核酸と蛋白質の相互作用の検出方法及び装置
【課題】蛍光分子による試料の標識や金属薄膜上への試料の固着を要することなく、核酸と蛋白質の相互作用を容易にかつ高感度で検出する。
【解決手段】試料Ｓ中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を光学的に検出する。具体的には、試料Ｓに対して励起光Ｌｅを照射するとともに、この励起光Ｌｅの照射により試料Ｓ内に生ずる光熱効果を測定するための測定光Ｌ２を照射する。この測定光Ｌ２の位相変化から、励起光Ｌｅによる試料Ｓの光熱効果を測定し、その測定信号の時間変化に基づいて核酸と蛋白質相互作用の発生の有無を判断する。
【解決手段】試料Ｓ中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を光学的に検出する。具体的には、試料Ｓに対して励起光Ｌｅを照射するとともに、この励起光Ｌｅの照射により試料Ｓ内に生ずる光熱効果を測定するための測定光Ｌ２を照射する。この測定光Ｌ２の位相変化から、励起光Ｌｅによる試料Ｓの光熱効果を測定し、その測定信号の時間変化に基づいて核酸と蛋白質相互作用の発生の有無を判断する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば癌マーカー蛋白の検出や転写因子探索等を目的として、試料中における核酸とそのリガンド蛋白質との相互作用の有無を検出するための技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、前記のような核酸と蛋白質との相互作用を検出するための方法として、下記特許文献１に記載されるようないわゆる蛍光法が知られている。この方法は、核酸と蛋白質の双方を互いに異なる蛍光色素で標識し、これらの蛍光色素が互いに作用して蛍光を変化させ得るようにした上で、その実際の変化の有無を測定することにより前記核酸と蛋白質の相互作用を検出するようにしたものである。
【特許文献１】特開２００４−１６１３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前記の蛍光法では、前記蛍光分子によって核酸及び蛋白質を特異的に染色するために数段階の前処理工程が必要である。従って、実際の測定工程に至るまでに多大な手間を要する。また、蛍光分子が活性部位に与える影響も懸念される。
【０００４】
なお、前記蛍光分子等による標識が不要な分子間相互作用検出方法として、ＳＰＲ（表面局在プラズモン共鳴）センサを用いる方法が考えられる。この方法は、基板上に形成された金属薄膜上に試料を固相結合し、この試料に所定のレーザ光を入射したときの前記試料の吸着度合いをＳＰＲセンサによって検出するものである。
【０００５】
しかしながら、この方法を前記核酸−蛋白質相互作用の検出に利用することは実用上困難である。すなわち、この方法では、前記金属薄膜の膜厚についてナノメートルオーダーでの制御が求められるとともに、その薄膜表面にアナライトと呼ばれる目的分子捕獲用の分子（例えば抗原に対する抗体）を吸着させる必要があり、このような事情から、再現性の高い基板を作成することはきわめて困難である。特に、機能性分子については、基板表面付近に活性部位を置いての計測となるため、当該活性部位が基板の影響を受ける可能性は否定できない。
【０００６】
本発明は、このような事情に鑑み、蛍光分子による試料の標識や金属薄膜上への試料の固着を要することなく、核酸と蛋白質の相互作用を容易にかつ高感度で検出することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決するための手段として、前記核酸及び蛋白質を含む試料の光熱効果、すなわち、当該試料に所定の励起光を入射した時にこの励起光を前記試料が吸収して発熱する効果に着目し、この光熱効果と、試料中での核酸と蛋白質との相互作用の有無との間に著しい相関関係があることを見出した。具体的に、前記光熱効果は一般に時間が経過するに従って減少するのであるが、核酸と蛋白質との相互作用が生じている試料では少なくとも光熱効果の立上り直後において前記光熱効果の時間減少がほとんどないことを見出した。これは、前記核酸の断片の構造がリガンド蛋白質との相互作用によって安定化することによるものであると推察される。
【０００８】
本発明は、このような点に着目してなされたものであり、試料中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を検出するための方法であって、前記試料に対して励起光を照射するステップと、前記励起光の照射により前記試料内に生ずる光熱効果を測定するステップと、前記光熱効果の時間変化に基づいて核酸と蛋白質相互作用の発生の有無を判断するステップとを含むものである。
【０００９】
また本発明は、試料中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を検出するための装置であって、前記試料を収容する試料収容部と、前記試料収容部に収容された試料に対して励起光を照射する励起光照射系と、前記励起光の照射により前記試料内に生ずる光熱効果の測定信号を生成する測定装置とを含み、この測定装置は、前記測定信号の時間変化に関するデータを作成し、その作成したデータに基づいて前記相互作用の有無を判断する信号処理装置を含むものである。
【００１０】
以上の構成によれば、前記試料に励起光を照射してそのときの光熱効果を測定し、その光熱効果の時間変化を監視することにより、前記試料中での核酸と蛋白質の相互作用の発生の有無を的確に判断することができる。従って、試料中の核酸及び蛋白質の標識や金属薄膜への試料の固着を要することなく、前記相互作用の有無を容易にかつ高感度で検出することができる。また、前記検出装置では、前記信号処理装置が前記相互作用の有無の判断に有用なデータを作成してそのデータに基づいて相互作用の有無を自動的に判断する。
【００１１】
前記検出方法は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる機能性高分子（いわゆるアプタマー）と、そのリガンド蛋白質との相互作用の有無を検出するのに好適である。
【００１２】
また、前記検出方法において前記光熱効果を測定するステップとしては、前記試料に前記励起光とは別の測定光を透過させてこの透過した測定光の位相変化を測定する操作を含むものが、好適である。同様に、前記検出装置における測定装置は、前記試料に前記励起光とは別の測定光を透過させてこの透過した測定光の位相変化を測定するものが、好適である。前記試料が光熱効果により発熱すると、当該試料での光の屈折率が変化するので、この試料に測定光を透過させてその位相変化を測定することにより、前記試料の光熱効果を容易にかつ的確に把握することができる。
【００１３】
この場合、前記測定装置は、測定用光源と、この測定用光源から発せられる測定光を前記試料収容部に収容された試料に透過させ、この透過した測定光と参照光とを干渉させる光学系と、その干渉した光の強度を検出する光検出器とを含むものが、好適である。
【００１４】
この測定装置によれば、前記測定光と参照光とを干渉させてその干渉光の強度を検出するだけの簡単な構成で、前記試料を透過する測定光の位相変化を容易に計測することができる。
【００１５】
一方、前記試料収容部は、前記試料を収容する試料収容器と、この試料収容器内の試料を前記核酸と蛋白質の反応温度に調節する温度調節機構と、その加熱された試料を前記励起光の照射位置まで移送する移送手段とを含むものが、好ましい。
【００１６】
この構成によれば、前記試料収容器内で、前記試料中における核酸と蛋白質との反応（相互作用）を行わせ、かつ、そのまま当該試料に対して励起光の照射を行うことができる。
【００１７】
より具体的に、前記移送手段としては、前記試料収容器を、この試料収容器内に前記試料を注入するための注入位置と、その注入された試料の温度を前記温度調節機構により調節するための温度調節位置と、前記励起光の照射位置の順に移送するものが、好適である。
【００１８】
また、前記試料収容器が、前記試料を流すための流路を有し、この流路は、その上流側から順に、前記核酸及び前記蛋白質がそれぞれ導入される導入部と、その導入された核酸と蛋白質とを合流させて混合する混合部と、その混合液の温度を前記温度調節機構により調節して前記反応を行わせるための反応部と、前記励起光が照射される励起光照射部とを有するものであってもよい。この構成によれば、前記試料収容部内で前記試料の移送を行うことができる。
【００１９】
また、前記励起光照射部が、その試料の流れ方向に並ぶ複数の位置に前記励起光が照射されるものであれば、その各位置で光熱効果を測定することによって、当該光熱効果の時間変化を適正に検出することができる。
【発明の効果】
【００２０】
