比べて１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌの濃度などは、僅かの差があるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明のルシドンとして分離した単一物質は、細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９６】
２）メチルリンデロン(Methyllinderone)（化合物２）
メチルリンデロンとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して培養した後に、ＭＴＴ方法によって細胞の生存率を観察した。図３０からわかるように対照群の細胞生存率を１００％とした際に、コーヒー酸(caffeic acid)の１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌ濃度においてほとんど９３〜９９％で、対照群に比べて僅かに減少した。このように対照群に比べて１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌの濃度などは、僅かの差があるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明のメチルリンデロンとして分離した単一物質は、細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９７】
３）カナクギオール(Kanakugiol)（化合物３）
カナクギオールとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して培養した後に、ＭＴＴ方法によって細胞の生存率を観察した。図３１からわかるように対照群の細胞生存率を１００％とした際に、コーヒー酸の１．２５、２．５、５、１０μｇ／ｍｌの濃度においてほとんど９１〜９６％で、対照群に比べて僅かに減少した。このように対照群に比べて１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌの濃度などは、僅かの差があるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明のカナクギオールとして分離した単一物質は、細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【００９８】
実験例６：本発明のカナクギノキ由来シクロペンタジオン化合物のメラニン生成抑制効果測定
１）ルシドン(Lucidone)（化合物１）
ルシドンとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株に対するメラニン生成抑制効果を測定するために、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理した後、メラニン生成阻害活性を測定した。
その結果、図３２からわかるように、対照群であって美白剤として知られているアルブチン５０μｇ／ｍｌ処理時に２３．５％のメラニン生成抑制活性を示し、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度までの処理時にルシドンは、３％、１９％、３７％、５３％の高い阻害活性を示した。したがって、対照群であるアルブチンより高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として良い結果を示した。
【００９９】
２）メチルリンデロン(Methyllinderone)（化合物２）
メチルリンデロンとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株に対するメラニン生成抑制効果を測定するために、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理した後、メラニン生成阻害活性を測定した。
その結果、図３３からわかるように、対照群であって美白剤として知られているアルブチン５０μｇ／ｍｌ処理時に２３．５％のメラニン生成抑制活性を示し、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度までの処理時にメチルリンデロンは、１％、１４％、３８％、６２％の高い阻害活性を示した。したがって、対照群であるアルブチンより高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として良い結果を示した。
【０１００】
３）カナクギオール(Kanakugiol)（化合物３）
カナクギオールとして分離した単一物質を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株に対するメラニン生成抑制効果を測定するために、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および、１０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理した後、メラニン生成阻害活性を測定した。
その結果、図３４からわかるように、対照群であって美白剤として知られているアルブチン５０μｇ／ｍｌ処理時に２３．５％のメラニン生成抑制活性を示し、それぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度までの処理時にカナクギオールは、２％、１６％、２９％、６１％の高い阻害活性を示した。したがって、対照群であるアルブチンより高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として良い結果を示した。
【０１０１】
実験例７：本発明のカナクギノキ由来シクロペンタジオン化合物のチロシナーゼ阻害活性測定
