オリーブポリフェノール濃縮物
オリーブオイル抽出物の副産物からオリーブポリフェノール濃縮物が得られるプロセスであって、（ａ）副産物を極性溶媒と混合して副産物／溶媒混合物を得て、（ｂ）該混合物からポリフェノールを抽出してオリーブポリフェノール溶液と抽出固体とを得て、（ｃ）膜分離法技術により該溶液を濃縮してオリーブポリフェノール濃縮物を収量するステップを含んでなり、存在するポリフェノールの濃縮物が少なくとも１０ｗｔ％であり、さらに脱脂ステップが行われる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はオリーブポリフェノールに富んだオリーブ製品で、始めの材料がオリーブ油抽出工程の副産物から得る工程に関するものであり、特に液状および粉状のオリーブポリフェノール濃縮物を製造する工程に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＥＵは世界中のオリーブ生産の約７４％を生産しており、その内スペインは４９％で総耕作面積が２１５００００Ｈａである。世界のオリーブ生産は過去１０年間に９〜１５百万トンの間を変動しており、その内９０〜９５％がオリーブ油とアルペオルホ油の生産に使われている。
【０００３】
オリーブ油の生産においては、オリーブ油工場やオリーブプレス機で発生される副産物の利用という大きな問題がある。３段階方式のオリーブ油抽出も「古い方法」として知られており、粉引き、打解、プレスおよび遠心分離の操作を含んでいる。オルホ５０〜６０％湿分およびアルペチンがプレス工程で得られる。２段階方式は「新方法」として知られており、粉引き、デカントおよび遠心分離の操作を含んでいる。この場合アルペオルホがデカント工程で得られる（６０〜７４ｗｔ％湿分）。
【０００４】
最近異なる製品がオリーブから引き出されており、オリーブ粉（３〜６ｗｔ％湿分）が登場した。この製品は人間の消費用である。オリーブ粉については特許が取られている（英国特許出願第０３１４２９４．０号）。
【特許文献１】英国特許出願第０３１４２９４．０号
【０００５】
これらの３種の副産物の乾燥組成は同じであり、ポリフェノール２〜４ｗｔ％、繊維５０〜６０ｗｔ％、油脂１０〜２０ｗｔ％、蛋白質１０〜１５ｗｔ％、炭水化物１０〜１５ｗｔ％およびミネラル３〜６ｗｔ％である。ポリフェノールがこれらの副産物から抽出され得るプロセスを開発するのが有利である。
【０００６】
数種のオリーブ成分が人間の健康上重要な役割を示すことがよく認められている。これらの成分中でポリフェノールは非常に重要な部分である。それらはオリーブ油の安定性と知覚特性に深く関与している。しかも薬理学的な性質を具えたそれらは天然の抗酸化物であり、グラム陽性微生物を抑制する。
【０００７】
オリーブ果物は１０００ｇのサンプル当り８０ｍｇまでのポリフェノールを含有できる。これらのポリフェノールは純粋なオリーブ油の独特な芳香に深く関与している。総フェノール含有量とフェノール成分の分布とは栽培、成長場所および成熟程度などにより影響される。ポリフェノールの一例としてオレウロペインがある。オレウロペイン含有量はオリーブ果物が成熟するにしたがって低減するが、ジメチルオレウロペインと２．４−ジヒドロキシ・フェニルエタノールの含有量は増加する。
【０００８】
セコイルドイド、オレウロペイン、ジメチルオレウロペインおよびリグストロサイドは主たるフェノールグルコサイドであり、ベルバコサイド（ヒドロキシチロソールのカフェ油脂ハモノシグルコサイド）はオリーブ果物から引き出される主たるヒドロキシナム酸である。オレウロペインのアグリコーンは２−（４−ジヒドロキシフェニル）−エタノール（ヒドロキシチロソール）を有したエレノール酸のエステルであり、リグストロサイドのアグリコーンは２−（４−ヒドロキシフェニル）−エタノール（チロソール）（図１）を具えたエレノール酸のエステルである。
【０００９】
オレウロペインはオリーブ果物の苦さに深く関与する主要なフェノール成分である。しかもヒドロキシチロソール（３，４−ＤＨＰＥＡ）およびチロソール（ｐ−ＨＰＥＡ）などのフェニルアルコールやベルスコサイドおよびフェノール酸（ヒドロキシナミック、ヒドロキシゼンゾイック、ヒドロキシカフェイックおよびヒドロキシフェニル酢酸を含む）はオリーブ果物中で報告されている。
【００１０】
オリーブの乳酸醗酵はオレウロペインおよびルテオリン７−グルコサイドのヒドロキシルチロソール、チロソールおよびルテオリンへの完全な加水分解を齎す。これはラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株からのβグルコシダーゼおよびエステラーゼによって触媒作用される。
【００１１】
ギリシャ、ポルトガル、イタリーおよびスペインテーブルオリーブのヒドロキシチロソールおよびヒドロキシチロソール誘導体（オレウロペイン、オレウロペインアグリコーン、ジメチル・オレウロペインおよびヒドロキシチロソール グルコサイド）の含有量はそれぞれ１００〜４３０ｍｇ／Ｋｇおよび３６７０〜５６１０ｍｇ／Ｋｇの範囲にある。
【００１２】
最近、Ｂｌｅｋａｓ他がカラマタおよびスパニッシュタイプオリーブ油に関して高レベルのヒドロキシチロソール（２５０〜７６０ｍｇ／Ｋｇ）を検出した（２００２年）。イタリア栽培のオリーブ果物中のベルバスコサイドの含有量は１６０〜３２００ｍｇ／Ｋｇであるが、ルチンおよびルテオリン７−グルコサイド、２種の主オリーブ果物中のフラボノイドの濃度はそれぞれ１１０〜６６０および５〜６００ｍｇ／Ｋｇである。
【００１３】
オリーブポリフェノールはオリーブ油の酸化安定性を高める役目を果たし、かつまた人間の健康にポジティブな効果を有することが発見されている。実験室内の研究ではヒドロキシチロソールが人間の低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）酸化を抑制すること、遊離基を捕捉すること、小板状集合および人間ｎｅｕｔｒｏｐｈｙｌｓ（抗炎症性を示す）のｌｅｕｃｏｔｒｉｅｎｅの製造を抑制すること、細胞保護を与えることが示されている。またヒドロキシチロソールが実験では呼吸および腸における感染を引き起こすグラム陽性およびグラム陰性バクテリアに対して逆らって働くことが示されている。
【００１４】
オリーブポリフェノールは極性溶媒に可溶である。それらは一般に単純な可溶化処理により抽出される。しかし最終抽出物中に存在するポリフェノール濃度は通常乾燥抽出物中の濃度の２〜３倍に過ぎない。何故かというと、それらは通常のフィルターを通過するオリーブ中に存在する他の化合物があるからである。それらの不純物は除去してフェノール分留を純粋化しなければならない。
【００１５】
ＥＰ−Ａ−１３６９４０７号には水性抽出物へのクロマトグラフィー分離処理を使ってオリーブ副産物から特定のポリフェノール、ヒドロキシチロソールを抽出する方法を開示している。該処理は、第１のイオン交換ステップと極性と分子サイズに基づいたポリマー吸収剤選択性を使った第２のステップとを、含んでいる。これにより単一のポリフェノールが分離されるが、これはポリフェノールが食品用に使用される場合には必要ではない。
【特許文献２】ＥＰ−Ａ−１３６９４０７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
この発明の目的はオリーブ油製造の副産物中に存在する全ての異なるポリフェノールを該副産物から集団として分離でき、しかも望ましくない不純物は除去できるプロセスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この発明が提供するプロセスにおいては、オリーブオイル抽出物の副産物からオリーブポリフェノール濃縮物が得られるものであって、（ａ）極性溶媒と副産物とを混合して副産物／溶媒混合物を形成するステップと、（ｂ）該混合物からポリフェノールを抽出してオリーブポリフェノール溶液と抽出固体とを得るステップと、（ｃ）膜分離技術によりオリーブポリフェノール溶液を濃縮して存在するポリフェノールの濃度が少なくとも１０ｗｔ％のオリーブポリフェノール濃縮物を得るステップとを含んでなり、さらに脱脂ステップを含んだものである。
【００１８】
「抽出物のオリーブの副産物」という用語はオリーブ油抽出３段階プロセスで得られるオルホおよび／またはアルペチン、オリーブ油抽出２段階方法で得られるアルペオルホ、オルホまたはアルペオルホから形成されるこれらの半固体または微粒子物質のどれかからの水性抽出物を言うものである。
【００１９】
ＧＢ−Ａ−０３１４２９４．０に開示されたオリーブ粉は適切な粒子状出発材料の一例である。このオリーブ粉は水性オリーブペーストを低温で乾燥および乾燥粉砕により処理することにより得られるものである。該水性ペーストは全てのオリーブ果物、オルホおよびアルペオルホから形成することができる。準備プロセスでは酵素処理の選択的な予備ステップを含んでいる。例えば該粉は少なくとも９９ｗｔ％粒サイズが０．５５ｍｍ未満であるという性質を具えている。
【特許文献３】ＧＢ−Ａ−０３１４２９４．０
【００２０】
３段階オリーブ油抽出で得られるオルホの収量はほぼ６０〜７５％であり、アルペチンの収量はほぼ３０％である。平均して、オルホは基本的に水２５％、油１０．２％、炭水化物４４．２％、全繊維１３．５％、蛋白質３．７％、灰２．４７％である。オルホ中のポリフェノールの含有量は０〜１％の間で変動し、アルペチンは一般にほぼ０．６２％のポリフェノール平均含有量である。
【００２１】
２段階オリーブ油抽出で得られるアルペオルホの収量は一般に７０〜８０％である。平均して、アルペオルホは基本的に水６０．６８％、油５．３４％、炭水化物２３．１８％、全繊維７．０８％、蛋白質１．９４％、灰１．８２％である。アルペオルホは通常０．４％までの全ポリフェノールを含有している。
【００２２】
ある種のアルマサラ（ａｌｍａｚａｒａ）はアルペオルホまたはオルホの製造中に核を除去する。湿ったアルペオルホまたはオルホから除かれた核の収量はオリーブの種類および使用された篩の直径により１０〜２０ｗｔ％の範囲で変動する。この発明に関しては除去された核は選択的である。
【００２３】
この発明における最終製品のサンプル中のポリフェノールの含有量を測定するにはいくつかの方法が使用される。オリーブサンプル中のポリフェノールの総含有量を測定する最も一般的な方法はＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法であり、その結果はｗｔ％で表わされる（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ他、１９９９年）。その他にもポリフェノールを識別・定量する方法としては、ＨＰＬＣシステムおよび重量分光計、ＬＣ−ＭＳ、ＵＶ検知に組み合わされたＨＰＬＣ、超臨界流体抽出（ＳＦＥ）、ダイオードアレイ分光学および重量分光学によるダブルオンライン検知を使用するＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＤＡＳ−ＭＳ）およびＬＣ−ＮＭＲがある。
【００２４】
この発明の第１のステップ（ａ）は副産物を極性溶媒と混合して、存在するポリフェノールを溶液中に行かせることである。使用される極性溶媒は好ましくは人間の消費のためにＣｏｄｅｘ−Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓにより認可されたものである。より好ましくは溶媒は水、エタノールまたはそれらの混合物である。このステップの結果は副産物／溶媒混合物である。
【００２５】
選択的にステップ（ａ）の後で、酵素非活性化ステップを含めることもできる。このステップを含めることにより、プロセス中にポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）酵素を非活性化または抑制するのである。ＰＰＯは好ましくない反応であるオリーブポリフェノールの重合に深く関与するもので、そのような酵素非活性化ステップはいくつかの方法をとることができる。
【００２６】
酵素反応を抑制するひとつの方法は反応の本質的な成分のひとつを除去することである。ポリフェノールオキシダーゼにより触媒作用をされる反応は基質、酵素それ自身、酸素および銅の存在を必要とする。この発明の一実施例においては、プロセス中に酸素が除かれる。これを行うには真空処理または二酸化炭素または窒素などの異なる気体を使っての置換がある。
【００２７】
酵素非活性化ステップの他の実施例においては、銅に対する親和性を具えたキレート剤の添加により銅を反応から除去する。適切なキレート剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、ＥＤＴＡがある。これらの処理剤はまた反応媒体のｐＨを低下させるので好ましい。
【００２８】
さらなるＰＰＯ酵素の非活性化方法としては、加熱ステップを行うものである。この方法が採用された場合には、７５〜１００℃の温度範囲と５〜１０分の時間範囲で漂白を行うのが好ましい。そのような加熱の採用により酵素が変性される。
【００２９】
上記した実施例がポリフェノールオキシダーゼ酵素が非活性化または抑制される例に過ぎないことを当業者は理解するであろう。
【００３０】
ステップ（ａ）に続いて、副産物／溶媒混合物は抽出ステップに掛けられて存在するポリフェノールが抽出される。数種の異なる副産物がステップ（ａ）に掛けられている場合には、ステップ（ｂ）において結合または個別に処理できる。
【００３１】
この発明の好ましき実施例においては、溶媒を添加して爾後液体と固体とを分離してオリーブポリフェノールは副産物／溶媒混合物から固体−液体抽出により抽出される。
【００３２】
オリーブポリフェノールを抽出するには数種の溶媒を使用でき、好ましくはＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓの認可した人間の消費のためのものが使われる。好ましくは水、エタノールまたはそれらの混合物が使用される。