以上のように、本発明によれば、試料に励起光を照射して当該試料における光熱効果を測定するだけで、当該光熱効果の時間変化に基づいて前記試料における核酸−蛋白質相互作用の有無を容易にかつ高感度で検出することができる効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の第１の実施の形態を、図１〜図５を参照しながら説明する。
【００２２】
図１は、この実施の形態に係る検出装置の全体構成を示したものである。図示の検出装置は、励起光照射系（以下、単に「励起系」と称する。）１０と、測定系（測定装置）２０と、試料収容部４０とを備える。そして、この試料収容部４０に後述の試料が収容される。
【００２３】
前記励起系１０は、前記試料収容部４０の所定位置に収容される試料に励起光を照射するためのものであり、励起光源１２と、分光機構１４と、変調器構１６と、ダイクロイックミラー１７と、集光レンズ１８とを備える。
【００２４】
前記励起光源１２としては、例えば白色光を出力するキセノンランプや紫外光を出力する水銀ランプが好適である。この励起光源１２から発せられる光は前記分光機構１４で分光され、前記変調機構１６で周期的に変調されて測定に好適な励起光Ｌｅとなる。
【００２５】
前記ダイクロイックミラー１７は、前記測定系２０と前記試料収容部４０との間に位置し、後述のように前記測定系２０から送られてくる測定光はそのまま透過させる一方、前記励起光源１２から送られてくる励起光Ｌｅを９０°反射させて前記測定光と同軸で前記試料収容器４０側に導く。前記集光レンズ１８は、前記ダイクロイックミラー１７で反射した後の励起光Ｌｅを特定領域内に集光して前記試料収容部４０に収容された試料に照射する。この励起光を前記試料が吸収して発熱することにより、その温度変化分だけ当該試料の屈折率が変化する。
【００２６】
前記測定系２０は、前記試料の屈折率を測定するための測定光Ｌ２を当該試料に照射し、かつ、その測定光の位相変化によって前記屈折率を測定するものである。この実施の形態では、前記測定系２０は、測定光源２２と必要な光学系、さらには光検出器３６及び信号処理装置３８を備えている。
【００２７】
前記測定光源２２は、例えば出力１ｍＷのＨｅ−Ｎｅレーザ発生器からなり、この測定光源２２から照射される測定光は、図１に示されるように、λ／２波長板２３で偏光面の調節を受けた後、偏光ビームスプリッタ２４によって、互いに直交する２つの偏光、すなわち、参照光Ｌ１と測定光Ｌ２とに分光される。
【００２８】
前記参照光Ｌ１は、音響光学変調器２５Ａによって光周波数のシフト（周波数変換）を受けた後、ミラー２６Ａで反射して偏光ビームスプリッタ２８に入力される。また、前記測定光Ｌ２は、音響光学変調器２５Ｂによって光周波数のシフト（周波数変換）を受けた後、ミラー２６Ｂで反射して前記偏光ビームスプリッタ２８に入力され、このスプリッタ２８で前記参照光Ｌ１と合成される。
【００２９】
前記参照光Ｌ１は、前記偏向ビームスプリッタ３０をそのまま透過してミラー３４で１８０°反射することにより前記偏光ビームスプリッタ３０に戻る。このとき、前記偏光ビームスプリッタ３０と前記ミラー３４との間には１／４波長板３３が介在していてこの１／４波長板３３を前記測定光Ｌ２が往復で通過するため、この参照光Ｌ１の偏光面は９０°回転する。従って、前記偏光ビームスプリッタ３０に戻った参照光Ｌ１は前記試料収容部４０と反対の側に９０°反射する。この参照光Ｌ１は、偏光板３５を通じて光検出器３６に入力される。
【００３０】
一方、前記測定光Ｌ２は、前記偏光ビームスプリッタ３０で前記試料収容部４０側に９０°反射され、１／４波長板３２、前記ダイクロイックミラー１７、及び前記集光レンズ１８を通じて試料収容部４０へ導かれる。この測定光Ｌ２は後述のように試料に入射され、さらに１８０°反射して、前記１／４波長板３２を通じて前記偏光ビームスプリッタ３０に戻る。この測定光Ｌ２は、前記１／４波長板３２の往復透過によってその偏光面が９０°回転した状態にあるので、今度は当該偏光ビームスプリッタ３０をそのまま透過して前記参照光Ｌ１と合流し、前記偏光板３５および前記光検出器３６へ向かう。
【００３１】
前記偏光板３５では、前記参照光Ｌ１と前記測定光Ｌ２とが互いに干渉し、その干渉光の光強度が前記光検出器３６によって電気信号（測定信号）に変換される。
【００３２】
前記信号処理装置３８は、前記測定信号を特定のサンプリング周期をおいてサンプリングし、その測定信号に基づいて前記測定光Ｌ２（測定光）の位相変化を演算する。さらに、この信号処理装置３８は、前記位相変化の時間的変化に関するデータを作成し、かつ、後述のように、当該データに基づいて前記試料Ｓ内における相互作用の有無を自動的に判断する。
【００３３】
ここで、前記干渉光強度Ｓ１は、次の（１）式で表される。
【００３４】
Ｓ１＝Ｃ１＋Ｃ２・ｃｏｓ（２π・ｆｂ・ｔ＋φ） …（１）
同式において、Ｃ１、Ｃ２は前記偏光ビームスプリッタ等の光学系や試料Ｓの透過率により定まる定数、φは前記参照光Ｌ１と前記測定光Ｌ２の光路長差による位相差、ｆｂは前記参照光Ｌ１と前記測定光Ｌ２の周波数差である。この（１）式より、前記干渉光強度Ｓ１の変化（前記励起光を照射しない或いはその光強度が小さいときとその光強度が大きいときとの差）から、前記位相差φの変化が求まることがわかる。前記信号処理装置３８は、（１）式に基づいて前記位相差φの変化を算出する。
【００３５】
なお、前記励起光Ｌｅの強度が例えばチョッパの回転により周波数ｆで周期的に強度変調されていると、試料Ｓの屈折率も前記周波数ｆで変化し、測定光Ｌ２の光路長も前記周波数ｆで変化し（参照光Ｌ１の光路長は一定）、前記位相差φも周波数ｆで変化する。従って、前記位相差φの変化を前記周波数ｆの成分（前記励起信号の強度変調周期と同周期成分）について測定（算出）すれば、周波数ｆの成分を有しないノイズの影響を除去しつつ試料Ｓの屈折率変化のみを測定することが可能である。この測定は、前記位相差φの測定のＳ／Ｎ比を向上させる。
【００３６】
また、前記励起光源１２にレーザダイオードやＬＥＤなどが用いられる場合、その励起光源１２の電源を電気回路でコントロールすることにより前記変調を行うことも可能である。
【００３７】
前記試料収容部４０は、図２に示すように、基台４１と、試料収容器であるマイクロアレイ４２と、移送手段であるマニピュレータ４４とを備え、前記基台４１上には、自動分注装置４６、ヒータ４７、及びミラー４８が設置されている。
【００３８】
前記マイクロアレイ４２は、前記自動分注装置４６から分注される試料を収容するものであり、図２〜図４に示すような平坦な基板により構成される。このマイクロアレイ４２の上面部には、縦横に並ぶ複数（図４（ａ）に示す例では５×５＝２５個）の試料収容凹部４２ａが形成され、各試料収容凹部４２ａ内に図４（ｂ）に示すような試料Ｓが分注される。本発明では試料収容器の具体的な材質を問わないが、この実施の形態に係るマイクロアレイ４２は、前記励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２を透過させる材質を有する必要がある。具体的には、合成石英、石英、ＰＤＭＳなどが好適である。
【００３９】
前記マニピュレータ４４は、前記マイクロアレイ４２の外形に対応する形状の窓４４ａを有し、この窓４４ａ内に前記マイクロアレイ４２が嵌まり込んだ状態で同アレイ４２を保持する。換言すれば、このマイクロアレイ４２を上下に開放した状態で同アレイ４２を四方外側から保持する。
【００４０】
前記自動分注装置４６は、前記基台４１上に立設され、前記試料Ｓを適量（すなわち前記各試料収容凹部４２ａを満たす量）だけ滴下する。
【００４１】
前記ミラー４８は、前記自動分注装置４６から水平方向に離れた位置で前記基台４１上に設置され、前記測定系２０から下向きに導入される測定光Ｌ２を上向きに１８０°反射させる。
【００４２】
前記ヒータ４７は、本発明の温度調節機構を構成するもので、前記ミラー４８のすぐ上に配設され、このヒータ４７上に移送されるマイクロアレイ４２を所定温度まで加熱する。この加熱温度は、前記試料Ｓにおける核酸と蛋白質との相互作用を促進させる温度（反応温度）に設定されている。このヒータ４７において前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２が照射される位置には切欠部４７ａが形成され、この切欠部４７ａにおいて前記ミラー４８が上方に開放されている。
【００４３】
なお、本発明に係る温度調節機構は、前記ヒータ４７に限らない。逆に試料の温度を低下させる冷却器も含まれ得る。
【００４４】
前記マニピュレータ４４は、前記自動分注装置４６による分注位置、前記ヒータ４７上の加熱位置、及び前記ミラー４８上の励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２の照射位置の順に前記マイクロアレイ４２を搬送する。
【００４５】
次に、この検出装置の作用を説明する。
【００４６】