Ｂ１６Ｆ１０細胞においてチロシナーゼ活性をそれぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの様々な濃度で３日間処理した結果、図３５のように、対照群のアルブチン処理時に１９％のチロシナーゼ阻害活性を示し、ルシドンのそれぞれ１．２５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの濃度による処理時に、１０％、１７％、２６．４％、４８．９％と、対照群より高いチロシナーゼ阻害活性を示した。このような結果から見る時、Ｂ１６Ｆ１０細胞株におけるカナクギノキより分離したルシドン単一化合物によるメラニン生成減少は、チロシナーゼ阻害活性によるものであることが主要な原因の一つとして判断された。
【０１０２】
実施例４：カナクギノキの葉と薄皮との抽出物の製造およびそれからの溶媒分画物の分離
本実施例において用いられた陸上植物試料のカナクギノキ(Lindera erythrocarpa)は、大韓民国の（財）済州ハイテク産業振興院抽出物銀行から分譲を受けて使用し、試料の抽出に用いられた溶媒は、Ｍｅｒｋ Ｃｏ．社の製品を使用した。
カナクギノキの生葉を流水で洗浄した後、３日間４０℃で熱風乾燥して粉砕機で粉砕した。乾燥粉末試料２００ｇを７０％エタノールに沈積させて３日間室温で２４時間撹拌して抽出し、この浸出物をろ過器でろ過した。浸出ろ過過程を３回再び繰り返した後、得られたろ過液を減圧濃縮した。得られた抽出物（７０％エタノール抽出物）６０ｇのうち、４２ｇを蒸溜水に懸濁して、分液ロートを用いてｎ−ヘキサン(n-Hex)、塩化メチレン(CH2Cl2)、エチルアセテート(EtOAc)、ｎ−ブタノール(n-BuOH)を使用して分画した後、ろ過、減圧濃縮して、それぞれ溶媒別の分画物ｎ−ヘキサン８．５６ｇ、塩化メチレン１．４７ｇ、エチルアセテート４．１４ｇ、ｎ−ブタノール１０．２ｇ、水１４．５８ｇを得た。
一方、カナクギノキの薄皮も葉と同様な方法によって乾燥した後、粉砕し、乾燥粉末試料５６０ｇを用いて同様な条件で抽出して得た７０％エタノール抽出物６８．２ｇを用いて極性別の溶媒分画を行い、それぞれの分画物を得た。
【０１０３】
実施例５：カナクギノキ溶媒分画物から化合物の分離および構造の同定
本実施例の分離過程で使用された充填剤としては、順相シリカゲル６０(normal-phase silica gel 60)(0.063-0.200mm，Merck Co.)が用いられた。分析過程で使用した機器としては、ＨＰＬＣ(Alliance2695，Waters Co.)を用い、ＸＴｅｒｒａ（登録商標） Ｃ１８ ３．５μｍ ４．６×１００ｍｍを装着して使用し、分析に使用した検出器としては、Ｗａｔｅｒｓ社の２９９８モデルのＰＤＡを用いた。実験に使用した溶媒および試薬としては、ＨＰＬＣ ｇｒａｄｅを用い、構造分析に使用した機器としては、ＮＭＲ(Nuclear Magnetic Resonance)はＢｕｒｋｅｒ(German Co.)のＪＮＭ−ＬＡ５００を用い、ＮＭＲ測定時に使用した溶媒としては、メタノール−ｄ４、クロロホルム−ｄ１を用いた。
【０１０４】
前記の実施例４で得たカナクギノキの葉の塩化メチレン分画層（２．５ｇ）に対して順相シリカゲル（ヘキサン／エチルアセテート）（ｖ／ｖ）、溶媒グラジエント(gradient)条件で分画することによって、１０個の分画を得た。そのうち、分画−６から再結晶法を用いて化合物１０（２１．８ｍｇ）を得た。
一方、前記実施例４で得たカナクギノキの薄皮の塩化メチレン分画層（７．０ｇ）に対して順相シリカゲル（ヘキサン／エチルアセテート）（ｖ／ｖ）、溶媒グラジエント条件で分画することによって、８個の分画を得た。前記分画のうち、分画−２を用いて順相シリカゲル（ヘキサン／エチルアセテート）（３／２）条件でクロマトグラフィーを行い、そのうち、分画−２−２から化合物１２（５９．６ｍｇ）を得、分画−２−３から化合物１１を得た。
【０１０５】
前記のように得られた化合物１０〜１２に対してＨＰＬＣ、ＮＭＲ、（１Ｄ、２Ｄ ＮＭＲ）、ＬＲ／ＨＲ ＦＡＢ−ＭＳを介して化合物分析および構造確認を行い、ＨＰＬＣを用いて化合物の純度およびエタノール抽出物内の含有量を確認した。
その結果、化合物１０はシクロペンタジオン(cyclopentadione)系列のルシドン(lucidone)と同定され、化合物１１は同じ系列のメチルリンデロン(methyllinderone)、化合物１２は下記化学式１０のシクロペンタジオン(cyclopentadione)系列から変形された誘導体化合物である、現在まで報告されたことのない新規化合物（Ｎ２）と同定された。前記新規化合物のＩＵＰＡＣ名は、２，３，４，５−テトラメトキシ−６−(１−メトキシ−３−フェニルプロピル)フェノール[2,3,4,5-tetramethoxy-6-(1-methoxy-3-phenylpropyl)phenol]であり、一般名は、チェジュ−ポリメトキシフェノール(jeju-polymethoxy-phenol)と命名した。化合物１２の１Ｄおよび２Ｄ ＮＭＲデータを下記の表３に示した。
【０１０６】
【化２２】
【０１０７】
化合物の特性
１）ＩＵＰＡＣ名：２，３，４，５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｏｘｙ−６−（１−ｍｅｔｈｏｘｙ−３−ｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｏｌ
２）色：濃い緑色
３）香り：弱い腐敗性の臭い
４）溶解性：メタノール、アセトン、クロロホルムなどの有機溶媒
５）カナクギノキの薄皮のみに分布
６）一般名：ｊｅｊｕ−ｐｏｌｙｍｅｔｈｏｘｙ−ｐｈｅｎｏｌ
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
カナクギノキの葉および薄皮のエタノール抽出物と各溶媒別の分画物並びに化学式１０の化合物の収率を下記の表４に示した。
【０１１０】
【表４】
【０１１１】
前記の表４を介してわかるように、化学式１０の化合物は、葉では発見されなかったが、薄皮において０．７１％と高く観察された。
【０１１２】