【００３３】
副産物からポリフェノールを抽出するには、溶媒に対する低減ポリフェノールオキシダーゼ活性を具えた副産物の重量比は１／３〜１／３０の範囲内にある。より具体的には副産物がアルペオルホまたはオルホである場合には、低減ポリフェノールオキシダーゼ活性／溶媒を具えた副産物との間の該重量比は好ましくは１／３〜１／３０であり、例えば１／１０である。ポリフェノールがオリーブ粉から抽出される場合には、低減ポリフェノールオキシダーゼ活性溶媒を具えた副産物との間の該重量比は好ましくは１／１０〜１／３０、例えば１／２０である。
【００３４】
プロセス中のポリフェノール重合化および酸化を回避するには、抽出温度は好ましくは８５℃未満、例えば３０〜７０℃である。抽出にあっては、低減ポリフェノールオキシダーゼ活性を具えた副産物と溶媒との混合物は攪拌する必要がある。抽出ステップ（ｂ）は食品産業用の適宜な装置内で起きる。例えばステンレス鋼からなる３１６Ｌ反応器またはステンレス鋼からなる３０４Ｌ反応器である。
【００３５】
抽出ステップの時間の長さはプロセスの効率により変動する。単一ステップ抽出のための適切な時間は少なくとも２時間であり、例えば３〜５時間である。できることなら、複バッチ抽出を使って同じサンプルからポリフェノールを抽出するのがよい。例えば、サンプルは１ステップで抽出でき、爾後オリーブポリフェノール溶液と抽出された固体とはデカント（デカンターにより）または濾過により分離され、ついで所望の抽出の収量に応じて抽出された固体を使って作業を２または３回行う。消費された固体中の水分量は通常５５〜７０ｗｔ％である。産業用デカンターは市販されている（例えばＷｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｉｎｃ．またはＡｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｉｎｃ．）。従来のデカンターを使って混合物から固体分留を除去でき、３０００〜５０００ｒｐｍ（２０００〜３０００Ｇ）で動作する。
【００３６】
低減ポリフェノールオキシダーゼ活性を具えた副産物のデカンター分離は０．１ｗｔ％、好ましくは３ｗｔ％、より好ましくは５ｗｔ％を越える総溶解固体を含んだ溶液を形成する。
【００３７】
溶液中のポリフェノール含有量は総溶解固体の２〜１５ｗｔ％であり、例えば７ｗｔ％である。該溶液は通常初期の副産物中に存在する他の可溶成分を含んでおり、それらもプロセス中で抽出される。可溶液体状中のオリーブポリフェノール溶液が抽出および固体分離プロセス後に得られる。
【００３８】
抽出ステップ（ｂ）もまたデカント前に選択的予備固体−液体分離ステップを含むことがあり、そこでは固体が除去されて液体が回収される。これを達成するには口径が１０〜１５０μｍ、好ましくは０．２〜３０μｍの範囲のステンレス鋼、紙またはセルローズフィルタ−などにより濾過する。例えば適切なフィルターとしてはＢａｃｈｉｌｌｅｒ Ｓ．Ａ（スペイン）製造のＮｕｔｃｈａタイプのフィルターなどが挙げられる。
【００３９】
デカントおよび／または濾過ステップ後に得られたオリーブポリフェノール溶液は通常、懸濁固体を含んでおり、その粒径は４μｍで９９ｖｏｌ％の分布である。これらの固体は懸濁はしているが溶解はしていない。それらは０．４５μｍより大きい。そのような固体は単純な濾過では除去できず、もし除去するなら、別の技術を用いる必要がある。
【００４０】
オリーブポリフェノール溶液中に懸濁状で残った該固体を除去するには遠心分離またはミクロ濾過（ＭＦ）が使える。
【００４１】
デカンタプロセスなどの遠心分離は２種の材料の分離に基づいており、その駆動メカニズムは２種の材料の比重の差からくるものであり、印加される力は角速度の変化からくるものである。ディスクタイプの遠心分離機は１００００Ｇまで作用し、この技術により０．４５μｍより大きな全ての可溶性固体はオリーブポリフェノール溶液から除去できる。この種の遠心分離機はまた浄化機またはデスランガー（ｄｅｓｌｕｎｇｅｒ）として知られており、市販入手可能である（例えばＷｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｉｎｃ．またはＡｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｉｎｃ．）。
【００４２】
ミクロ濾過はクロスフロー分離プロセスおよび従来式のデッドエンド濾過として行える。好ましくはこの発明では、懸濁固体の粒径が０．０５μｍを越えバクテリアと油脂小球だけが通常拒否される物質であるクロスフロー原理を用いたミクロ濾過が採用される。
【００４３】
ミクロ濾過は、大分子量で粒径が０．０５〜１０μｍの懸濁またはコロイド粒子を分離するには、低圧を用いる。ＭＦ膜孔の直径は通常０．１〜１０μｍであり１００〜８６０ｋＰａの圧力で作動する。１００００ドルトンを越える分子量の化合物は通常ミクロ濾過により分離される。ミクロ濾過ステップを含むことにより濾過プロセスの故に部分脱脂に至る。
【００４４】
ミクロ濾過ステップに使える数種の膜がある。例えば金属膜が使える。これらの膜は安定な孔マトリックスを有しており、圧縮焼結される。好ましくは、膜は精密なバブルポイント制御、均一な透過性、均一な有孔性、高効率、二方向フローを有しており、かつ標準３１６Ｌステンレス鋼から形成されている。例えば、これらの種類の膜としてはＭｏｔｔ ｃｏｒｐ（例えば３１６Ｌステンレス鋼、ニッケル、インコメル、ハステロイ、チタン）、Ｇｒａｖｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えばＳｃｅｐｔｅｒ）、Ａｔｅｃｈ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨなどがある。
【００４５】
ミクロ濾過にはセラミックの膜も使用できる。セラミック膜は筒状であってかつマルチチャンネル状である。支持材は通常純粋なａ−Ａｌ2Ｏ3からなっている。多孔性膜層はａ−Ａｌ2Ｏ3、ＴｉＯ2またはＺｒＯ2から形成されている。これらの種類の膜は化学的に安定（有機溶媒を用いてＰＨ０−１４）であり、熱的に安定であり（＞１００℃蒸気により消毒）、機械的に安定であり、化学的に不活性である。例挙するとＡｔｅｃｈ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（例えばＭｅｍｂｒａｌｏｘ）製などがある（いかなるサイズの膜が使われるか？）。
【００４６】
ミクロ濾過にはポリマー膜も使用できる。これらの種類の膜は通常ポリプロピレン、ポリビニリデン、フッ化物、ポリテトラフルオロエチレンまたはポリアクリロニトリルから形成される。例挙するとＫｏｃｈ（例えばＭＦＫ−６１８、ＭＦＫ−６０１）、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌおよび他製などがある。
【００４７】
遠心分離やミクロ濾過ステップを行う効果は、オリーブポリフェノール溶液がさらなる純化が行われて好ましくない組成が除去される、ことにある。繊維や他の不溶性化合物はデカント／濾過および遠心分離／ミクロ濾過のプロセス中に除去される。実際にはオリーブポリフェノール溶液中に残っているポリフェノールや蛋白や炭水化物やミネラルや油脂などの全ての固体は可溶性の化合物である。
【００４８】
ステップ（ｂ）後のポリフェノールの含有量はオリーブポリフェノール溶液中の総溶解固体の５〜２０ｗｔ％であり、例えば７ｗｔ％である。固体の可溶化と固体除去の後は、ポリフェノール濃度はほぼ２〜５倍に増加する。好ましくは、初期副産物出発材料中の乾燥抽出物に基づいて少なくとも３倍の増加である。
【００４９】
ステップ（ｂ）におけるポリフェノールの損失は、初期の副産物出発材料中の乾燥抽出物を基にして、１５ｗｔ％を越えてはならず、好ましくは１０ｗｔ％未満でなければならない。
【００５０】
乾燥抽出物として表される副産物中のオイルの含有量は５０ｗｔ％未満、好ましくは２５ｗｔ％、例えば１５ｗｔ％でなければならない。原材料中のオイルの含有量はオリーブオイル抽出プロセスにおいて制御される。初期の材料中に存在するオイルの全てがオリーブオイル抽出プロセスで除去された訳ではない。
【００５１】
オリーブオイルは油脂である。したがって、抽出ステップ（ｂ）で溶媒が使われた場合には、オリーブオイルはその極性の故に溶媒には溶解できない。前記したように、副産物はまだある種のオリーブオイルを含んでいる。オリーブオイルの融点は−１０℃であり、したがって通常のプロセス温度では、液状である。極性溶媒中ではオリーブオイルはエマルジョンを形成しないので、プロセスから除去しなければならない。したがって、脱脂ステップはこの発明において必須である。脱脂ステップが含まれなければならないが、その含まれる段階は選択的である。一実施例においては、油脂はステップ（ａ）前に除かれる。油脂の除去は部分的または完全に行なわれる。
【００５２】
脱脂ステップに用いられる適宜な方法としては溶媒抽出がある。副産物が粒状、例えばオリーブ粉の場合には、この技術は特に好ましい。
【００５３】
ステップ（ａ）前に溶媒抽出プロセスを使ってオリーブ粉を脱脂できる。オリーブ粉は１４〜２０ｗｔ％のオリーブオイルを含んでいる。食品産業での使用に適したヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチルまたは他の非極性溶媒などはオリーブオイルを抽出する溶媒として使用できる。ヘキサンが好ましい。
【００５４】
他の一実施例においては、脱脂ステップはオリーブポリフェノール溶液についてステップ（ｃ）の前にステップ（ｂ）の最終段階として行われる。この場合には、オリーブポリフェノール溶液は短時間（つまり、２〜２４時間）容器中で室温、好ましくは２５℃未満の温度で貯蔵される。この期間油脂が分離して溶液の上面に上る。オリーブポリフェノール溶液は底に残っている。この分離は単純なデカント、例えば反応器下の弁を開いて容器中に残っている油脂から懸濁粒子を含んだ液体を分離することにより、簡単に達成できる。分離後、油脂は簡単に除去できてオリーブオイルを得る。
【００５５】
これに代えて、オリーブポリフェノール溶液を容器中でオリーブオイルの融点より低い温度（＜−１０℃）で凍結させる。この操作は油脂分留が固体になるので、デカントプロセスにおける油脂分留の分離には好ましい。オリーブポリフェノール溶液を凍結するには、熱交換または直接ガス膨張（例えば窒素）が使える。このプロセスは低温分離として知られている。得られた他の分留は脱脂オリーブポリフェノール溶液である。
【００５６】
ステップ（ｂ）を行って得られたオリーブポリフェノール溶液は高比率の初期出発材料中に存在したポリフェノールを含んでいる。しかし該溶液は非常に希薄であり、したがって濃縮ステップ（ｃ）を行うことが必要である。従来は真空蒸着またはクロマトグラフィー法が使われてきたが、膜分離技術を採用したのがこの発明の必須の特徴である。
【００５７】
クロマトグラフィーカラムに代えて、膜技術を使用することにより、粒状ポリフェノールを抽出または純化するよりも存在するポリフェノールを濃縮する効果がある。つまり、オリーブポリフェノール濃縮物中に存在するポリフェノールは初期副産物出発材料中に存在するそれと本質的に同じである。勿論酵素処理ステップが行われると、分布は変化する。これにより、各ポリフェノールを個別に分離することなしに、ポリフェノールのファミリーとしての分離を促進する。
【００５８】
好ましき実施例においては、超濾過（ＵＦ）プロセスがステップ（ｃ）において採用されて、オリーブポリフェノールから最大の分子を分離する。超濾過は選択的分離ステップであり、大きな分子を除去することにより製品を濃縮・純化する。ＵＦにおいては低圧で適切な膜を使用する。ＵＦ膜孔の直径は通常０．０１〜０．１μｍであり、４８０〜１３８０ｋＰａの範囲内の圧力で作用する。分子量が１００００を越える化合物は通常そのようなプロセスで分離される。塩、砂糖、有機酸およびより小さなペプチドは通過するが、蛋白質、油脂および多糖類は通されない。このシステムは５００００ドルトンより大きな分子を分離できなければならない。
【００５９】
いく種類かの異なる膜が使用に適している。ＵＦ膜は通常セラミック、セルロース、ポリスルホンおよびポリビニリデンフルオライドなどから形成されている。例えば、筒状、中空繊維、板および渦巻き状膜が市販されている。この種の膜を例挙するとＫｏｃｈ Ｉｎｃ．（例えばＨＦＭ−１１６／１００、ＨＦＭ−１８０／５１３、ＨＦＫ−６１８））、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｉｎｃ、Ｉｎｇｅ ＡＧ Ｉｎｃ．（例えばＤｉｚｚｅｒシリーズ）製などがある。これらの膜は１４０〜６９０ｋＰａ（２０〜１００ｐｓｉ）の圧力で作用する。
【００６０】
この発明において言及されたＵＦにおいては、実際に全てのポリフェノールが膜を通過し、少しの分留だけが残留物中に残る。残留物中のポリフェノールの損失は１０ｗｔ％を越えてはならなく、好ましくは抽出されたオリーブポリフェノールの総溶解固体に基づいて５ｗｔ％を越えてはならない。選択的に残留物は抽出タンク戻されて、前記の作業に再び通される。副産物から抽出されたオリーブポリフェノールの分子量は１００〜６００ドルトンである。
【００６１】
出発材料としてアルペチンを用いた場合には、超濾過法は成功しないという従来の知識にも拘わらず、アルペチンを極性溶媒と混合して（ステップａ）かつポリフェノールを抽出する（ステップｂ）前のステップが採用された場合には、驚いたことに、超濾過ステップが成功するのである。理論に囚われなければ、除かないと膜を塞ぐであろうアルペチン中に存在する大きな懸濁固体の除去によるものと仮定される。またアルペチンが使用された副産物である場合には、ステップ（ｃ）の前に脱脂ステップが導入されれば、超濾過ステップは成功するだろう。