前記試料収容部４０では、マイクロアレイ４２を保持するマニピュレータ４４が同アレイ４２をまず分注位置に移送する。そして、前記マイクロアレイ４２の各試料収容凹部４２ａが順に前記自動分注装置４６の直下に位置するように同アレイ４２を走査する。これらの分注位置で、前記自動分注装置４６から各試料収容凹部４２ａ内に試料Ｓが分注される。
【００４７】
全ての試料収容凹部４２ａへの試料Ｓの分注が完了した後、前記マニピュレータ４４は前記マイクロアレイ４２を前記ヒータ４７上の加熱位置へ移送する。この加熱位置は、前記マイクロアレイ４２が前記ヒータ４７に直接接触する位置であってもよいし、当該ヒータ４７から若干離間する位置であってもよい。この加熱位置に前記マイクロアレイ４２が所定時間保持されることにより、各試料収容凹部４２ａ内の試料Ｓにおける反応（核酸と蛋白質との相互作用）が促される。
【００４８】
その後、前記マニピュレータ４４は、前記マイクロアレイ４２を図４（ｂ）に示すような前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２の照射位置（前記ヒータ４７の切欠部４７ａに対応する位置であって前記ミラー４８の直上位置）へ移送する。そして、前記マイクロアレイ４２の各試料収容凹部４２ａ内の試料Ｓに対して順に前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２が照射されるように、前記マイクロアレイ４２を走査する。
【００４９】
この照射位置では、前記励起系１０から前記試料収容部４０に導かれる励起光Ｌｅが前記試料Ｓに入射され、透過する。このとき、試料Ｓが前記励起光Ｌｅを吸収して発熱する（光熱効果）。一方、前記測定系２０から試料収容部４０に導入される測定光Ｌ２は、前記励起光Ｌｅと同軸で前記各試料収容凹部４２ａに入射され、その凹部４２ａ内の試料Ｓを透過する。さらに、この測定光Ｌ２はミラー４８で上向きに反射して前記試料Ｓをさらに透過する。このとき、前記光熱効果による発熱の量に応じて前記試料Ｓでの屈折率が変わり、該屈折率に応じて前記位相差φが変わっているので、当該発熱の量に応じて前記測定系２０に戻る測定光Ｌ２とこの測定系２０における前記参照光Ｌ１との干渉光強度が変わる。この干渉光強度に対応する測定信号が前記測定系２０の光検出器３６により生成され、信号処理装置３８に入力される。
【００５０】
この信号処理装置３８は、前記測定信号を所定のサンプリング周期で取り込み、この測定信号の時間変化を示すデータ、例えば図５に示すように経過時間と信号強度との関係を示すグラフを作成する。ここで、前記試料Ｓ中で核酸と蛋白質との相互作用が生じていない場合は、時間経過とともに前記信号強度が低下していくのに対し、前記相互作用が生じていると時間経過にかかわらず信号強度はほぼ一定値を維持する。そこで、この信号処理装置３８は、前記信号強度の時間減衰率を求め、その時間減衰率が一定以下の場合に前記相互作用が存在していると判断する。
【００５１】
この時間減衰率は、前記グラフに基づいて測定者が判定することも可能であるが、この実施の形態では前記信号処理装置３８が自動的に前記時間減衰率を演算して前記相互作用の有無を判定する。その具体例としては、前記信号処理装置３８がサンプリング周期毎に取り込んだ信号強度に基づいて当該信号強度の時間変化を表す直線近似式を演算し、その直線の傾きが一定以下の場合に前記相互作用が生じていると判断することが考えられる。また、前記直線近似式からの各サンプリング信号のばらつきが過度に大きい場合に測定不良と判断するようにしてもよい。
【００５２】
このような方法及び装置によれば、前記試料Ｓにおける核酸及び蛋白質の標識や、金属薄膜への前記試料Ｓの固着を行うことなく、当該試料Ｓにおける核酸−蛋白質相互作用の有無を検出することができる。
【００５３】
次に、第２の実施の形態を図６及び図７を参照しながら説明する。なお、装置全体の構成は前記図１に示したものと同等であるので、ここでは省略する。
【００５４】
この第２の実施の形態では、前記第１の実施の形態のように試料収容器であるマイクロアレイ４２そのものを移送する手段に代え、図６に示されるように試料を特定方向に流すための流路６０をもったマイクロリアクタ５０が使用される。すなわち、このマイクロリアクタ５０は、試料収容器としての役割と、試料を移送方向に案内する手段としての役割を兼ねる。
【００５５】
このマイクロリアクタ５０は、下側基板５２と、その上に重ねられる上側基板５４とを備える。これらの基板５２，５４は、前記マイクロアレイ４２と同様に前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２を透過する材料により形成されている。
【００５６】
前記流路６０は、前記下側基板５２の上面部に形成された溝により構成されている。そして、この下側基板５２の上に前記上側基板５４が載せられて接合されることにより、前記流路６０が封止されている。
【００５７】
この流路６０は、その上流側から順に、核酸供給部６１Ｎ及び蛋白質供給部６１Ｐと、各供給部６１Ｎ，６１Ｐの下流側の供給流路６２Ｎ，６２Ｐと、これらの供給流路６２Ｎ，６２Ｐが合流する合流流路６４と、合流して混合された核酸と蛋白質とを反応させるための反応部６５と、前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２が基板厚み方向に照射される光照射部６６と、試料排出部６８とを有する。
【００５８】
前記核酸供給部６１Ｎ及び蛋白質供給部６１Ｐは、試料を構成する核酸、蛋白質がそれぞれ供給される部分であり、これら供給部６１Ｎ，６１Ｐに対応して前記上側基板５４に同基板５４を厚み方向に貫通する供給孔５７が形成されている。同様に、前記試料排出部６８に対応して前記上側基板５４に排出孔５８が形成されている。
【００５９】
前記供給孔５７には、それぞれ、試料移送手段としての核酸供給用シリンジ及び蛋白質供給用シリンジが接続される。これらのシリンジは、前記供給孔５７を通じて前記核酸供給部６１Ｎ及び蛋白質供給部６１Ｐにそれぞれ核酸及び蛋白質を供給する。
【００６０】
前記上側基板５４には、前記反応部６５の上方に位置するようにヒータ５６が組み込まれている。このヒータ５６は、前記核酸と蛋白質とが混合された試料をその反応温度まで加熱する。また、この加熱時間すなわち反応時間を十分に確保するために（例えば１０分）、前記反応部６５が蛇行してその流路長を稼いでいる。
【００６１】
前記光照射部６６は、直線状をなし、その長手方向（すなわち試料の流れ方向）に並ぶ複数の位置（図例では３つの位置Ａ，Ｂ，Ｃ）に前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２の照射位置が設定されている。そして、これらの照射位置に対して順に前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２が照射されるように、当該光Ｌｅ，Ｌ２の照射位置またはマイクロリアクタ５０が動かされる。
【００６２】
また、下側基板５２の底面には、前記測定光Ｌ２を１８０°反射させるための反射膜（例えば誘電多層膜）がコーティングされている。この反射膜は、前記測定光Ｌ２の反射によって当該測定光Ｌ２に前記試料Ｓ内を往復させる。
【００６３】
なお、前記流路６０の寸法は適宜設定可能であるが、一般には幅２００μｍ程度、深さ１００μｍ程度が好適である。試料の送液は比較的ゆっくりとした速度であることが好ましく、例えば０．５ｍｍ／ｓｅｃ程度が好適である。
【００６４】
このマイクロリアクタ５０では、前記核酸及び蛋白質の供給、混合、反応、及びその光熱効果の測定が全て行われる。従って、コンパクトな構成で核酸−蛋白質相互作用の検出を効率よく行うことが可能となる。
【００６５】
この第２の実施の形態での信号処理は例えば次のようにして行われる。前記試料中で核酸と蛋白質との相互作用が生じていない場合、前記励起光Ｌｅの照射による光熱効果は時間経過とともに減衰していくため、測定開始位置である位置Ａからその下流側の位置Ｂさらには位置Ｃに向かうに従って検出信号の強度は低下していく。しかしながら、前記試料中に前記相互作用が生じた部分が存在している場合、その部分については光熱効果の減衰がほとんどないため、当該部分が位置Ｂ及び位置Ｃを通過した時に信号強度が一時的に高くなる。すなわち、その信号強度の時間変化は例えば図７（ａ）のようになる。
【００６６】
ただし、各位置Ａ〜Ｃでの検出信号には時間的なずれがあるので、そのずれ分を補正して各位置Ａ〜Ｃでの検出信号を同図（ｂ）に示すように重ね合わせると、前記相互作用が生じた部分（同図Ｄ）においてのみ信号強度が著しく高くなる。従って、この局所的に信号強度が高い部分で相互作用が生じていることを把握することができる。
【００６７】