前記カナクギノキより分離した単一化合物は、ＤＭＳＯ溶媒を加えて完全に溶解させた後、ろ過して以後の実験に使用した。
【０１１３】
実験例８：本発明の化学式１０の化合物のＭＴＴアッセイを用いた細胞毒性測定
現在、知られていない新規化合物を用いてＢ１６Ｆ１０細胞株の細胞生存率に及ぼす影響を調べてみるために、下記のような実験を行った。
本実験例に使用されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞は、米国細胞株銀行(ATCC)から分譲を受けた。Ｂ１６Ｆ１０細胞を１０％ウシ胎児血清(FBS，Gibco)、１％抗生剤(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)、Ｌ−グルタミンと炭酸水素ナトリウムが含有されたＤＭＥＭ培地(Gibco)を使用して３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した。
Ｂ１６Ｆ１０細胞を２４ウェルプレートにウェル当り２×１０４個の細胞を接種して２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルにて５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および、３０μｇ／ｍｌまでの様々な濃度で３日間処理して７２時間培養した。それに２ｍｇ／ｍｌの濃度で製造したＭＴＴ溶液２００μｌを添加して同様な培養条件で４時間培養して培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェル当りＤＭＳＯ ２００μｌを加えてＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて５７０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１４】
その結果、図３６からわかるように、対照群の細胞生存率を１００％とした際に、化学式１０の化合物は、５、１０、２０、３０μｇ／ｍｌの濃度においてほとんど９７〜１０３％と、対照群に比べて僅かに減少させるか増加させた。このように対照群に比べて５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、および、３０μｇ／ｍｌの濃度などでは、僅かの差はあるが留意するほどの変化を示さなかったので、本発明の化学式１０の化合物は、細胞毒性が低く、美白剤として使用され得ることが確認できた。
【０１１５】
実験例９：本発明の化学式１０の化合物のメラニン生成阻害活性測定
２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０４個のＢ１６Ｆ１０細胞を接種して２４時間の間３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した後、試料をそれぞれのウェルにて処理して３日間試料処理後、培地を除去して細胞をＰＢＳで２回洗浄した。各ウェル当たり５００μｌの１Ｎ ＮａＯＨを加えて５６℃で３０分溶解した後、ＥＬＩＳＡ ｒｅａｄｅｒ(μQuant，USA)を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１１６】
その結果、図３７からわかるように、対照群であって美白剤として知られているアルブチン５０μｇ／ｍｌ処理時には３３．６％のメラニン生成抑制活性を示し、本発明の新規化合物は、それぞれ５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌの濃度までによる処理時に、１９％、３２％、５１％、５９％の高い阻害活性を示した。したがって、対照群であるアルブチンより約２倍さらに高いメラニン阻害活性を示し、天然植物における美白剤として良い結果を示した。
【０１１７】
実験例１０：本発明の化学式１０の化合物のメラニン生成に関与するｍＲＮＡ発現阻害活性測定
本実験例に使用されたＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞は、米国細胞株銀行(ATCC)から分譲を受けた。Ｂ１６Ｆ１０細胞を１０％ウシ胎児血清(FBS，Gibco)、１％抗生剤(Antibiotic-Antimycotic)(Gibco)、Ｌ−グルタミンと炭酸水素ナトリウムを含有するＤＭＥＭ培地(Gibco)を使用して３７℃、５％ＣＯ２細胞培養器で培養した。
培養が済んだ細胞を２〜３回ＰＢＳで洗浄した後、総ＲＮＡ(total RNA)抽出は、ＴＲＩｚｏｌ−ｒｅａｇｅｎｔ(Invitrogen，USA)を用いて分離した。細胞にＴＲＩｚｏｌ−ｒｅａｇｅｎｔを添加して均質化した後、クロロホルムを添加して遠心分離(12,000rpm，15min)した。上澄液に同量のイソプロパノールを添加して遠心分離(12,000rpm，10min)してＲＮＡを沈殿させて７５％のジエチルピロカルボネート(diethylpyrocarbonate，DEPC)処理されたエタノールで洗浄した後、乾燥させてＤＥＰＣ処理された蒸溜水に溶かした。２６０ｎｍの吸光度を測定してＲＮＡを定量し、Ａ２６０／Ａ２８０ｎｍの比率が１．６〜１．９の範囲内の値を有するＲＮＡを実験に使用した。ｃＤＮＡ合成は、Ｉｍｐｒｏｍ−IIＴＭ ｃＤＮＡ ｋｉｔ(Promega，USA)を用い、１μｇの総ＲＮＡ(total RNA)をオリゴ（ｄＴ）プライマー(oligo (dT) primer)、ｄＮＴＰ（０．５μＭ）、１ｕｎｉｔ ＲＮａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、および、Ｉｍｐｒｏｍ−IIＴＭ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２Ｕ）で２５℃で５分、３７℃で６０分、そして、７０℃で１０分間ヒーティングすることによって反応を中止させた。