【００６２】
ＵＦ作業の後、オリーブポリフェノール透過物の総溶解固体中のポリフェノールの濃度は１５ｗｔ％、好ましくは２０ｗｔ％を越える、例えば３５ｗｔ％にも至る。
【００６３】
好ましくは、前のＵＦ作業で得られたオリーブポリフェノール透過物はナノ濾過（ＮＦ）膜を通過して、溶液から溶解したミネラルを除去する。ＮＦは逆浸透（ＲＯ）は秀れた分離プロセスではなく、選択性の若干少ない膜を使う。
【００６４】
選択的に，ＲＯ用の膜も使える。分子のサイズと形状によっては、ＮＦによれば、大きなイオンと無機成分は拒否するものの、小さなイオンが通過する。ＮＦ膜孔の直径は通常０．００１〜０．１μｍであり、膜は６９０〜４１４０ｋＰａの圧力で使用される。１９００ドルトンを越える分子量を有した化合物は通常分離され、かつ非常に薄いＮＦ膜は１００ドルトンを越える分子量の化合物を分離できる。この発明で使用されるＮＦは１００ドルトンを越える分子量限界を有している。
【００６５】
ＮＦ膜は通常薄いフィルム合成物やセルロース化合物から形成されている。ＮＦに使える膜は例えば中空繊維や渦巻き膜である。この種の膜を例挙するとＫｏｃｈ Ｉｎｃ．（例えばＴＦＣ−ＲＯ、ＴＦＣ−Ｓ、ＴＦＣ−ＳＲ３、ＳｅｌＲＯシリーズ）、ＰＣＩ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．（例えばＢ１ ｍｏｄｕｌｅ、Ｃ１０ ｍｏｄｕｌｅ、ＡＦＣ９９）、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｉｎｃ．製などがある。ＮＦに用いられる膜は０．００１〜０．０１μｍで作用する。この発明で言及するＮＦは２０００〜４８００ｋＰａ（３００〜７００ｐｓｉ）で作用する。
【００６６】
この発明で言及されるＮＦにおいては、実際に全てのポリフェノールが残留物中に残留する。ＵＦ作業の後に得られた透過物の総溶解固体を基にして、透過物中のポリフェノールの損失は１０ｗｔ％を越えてはならず、好ましくは５ｗｔ％未満でなければならない。
【００６７】
ＮＦ作業の後、残留物の総溶解固体中のポリフェノールの濃度は２０ｗｔ％に達し、好ましくは４０ｗｔ％を越え、例えば６５ｗｔ％である。
【００６８】
ＮＦ作業において、水の顕著な部分は除かれる。爾後、残留物中の総溶解固体は初期のＵＦ透過物中より高い。残留物中の総溶解固体は５ｗｔ％を越え、好ましくは１０ｗｔ％を越え、例えば２０ｗｔ％にも至る。
【００６９】
一実施例においては、ＵＦオリーブポリフェノール透過物とＮＦオリーブポリフェノール残留物またはこれらの混合物はさらなる真空濃縮に掛けられて、オリーブポリフェノール濃縮物を得る。この実施例においては、真空ドライヤーシステムを採用できる。オリーブポリフェノール濃縮物をさらに濃縮すべく、種々の工業用真空ドライヤー（例えば水平ドライヤーまたは垂直ドライヤー）が市販入手可能である。プロセス温度は７０℃未満、好ましくは６０℃未満、例えば４０℃である。溶媒としての水を除く作業圧力は３０ｋＰａ（３００ｍｂａｒ）未満、好ましくは２０ｋＰａ（２００ｍｂａｒ）未満である。
【００７０】
溶媒の除去後、総溶解固体が２０ｗｔ％を越える、好ましくは総溶解固体の２５ｗｔ％を超え、例えば総溶解固体の４５および６５ｗｔ％の製品が得られる。総オリーブポリフェノール含有量は使われた副産物によって決まる。好ましくは総ポリフェノール含有量は少なくとも１０ｗｔ％である。
【００７１】
最後のステップとして、最終応用目的に応じて、オリーブポリフェノール濃縮物を乾燥して固体、好ましくは粉を得るのが好ましい。乾燥後の最終水分量は６ｗｔ％未満、好ましくは３ｗｔ％未満、例えば１ｗｔ％でなければならない。
【００７２】
一実施例においては、オリーブポリフェノール濃縮物はパン真空ドライヤーを用いて乾燥する。乾燥後、硬い塊が得られる。好ましくは、該塊を製粉前にすりつぶして、粉を作るために粒子サイズを低減する。製粉にはハンマーまたはナイフタイプの製粉機が使える。粉化にはハンマーミル、ピンミル、クラシフィケーター分離ミルまたはミルの組合せを採用して粉化を行う。最終粒サイズ分布は３００μｍで９９ｖｏｌ％、好ましくは２００μｍで９９ｖｏｌ％、１００μｍでは９９ｖｏｌ％、例えば７５μｍで９９ｖｏｌ％でなければならない。
【００７３】
他の実施例においては、オリーブポリフェノール濃縮物がスプレードライヤーを用いて乾燥される。スプレー乾燥プロセスにおけるキャリアーとしては、いくつかの安定剤（例えばグアーガム）が使える。最終粉は１０ｗｔ％未満、好ましくは３ｗｔ％未満、例えば１ｗｔ％の安定剤を含むべきである。
【００７４】
選択的に、他の実施例においては、グルコシダーゼまたはエステラーゼ活性を具えた酵素を使って酵素処理ステップが行われる。この目的は存在するオレウロペインおよび／またはジメチルオレウロペインを加水分解して、主としてヒドロキシチロソール、チロソール、エレアノ酸およびグルコーゼを誘導体として得ることにある。オリーブポリフェノール誘導体は苦味が少ないので、よりよい抗酸化剤でありより容易に人間の身体に吸収されるからである。
【００７５】
オレウロペインおよび／またはジメチルオレウロペイン加水分解は２種の酵素、β−グリコシドおよびエステラーゼを使って行われる。β−グリコシダーゼはグリコシダーゼ結合を破壊してグルコース分子を解放しアグリコン（図１中の結合ｂ）を形成する。よく知られているが、グルコースを付着したポリフェノールに比べて、アグリコンポリフェノールは消化器内の身体により容易に吸収される。エステラーゼはエステル結合を破壊して、ヒドロキシチロソールおよびエレアノリン酸モノーテルペン（図１中の結合ａ）を解放する。エストラーゼ活性とグリコシダーゼ活性とが同時に起きるのが好ましい。
【００７６】
この発明においては、分離したβ−グリコシダーゼとエステラーゼとを使用できる。好ましくは、微生物源から酵素が分離される。
【００７７】
加えて、βーグリコシダーゼとエステラーゼを含む酵素の混合物または発酵によりポリフェノールを加水分解できる微生物が使用できる。分離した酵素は一般に改変された生物から得られる。Ｂｒｉａｎｔｅ他（２０００年）により使用された酵素が使用できる。酵素の混合物は菌または微生物源から得られる。例えばＣａｎｄｉｄａ ｍｏｌｉｓｃｈｉａｎａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｐｌａｎｔａｒｕｍである。直接の微生物を使う場合には、製品を発酵させる必要がある。適切な酵素は市販入手可能である（例えばＤＳＭまたはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ）。
【００７８】
オリーブが熟すると、オレウロペイン含有量は低減しヒドロキシチロソールの含有量は増加する。したがって、副産物の早期の熟し段階の場合には、ポリフェノール含有物を加水分解する必要はない。
【００７９】
副産物中のオリーブポリフェノールの加水分解はステップ（ｂ）中またはステップ（ｂ）の前にできる。選択的な酵素非活性化ステップが含まれる場合には、このステップの後で、ポリフェノール酸化酵素非活性化がすでに行われているように、グリコシダーゼおよびエステラーゼ活性を具えた酵素を副産物に加える必要がある。これによりグリコシダーゼおよびエステラーゼ活性を具えた酵素がステップ（ａ）においてまた活性化されないことを確実にできる。
【００８０】
ステップ（ｃ）の後で酵素処理ステップを行うこともできる。この場合には、オリーブポリフェノール濃縮物が加熱されて、最適温度に達するようになり、加水分解または発酵のために時間が保たれる。反応の条件、例えば温度、ｐＨおよび濃度および時間を最適にして、適切なレベルの酵素反応を達成するようにする。通常、β−グリコシダーゼは３５〜４５℃、ｐＨ４〜６．５で最も活性である。熱安定酵素例えば組換えグリコシダーゼを使うこともでき、これは６０〜７０℃で最適の活性を有する。同様に、エステラーゼも使うことができ、生理学的な温度で活性であるか、熱的に安定であり、６５℃までの「温度で活性である。
【００８１】
加水分解後の加水分解オレウロペインおよび／またはジメチルオレウロペイン（セコロイド、ｓｅｃｏｒｏｉｄｓ）の含有量は一般に５０ｗｔ％を越え、好ましくは７０ｗｔ％を越えなければならず、例えば９５ｗｔ％である。酵素処理ステップは２０〜８０℃、好ましくは３５〜６５℃、より好ましくは５０〜６０℃の範囲の温度で行われる。
【００８２】
この発明のプロセスで得られたオリーブポリフェノール濃縮物は種々の用途があり、例えば多くの食品の成分として使える。オリーブポリフェノールは食品に強い苦味を付与する。加えて食品に抗酸化活性を与えて、酸化を低減して貯蔵期間を増加する。
【００８３】
さらにオリーブポリフェノールは抗微生物性を有しており微生物の成長を防止し、これにより食品の貯蔵期間を増加することを示した。オリーブポリフェノール濃縮物はまた、健康的な性質の故に、多くの食品において機能的な性質を増加するサプリメントとして使用でき、かつピル、カプセルその他の製品の製造において栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として使用できる。
【実験例１】
【００８４】
６０％湿度と０．８５％総ポリフェノールと０．１％ヒドロキシチロソールを含む１０００Ｋｇのアルペオルホを５０００Ｋｇの蒸留水と２０ｍ3 ３１６Ｌステンレス鋼容器中で混合した。混合物を８５℃に５分間加熱して（漂白）ポリフェノールオキシダーゼを非活性化した。漂白処理の直後、混合物を５５℃で冷却した。β−グルコシダーゼ（２１２１３ｍＵ／ｍＬのβ−グルコシダーゼ活性）とエステラーゼを含む３００ｇの市販酵素を添加し、混合物を３時間加水分解した。
【００８５】
ついで混合物を７５℃で加熱してポリフェノールを抽出した。抽出後、デカンターを使って固体を分離した。ついでディスク遠心分離機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｉｎｃ．）で純化して２６ｇ／Ｌの総固体を含んだオリーブポリフェノール抽出物を４５４０ ｌ得た。Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法で測定したらこの７ｗｔ％は総ポリフェノールであった。
【００８６】
オリーブポリフェノール抽出物をついで非常に開いた超濾過に通して、高マクロ分子（ＨＦＭ−１１６／１００ Ｋｏｃｈ．３０ｐｓｉ）を分離した。爾後４５００ ｌの透過物が得られた。この透過物は９１０ｇ／Ｌの固体を２０ｗｔ％の総ポリフェノールとともに含んでいた。
【００８７】
ついで、ＵＦプロセスで得られた透過物をナノ濾過に通して透過物をさらに濃縮した（ＴＦＣ−Ｓ Ｋｏｃｈ．４００ｐｓｉ）。爾後１６０ ｌの残留物が得られた。これは１００ｇ／Ｌの固体を５０ｗｔ％の総ポリフェノールとともに含んでいた。
【００８８】
ＮＦ残留物を水平真空ドライヤー中で５５℃、３００ｍｂａｒで濃縮した。乾燥後、３５％の総溶解固体（ＴＤＳ）を含んだ４５ ｌの液状オリーブポリフェノール濃縮物が得られた。この５０ｗｔ％は総ポリフェノール濃縮物であった。
【実験例２】
【００８９】
ＧＢ３１４２９４．０の実験例２に記載されたプロセスによりアルペオルホからオリーブ粉を得た。特に、１０００Ｋｇのアルペオルホを予処理して微生物劣化を回避し、８０ｋｇのエタノールを添加して１０８０ｋｇの安定化アルペオルホを得た。安定化アルペオルホの１０８０ｋｇは６５℃で１５分間漂白して、ＰＰＯを非活性化した。漂白されたペースト状耐熱性のβ−グルコシダーゼを加水分解オレウロペインに３時間・６０℃で添加した。加水分解の直後ペーストを５５℃、１０ｍｍＨｇ（１．３ｋｇ）で火中で乾燥した。乾燥は同時に２個の各５００ｋｇ容量のＧｕｅｄｕドライヤーで起きた。各バッチについて１２時間であり、エネルギー消費は約１ｋｗ／ｋｇ湿ペーストであった。
【００９０】
４００ｋｇの乾燥アルペオルホと６８０ｋｇの濃縮物が回収された。０．５００ｍｍ寸法より高い粒子を分離して４００ｋｇの乾燥アルペオルホをふるいにかけた。２４０ｋｇのピットが分離され、１６０Ｋｇの乾燥フレッシュが得られた。該フレッシュをピンミル中で−１０℃未満の温度の低温冷却システムで粉化し、粒子の９９％の寸法を０．０７５ｍｍ未満に低減した。
【００９１】
５ｗｔ％の水分、３％総ポリフェノールおよび１％ヒドロキシチロソールを含むこのオリーブ粉１０００Ｋｇを１００００Ｋｇの溶媒（水：エタノール＝１：１）で抽出した。混合物を７５℃で加熱してポリフェノールを抽出した。
【００９２】
抽出後、デカンターを使って固体が分離され９０８０ ｌの溶液が得られた。次にミクロ濾過膜（ｍｅｍｂｒａｌｏｘ Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．３０ｐｓｉ）を用いて固体を浄化した。爾後９０００ ｌのオリーブポリフェノール溶液が得られた。この溶液は２５ｇ／ｌの固体を含み、１２．４％が総ポリフェノールであった。
【００９３】
該溶液を非常に開いた超濾過に掛けて高分子（ＨＦＭ−１１６／１００ Ｋｏｃｈ．３０ｐｓｉ ）を分離した。爾後８．９４０リットルの透過物が得られた。この透過物は２５ｗｔ％の総ポリフェノールの１１．７０ｇ／Ｌの固体を含んでいた。
【００９４】
次いで、ＵＦプロセスで得られた透過物をナノ濾過に通して透過物を濃縮した（ＴＦＣ−Ｓ Ｋｏｃｈ、４００ｐｓｉ）。ナノ濾過プロセス後に２９０リットルの残留物が得られた。この残留物は１５０ｇ／Ｌの固体を含み、その６０ｗｔ％が総ポリフェノールであった。
【００９５】
ＮＦ残留物を水平真空ドライヤー中で５５℃・３００ｍｂａｒで濃縮した。乾燥後、４０％の総溶解固体（ＴＤＳ）を含んだ液状オリーブポリフェノール濃縮物１３０ ｌが得られ、その５０ｗｔ％が総ポリフェノール濃縮物であった（ほぼ２６ｋｇのポリフェノール）。
【００９６】
爾後５％のグアーガムをＮＦ残留物に添加してスプレー乾燥した。３％水分と４３ｗｔ％総ポリフェノールを有した粉化オリーブポリフェノール濃縮物が６０Ｋｇ得られた。