前記信号処理装置３８は、前記図７（ｂ）に示されるような重ね合わせデータの出力に加え、その重ね合わせデータでのピーク値の大小から相互作用の有無を自動的に判定する。なお、この第２の実施の形態においても、前記第１の実施の形態と同様に励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２の照射位置を単一の位置にのみ設定し、その時間変化を監視するようにしてもよい。あるいは、前記光照射部６６での試料の流れ速度と同等の速度で前記励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２の照射位置を追従させるようにしてもよい。
【００６８】
また、本発明において、前記励起光による試料の光熱効果を測定する方法は前記のような光干渉法に限られない。例えば、熱レンズ法のように、溶媒の屈折率の変化に伴う測定光の強度変化を測定する方法も利用可能である。
【実施例１】
【００６９】
前記図１〜図４に示す装置により核酸−蛋白質相互作用の検出を行う。
【００７０】
図４（ａ）（ｂ）に示されるマイクロアレイ４２には合成石英製のものを用い、その各試料収容凹部４２ａの形状は０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×１．０ｍｍの直方体とする（ただし、この形状は例えば直径０．５ｍｍの円柱でも可。）。
【００７１】
前記各試料収容凹部４２ａに、蛋白質トロンビンとこのトロンビンに特異的に反応する核酸であるアプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡからなる機能性高分子）の混合溶液からなる試料を分注する。その比率は、トロンビンの最終濃度が７０ｎＭ、アプタマーの最終濃度が１７５ｎＭとなるようにする。
【００７２】
分注後、前記試料をヒータ４７により３７℃まで加熱して１５分間保持し、その後、励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２の照射位置にセットしてその光熱効果の測定を行う。励起光Ｌｅの光源１２には高圧水銀ランプを用い、その波長２５０ｎｍ付近の発光極大域をバンドパスフィルタで取り出してオプティカルチョッパーで８０Ｈｚ程度に変調し、直径５ｍｍの領域に集光して前記試料に照射する。さらに、この励起光Ｌｅと同軸で測定光Ｌ２を試料に照射し、この測定光Ｌ２と参照光Ｌ１との干渉光の強度を測定する。この測定信号を信号処理装置３８に電圧値として表示させ、さらにデータロガーにより連続的に記録する。
【００７３】
その測定結果を図８に示す。同図破線７１に示されるように、試料がアプタマーのみの場合は測定信号の強度がその立上り後に時間経過とともに徐々に低下していく。また、同図一点鎖線７２に示されるように、試料がトロンビンのみの場合は信号強度の立上りすら存しない。これに対し、試料がアプタマーとトロンビンの混合溶液である場合は、同図実線７０に示されるように、信号強度が立ち上がってからその低下がほとんど見られない。
【００７４】
従って、この測定信号の立上り後の低下速度を比較することにより、アプタマーとトロンビンとの相互作用の存在を判定することができる。具体的には、アプタマーと混合されるトロンビンの存在を４０ｎＭ程度まで検出できることが確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る核酸と蛋白質との相互作用の検出装置の全体構成図である。
【図２】前記検出装置における試料収容部の一部断面正面図である。
【図３】前記試料収容部の要部を示す一部断面斜視図である。
【図４】（ａ）は前記試料収容部に用いられるマイクロアレイの平面図、（ｂ）はその要部断面図である。
【図５】前記検出装置が生成する測定信号の強度の時間変化を示すグラフである。
【図６】（ａ）は本発明の第２の実施の形態で用いられるマイクロリアクタの平面図、（ｂ）は（ａ）の６Ｂ−６Ｂ線断面図である。
【図７】（ａ）は本発明の第２の実施の形態において得られる各測定位置Ａ〜Ｃでの測定信号の時間変化を示すグラフ、（ｂ）はその測定信号を重ね合わせた信号の時間変化を示すグラフである。
【図８】前記第１の実施の形態に係る装置の実施により得られる測定信号を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７６】
Ｌ１ 参照光
Ｌ２ 測定光
Ｌｅ 励起光
Ｓ 試料
１０ 励起系（励起光照射系）
１２ 励起光源
２０ 測定系（測定装置）
２２ 測定光源
２６Ａ ミラー
２６Ｂ ミラー
２８ 偏光ビームスプリッタ
３６ 光検出器
３８ 信号処理装置
４０ 試料収容部
４１ 基台
４２ マイクロアレイ（試料収容器）
４４ マニピュレータ（移送手段）
４６ 自動分注装置
４７ ヒータ（温度調節機構）
５０ マイクロリアクタ（試料収容器）
５６ ヒータ（温度調節機構）
６０ 流路
６１Ｎ 核酸供給部
６１Ｐ 蛋白質供給部
６４ 合流流路
６５ 反応部
６６ 光照射部
６８ 試料排出部
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば癌マーカー蛋白の検出や転写因子探索等を目的として、試料中における核酸とそのリガンド蛋白質との相互作用の有無を検出するための技術に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、前記のような核酸と蛋白質との相互作用を検出するための方法として、下記特許文献１に記載されるようないわゆる蛍光法が知られている。この方法は、核酸と蛋白質の双方を互いに異なる蛍光色素で標識し、これらの蛍光色素が互いに作用して蛍光を変化させ得るようにした上で、その実際の変化の有無を測定することにより前記核酸と蛋白質の相互作用を検出するようにしたものである。
【特許文献１】特開２００４−１６１３２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
前記の蛍光法では、前記蛍光分子によって核酸及び蛋白質を特異的に染色するために数段階の前処理工程が必要である。従って、実際の測定工程に至るまでに多大な手間を要する。また、蛍光分子が活性部位に与える影響も懸念される。
【０００４】
なお、前記蛍光分子等による標識が不要な分子間相互作用検出方法として、ＳＰＲ（表面局在プラズモン共鳴）センサを用いる方法が考えられる。この方法は、基板上に形成された金属薄膜上に試料を固相結合し、この試料に所定のレーザ光を入射したときの前記試料の吸着度合いをＳＰＲセンサによって検出するものである。
【０００５】
しかしながら、この方法を前記核酸−蛋白質相互作用の検出に利用することは実用上困難である。すなわち、この方法では、前記金属薄膜の膜厚についてナノメートルオーダーでの制御が求められるとともに、その薄膜表面にアナライトと呼ばれる目的分子捕獲用の分子（例えば抗原に対する抗体）を吸着させる必要があり、このような事情から、再現性の高い基板を作成することはきわめて困難である。特に、機能性分子については、基板表面付近に活性部位を置いての計測となるため、当該活性部位が基板の影響を受ける可能性は否定できない。
【０００６】
本発明は、このような事情に鑑み、蛍光分子による試料の標識や金属薄膜上への試料の固着を要することなく、核酸と蛋白質の相互作用を容易にかつ高感度で検出することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、前記課題を解決するための手段として、前記核酸及び蛋白質を含む試料の光熱効果、すなわち、当該試料に所定の励起光を入射した時にこの励起光を前記試料が吸収して発熱する効果に着目し、この光熱効果と、試料中での核酸と蛋白質との相互作用の有無との間に著しい相関関係があることを見出した。具体的に、前記光熱効果は一般に時間が経過するに従って減少するのであるが、核酸と蛋白質との相互作用が生じている試料では少なくとも光熱効果の立上り直後において前記光熱効果の時間減少がほとんどないことを見出した。これは、前記核酸の断片の構造がリガンド蛋白質との相互作用によって安定化することによるものであると推察される。
【０００８】
本発明は、このような点に着目してなされたものであり、試料中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を検出するための方法であって、前記試料に対して励起光を照射するステップと、前記励起光の照射により前記試料内に生ずる光熱効果を測定するステップと、前記光熱効果の時間変化に基づいて核酸と蛋白質相互作用の発生の有無を判断するステップとを含むものである。
【０００９】
また本発明は、試料中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を検出するための装置であって、前記試料を収容する試料収容部と、前記試料収容部に収容された試料に対して励起光を照射する励起光照射系と、前記励起光の照射により前記試料内に生ずる光熱効果の測定信号を生成する測定装置とを含み、この測定装置は、前記測定信号の時間変化に関するデータを作成し、その作成したデータに基づいて前記相互作用の有無を判断する信号処理装置を含むものである。
【００１０】