重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction，PCR)は、合成されたｃＤＮＡからチロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、β−アクチンを増幅させるために、１μｌのｃＤＮＡ、４μＭの５’と３’ｐｒｉｍｅｒ、１０×ｂｕｆｆｅｒ (10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，0.1% Triton X-100)、２５０μＭのｄＮＴＰ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｕｎｉｔ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(Promega，USA)を混ぜて、３次蒸溜水で最終２５μｌに合わせた後、パーキンエルマーサーマルサイクラー(Perkin-Elmer Thermal Cycler)を用いて行った。この時、ＰＣＲの条件は、９４℃／３０秒、５０〜５５℃／４５秒、７２℃／４５秒で２０〜２５回であり、ＰＣＲによって生成された産物は１．２％アガロースゲル(agarose gel)で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド(ethidium bromide)で染色して特定バンド(band)を確認した。
メラニン細胞は、紫外線によって角質形成細胞などから生成されたＮＯがｃＧＭＰ経路を通じてメラニン生成を増加させ、チロシナーゼとＴＲＰ−１を増加させ、チロシナーゼ活性のｍＲＮＡ発現を誘導する過程に関与することが知られている。Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞において毒性を見せない濃度でカナクギノキから分離した単一化合物などのメラニン抑制効果がｍＲＮＡ発現抑制によるものであるかを確認するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。メラニン生成の主要な酵素として知られているチロシナーゼ以外のＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２遺伝子の発現抑制の様相を確認した。
【０１１８】
その結果、図３８からわかるように、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１ ｍＲＮＡの発現量が濃度依存的に減少することが示された。通常のメラニン合成過程でＴＲＰ−２は、ドパクロム(dopachrome)をカルボキシル化誘導体(carboxylated derivative)である５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)に転換させる機能を有すると報告されているが、ＴＲＰ−２ ｍＲＮＡ遺伝子の発現を確認した結果、ＴＲＰ−２ ｍＲＮＡ発現は濃度に関係なく一定であった。
したがって、カナクギノキから分離した新規化合物は、ＴＲＰ−２と関係なく、チロシナーゼとＴＲＰ−１のｍＲＮＡ発現を減少させることによって、メラニン合成を阻害することが確認された（図３８）。以上の結果からカナクギノキから分離した新規化合物がＢ１６Ｆ１０黒種細胞に対して優れたメラニン色素生成抑制およびチロシナーゼ抑制効果を有しているものとして確認され、これより美白関連機能性素材としての活用価値のあることが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
以上、前記実施例および実験例を介して説明したように、本発明のカナクギノキ由来抽出物、分画物または、化合物を含有する皮膚美白用組成物は、シクロペンタジオン化合物または、その誘導体を有効成分として含有することによって、優れたメラニン生成阻害活性およびチロシナーゼ阻害活性を表するので、化粧品、製薬および食品産業に有用に使用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カナクギノキ(Lindera erythrocarpa)抽出物または、その溶媒分画物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物。
【請求項２】
前記のカナクギノキ抽出物は、エタノール抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項３】
前記の溶媒分画物は、ヘキサン分画物、塩化メチレン分画物、エチルアセテート分画物、ブタノール分画物、水分画物、または、その組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項４】
下記の化学式１〜化学式１０で表される化合物よりなる群から選択される１種以上の化合物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【請求項５】
前記の化合物は、カナクギノキから分離精製されたことを特徴とする請求項４に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項６】
前記の皮膚美白用組成物は、化粧料組成物であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項７】
前記の皮膚美白用組成物は、薬剤学的組成物であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項８】
前記の皮膚美白用組成物は、食品組成物であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項９】
下記の化学式１０で表される化合物：
【化１１】
【請求項１０】
前記化学式１０の化合物は、カナクギノキから分離したものであることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記化学式１０の化合物は、カナクギノキの薄皮から分離したものであることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