【実験例３】
【００９７】
Ｒｏｍｅｒｏ他（２０００年）により開示された方法を用いて実験例２のプロセスにより得られたオリーブポリフェノール濃縮物を分析した。得られたクロマトグラムを図８に示す。この図はオリーブポリフェノールの典型的な分布を示している。ヒドロキシチロソール（６．９８１ｍｉｎ）とチロソール（８．９４９ｍｉｎ）が明らかに識別される。通常３５ｍｉｎで現われるオレウロペインが存在しない。これは酵素処理ステップの採用とオレウロペインの成分の変態を示している。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
この発明はオリーブポリフェノール濃縮物を製造産業で広く応用できる。
【非特許文献１】ＧＢ ０３１４２９４．０ （Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）． Ｏｌｉｖｅ Ｐｏｗｄｅｒ．
【非特許文献２】Ａｂｓｔｒａｃｔｓ． ２００３． Ｆｉｒｓｔ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ． １８ ｔｏ ２１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ， Ｖｉｃｈｙ， Ｆｒａｎｃｅ．
【非特許文献３】Ａｍｉｏｔ Ｍ．， Ｆｌｅｕｒｉｅｔ Ａ．， ａｎｄ Ｍａｃｈｅｉｘ ． １９８６． Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｏｌｉｖｅ ｄｕｒｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ３４：８２３−８２６．
【非特許文献４】Ａｎｇｅｒｏｓａ Ｆ， ｄ‘Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ Ｎ．， Ｃｏｒａｎａ Ｆ． ａｎｄ Ｍａｌｌｅｉｒｏ Ｇ． １９９６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｎｄ ｓｅｃｏｉｒｉｄｏｉｄ ａｇｌｙｃｏｎｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｖｉｒｇｉｎ ｏｉｌ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ７３６： １９５−２０３．
【非特許文献５】Ｂｉａｎｃｏ Ａ． ａｎｄ Ｕｃｃｅｌｌａ Ｎ． ２０００． Ｂｉｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｏｌｉｖｅ． Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ． ３３： ４７５−４８５．
【非特許文献６】Ｂｌｅｋａｓ Ｇ．， Ｖａｓｓｉｌａｋｉｓ Ｃ， Ｈａｒｉｚａｎｉｓ Ｃ， Ｔｓｉｍｉｄｏｕ Ｍ． ａｎｄ Ｂｏｓｋｏｕ Ｄ． ２００２． Ｂｉｏｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎ ｔａｂｌｅ ｏｌｉｖｅｓ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ５０： ３６８８：３６９２
【非特許文献７】Ｂｒｉａｎｔｅ Ｒ．， Ｐａｔｕｍｉ Ｍ．， Ｌｉｍｏｎｇｅｌｌｉ Ｓ．， Ｆｅｂｂｒａｉｏ Ｆ．， Ｖａｃｃａｒｏ Ｃ．， Ｄｉ Ｓａｌｌｅ Ａ．， Ｌａ Ｃａｒａ Ｆ． ａｎｄ Ｎｕｃｃｉ Ｒ． ２００２． Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｗｏ Ｉｔａｌｉａｎ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｏｆ Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐｅａ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６２， ７９１ − ７９８．
【非特許文献８】Ｈａｒｗｏｏｄ Ｊ． ａｎｄ Ａｐａｒｉｃｉｏ Ｒ． ２０００． Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ａｓｐｅｎ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ． Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ．
【非特許文献９】Ｉｍｐｒｏｌｉｖｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ． ２０００． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ−ｓｏｌｉｄ ｗａｓｔｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｆｉｎａｌ ｒｅｐｏｒｔ． ＦＡＩＲ ＣＴ９６ １４２０．
【非特許文献１０】Ｋｉｒｉｔｓａｋｉｓ Ａ． １９９１． Ｅｌ ａｃｅｉｔｅ ｄｅ ｏｌｉｖａ． Ｅｄ． Ａ． Ｍａｄｒｉｄ． Ｓｐａｉｎ．
【非特許文献１１】Ｍａｅｓｔｒｏ−Ｄｕｒａｎ Ｒ．， Ｌｅｏｎ Ｒ． ａｎｄ Ｒｕｉｚ Ｖ． １９９４． Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ｏｌｉｖｅ （Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐｅａ）． Ｇｒａｓａｓ Ａｃｅｉｔｅｓ ４５， ２６５−２６９．
【非特許文献１２】Ｒｏｍｅｒｏ， Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ， Ｐｅｄｒｏ Ｇａｒｃｉａ， ｅｔ ａｌ． ２００２． Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｂｌａｃｋ Ｓｐａｎｉｓｈ ｏｌｉｖｅ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ． Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２１５：４８９−４９６．
【非特許文献１３】Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ Ｖ．， Ｏｒｔｈｏｆｅｒ Ｒ． ａｎｄ Ｌａｍｕｅｌａ−Ｒａｖｅｎｔｏｓ Ｒ． １９９９． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ． ００７６−６８７９１９９．
【非特許文献１４】Ｖｉｓｉｏｌｉ Ｆ．， Ｒｏｍａｎｉ Ａ．， Ｍｕｌｉｎｎａｃｃｉ Ｎ．， Ｚａｒｉｎｉ Ｓ．， Ｃｏｎｔｅ Ｄ．， Ｖｉｎｃｉｅｒｉ Ｆ． ａｎｄ Ｇａｌｌｉ Ｃ． １９９９． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｏｌｉｖｅ ｍｉｌｌ ｗａｓｔｅ ｗａｔｅｒ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ４１ ， ５１８１−５１８７．
【非特許文献１３】Ｖｉｓｉｏｌｉ Ｆ．， Ｂｅｌｌｏｍｏ Ｇ．， ａｎｄ Ｇａｌｌｉ Ｃ． １９９８． Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４７， ６０−６４．
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】オリーブ中の原理的フェノール化合物の化学構造を示す。
【図２】ステップ（ｂ）の一実施例のグラフである。
【図３】ステップ（ｂ）の一部として行われる第２の抽出ステップのグラフである。
【図４】ステップ（ｃ）の一例のグラフである。
【図５】さらなるナノ濾過が行われるステップ（ｃ）のグラフである。
【図６】ステップ（ｃ）で行われる乾燥ステップのグラフである。
【図７】粉状オリーブポリフェノール濃縮物を与えるための最終乾燥ステップのグラフである。
【図８】実験例３の結果を示すクロマトグラムである。
【技術分野】
【０００１】
この発明はオリーブポリフェノールに富んだオリーブ製品で、始めの材料がオリーブ油抽出工程の副産物から得る工程に関するものであり、特に液状および粉状のオリーブポリフェノール濃縮物を製造する工程に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ＥＵは世界中のオリーブ生産の約７４％を生産しており、その内スペインは４９％で総耕作面積が２１５００００Ｈａである。世界のオリーブ生産は過去１０年間に９〜１５百万トンの間を変動しており、その内９０〜９５％がオリーブ油とアルペオルホ油の生産に使われている。
【０００３】
オリーブ油の生産においては、オリーブ油工場やオリーブプレス機で発生される副産物の利用という大きな問題がある。３段階方式のオリーブ油抽出も「古い方法」として知られており、粉引き、打解、プレスおよび遠心分離の操作を含んでいる。オルホ５０〜６０％湿分およびアルペチンがプレス工程で得られる。２段階方式は「新方法」として知られており、粉引き、デカントおよび遠心分離の操作を含んでいる。この場合アルペオルホがデカント工程で得られる（６０〜７４ｗｔ％湿分）。
【０００４】
最近異なる製品がオリーブから引き出されており、オリーブ粉（３〜６ｗｔ％湿分）が登場した。この製品は人間の消費用である。オリーブ粉については特許が取られている（英国特許出願第０３１４２９４．０号）。
【特許文献１】英国特許出願第０３１４２９４．０号
【０００５】
これらの３種の副産物の乾燥組成は同じであり、ポリフェノール２〜４ｗｔ％、繊維５０〜６０ｗｔ％、油脂１０〜２０ｗｔ％、蛋白質１０〜１５ｗｔ％、炭水化物１０〜１５ｗｔ％およびミネラル３〜６ｗｔ％である。ポリフェノールがこれらの副産物から抽出され得るプロセスを開発するのが有利である。
【０００６】
数種のオリーブ成分が人間の健康上重要な役割を示すことがよく認められている。これらの成分中でポリフェノールは非常に重要な部分である。それらはオリーブ油の安定性と知覚特性に深く関与している。しかも薬理学的な性質を具えたそれらは天然の抗酸化物であり、グラム陽性微生物を抑制する。
【０００７】
オリーブ果物は１０００ｇのサンプル当り８０ｍｇまでのポリフェノールを含有できる。これらのポリフェノールは純粋なオリーブ油の独特な芳香に深く関与している。総フェノール含有量とフェノール成分の分布とは栽培、成長場所および成熟程度などにより影響される。ポリフェノールの一例としてオレウロペインがある。オレウロペイン含有量はオリーブ果物が成熟するにしたがって低減するが、ジメチルオレウロペインと２．４−ジヒドロキシ・フェニルエタノールの含有量は増加する。
【０００８】
セコイルドイド、オレウロペイン、ジメチルオレウロペインおよびリグストロサイドは主たるフェノールグルコサイドであり、ベルバコサイド（ヒドロキシチロソールのカフェ油脂ハモノシグルコサイド）はオリーブ果物から引き出される主たるヒドロキシナム酸である。オレウロペインのアグリコーンは２−（４−ジヒドロキシフェニル）−エタノール（ヒドロキシチロソール）を有したエレノール酸のエステルであり、リグストロサイドのアグリコーンは２−（４−ヒドロキシフェニル）−エタノール（チロソール）（図１）を具えたエレノール酸のエステルである。
【０００９】
オレウロペインはオリーブ果物の苦さに深く関与する主要なフェノール成分である。しかもヒドロキシチロソール（３，４−ＤＨＰＥＡ）およびチロソール（ｐ−ＨＰＥＡ）などのフェニルアルコールやベルスコサイドおよびフェノール酸（ヒドロキシナミック、ヒドロキシゼンゾイック、ヒドロキシカフェイックおよびヒドロキシフェニル酢酸を含む）はオリーブ果物中で報告されている。
【００１０】
オリーブの乳酸醗酵はオレウロペインおよびルテオリン７−グルコサイドのヒドロキシルチロソール、チロソールおよびルテオリンへの完全な加水分解を齎す。これはラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株からのβグルコシダーゼおよびエステラーゼによって触媒作用される。
【００１１】
ギリシャ、ポルトガル、イタリーおよびスペインテーブルオリーブのヒドロキシチロソールおよびヒドロキシチロソール誘導体（オレウロペイン、オレウロペインアグリコーン、ジメチル・オレウロペインおよびヒドロキシチロソール グルコサイド）の含有量はそれぞれ１００〜４３０ｍｇ／Ｋｇおよび３６７０〜５６１０ｍｇ／Ｋｇの範囲にある。
【００１２】
最近、Ｂｌｅｋａｓ他がカラマタおよびスパニッシュタイプオリーブ油に関して高レベルのヒドロキシチロソール（２５０〜７６０ｍｇ／Ｋｇ）を検出した（２００２年）。イタリア栽培のオリーブ果物中のベルバスコサイドの含有量は１６０〜３２００ｍｇ／Ｋｇであるが、ルチンおよびルテオリン７−グルコサイド、２種の主オリーブ果物中のフラボノイドの濃度はそれぞれ１１０〜６６０および５〜６００ｍｇ／Ｋｇである。
【００１３】
オリーブポリフェノールはオリーブ油の酸化安定性を高める役目を果たし、かつまた人間の健康にポジティブな効果を有することが発見されている。実験室内の研究ではヒドロキシチロソールが人間の低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）酸化を抑制すること、遊離基を捕捉すること、小板状集合および人間ｎｅｕｔｒｏｐｈｙｌｓ（抗炎症性を示す）のｌｅｕｃｏｔｒｉｅｎｅの製造を抑制すること、細胞保護を与えることが示されている。またヒドロキシチロソールが実験では呼吸および腸における感染を引き起こすグラム陽性およびグラム陰性バクテリアに対して逆らって働くことが示されている。