以上の構成によれば、前記試料に励起光を照射してそのときの光熱効果を測定し、その光熱効果の時間変化を監視することにより、前記試料中での核酸と蛋白質の相互作用の発生の有無を的確に判断することができる。従って、試料中の核酸及び蛋白質の標識や金属薄膜への試料の固着を要することなく、前記相互作用の有無を容易にかつ高感度で検出することができる。また、前記検出装置では、前記信号処理装置が前記相互作用の有無の判断に有用なデータを作成してそのデータに基づいて相互作用の有無を自動的に判断する。
【００１１】
前記検出方法は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡからなる機能性高分子（いわゆるアプタマー）と、そのリガンド蛋白質との相互作用の有無を検出するのに好適である。
【００１２】
また、前記検出方法において前記光熱効果を測定するステップとしては、前記試料に前記励起光とは別の測定光を透過させてこの透過した測定光の位相変化を測定する操作を含むものが、好適である。同様に、前記検出装置における測定装置は、前記試料に前記励起光とは別の測定光を透過させてこの透過した測定光の位相変化を測定するものが、好適である。前記試料が光熱効果により発熱すると、当該試料での光の屈折率が変化するので、この試料に測定光を透過させてその位相変化を測定することにより、前記試料の光熱効果を容易にかつ的確に把握することができる。
【００１３】
この場合、前記測定装置は、測定用光源と、この測定用光源から発せられる測定光を前記試料収容部に収容された試料に透過させ、この透過した測定光と参照光とを干渉させる光学系と、その干渉した光の強度を検出する光検出器とを含むものが、好適である。
【００１４】
この測定装置によれば、前記測定光と参照光とを干渉させてその干渉光の強度を検出するだけの簡単な構成で、前記試料を透過する測定光の位相変化を容易に計測することができる。
【００１５】
一方、前記試料収容部は、前記試料を収容する試料収容器と、この試料収容器内の試料を前記核酸と蛋白質の反応温度に調節する温度調節機構と、その加熱された試料を前記励起光の照射位置まで移送する移送手段とを含むものが、好ましい。
【００１６】
この構成によれば、前記試料収容器内で、前記試料中における核酸と蛋白質との反応（相互作用）を行わせ、かつ、そのまま当該試料に対して励起光の照射を行うことができる。
【００１７】
より具体的に、前記移送手段としては、前記試料収容器を、この試料収容器内に前記試料を注入するための注入位置と、その注入された試料の温度を前記温度調節機構により調節するための温度調節位置と、前記励起光の照射位置の順に移送するものが、好適である。
【００１８】
また、前記試料収容器が、前記試料を流すための流路を有し、この流路は、その上流側から順に、前記核酸及び前記蛋白質がそれぞれ導入される導入部と、その導入された核酸と蛋白質とを合流させて混合する混合部と、その混合液の温度を前記温度調節機構により調節して前記反応を行わせるための反応部と、前記励起光が照射される励起光照射部とを有するものであってもよい。この構成によれば、前記試料収容部内で前記試料の移送を行うことができる。
【００１９】
また、前記励起光照射部が、その試料の流れ方向に並ぶ複数の位置に前記励起光が照射されるものであれば、その各位置で光熱効果を測定することによって、当該光熱効果の時間変化を適正に検出することができる。
【発明の効果】
【００２０】
以上のように、本発明によれば、試料に励起光を照射して当該試料における光熱効果を測定するだけで、当該光熱効果の時間変化に基づいて前記試料における核酸−蛋白質相互作用の有無を容易にかつ高感度で検出することができる効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の第１の実施の形態を、図１〜図５を参照しながら説明する。
【００２２】
図１は、この実施の形態に係る検出装置の全体構成を示したものである。図示の検出装置は、励起光照射系（以下、単に「励起系」と称する。）１０と、測定系（測定装置）２０と、試料収容部４０とを備える。そして、この試料収容部４０に後述の試料が収容される。
【００２３】
前記励起系１０は、前記試料収容部４０の所定位置に収容される試料に励起光を照射するためのものであり、励起光源１２と、分光機構１４と、変調器構１６と、ダイクロイックミラー１７と、集光レンズ１８とを備える。
【００２４】
前記励起光源１２としては、例えば白色光を出力するキセノンランプや紫外光を出力する水銀ランプが好適である。この励起光源１２から発せられる光は前記分光機構１４で分光され、前記変調機構１６で周期的に変調されて測定に好適な励起光Ｌｅとなる。
【００２５】
前記ダイクロイックミラー１７は、前記測定系２０と前記試料収容部４０との間に位置し、後述のように前記測定系２０から送られてくる測定光はそのまま透過させる一方、前記励起光源１２から送られてくる励起光Ｌｅを９０°反射させて前記測定光と同軸で前記試料収容器４０側に導く。前記集光レンズ１８は、前記ダイクロイックミラー１７で反射した後の励起光Ｌｅを特定領域内に集光して前記試料収容部４０に収容された試料に照射する。この励起光を前記試料が吸収して発熱することにより、その温度変化分だけ当該試料の屈折率が変化する。
【００２６】
前記測定系２０は、前記試料の屈折率を測定するための測定光Ｌ２を当該試料に照射し、かつ、その測定光の位相変化によって前記屈折率を測定するものである。この実施の形態では、前記測定系２０は、測定光源２２と必要な光学系、さらには光検出器３６及び信号処理装置３８を備えている。
【００２７】
前記測定光源２２は、例えば出力１ｍＷのＨｅ−Ｎｅレーザ発生器からなり、この測定光源２２から照射される測定光は、図１に示されるように、λ／２波長板２３で偏光面の調節を受けた後、偏光ビームスプリッタ２４によって、互いに直交する２つの偏光、すなわち、参照光Ｌ１と測定光Ｌ２とに分光される。
【００２８】
前記参照光Ｌ１は、音響光学変調器２５Ａによって光周波数のシフト（周波数変換）を受けた後、ミラー２６Ａで反射して偏光ビームスプリッタ２８に入力される。また、前記測定光Ｌ２は、音響光学変調器２５Ｂによって光周波数のシフト（周波数変換）を受けた後、ミラー２６Ｂで反射して前記偏光ビームスプリッタ２８に入力され、このスプリッタ２８で前記参照光Ｌ１と合成される。
【００２９】
前記参照光Ｌ１は、前記偏向ビームスプリッタ３０をそのまま透過してミラー３４で１８０°反射することにより前記偏光ビームスプリッタ３０に戻る。このとき、前記偏光ビームスプリッタ３０と前記ミラー３４との間には１／４波長板３３が介在していてこの１／４波長板３３を前記測定光Ｌ２が往復で通過するため、この参照光Ｌ１の偏光面は９０°回転する。従って、前記偏光ビームスプリッタ３０に戻った参照光Ｌ１は前記試料収容部４０と反対の側に９０°反射する。この参照光Ｌ１は、偏光板３５を通じて光検出器３６に入力される。
【００３０】
一方、前記測定光Ｌ２は、前記偏光ビームスプリッタ３０で前記試料収容部４０側に９０°反射され、１／４波長板３２、前記ダイクロイックミラー１７、及び前記集光レンズ１８を通じて試料収容部４０へ導かれる。この測定光Ｌ２は後述のように試料に入射され、さらに１８０°反射して、前記１／４波長板３２を通じて前記偏光ビームスプリッタ３０に戻る。この測定光Ｌ２は、前記１／４波長板３２の往復透過によってその偏光面が９０°回転した状態にあるので、今度は当該偏光ビームスプリッタ３０をそのまま透過して前記参照光Ｌ１と合流し、前記偏光板３５および前記光検出器３６へ向かう。
【００３１】
前記偏光板３５では、前記参照光Ｌ１と前記測定光Ｌ２とが互いに干渉し、その干渉光の光強度が前記光検出器３６によって電気信号（測定信号）に変換される。
【００３２】
前記信号処理装置３８は、前記測定信号を特定のサンプリング周期をおいてサンプリングし、その測定信号に基づいて前記測定光Ｌ２（測定光）の位相変化を演算する。さらに、この信号処理装置３８は、前記位相変化の時間的変化に関するデータを作成し、かつ、後述のように、当該データに基づいて前記試料Ｓ内における相互作用の有無を自動的に判断する。
【００３３】
ここで、前記干渉光強度Ｓ１は、次の（１）式で表される。
【００３４】
Ｓ１＝Ｃ１＋Ｃ２・ｃｏｓ（２π・ｆｂ・ｔ＋φ） …（１）
同式において、Ｃ１、Ｃ２は前記偏光ビームスプリッタ等の光学系や試料Ｓの透過率により定まる定数、φは前記参照光Ｌ１と前記測定光Ｌ２の光路長差による位相差、ｆｂは前記参照光Ｌ１と前記測定光Ｌ２の周波数差である。この（１）式より、前記干渉光強度Ｓ１の変化（前記励起光を照射しない或いはその光強度が小さいときとその光強度が大きいときとの差）から、前記位相差φの変化が求まることがわかる。前記信号処理装置３８は、（１）式に基づいて前記位相差φの変化を算出する。
【００３５】