カナクギノキを水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコールまたは、それらの混合溶媒から選択された溶媒で抽出してカナクギノキ抽出物を得る段階；
前記のカナクギノキ抽出物をヘキサン、塩化メチレン、エチルアセテートおよびブタノールで分画して各溶媒分画物を得る段階；
前記のカナクギノキ溶媒分画物を、溶出溶媒としてヘキサンとエチルアセテートを溶媒グラジエントにて使用して、１次シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って分画する段階；および
前記の１次シリカゲルカラムクロマトグラフィー分画物を、溶出溶媒としてヘキサンとエチルアセテートの混合溶媒を使用して、２次シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行う段階を含む、カナクギノキから請求項９項の化合物を分離する方法。
【請求項１３】
前記のカナクギノキは、カナクギノキの薄皮部分であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１】
カナクギノキ(Lindera erythrocarpa)抽出物または、その溶媒分画物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物。
【請求項２】
前記のカナクギノキ抽出物は、エタノール抽出物であることを特徴とする請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項３】
前記の溶媒分画物は、ヘキサン分画物、塩化メチレン分画物、エチルアセテート分画物、ブタノール分画物、水分画物、または、その組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項４】
下記の化学式１〜化学式１０で表される化合物よりなる群から選択される１種以上の化合物を有効成分として含有する皮膚美白用組成物：
【化１】
【化２】
【化３】
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【請求項５】
前記の化合物は、カナクギノキから分離精製されたことを特徴とする請求項４に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項６】
前記の皮膚美白用組成物は、化粧料組成物であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項７】
前記の皮膚美白用組成物は、薬剤学的組成物であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項８】
前記の皮膚美白用組成物は、食品組成物であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物。
【請求項９】
下記の化学式１０で表される化合物：
【化１１】
【請求項１０】
前記化学式１０の化合物は、カナクギノキから分離したものであることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記化学式１０の化合物は、カナクギノキの薄皮から分離したものであることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１２】
カナクギノキを水、Ｃ１〜Ｃ４の低級アルコールまたは、それらの混合溶媒から選択された溶媒で抽出してカナクギノキ抽出物を得る段階；
前記のカナクギノキ抽出物をヘキサン、塩化メチレン、エチルアセテートおよびブタノールで分画して各溶媒分画物を得る段階；
前記のカナクギノキ溶媒分画物を、溶出溶媒としてヘキサンとエチルアセテートを溶媒グラジエントにて使用して、１次シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って分画する段階；および
前記の１次シリカゲルカラムクロマトグラフィー分画物を、溶出溶媒としてヘキサンとエチルアセテートの混合溶媒を使用して、２次シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行う段階を含む、カナクギノキから請求項９項の化合物を分離する方法。
【請求項１３】
前記のカナクギノキは、カナクギノキの薄皮部分であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【公表番号】特表２０１２−５０２０２２（Ｐ２０１２−５０２０２２Ａ）
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２５９８１（Ｐ２０１１−５２５９８１）
【出願日】平成２１年９月４日（２００９．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００５０２７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２７２２１
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５１１０５８２１３）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月４日（２００９．９．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００５０２７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２７２２１
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５１１０５８２１３）
【Ｆターム（参考）】
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