【００１４】
オリーブポリフェノールは極性溶媒に可溶である。それらは一般に単純な可溶化処理により抽出される。しかし最終抽出物中に存在するポリフェノール濃度は通常乾燥抽出物中の濃度の２〜３倍に過ぎない。何故かというと、それらは通常のフィルターを通過するオリーブ中に存在する他の化合物があるからである。それらの不純物は除去してフェノール分留を純粋化しなければならない。
【００１５】
ＥＰ−Ａ−１３６９４０７号には水性抽出物へのクロマトグラフィー分離処理を使ってオリーブ副産物から特定のポリフェノール、ヒドロキシチロソールを抽出する方法を開示している。該処理は、第１のイオン交換ステップと極性と分子サイズに基づいたポリマー吸収剤選択性を使った第２のステップとを、含んでいる。これにより単一のポリフェノールが分離されるが、これはポリフェノールが食品用に使用される場合には必要ではない。
【特許文献２】ＥＰ−Ａ−１３６９４０７号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
この発明の目的はオリーブ油製造の副産物中に存在する全ての異なるポリフェノールを該副産物から集団として分離でき、しかも望ましくない不純物は除去できるプロセスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この発明が提供するプロセスにおいては、オリーブオイル抽出物の副産物からオリーブポリフェノール濃縮物が得られるものであって、（ａ）極性溶媒と副産物とを混合して副産物／溶媒混合物を形成するステップと、（ｂ）該混合物からポリフェノールを抽出してオリーブポリフェノール溶液と抽出固体とを得るステップと、（ｃ）膜分離技術によりオリーブポリフェノール溶液を濃縮して存在するポリフェノールの濃度が少なくとも１０ｗｔ％のオリーブポリフェノール濃縮物を得るステップとを含んでなり、さらに脱脂ステップを含んだものである。
【００１８】
「抽出物のオリーブの副産物」という用語はオリーブ油抽出３段階プロセスで得られるオルホおよび／またはアルペチン、オリーブ油抽出２段階方法で得られるアルペオルホ、オルホまたはアルペオルホから形成されるこれらの半固体または微粒子物質のどれかからの水性抽出物を言うものである。
【００１９】
ＧＢ−Ａ−０３１４２９４．０に開示されたオリーブ粉は適切な粒子状出発材料の一例である。このオリーブ粉は水性オリーブペーストを低温で乾燥および乾燥粉砕により処理することにより得られるものである。該水性ペーストは全てのオリーブ果物、オルホおよびアルペオルホから形成することができる。準備プロセスでは酵素処理の選択的な予備ステップを含んでいる。例えば該粉は少なくとも９９ｗｔ％粒サイズが０．５５ｍｍ未満であるという性質を具えている。
【特許文献３】ＧＢ−Ａ−０３１４２９４．０
【００２０】
３段階オリーブ油抽出で得られるオルホの収量はほぼ６０〜７５％であり、アルペチンの収量はほぼ３０％である。平均して、オルホは基本的に水２５％、油１０．２％、炭水化物４４．２％、全繊維１３．５％、蛋白質３．７％、灰２．４７％である。オルホ中のポリフェノールの含有量は０〜１％の間で変動し、アルペチンは一般にほぼ０．６２％のポリフェノール平均含有量である。
【００２１】
２段階オリーブ油抽出で得られるアルペオルホの収量は一般に７０〜８０％である。平均して、アルペオルホは基本的に水６０．６８％、油５．３４％、炭水化物２３．１８％、全繊維７．０８％、蛋白質１．９４％、灰１．８２％である。アルペオルホは通常０．４％までの全ポリフェノールを含有している。
【００２２】
ある種のアルマサラ（ａｌｍａｚａｒａ）はアルペオルホまたはオルホの製造中に核を除去する。湿ったアルペオルホまたはオルホから除かれた核の収量はオリーブの種類および使用された篩の直径により１０〜２０ｗｔ％の範囲で変動する。この発明に関しては除去された核は選択的である。
【００２３】
この発明における最終製品のサンプル中のポリフェノールの含有量を測定するにはいくつかの方法が使用される。オリーブサンプル中のポリフェノールの総含有量を測定する最も一般的な方法はＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法であり、その結果はｗｔ％で表わされる（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ他、１９９９年）。その他にもポリフェノールを識別・定量する方法としては、ＨＰＬＣシステムおよび重量分光計、ＬＣ−ＭＳ、ＵＶ検知に組み合わされたＨＰＬＣ、超臨界流体抽出（ＳＦＥ）、ダイオードアレイ分光学および重量分光学によるダブルオンライン検知を使用するＨＰＬＣ（ＨＰＬＣ−ＤＡＳ−ＭＳ）およびＬＣ−ＮＭＲがある。
【００２４】
この発明の第１のステップ（ａ）は副産物を極性溶媒と混合して、存在するポリフェノールを溶液中に行かせることである。使用される極性溶媒は好ましくは人間の消費のためにＣｏｄｅｘ−Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓにより認可されたものである。より好ましくは溶媒は水、エタノールまたはそれらの混合物である。このステップの結果は副産物／溶媒混合物である。
【００２５】
選択的にステップ（ａ）の後で、酵素非活性化ステップを含めることもできる。このステップを含めることにより、プロセス中にポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）酵素を非活性化または抑制するのである。ＰＰＯは好ましくない反応であるオリーブポリフェノールの重合に深く関与するもので、そのような酵素非活性化ステップはいくつかの方法をとることができる。
【００２６】
酵素反応を抑制するひとつの方法は反応の本質的な成分のひとつを除去することである。ポリフェノールオキシダーゼにより触媒作用をされる反応は基質、酵素それ自身、酸素および銅の存在を必要とする。この発明の一実施例においては、プロセス中に酸素が除かれる。これを行うには真空処理または二酸化炭素または窒素などの異なる気体を使っての置換がある。
【００２７】
酵素非活性化ステップの他の実施例においては、銅に対する親和性を具えたキレート剤の添加により銅を反応から除去する。適切なキレート剤としては、クエン酸、アスコルビン酸、ＥＤＴＡがある。これらの処理剤はまた反応媒体のｐＨを低下させるので好ましい。
【００２８】
さらなるＰＰＯ酵素の非活性化方法としては、加熱ステップを行うものである。この方法が採用された場合には、７５〜１００℃の温度範囲と５〜１０分の時間範囲で漂白を行うのが好ましい。そのような加熱の採用により酵素が変性される。
【００２９】
上記した実施例がポリフェノールオキシダーゼ酵素が非活性化または抑制される例に過ぎないことを当業者は理解するであろう。
【００３０】
ステップ（ａ）に続いて、副産物／溶媒混合物は抽出ステップに掛けられて存在するポリフェノールが抽出される。数種の異なる副産物がステップ（ａ）に掛けられている場合には、ステップ（ｂ）において結合または個別に処理できる。
【００３１】
この発明の好ましき実施例においては、溶媒を添加して爾後液体と固体とを分離してオリーブポリフェノールは副産物／溶媒混合物から固体−液体抽出により抽出される。
【００３２】
オリーブポリフェノールを抽出するには数種の溶媒を使用でき、好ましくはＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓの認可した人間の消費のためのものが使われる。好ましくは水、エタノールまたはそれらの混合物が使用される。
【００３３】
副産物からポリフェノールを抽出するには、溶媒に対する低減ポリフェノールオキシダーゼ活性を具えた副産物の重量比は１／３〜１／３０の範囲内にある。より具体的には副産物がアルペオルホまたはオルホである場合には、低減ポリフェノールオキシダーゼ活性／溶媒を具えた副産物との間の該重量比は好ましくは１／３〜１／３０であり、例えば１／１０である。ポリフェノールがオリーブ粉から抽出される場合には、低減ポリフェノールオキシダーゼ活性溶媒を具えた副産物との間の該重量比は好ましくは１／１０〜１／３０、例えば１／２０である。
【００３４】
プロセス中のポリフェノール重合化および酸化を回避するには、抽出温度は好ましくは８５℃未満、例えば３０〜７０℃である。抽出にあっては、低減ポリフェノールオキシダーゼ活性を具えた副産物と溶媒との混合物は攪拌する必要がある。抽出ステップ（ｂ）は食品産業用の適宜な装置内で起きる。例えばステンレス鋼からなる３１６Ｌ反応器またはステンレス鋼からなる３０４Ｌ反応器である。
【００３５】
抽出ステップの時間の長さはプロセスの効率により変動する。単一ステップ抽出のための適切な時間は少なくとも２時間であり、例えば３〜５時間である。できることなら、複バッチ抽出を使って同じサンプルからポリフェノールを抽出するのがよい。例えば、サンプルは１ステップで抽出でき、爾後オリーブポリフェノール溶液と抽出された固体とはデカント（デカンターにより）または濾過により分離され、ついで所望の抽出の収量に応じて抽出された固体を使って作業を２または３回行う。消費された固体中の水分量は通常５５〜７０ｗｔ％である。産業用デカンターは市販されている（例えばＷｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｉｎｃ．またはＡｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｉｎｃ．）。従来のデカンターを使って混合物から固体分留を除去でき、３０００〜５０００ｒｐｍ（２０００〜３０００Ｇ）で動作する。
【００３６】
低減ポリフェノールオキシダーゼ活性を具えた副産物のデカンター分離は０．１ｗｔ％、好ましくは３ｗｔ％、より好ましくは５ｗｔ％を越える総溶解固体を含んだ溶液を形成する。
【００３７】
溶液中のポリフェノール含有量は総溶解固体の２〜１５ｗｔ％であり、例えば７ｗｔ％である。該溶液は通常初期の副産物中に存在する他の可溶成分を含んでおり、それらもプロセス中で抽出される。可溶液体状中のオリーブポリフェノール溶液が抽出および固体分離プロセス後に得られる。
【００３８】
抽出ステップ（ｂ）もまたデカント前に選択的予備固体−液体分離ステップを含むことがあり、そこでは固体が除去されて液体が回収される。これを達成するには口径が１０〜１５０μｍ、好ましくは０．２〜３０μｍの範囲のステンレス鋼、紙またはセルローズフィルタ−などにより濾過する。例えば適切なフィルターとしてはＢａｃｈｉｌｌｅｒ Ｓ．Ａ（スペイン）製造のＮｕｔｃｈａタイプのフィルターなどが挙げられる。
【００３９】
デカントおよび／または濾過ステップ後に得られたオリーブポリフェノール溶液は通常、懸濁固体を含んでおり、その粒径は４μｍで９９ｖｏｌ％の分布である。これらの固体は懸濁はしているが溶解はしていない。それらは０．４５μｍより大きい。そのような固体は単純な濾過では除去できず、もし除去するなら、別の技術を用いる必要がある。
【００４０】
オリーブポリフェノール溶液中に懸濁状で残った該固体を除去するには遠心分離またはミクロ濾過（ＭＦ）が使える。
【００４１】
デカンタプロセスなどの遠心分離は２種の材料の分離に基づいており、その駆動メカニズムは２種の材料の比重の差からくるものであり、印加される力は角速度の変化からくるものである。ディスクタイプの遠心分離機は１００００Ｇまで作用し、この技術により０．４５μｍより大きな全ての可溶性固体はオリーブポリフェノール溶液から除去できる。この種の遠心分離機はまた浄化機またはデスランガー（ｄｅｓｌｕｎｇｅｒ）として知られており、市販入手可能である（例えばＷｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｉｎｃ．またはＡｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｉｎｃ．）。
【００４２】
ミクロ濾過はクロスフロー分離プロセスおよび従来式のデッドエンド濾過として行える。好ましくはこの発明では、懸濁固体の粒径が０．０５μｍを越えバクテリアと油脂小球だけが通常拒否される物質であるクロスフロー原理を用いたミクロ濾過が採用される。
【００４３】
ミクロ濾過は、大分子量で粒径が０．０５〜１０μｍの懸濁またはコロイド粒子を分離するには、低圧を用いる。ＭＦ膜孔の直径は通常０．１〜１０μｍであり１００〜８６０ｋＰａの圧力で作動する。１００００ドルトンを越える分子量の化合物は通常ミクロ濾過により分離される。ミクロ濾過ステップを含むことにより濾過プロセスの故に部分脱脂に至る。
【００４４】
ミクロ濾過ステップに使える数種の膜がある。例えば金属膜が使える。これらの膜は安定な孔マトリックスを有しており、圧縮焼結される。好ましくは、膜は精密なバブルポイント制御、均一な透過性、均一な有孔性、高効率、二方向フローを有しており、かつ標準３１６Ｌステンレス鋼から形成されている。例えば、これらの種類の膜としてはＭｏｔｔ ｃｏｒｐ（例えば３１６Ｌステンレス鋼、ニッケル、インコメル、ハステロイ、チタン）、Ｇｒａｖｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えばＳｃｅｐｔｅｒ）、Ａｔｅｃｈ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨなどがある。
【００４５】
ミクロ濾過にはセラミックの膜も使用できる。セラミック膜は筒状であってかつマルチチャンネル状である。支持材は通常純粋なａ−Ａｌ2Ｏ3からなっている。多孔性膜層はａ−Ａｌ2Ｏ3、ＴｉＯ2またはＺｒＯ2から形成されている。これらの種類の膜は化学的に安定（有機溶媒を用いてＰＨ０−１４）であり、熱的に安定であり（＞１００℃蒸気により消毒）、機械的に安定であり、化学的に不活性である。例挙するとＡｔｅｃｈ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（例えばＭｅｍｂｒａｌｏｘ）製などがある（いかなるサイズの膜が使われるか？）。