なお、前記励起光Ｌｅの強度が例えばチョッパの回転により周波数ｆで周期的に強度変調されていると、試料Ｓの屈折率も前記周波数ｆで変化し、測定光Ｌ２の光路長も前記周波数ｆで変化し（参照光Ｌ１の光路長は一定）、前記位相差φも周波数ｆで変化する。従って、前記位相差φの変化を前記周波数ｆの成分（前記励起信号の強度変調周期と同周期成分）について測定（算出）すれば、周波数ｆの成分を有しないノイズの影響を除去しつつ試料Ｓの屈折率変化のみを測定することが可能である。この測定は、前記位相差φの測定のＳ／Ｎ比を向上させる。
【００３６】
また、前記励起光源１２にレーザダイオードやＬＥＤなどが用いられる場合、その励起光源１２の電源を電気回路でコントロールすることにより前記変調を行うことも可能である。
【００３７】
前記試料収容部４０は、図２に示すように、基台４１と、試料収容器であるマイクロアレイ４２と、移送手段であるマニピュレータ４４とを備え、前記基台４１上には、自動分注装置４６、ヒータ４７、及びミラー４８が設置されている。
【００３８】
前記マイクロアレイ４２は、前記自動分注装置４６から分注される試料を収容するものであり、図２〜図４に示すような平坦な基板により構成される。このマイクロアレイ４２の上面部には、縦横に並ぶ複数（図４（ａ）に示す例では５×５＝２５個）の試料収容凹部４２ａが形成され、各試料収容凹部４２ａ内に図４（ｂ）に示すような試料Ｓが分注される。本発明では試料収容器の具体的な材質を問わないが、この実施の形態に係るマイクロアレイ４２は、前記励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２を透過させる材質を有する必要がある。具体的には、合成石英、石英、ＰＤＭＳなどが好適である。
【００３９】
前記マニピュレータ４４は、前記マイクロアレイ４２の外形に対応する形状の窓４４ａを有し、この窓４４ａ内に前記マイクロアレイ４２が嵌まり込んだ状態で同アレイ４２を保持する。換言すれば、このマイクロアレイ４２を上下に開放した状態で同アレイ４２を四方外側から保持する。
【００４０】
前記自動分注装置４６は、前記基台４１上に立設され、前記試料Ｓを適量（すなわち前記各試料収容凹部４２ａを満たす量）だけ滴下する。
【００４１】
前記ミラー４８は、前記自動分注装置４６から水平方向に離れた位置で前記基台４１上に設置され、前記測定系２０から下向きに導入される測定光Ｌ２を上向きに１８０°反射させる。
【００４２】
前記ヒータ４７は、本発明の温度調節機構を構成するもので、前記ミラー４８のすぐ上に配設され、このヒータ４７上に移送されるマイクロアレイ４２を所定温度まで加熱する。この加熱温度は、前記試料Ｓにおける核酸と蛋白質との相互作用を促進させる温度（反応温度）に設定されている。このヒータ４７において前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２が照射される位置には切欠部４７ａが形成され、この切欠部４７ａにおいて前記ミラー４８が上方に開放されている。
【００４３】
なお、本発明に係る温度調節機構は、前記ヒータ４７に限らない。逆に試料の温度を低下させる冷却器も含まれ得る。
【００４４】
前記マニピュレータ４４は、前記自動分注装置４６による分注位置、前記ヒータ４７上の加熱位置、及び前記ミラー４８上の励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２の照射位置の順に前記マイクロアレイ４２を搬送する。
【００４５】
次に、この検出装置の作用を説明する。
【００４６】
前記試料収容部４０では、マイクロアレイ４２を保持するマニピュレータ４４が同アレイ４２をまず分注位置に移送する。そして、前記マイクロアレイ４２の各試料収容凹部４２ａが順に前記自動分注装置４６の直下に位置するように同アレイ４２を走査する。これらの分注位置で、前記自動分注装置４６から各試料収容凹部４２ａ内に試料Ｓが分注される。
【００４７】
全ての試料収容凹部４２ａへの試料Ｓの分注が完了した後、前記マニピュレータ４４は前記マイクロアレイ４２を前記ヒータ４７上の加熱位置へ移送する。この加熱位置は、前記マイクロアレイ４２が前記ヒータ４７に直接接触する位置であってもよいし、当該ヒータ４７から若干離間する位置であってもよい。この加熱位置に前記マイクロアレイ４２が所定時間保持されることにより、各試料収容凹部４２ａ内の試料Ｓにおける反応（核酸と蛋白質との相互作用）が促される。
【００４８】
その後、前記マニピュレータ４４は、前記マイクロアレイ４２を図４（ｂ）に示すような前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２の照射位置（前記ヒータ４７の切欠部４７ａに対応する位置であって前記ミラー４８の直上位置）へ移送する。そして、前記マイクロアレイ４２の各試料収容凹部４２ａ内の試料Ｓに対して順に前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２が照射されるように、前記マイクロアレイ４２を走査する。
【００４９】
この照射位置では、前記励起系１０から前記試料収容部４０に導かれる励起光Ｌｅが前記試料Ｓに入射され、透過する。このとき、試料Ｓが前記励起光Ｌｅを吸収して発熱する（光熱効果）。一方、前記測定系２０から試料収容部４０に導入される測定光Ｌ２は、前記励起光Ｌｅと同軸で前記各試料収容凹部４２ａに入射され、その凹部４２ａ内の試料Ｓを透過する。さらに、この測定光Ｌ２はミラー４８で上向きに反射して前記試料Ｓをさらに透過する。このとき、前記光熱効果による発熱の量に応じて前記試料Ｓでの屈折率が変わり、該屈折率に応じて前記位相差φが変わっているので、当該発熱の量に応じて前記測定系２０に戻る測定光Ｌ２とこの測定系２０における前記参照光Ｌ１との干渉光強度が変わる。この干渉光強度に対応する測定信号が前記測定系２０の光検出器３６により生成され、信号処理装置３８に入力される。
【００５０】
この信号処理装置３８は、前記測定信号を所定のサンプリング周期で取り込み、この測定信号の時間変化を示すデータ、例えば図５に示すように経過時間と信号強度との関係を示すグラフを作成する。ここで、前記試料Ｓ中で核酸と蛋白質との相互作用が生じていない場合は、時間経過とともに前記信号強度が低下していくのに対し、前記相互作用が生じていると時間経過にかかわらず信号強度はほぼ一定値を維持する。そこで、この信号処理装置３８は、前記信号強度の時間減衰率を求め、その時間減衰率が一定以下の場合に前記相互作用が存在していると判断する。
【００５１】
この時間減衰率は、前記グラフに基づいて測定者が判定することも可能であるが、この実施の形態では前記信号処理装置３８が自動的に前記時間減衰率を演算して前記相互作用の有無を判定する。その具体例としては、前記信号処理装置３８がサンプリング周期毎に取り込んだ信号強度に基づいて当該信号強度の時間変化を表す直線近似式を演算し、その直線の傾きが一定以下の場合に前記相互作用が生じていると判断することが考えられる。また、前記直線近似式からの各サンプリング信号のばらつきが過度に大きい場合に測定不良と判断するようにしてもよい。
【００５２】
このような方法及び装置によれば、前記試料Ｓにおける核酸及び蛋白質の標識や、金属薄膜への前記試料Ｓの固着を行うことなく、当該試料Ｓにおける核酸−蛋白質相互作用の有無を検出することができる。
【００５３】
次に、第２の実施の形態を図６及び図７を参照しながら説明する。なお、装置全体の構成は前記図１に示したものと同等であるので、ここでは省略する。
【００５４】
この第２の実施の形態では、前記第１の実施の形態のように試料収容器であるマイクロアレイ４２そのものを移送する手段に代え、図６に示されるように試料を特定方向に流すための流路６０をもったマイクロリアクタ５０が使用される。すなわち、このマイクロリアクタ５０は、試料収容器としての役割と、試料を移送方向に案内する手段としての役割を兼ねる。
【００５５】
このマイクロリアクタ５０は、下側基板５２と、その上に重ねられる上側基板５４とを備える。これらの基板５２，５４は、前記マイクロアレイ４２と同様に前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２を透過する材料により形成されている。
【００５６】
前記流路６０は、前記下側基板５２の上面部に形成された溝により構成されている。そして、この下側基板５２の上に前記上側基板５４が載せられて接合されることにより、前記流路６０が封止されている。
【００５７】
この流路６０は、その上流側から順に、核酸供給部６１Ｎ及び蛋白質供給部６１Ｐと、各供給部６１Ｎ，６１Ｐの下流側の供給流路６２Ｎ，６２Ｐと、これらの供給流路６２Ｎ，６２Ｐが合流する合流流路６４と、合流して混合された核酸と蛋白質とを反応させるための反応部６５と、前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２が基板厚み方向に照射される光照射部６６と、試料排出部６８とを有する。
【００５８】
前記核酸供給部６１Ｎ及び蛋白質供給部６１Ｐは、試料を構成する核酸、蛋白質がそれぞれ供給される部分であり、これら供給部６１Ｎ，６１Ｐに対応して前記上側基板５４に同基板５４を厚み方向に貫通する供給孔５７が形成されている。同様に、前記試料排出部６８に対応して前記上側基板５４に排出孔５８が形成されている。
【００５９】
前記供給孔５７には、それぞれ、試料移送手段としての核酸供給用シリンジ及び蛋白質供給用シリンジが接続される。これらのシリンジは、前記供給孔５７を通じて前記核酸供給部６１Ｎ及び蛋白質供給部６１Ｐにそれぞれ核酸及び蛋白質を供給する。
【００６０】
前記上側基板５４には、前記反応部６５の上方に位置するようにヒータ５６が組み込まれている。このヒータ５６は、前記核酸と蛋白質とが混合された試料をその反応温度まで加熱する。また、この加熱時間すなわち反応時間を十分に確保するために（例えば１０分）、前記反応部６５が蛇行してその流路長を稼いでいる。
【００６１】
前記光照射部６６は、直線状をなし、その長手方向（すなわち試料の流れ方向）に並ぶ複数の位置（図例では３つの位置Ａ，Ｂ，Ｃ）に前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２の照射位置が設定されている。そして、これらの照射位置に対して順に前記励起光Ｌｅ及び前記測定光Ｌ２が照射されるように、当該光Ｌｅ，Ｌ２の照射位置またはマイクロリアクタ５０が動かされる。
【００６２】
また、下側基板５２の底面には、前記測定光Ｌ２を１８０°反射させるための反射膜（例えば誘電多層膜）がコーティングされている。この反射膜は、前記測定光Ｌ２の反射によって当該測定光Ｌ２に前記試料Ｓ内を往復させる。
【００６３】
なお、前記流路６０の寸法は適宜設定可能であるが、一般には幅２００μｍ程度、深さ１００μｍ程度が好適である。試料の送液は比較的ゆっくりとした速度であることが好ましく、例えば０．５ｍｍ／ｓｅｃ程度が好適である。
【００６４】
このマイクロリアクタ５０では、前記核酸及び蛋白質の供給、混合、反応、及びその光熱効果の測定が全て行われる。従って、コンパクトな構成で核酸−蛋白質相互作用の検出を効率よく行うことが可能となる。
【００６５】
この第２の実施の形態での信号処理は例えば次のようにして行われる。前記試料中で核酸と蛋白質との相互作用が生じていない場合、前記励起光Ｌｅの照射による光熱効果は時間経過とともに減衰していくため、測定開始位置である位置Ａからその下流側の位置Ｂさらには位置Ｃに向かうに従って検出信号の強度は低下していく。しかしながら、前記試料中に前記相互作用が生じた部分が存在している場合、その部分については光熱効果の減衰がほとんどないため、当該部分が位置Ｂ及び位置Ｃを通過した時に信号強度が一時的に高くなる。すなわち、その信号強度の時間変化は例えば図７（ａ）のようになる。
【００６６】
ただし、各位置Ａ〜Ｃでの検出信号には時間的なずれがあるので、そのずれ分を補正して各位置Ａ〜Ｃでの検出信号を同図（ｂ）に示すように重ね合わせると、前記相互作用が生じた部分（同図Ｄ）においてのみ信号強度が著しく高くなる。従って、この局所的に信号強度が高い部分で相互作用が生じていることを把握することができる。
【００６７】
前記信号処理装置３８は、前記図７（ｂ）に示されるような重ね合わせデータの出力に加え、その重ね合わせデータでのピーク値の大小から相互作用の有無を自動的に判定する。なお、この第２の実施の形態においても、前記第１の実施の形態と同様に励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２の照射位置を単一の位置にのみ設定し、その時間変化を監視するようにしてもよい。あるいは、前記光照射部６６での試料の流れ速度と同等の速度で前記励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２の照射位置を追従させるようにしてもよい。
【００６８】
また、本発明において、前記励起光による試料の光熱効果を測定する方法は前記のような光干渉法に限られない。例えば、熱レンズ法のように、溶媒の屈折率の変化に伴う測定光の強度変化を測定する方法も利用可能である。
【実施例１】
【００６９】
前記図１〜図４に示す装置により核酸−蛋白質相互作用の検出を行う。
【００７０】
図４（ａ）（ｂ）に示されるマイクロアレイ４２には合成石英製のものを用い、その各試料収容凹部４２ａの形状は０．５ｍｍ×０．５ｍｍ×１．０ｍｍの直方体とする（ただし、この形状は例えば直径０．５ｍｍの円柱でも可。）。
【００７１】
前記各試料収容凹部４２ａに、蛋白質トロンビンとこのトロンビンに特異的に反応する核酸であるアプタマー（ＤＮＡまたはＲＮＡからなる機能性高分子）の混合溶液からなる試料を分注する。その比率は、トロンビンの最終濃度が７０ｎＭ、アプタマーの最終濃度が１７５ｎＭとなるようにする。
【００７２】
分注後、前記試料をヒータ４７により３７℃まで加熱して１５分間保持し、その後、励起光Ｌｅ及び測定光Ｌ２の照射位置にセットしてその光熱効果の測定を行う。励起光Ｌｅの光源１２には高圧水銀ランプを用い、その波長２５０ｎｍ付近の発光極大域をバンドパスフィルタで取り出してオプティカルチョッパーで８０Ｈｚ程度に変調し、直径５ｍｍの領域に集光して前記試料に照射する。さらに、この励起光Ｌｅと同軸で測定光Ｌ２を試料に照射し、この測定光Ｌ２と参照光Ｌ１との干渉光の強度を測定する。この測定信号を信号処理装置３８に電圧値として表示させ、さらにデータロガーにより連続的に記録する。
【００７３】
その測定結果を図８に示す。同図破線７１に示されるように、試料がアプタマーのみの場合は測定信号の強度がその立上り後に時間経過とともに徐々に低下していく。また、同図一点鎖線７２に示されるように、試料がトロンビンのみの場合は信号強度の立上りすら存しない。これに対し、試料がアプタマーとトロンビンの混合溶液である場合は、同図実線７０に示されるように、信号強度が立ち上がってからその低下がほとんど見られない。
【００７４】
従って、この測定信号の立上り後の低下速度を比較することにより、アプタマーとトロンビンとの相互作用の存在を判定することができる。具体的には、アプタマーと混合されるトロンビンの存在を４０ｎＭ程度まで検出できることが確認されている。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る核酸と蛋白質との相互作用の検出装置の全体構成図である。
【図２】前記検出装置における試料収容部の一部断面正面図である。
【図３】前記試料収容部の要部を示す一部断面斜視図である。
【図４】（ａ）は前記試料収容部に用いられるマイクロアレイの平面図、（ｂ）はその要部断面図である。
【図５】前記検出装置が生成する測定信号の強度の時間変化を示すグラフである。
【図６】（ａ）は本発明の第２の実施の形態で用いられるマイクロリアクタの平面図、（ｂ）は（ａ）の６Ｂ−６Ｂ線断面図である。
【図７】（ａ）は本発明の第２の実施の形態において得られる各測定位置Ａ〜Ｃでの測定信号の時間変化を示すグラフ、（ｂ）はその測定信号を重ね合わせた信号の時間変化を示すグラフである。
【図８】前記第１の実施の形態に係る装置の実施により得られる測定信号を示すグラフである。
【符号の説明】
【００７６】
Ｌ１ 参照光
Ｌ２ 測定光
Ｌｅ 励起光
Ｓ 試料
１０ 励起系（励起光照射系）
１２ 励起光源
２０ 測定系（測定装置）
２２ 測定光源
２６Ａ ミラー
２６Ｂ ミラー
２８ 偏光ビームスプリッタ
３６ 光検出器
３８ 信号処理装置
４０ 試料収容部
４１ 基台
４２ マイクロアレイ（試料収容器）
４４ マニピュレータ（移送手段）
４６ 自動分注装置
４７ ヒータ（温度調節機構）
５０ マイクロリアクタ（試料収容器）
５６ ヒータ（温度調節機構）
６０ 流路
６１Ｎ 核酸供給部
６１Ｐ 蛋白質供給部
６４ 合流流路
６５ 反応部
６６ 光照射部
６８ 試料排出部
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を検出するための方法であって、
前記試料に対して励起光を照射するステップと、
前記励起光の照射により前記試料内に生ずる光熱効果を測定するステップと、
前記光熱効果の時間変化に基づいて核酸と蛋白質相互作用の発生の有無を判断するステップとを含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出方法であって、
ＤＮＡまたはＲＮＡからなる機能性高分子とそのリガンド蛋白質との相互作用の有無を検出するものであることを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の核酸−蛋白質相互作用の検出方法において、
前記光熱効果を測定するステップは、前記試料に前記励起光とは別の測定光を透過させてこの透過した測定光の位相変化を測定する操作を含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出方法。
【請求項４】