【００４６】
ミクロ濾過にはポリマー膜も使用できる。これらの種類の膜は通常ポリプロピレン、ポリビニリデン、フッ化物、ポリテトラフルオロエチレンまたはポリアクリロニトリルから形成される。例挙するとＫｏｃｈ（例えばＭＦＫ−６１８、ＭＦＫ−６０１）、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌおよび他製などがある。
【００４７】
遠心分離やミクロ濾過ステップを行う効果は、オリーブポリフェノール溶液がさらなる純化が行われて好ましくない組成が除去される、ことにある。繊維や他の不溶性化合物はデカント／濾過および遠心分離／ミクロ濾過のプロセス中に除去される。実際にはオリーブポリフェノール溶液中に残っているポリフェノールや蛋白や炭水化物やミネラルや油脂などの全ての固体は可溶性の化合物である。
【００４８】
ステップ（ｂ）後のポリフェノールの含有量はオリーブポリフェノール溶液中の総溶解固体の５〜２０ｗｔ％であり、例えば７ｗｔ％である。固体の可溶化と固体除去の後は、ポリフェノール濃度はほぼ２〜５倍に増加する。好ましくは、初期副産物出発材料中の乾燥抽出物に基づいて少なくとも３倍の増加である。
【００４９】
ステップ（ｂ）におけるポリフェノールの損失は、初期の副産物出発材料中の乾燥抽出物を基にして、１５ｗｔ％を越えてはならず、好ましくは１０ｗｔ％未満でなければならない。
【００５０】
乾燥抽出物として表される副産物中のオイルの含有量は５０ｗｔ％未満、好ましくは２５ｗｔ％、例えば１５ｗｔ％でなければならない。原材料中のオイルの含有量はオリーブオイル抽出プロセスにおいて制御される。初期の材料中に存在するオイルの全てがオリーブオイル抽出プロセスで除去された訳ではない。
【００５１】
オリーブオイルは油脂である。したがって、抽出ステップ（ｂ）で溶媒が使われた場合には、オリーブオイルはその極性の故に溶媒には溶解できない。前記したように、副産物はまだある種のオリーブオイルを含んでいる。オリーブオイルの融点は−１０℃であり、したがって通常のプロセス温度では、液状である。極性溶媒中ではオリーブオイルはエマルジョンを形成しないので、プロセスから除去しなければならない。したがって、脱脂ステップはこの発明において必須である。脱脂ステップが含まれなければならないが、その含まれる段階は選択的である。一実施例においては、油脂はステップ（ａ）前に除かれる。油脂の除去は部分的または完全に行なわれる。
【００５２】
脱脂ステップに用いられる適宜な方法としては溶媒抽出がある。副産物が粒状、例えばオリーブ粉の場合には、この技術は特に好ましい。
【００５３】
ステップ（ａ）前に溶媒抽出プロセスを使ってオリーブ粉を脱脂できる。オリーブ粉は１４〜２０ｗｔ％のオリーブオイルを含んでいる。食品産業での使用に適したヘキサン、ジエチルエーテル、酢酸エチルまたは他の非極性溶媒などはオリーブオイルを抽出する溶媒として使用できる。ヘキサンが好ましい。
【００５４】
他の一実施例においては、脱脂ステップはオリーブポリフェノール溶液についてステップ（ｃ）の前にステップ（ｂ）の最終段階として行われる。この場合には、オリーブポリフェノール溶液は短時間（つまり、２〜２４時間）容器中で室温、好ましくは２５℃未満の温度で貯蔵される。この期間油脂が分離して溶液の上面に上る。オリーブポリフェノール溶液は底に残っている。この分離は単純なデカント、例えば反応器下の弁を開いて容器中に残っている油脂から懸濁粒子を含んだ液体を分離することにより、簡単に達成できる。分離後、油脂は簡単に除去できてオリーブオイルを得る。
【００５５】
これに代えて、オリーブポリフェノール溶液を容器中でオリーブオイルの融点より低い温度（＜−１０℃）で凍結させる。この操作は油脂分留が固体になるので、デカントプロセスにおける油脂分留の分離には好ましい。オリーブポリフェノール溶液を凍結するには、熱交換または直接ガス膨張（例えば窒素）が使える。このプロセスは低温分離として知られている。得られた他の分留は脱脂オリーブポリフェノール溶液である。
【００５６】
ステップ（ｂ）を行って得られたオリーブポリフェノール溶液は高比率の初期出発材料中に存在したポリフェノールを含んでいる。しかし該溶液は非常に希薄であり、したがって濃縮ステップ（ｃ）を行うことが必要である。従来は真空蒸着またはクロマトグラフィー法が使われてきたが、膜分離技術を採用したのがこの発明の必須の特徴である。
【００５７】
クロマトグラフィーカラムに代えて、膜技術を使用することにより、粒状ポリフェノールを抽出または純化するよりも存在するポリフェノールを濃縮する効果がある。つまり、オリーブポリフェノール濃縮物中に存在するポリフェノールは初期副産物出発材料中に存在するそれと本質的に同じである。勿論酵素処理ステップが行われると、分布は変化する。これにより、各ポリフェノールを個別に分離することなしに、ポリフェノールのファミリーとしての分離を促進する。
【００５８】
好ましき実施例においては、超濾過（ＵＦ）プロセスがステップ（ｃ）において採用されて、オリーブポリフェノールから最大の分子を分離する。超濾過は選択的分離ステップであり、大きな分子を除去することにより製品を濃縮・純化する。ＵＦにおいては低圧で適切な膜を使用する。ＵＦ膜孔の直径は通常０．０１〜０．１μｍであり、４８０〜１３８０ｋＰａの範囲内の圧力で作用する。分子量が１００００を越える化合物は通常そのようなプロセスで分離される。塩、砂糖、有機酸およびより小さなペプチドは通過するが、蛋白質、油脂および多糖類は通されない。このシステムは５００００ドルトンより大きな分子を分離できなければならない。
【００５９】
いく種類かの異なる膜が使用に適している。ＵＦ膜は通常セラミック、セルロース、ポリスルホンおよびポリビニリデンフルオライドなどから形成されている。例えば、筒状、中空繊維、板および渦巻き状膜が市販されている。この種の膜を例挙するとＫｏｃｈ Ｉｎｃ．（例えばＨＦＭ−１１６／１００、ＨＦＭ−１８０／５１３、ＨＦＫ−６１８））、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｉｎｃ、Ｉｎｇｅ ＡＧ Ｉｎｃ．（例えばＤｉｚｚｅｒシリーズ）製などがある。これらの膜は１４０〜６９０ｋＰａ（２０〜１００ｐｓｉ）の圧力で作用する。
【００６０】
この発明において言及されたＵＦにおいては、実際に全てのポリフェノールが膜を通過し、少しの分留だけが残留物中に残る。残留物中のポリフェノールの損失は１０ｗｔ％を越えてはならなく、好ましくは抽出されたオリーブポリフェノールの総溶解固体に基づいて５ｗｔ％を越えてはならない。選択的に残留物は抽出タンク戻されて、前記の作業に再び通される。副産物から抽出されたオリーブポリフェノールの分子量は１００〜６００ドルトンである。
【００６１】
出発材料としてアルペチンを用いた場合には、超濾過法は成功しないという従来の知識にも拘わらず、アルペチンを極性溶媒と混合して（ステップａ）かつポリフェノールを抽出する（ステップｂ）前のステップが採用された場合には、驚いたことに、超濾過ステップが成功するのである。理論に囚われなければ、除かないと膜を塞ぐであろうアルペチン中に存在する大きな懸濁固体の除去によるものと仮定される。またアルペチンが使用された副産物である場合には、ステップ（ｃ）の前に脱脂ステップが導入されれば、超濾過ステップは成功するだろう。
【００６２】
ＵＦ作業の後、オリーブポリフェノール透過物の総溶解固体中のポリフェノールの濃度は１５ｗｔ％、好ましくは２０ｗｔ％を越える、例えば３５ｗｔ％にも至る。
【００６３】
好ましくは、前のＵＦ作業で得られたオリーブポリフェノール透過物はナノ濾過（ＮＦ）膜を通過して、溶液から溶解したミネラルを除去する。ＮＦは逆浸透（ＲＯ）は秀れた分離プロセスではなく、選択性の若干少ない膜を使う。
【００６４】
選択的に，ＲＯ用の膜も使える。分子のサイズと形状によっては、ＮＦによれば、大きなイオンと無機成分は拒否するものの、小さなイオンが通過する。ＮＦ膜孔の直径は通常０．００１〜０．１μｍであり、膜は６９０〜４１４０ｋＰａの圧力で使用される。１９００ドルトンを越える分子量を有した化合物は通常分離され、かつ非常に薄いＮＦ膜は１００ドルトンを越える分子量の化合物を分離できる。この発明で使用されるＮＦは１００ドルトンを越える分子量限界を有している。
【００６５】
ＮＦ膜は通常薄いフィルム合成物やセルロース化合物から形成されている。ＮＦに使える膜は例えば中空繊維や渦巻き膜である。この種の膜を例挙するとＫｏｃｈ Ｉｎｃ．（例えばＴＦＣ−ＲＯ、ＴＦＣ−Ｓ、ＴＦＣ−ＳＲ３、ＳｅｌＲＯシリーズ）、ＰＣＩ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．（例えばＢ１ ｍｏｄｕｌｅ、Ｃ１０ ｍｏｄｕｌｅ、ＡＦＣ９９）、Ａｌｆａ Ｌａｖａｌ Ｉｎｃ．製などがある。ＮＦに用いられる膜は０．００１〜０．０１μｍで作用する。この発明で言及するＮＦは２０００〜４８００ｋＰａ（３００〜７００ｐｓｉ）で作用する。
【００６６】
この発明で言及されるＮＦにおいては、実際に全てのポリフェノールが残留物中に残留する。ＵＦ作業の後に得られた透過物の総溶解固体を基にして、透過物中のポリフェノールの損失は１０ｗｔ％を越えてはならず、好ましくは５ｗｔ％未満でなければならない。
【００６７】
ＮＦ作業の後、残留物の総溶解固体中のポリフェノールの濃度は２０ｗｔ％に達し、好ましくは４０ｗｔ％を越え、例えば６５ｗｔ％である。
【００６８】
ＮＦ作業において、水の顕著な部分は除かれる。爾後、残留物中の総溶解固体は初期のＵＦ透過物中より高い。残留物中の総溶解固体は５ｗｔ％を越え、好ましくは１０ｗｔ％を越え、例えば２０ｗｔ％にも至る。
【００６９】
一実施例においては、ＵＦオリーブポリフェノール透過物とＮＦオリーブポリフェノール残留物またはこれらの混合物はさらなる真空濃縮に掛けられて、オリーブポリフェノール濃縮物を得る。この実施例においては、真空ドライヤーシステムを採用できる。オリーブポリフェノール濃縮物をさらに濃縮すべく、種々の工業用真空ドライヤー（例えば水平ドライヤーまたは垂直ドライヤー）が市販入手可能である。プロセス温度は７０℃未満、好ましくは６０℃未満、例えば４０℃である。溶媒としての水を除く作業圧力は３０ｋＰａ（３００ｍｂａｒ）未満、好ましくは２０ｋＰａ（２００ｍｂａｒ）未満である。
【００７０】
溶媒の除去後、総溶解固体が２０ｗｔ％を越える、好ましくは総溶解固体の２５ｗｔ％を超え、例えば総溶解固体の４５および６５ｗｔ％の製品が得られる。総オリーブポリフェノール含有量は使われた副産物によって決まる。好ましくは総ポリフェノール含有量は少なくとも１０ｗｔ％である。
【００７１】
最後のステップとして、最終応用目的に応じて、オリーブポリフェノール濃縮物を乾燥して固体、好ましくは粉を得るのが好ましい。乾燥後の最終水分量は６ｗｔ％未満、好ましくは３ｗｔ％未満、例えば１ｗｔ％でなければならない。
【００７２】
一実施例においては、オリーブポリフェノール濃縮物はパン真空ドライヤーを用いて乾燥する。乾燥後、硬い塊が得られる。好ましくは、該塊を製粉前にすりつぶして、粉を作るために粒子サイズを低減する。製粉にはハンマーまたはナイフタイプの製粉機が使える。粉化にはハンマーミル、ピンミル、クラシフィケーター分離ミルまたはミルの組合せを採用して粉化を行う。最終粒サイズ分布は３００μｍで９９ｖｏｌ％、好ましくは２００μｍで９９ｖｏｌ％、１００μｍでは９９ｖｏｌ％、例えば７５μｍで９９ｖｏｌ％でなければならない。
【００７３】
他の実施例においては、オリーブポリフェノール濃縮物がスプレードライヤーを用いて乾燥される。スプレー乾燥プロセスにおけるキャリアーとしては、いくつかの安定剤（例えばグアーガム）が使える。最終粉は１０ｗｔ％未満、好ましくは３ｗｔ％未満、例えば１ｗｔ％の安定剤を含むべきである。
【００７４】
選択的に、他の実施例においては、グルコシダーゼまたはエステラーゼ活性を具えた酵素を使って酵素処理ステップが行われる。この目的は存在するオレウロペインおよび／またはジメチルオレウロペインを加水分解して、主としてヒドロキシチロソール、チロソール、エレアノ酸およびグルコーゼを誘導体として得ることにある。オリーブポリフェノール誘導体は苦味が少ないので、よりよい抗酸化剤でありより容易に人間の身体に吸収されるからである。
【００７５】
オレウロペインおよび／またはジメチルオレウロペイン加水分解は２種の酵素、β−グリコシドおよびエステラーゼを使って行われる。β−グリコシダーゼはグリコシダーゼ結合を破壊してグルコース分子を解放しアグリコン（図１中の結合ｂ）を形成する。よく知られているが、グルコースを付着したポリフェノールに比べて、アグリコンポリフェノールは消化器内の身体により容易に吸収される。エステラーゼはエステル結合を破壊して、ヒドロキシチロソールおよびエレアノリン酸モノーテルペン（図１中の結合ａ）を解放する。エストラーゼ活性とグリコシダーゼ活性とが同時に起きるのが好ましい。
【００７６】
この発明においては、分離したβ−グリコシダーゼとエステラーゼとを使用できる。好ましくは、微生物源から酵素が分離される。
【００７７】
加えて、βーグリコシダーゼとエステラーゼを含む酵素の混合物または発酵によりポリフェノールを加水分解できる微生物が使用できる。分離した酵素は一般に改変された生物から得られる。Ｂｒｉａｎｔｅ他（２０００年）により使用された酵素が使用できる。酵素の混合物は菌または微生物源から得られる。例えばＣａｎｄｉｄａ ｍｏｌｉｓｃｈｉａｎａおよびＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ Ｐｌａｎｔａｒｕｍである。直接の微生物を使う場合には、製品を発酵させる必要がある。適切な酵素は市販入手可能である（例えばＤＳＭまたはＮｏｖｏｚｙｍｅｓ）。