試料中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を検出するための装置であって、
前記試料を収容する試料収容部と、
前記試料収容部に収容された試料に対して励起光を照射する励起光照射系と、
前記励起光の照射により前記試料内に生ずる光熱効果の測定信号を生成する測定装置とを含み、
前記測定装置は、前記測定信号の時間変化に関するデータを作成し、その作成したデータに基づいて前記相互作用の有無を判断する信号処理装置を含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項５】
請求項４記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記測定装置は、前記試料に前記励起光とは別の測定光を透過させてこの透過した測定光の位相変化を測定することを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項６】
請求項５記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記測定装置は、測定用光源と、この測定用光源から発せられる測定光を前記試料収容部に収容された試料に透過させ、この透過した測定光と参照光とを干渉させる光学系と、その干渉した光の強度を検出する光検出器とを含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記試料収容部は、前記試料を収容する試料収容器と、この試料収容器内の試料を前記核酸と蛋白質の反応温度に調節する温度調節機構と、その加熱された試料を前記励起光の照射位置まで移送する移送手段とを含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項８】
請求項７記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記移送手段は、前記試料収容器を、この試料収容器内に前記試料を注入するための注入位置と、その注入された試料の温度を前記温度調節機構により調節するための温度調節位置と、前記励起光の照射位置の順に移送することを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項９】
請求項７記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記試料収容器は、前記試料を流すための流路を有し、この流路は、その上流側から順に、前記核酸及び前記蛋白質がそれぞれ導入される導入部と、その導入された核酸と蛋白質とを合流させて混合する混合部と、その混合液の温度を前記温度調節機構により調節して前記反応を行わせるための反応部と、前記励起光が照射される励起光照射部とを有することを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項１】
試料中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を検出するための方法であって、
前記試料に対して励起光を照射するステップと、
前記励起光の照射により前記試料内に生ずる光熱効果を測定するステップと、
前記光熱効果の時間変化に基づいて核酸と蛋白質相互作用の発生の有無を判断するステップとを含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出方法。
【請求項２】
請求項１記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出方法であって、
ＤＮＡまたはＲＮＡからなる機能性高分子とそのリガンド蛋白質との相互作用の有無を検出するものであることを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出方法。
【請求項３】
請求項１または２記載の核酸−蛋白質相互作用の検出方法において、
前記光熱効果を測定するステップは、前記試料に前記励起光とは別の測定光を透過させてこの透過した測定光の位相変化を測定する操作を含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出方法。
【請求項４】
試料中での核酸と蛋白質との相互作用の発生の有無を検出するための装置であって、
前記試料を収容する試料収容部と、
前記試料収容部に収容された試料に対して励起光を照射する励起光照射系と、
前記励起光の照射により前記試料内に生ずる光熱効果の測定信号を生成する測定装置とを含み、
前記測定装置は、前記測定信号の時間変化に関するデータを作成し、その作成したデータに基づいて前記相互作用の有無を判断する信号処理装置を含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項５】
請求項４記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記測定装置は、前記試料に前記励起光とは別の測定光を透過させてこの透過した測定光の位相変化を測定することを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項６】
請求項５記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記測定装置は、測定用光源と、この測定用光源から発せられる測定光を前記試料収容部に収容された試料に透過させ、この透過した測定光と参照光とを干渉させる光学系と、その干渉した光の強度を検出する光検出器とを含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかに記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記試料収容部は、前記試料を収容する試料収容器と、この試料収容器内の試料を前記核酸と蛋白質の反応温度に調節する温度調節機構と、その加熱された試料を前記励起光の照射位置まで移送する移送手段とを含むことを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項８】
請求項７記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記移送手段は、前記試料収容器を、この試料収容器内に前記試料を注入するための注入位置と、その注入された試料の温度を前記温度調節機構により調節するための温度調節位置と、前記励起光の照射位置の順に移送することを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【請求項９】
請求項７記載の核酸と蛋白質の相互作用の検出装置において、
前記試料収容器は、前記試料を流すための流路を有し、この流路は、その上流側から順に、前記核酸及び前記蛋白質がそれぞれ導入される導入部と、その導入された核酸と蛋白質とを合流させて混合する混合部と、その混合液の温度を前記温度調節機構により調節して前記反応を行わせるための反応部と、前記励起光が照射される励起光照射部とを有することを特徴とする核酸と蛋白質の相互作用の検出装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−３３３６４９（Ｐ２００７−３３３６４９Ａ）
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６７８９８（Ｐ２００６−１６７８９８）
【出願日】平成１８年６月１６日（２００６．６．１６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５，１６年度，経済産業省，新エネルギー・産業技術総合開発機構「先進ナノバイオデバイスプロジェクト」委託研究，産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【出願人】（０００００１１９９）株式会社神戸製鋼所 (5,860)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１２月２７日（２００７．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１６日（２００６．６．１６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成１５，１６年度，経済産業省，新エネルギー・産業技術総合開発機構「先進ナノバイオデバイスプロジェクト」委託研究，産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０４１３２８８１）国立大学法人東京農工大学 (595)
【出願人】（０００００１１９９）株式会社神戸製鋼所 (5,860)
【Ｆターム（参考）】
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