【００７８】
オリーブが熟すると、オレウロペイン含有量は低減しヒドロキシチロソールの含有量は増加する。したがって、副産物の早期の熟し段階の場合には、ポリフェノール含有物を加水分解する必要はない。
【００７９】
副産物中のオリーブポリフェノールの加水分解はステップ（ｂ）中またはステップ（ｂ）の前にできる。選択的な酵素非活性化ステップが含まれる場合には、このステップの後で、ポリフェノール酸化酵素非活性化がすでに行われているように、グリコシダーゼおよびエステラーゼ活性を具えた酵素を副産物に加える必要がある。これによりグリコシダーゼおよびエステラーゼ活性を具えた酵素がステップ（ａ）においてまた活性化されないことを確実にできる。
【００８０】
ステップ（ｃ）の後で酵素処理ステップを行うこともできる。この場合には、オリーブポリフェノール濃縮物が加熱されて、最適温度に達するようになり、加水分解または発酵のために時間が保たれる。反応の条件、例えば温度、ｐＨおよび濃度および時間を最適にして、適切なレベルの酵素反応を達成するようにする。通常、β−グリコシダーゼは３５〜４５℃、ｐＨ４〜６．５で最も活性である。熱安定酵素例えば組換えグリコシダーゼを使うこともでき、これは６０〜７０℃で最適の活性を有する。同様に、エステラーゼも使うことができ、生理学的な温度で活性であるか、熱的に安定であり、６５℃までの「温度で活性である。
【００８１】
加水分解後の加水分解オレウロペインおよび／またはジメチルオレウロペイン（セコロイド、ｓｅｃｏｒｏｉｄｓ）の含有量は一般に５０ｗｔ％を越え、好ましくは７０ｗｔ％を越えなければならず、例えば９５ｗｔ％である。酵素処理ステップは２０〜８０℃、好ましくは３５〜６５℃、より好ましくは５０〜６０℃の範囲の温度で行われる。
【００８２】
この発明のプロセスで得られたオリーブポリフェノール濃縮物は種々の用途があり、例えば多くの食品の成分として使える。オリーブポリフェノールは食品に強い苦味を付与する。加えて食品に抗酸化活性を与えて、酸化を低減して貯蔵期間を増加する。
【００８３】
さらにオリーブポリフェノールは抗微生物性を有しており微生物の成長を防止し、これにより食品の貯蔵期間を増加することを示した。オリーブポリフェノール濃縮物はまた、健康的な性質の故に、多くの食品において機能的な性質を増加するサプリメントとして使用でき、かつピル、カプセルその他の製品の製造において栄養補助食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）として使用できる。
【実験例１】
【００８４】
６０％湿度と０．８５％総ポリフェノールと０．１％ヒドロキシチロソールを含む１０００Ｋｇのアルペオルホを５０００Ｋｇの蒸留水と２０ｍ3 ３１６Ｌステンレス鋼容器中で混合した。混合物を８５℃に５分間加熱して（漂白）ポリフェノールオキシダーゼを非活性化した。漂白処理の直後、混合物を５５℃で冷却した。β−グルコシダーゼ（２１２１３ｍＵ／ｍＬのβ−グルコシダーゼ活性）とエステラーゼを含む３００ｇの市販酵素を添加し、混合物を３時間加水分解した。
【００８５】
ついで混合物を７５℃で加熱してポリフェノールを抽出した。抽出後、デカンターを使って固体を分離した。ついでディスク遠心分離機（Ｗｅｓｔｆａｌｉａ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｉｎｃ．）で純化して２６ｇ／Ｌの総固体を含んだオリーブポリフェノール抽出物を４５４０ ｌ得た。Ｆｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅａｕ法で測定したらこの７ｗｔ％は総ポリフェノールであった。
【００８６】
オリーブポリフェノール抽出物をついで非常に開いた超濾過に通して、高マクロ分子（ＨＦＭ−１１６／１００ Ｋｏｃｈ．３０ｐｓｉ）を分離した。爾後４５００ ｌの透過物が得られた。この透過物は９１０ｇ／Ｌの固体を２０ｗｔ％の総ポリフェノールとともに含んでいた。
【００８７】
ついで、ＵＦプロセスで得られた透過物をナノ濾過に通して透過物をさらに濃縮した（ＴＦＣ−Ｓ Ｋｏｃｈ．４００ｐｓｉ）。爾後１６０ ｌの残留物が得られた。これは１００ｇ／Ｌの固体を５０ｗｔ％の総ポリフェノールとともに含んでいた。
【００８８】
ＮＦ残留物を水平真空ドライヤー中で５５℃、３００ｍｂａｒで濃縮した。乾燥後、３５％の総溶解固体（ＴＤＳ）を含んだ４５ ｌの液状オリーブポリフェノール濃縮物が得られた。この５０ｗｔ％は総ポリフェノール濃縮物であった。
【実験例２】
【００８９】
ＧＢ３１４２９４．０の実験例２に記載されたプロセスによりアルペオルホからオリーブ粉を得た。特に、１０００Ｋｇのアルペオルホを予処理して微生物劣化を回避し、８０ｋｇのエタノールを添加して１０８０ｋｇの安定化アルペオルホを得た。安定化アルペオルホの１０８０ｋｇは６５℃で１５分間漂白して、ＰＰＯを非活性化した。漂白されたペースト状耐熱性のβ−グルコシダーゼを加水分解オレウロペインに３時間・６０℃で添加した。加水分解の直後ペーストを５５℃、１０ｍｍＨｇ（１．３ｋｇ）で火中で乾燥した。乾燥は同時に２個の各５００ｋｇ容量のＧｕｅｄｕドライヤーで起きた。各バッチについて１２時間であり、エネルギー消費は約１ｋｗ／ｋｇ湿ペーストであった。
【００９０】
４００ｋｇの乾燥アルペオルホと６８０ｋｇの濃縮物が回収された。０．５００ｍｍ寸法より高い粒子を分離して４００ｋｇの乾燥アルペオルホをふるいにかけた。２４０ｋｇのピットが分離され、１６０Ｋｇの乾燥フレッシュが得られた。該フレッシュをピンミル中で−１０℃未満の温度の低温冷却システムで粉化し、粒子の９９％の寸法を０．０７５ｍｍ未満に低減した。
【００９１】
５ｗｔ％の水分、３％総ポリフェノールおよび１％ヒドロキシチロソールを含むこのオリーブ粉１０００Ｋｇを１００００Ｋｇの溶媒（水：エタノール＝１：１）で抽出した。混合物を７５℃で加熱してポリフェノールを抽出した。
【００９２】
抽出後、デカンターを使って固体が分離され９０８０ ｌの溶液が得られた。次にミクロ濾過膜（ｍｅｍｂｒａｌｏｘ Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．３０ｐｓｉ）を用いて固体を浄化した。爾後９０００ ｌのオリーブポリフェノール溶液が得られた。この溶液は２５ｇ／ｌの固体を含み、１２．４％が総ポリフェノールであった。
【００９３】
該溶液を非常に開いた超濾過に掛けて高分子（ＨＦＭ−１１６／１００ Ｋｏｃｈ．３０ｐｓｉ ）を分離した。爾後８．９４０リットルの透過物が得られた。この透過物は２５ｗｔ％の総ポリフェノールの１１．７０ｇ／Ｌの固体を含んでいた。
【００９４】
次いで、ＵＦプロセスで得られた透過物をナノ濾過に通して透過物を濃縮した（ＴＦＣ−Ｓ Ｋｏｃｈ、４００ｐｓｉ）。ナノ濾過プロセス後に２９０リットルの残留物が得られた。この残留物は１５０ｇ／Ｌの固体を含み、その６０ｗｔ％が総ポリフェノールであった。
【００９５】
ＮＦ残留物を水平真空ドライヤー中で５５℃・３００ｍｂａｒで濃縮した。乾燥後、４０％の総溶解固体（ＴＤＳ）を含んだ液状オリーブポリフェノール濃縮物１３０ ｌが得られ、その５０ｗｔ％が総ポリフェノール濃縮物であった（ほぼ２６ｋｇのポリフェノール）。
【００９６】
爾後５％のグアーガムをＮＦ残留物に添加してスプレー乾燥した。３％水分と４３ｗｔ％総ポリフェノールを有した粉化オリーブポリフェノール濃縮物が６０Ｋｇ得られた。
【実験例３】
【００９７】
Ｒｏｍｅｒｏ他（２０００年）により開示された方法を用いて実験例２のプロセスにより得られたオリーブポリフェノール濃縮物を分析した。得られたクロマトグラムを図８に示す。この図はオリーブポリフェノールの典型的な分布を示している。ヒドロキシチロソール（６．９８１ｍｉｎ）とチロソール（８．９４９ｍｉｎ）が明らかに識別される。通常３５ｍｉｎで現われるオレウロペインが存在しない。これは酵素処理ステップの採用とオレウロペインの成分の変態を示している。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
この発明はオリーブポリフェノール濃縮物を製造産業で広く応用できる。
【非特許文献１】ＧＢ ０３１４２９４．０ （Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）． Ｏｌｉｖｅ Ｐｏｗｄｅｒ．
【非特許文献２】Ａｂｓｔｒａｃｔｓ． ２００３． Ｆｉｒｓｔ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈｅａｌｔｈ． １８ ｔｏ ２１ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ， Ｖｉｃｈｙ， Ｆｒａｎｃｅ．
【非特許文献３】Ａｍｉｏｔ Ｍ．， Ｆｌｅｕｒｉｅｔ Ａ．， ａｎｄ Ｍａｃｈｅｉｘ ． １９８６． Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｏｌｉｖｅ ｄｕｒｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ３４：８２３−８２６．
【非特許文献４】Ａｎｇｅｒｏｓａ Ｆ， ｄ‘Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ Ｎ．， Ｃｏｒａｎａ Ｆ． ａｎｄ Ｍａｌｌｅｉｒｏ Ｇ． １９９６． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｎｄ ｓｅｃｏｉｒｉｄｏｉｄ ａｇｌｙｃｏｎｓ ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ ｖｉｒｇｉｎ ｏｉｌ ｂｙ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ． Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ７３６： １９５−２０３．
【非特許文献５】Ｂｉａｎｃｏ Ａ． ａｎｄ Ｕｃｃｅｌｌａ Ｎ． ２０００． Ｂｉｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｏｌｉｖｅ． Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ． ３３： ４７５−４８５．
【非特許文献６】Ｂｌｅｋａｓ Ｇ．， Ｖａｓｓｉｌａｋｉｓ Ｃ， Ｈａｒｉｚａｎｉｓ Ｃ， Ｔｓｉｍｉｄｏｕ Ｍ． ａｎｄ Ｂｏｓｋｏｕ Ｄ． ２００２． Ｂｉｏｐｈｅｎｏｌｓ ｉｎ ｔａｂｌｅ ｏｌｉｖｅｓ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ５０： ３６８８：３６９２
【非特許文献７】Ｂｒｉａｎｔｅ Ｒ．， Ｐａｔｕｍｉ Ｍ．， Ｌｉｍｏｎｇｅｌｌｉ Ｓ．， Ｆｅｂｂｒａｉｏ Ｆ．， Ｖａｃｃａｒｏ Ｃ．， Ｄｉ Ｓａｌｌｅ Ａ．， Ｌａ Ｃａｒａ Ｆ． ａｎｄ Ｎｕｃｃｉ Ｒ． ２００２． Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｎｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｆｒｕｉｔ ｒｉｐｅｎｉｎｇ ｉｎ ｔｗｏ Ｉｔａｌｉａｎ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｏｆ Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐｅａ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６２， ７９１ − ７９８．
【非特許文献８】Ｈａｒｗｏｏｄ Ｊ． ａｎｄ Ａｐａｒｉｃｉｏ Ｒ． ２０００． Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ａｓｐｅｎ ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ． Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍａｒｙｌａｎｄ．
【非特許文献９】Ｉｍｐｒｏｌｉｖｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ． ２０００． Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｌｉｑｕｉｄ−ｓｏｌｉｄ ｗａｓｔｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ． Ｆｉｎａｌ ｒｅｐｏｒｔ． ＦＡＩＲ ＣＴ９６ １４２０．
【非特許文献１０】Ｋｉｒｉｔｓａｋｉｓ Ａ． １９９１． Ｅｌ ａｃｅｉｔｅ ｄｅ ｏｌｉｖａ． Ｅｄ． Ａ． Ｍａｄｒｉｄ． Ｓｐａｉｎ．
【非特許文献１１】Ｍａｅｓｔｒｏ−Ｄｕｒａｎ Ｒ．， Ｌｅｏｎ Ｒ． ａｎｄ Ｒｕｉｚ Ｖ． １９９４． Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ｏｌｉｖｅ （Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐｅａ）． Ｇｒａｓａｓ Ａｃｅｉｔｅｓ ４５， ２６５−２６９．
【非特許文献１２】Ｒｏｍｅｒｏ， Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ， Ｐｅｄｒｏ Ｇａｒｃｉａ， ｅｔ ａｌ． ２００２． Ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｂｌａｃｋ Ｓｐａｎｉｓｈ ｏｌｉｖｅ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ． Ｅｕｒ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２１５：４８９−４９６．
【非特許文献１３】Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ Ｖ．， Ｏｒｔｈｏｆｅｒ Ｒ． ａｎｄ Ｌａｍｕｅｌａ−Ｒａｖｅｎｔｏｓ Ｒ． １９９９． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ． ００７６−６８７９１９９．
【非特許文献１４】Ｖｉｓｉｏｌｉ Ｆ．， Ｒｏｍａｎｉ Ａ．， Ｍｕｌｉｎｎａｃｃｉ Ｎ．， Ｚａｒｉｎｉ Ｓ．， Ｃｏｎｔｅ Ｄ．， Ｖｉｎｃｉｅｒｉ Ｆ． ａｎｄ Ｇａｌｌｉ Ｃ． １９９９． Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｏｌｉｖｅ ｍｉｌｌ ｗａｓｔｅ ｗａｔｅｒ． Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ４１ ， ５１８１−５１８７．
【非特許文献１３】Ｖｉｓｉｏｌｉ Ｆ．， Ｂｅｌｌｏｍｏ Ｇ．， ａｎｄ Ｇａｌｌｉ Ｃ． １９９８． Ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｏｌｉｖｅ ｏｉｌ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４７， ６０−６４．
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】オリーブ中の原理的フェノール化合物の化学構造を示す。
【図２】ステップ（ｂ）の一実施例のグラフである。
【図３】ステップ（ｂ）の一部として行われる第２の抽出ステップのグラフである。
【図４】ステップ（ｃ）の一例のグラフである。
【図５】さらなるナノ濾過が行われるステップ（ｃ）のグラフである。
【図６】ステップ（ｃ）で行われる乾燥ステップのグラフである。
【図７】粉状オリーブポリフェノール濃縮物を与えるための最終乾燥ステップのグラフである。
【図８】実験例３の結果を示すクロマトグラムである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリーブ油抽出物の副産物からオリーブポリフェノール濃縮物が得られる工程であって、（ａ）副産物を極性溶媒と混合して副産物／溶媒混合物を得て、（ｂ）副産物／溶媒混合物からポリフェノールを抽出してオリーブポリフェノール溶液と抽出された固体を得て、（ｃ）膜分離技術を使ってオリーブポリフェノール溶液を濃縮してオリーブポリフェノール濃縮物を収量するステップを含んでなり、存在するポリフェノールの濃度が少なくとも１０ｗｔ％であり、かつ脱脂ステップを含んだものであることを特徴とする工程。
【請求項２】
極性溶媒が人間による消費を意図されたものとしてＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓにより承認されたものであり、かつ好ましくは水、エタノールまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の工程。
【請求項３】
ステップ（ａ）において酵素非活性化ステップが行われることを特徴とする請求項１または２に記載の工程。
【請求項４】
酵素非活性化ステップ（ａ）において、副産物が貯蔵されている環境から酸素を除くことを特徴とする請求項３に記載の工程。
【請求項５】
酵素非活性化ステップにおいて、温度７５〜１００℃の範囲でかつ時間５〜１０分の範囲で水中の副産物により漂白が行われることを特徴とする請求項３に記載の工程。
【請求項６】
酵素非活性化ステップにおいて胴イオンに関して副産物と親和性のあるキレート剤を添加することを特徴とする請求項３に記載の工程。
【請求項７】
副産物がオルホ、アルペチン、アルペオルホまたは粒状オリーブ材料であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項８】
ステップ（ｂ）において溶媒を使ってポリフェノールが抽出されることを特徴とする請求項１〜７のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項９】
溶媒が水またはエタノールまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項６に記載の工程。
【請求項１０】
溶媒に対する低減ポリフェノールオキシダーゼ活性を有した副産物の比が重量にして１：３〜１：３０であり、抽出が８５℃以下の温度で行われ、抽出中連続攪拌が行われることを特徴とする請求項６または７に記載の工程。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）において、ポリフェノールが遠心分離または濾過により抽出されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）において予備の可溶化ステップが行われることを特徴とする請求項１〜１１いずれかひとつに記載の工程。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）の前にステップ（ｂ）で得られたオリーブポリフェノール抽出物がさらなる抽出ステップに掛けられることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項１４】
さらなる抽出ステップにおいて遠心分離またはミクロ濾過が行われることを特徴とする請求項１１に記載の工程。
【請求項１５】
ステップ（ｃ）において、使用された膜分離技術が超濾過であって、オリーブポリフェノール超濾過透過物であるオリーブポリフェノール濃縮物を与えることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項１６】
オリーブポリフェノール透過物であるオリーブポリフェノール濃縮物はナノ濾過ステップに掛けられてオリーブポリフェノールナノ濾過残留物であるオリーブポリフェノール濃縮物を与えることを特徴とする請求項１３に記載の工程。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）で得られたオリーブポリフェノール超濾過透過物またはナノ濾過残留物がさらに真空蒸発により濃縮されることを特徴とする請求項１３、１４に記載の工程。
【請求項１８】
脱脂ステップがステップ（ａ）の前に行われることを特徴とする請求項１〜１７のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項１９】
脱脂ステップにおいて溶媒抽出が採用されることを特徴とする請求項１６に記載の工程。
【請求項２０】
使用された溶媒がヘキサンであることを特徴とする請求項１７に記載の工程。
【請求項２１】
脱脂ステップがステップ（ｃ）の前に最終段階としてステップ（ｂ）の一部として行われることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）のオリーブポリフェノール抽出物が２５℃未満の温度に冷却されて油脂を分離させて表面に浮上させ、該油脂がついでデカントにより除去されることを特徴とする請求項１９に記載の工程。
【請求項２３】
さらにグリコシダーゼ活性とエステラーゼ活性を有した酵素を用いて酵素処理ステップが行われ、オレウロペインがヒドロキシチロソールまたはチロソールに変換されて、オリーブ副産物中間物を収量し、加水分解したオレウロペインおよび／またはジメチルオレウロペインの含有量が副産物中の初期のセコロイド含有量の５０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項２４】
酵素処理ステップがステップ（ｂ）の前に行われることを特徴とする請求項２１に記載の工程。
【請求項２５】
酵素処理ステップがステップ（ｂ）中に行われることを特徴とする請求項２１に記載の工程。
【請求項２６】
酵素処理ステップにおいて、副産物または低減ポリフェノールオキシダーゼ活性副産物が酵素混合物と接触し、エステラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性が同時に起きることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項２７】
酵素混合物が微生物源から分離された酵素を含んでいることを特徴とする請求項２４に記載の工程。
【請求項２８】
酵素処理ステップが２０〜８０℃、好ましくは３５〜６５℃、より好ましくは５０〜６０℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項２１〜２５のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項２９】
オリーブポリフェノール濃縮物を乾燥する最終のステップが行われて、固体、好ましくは粉状オリーブポリフェノール濃縮物が得られることを特徴とする請求項１〜２８のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項３０】
乾燥ステップにおいてスプレー乾燥または真空乾燥が行われることを特徴とする請求項２７に記載の工程。
【請求項１】
オリーブ油抽出物の副産物からオリーブポリフェノール濃縮物が得られる工程であって、（ａ）副産物を極性溶媒と混合して副産物／溶媒混合物を得て、（ｂ）副産物／溶媒混合物からポリフェノールを抽出してオリーブポリフェノール溶液と抽出された固体を得て、（ｃ）膜分離技術を使ってオリーブポリフェノール溶液を濃縮してオリーブポリフェノール濃縮物を収量するステップを含んでなり、存在するポリフェノールの濃度が少なくとも１０ｗｔ％であり、かつ脱脂ステップを含んだものであることを特徴とする工程。
【請求項２】
極性溶媒が人間による消費を意図されたものとしてＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓにより承認されたものであり、かつ好ましくは水、エタノールまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の工程。
【請求項３】
ステップ（ａ）において酵素非活性化ステップが行われることを特徴とする請求項１または２に記載の工程。
【請求項４】
酵素非活性化ステップ（ａ）において、副産物が貯蔵されている環境から酸素を除くことを特徴とする請求項３に記載の工程。
【請求項５】
酵素非活性化ステップにおいて、温度７５〜１００℃の範囲でかつ時間５〜１０分の範囲で水中の副産物により漂白が行われることを特徴とする請求項３に記載の工程。
【請求項６】
酵素非活性化ステップにおいて胴イオンに関して副産物と親和性のあるキレート剤を添加することを特徴とする請求項３に記載の工程。
【請求項７】
副産物がオルホ、アルペチン、アルペオルホまたは粒状オリーブ材料であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項８】
ステップ（ｂ）において溶媒を使ってポリフェノールが抽出されることを特徴とする請求項１〜７のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項９】
溶媒が水またはエタノールまたはこれらの混合物であることを特徴とする請求項６に記載の工程。
【請求項１０】
溶媒に対する低減ポリフェノールオキシダーゼ活性を有した副産物の比が重量にして１：３〜１：３０であり、抽出が８５℃以下の温度で行われ、抽出中連続攪拌が行われることを特徴とする請求項６または７に記載の工程。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）において、ポリフェノールが遠心分離または濾過により抽出されることを特徴とする請求項１〜５のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）において予備の可溶化ステップが行われることを特徴とする請求項１〜１１いずれかひとつに記載の工程。
【請求項１３】
ステップ（ｃ）の前にステップ（ｂ）で得られたオリーブポリフェノール抽出物がさらなる抽出ステップに掛けられることを特徴とする請求項１〜１２のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項１４】
さらなる抽出ステップにおいて遠心分離またはミクロ濾過が行われることを特徴とする請求項１１に記載の工程。
【請求項１５】
ステップ（ｃ）において、使用された膜分離技術が超濾過であって、オリーブポリフェノール超濾過透過物であるオリーブポリフェノール濃縮物を与えることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項１６】
オリーブポリフェノール透過物であるオリーブポリフェノール濃縮物はナノ濾過ステップに掛けられてオリーブポリフェノールナノ濾過残留物であるオリーブポリフェノール濃縮物を与えることを特徴とする請求項１３に記載の工程。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）で得られたオリーブポリフェノール超濾過透過物またはナノ濾過残留物がさらに真空蒸発により濃縮されることを特徴とする請求項１３、１４に記載の工程。
【請求項１８】
脱脂ステップがステップ（ａ）の前に行われることを特徴とする請求項１〜１７のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項１９】
脱脂ステップにおいて溶媒抽出が採用されることを特徴とする請求項１６に記載の工程。
【請求項２０】
使用された溶媒がヘキサンであることを特徴とする請求項１７に記載の工程。
【請求項２１】
脱脂ステップがステップ（ｃ）の前に最終段階としてステップ（ｂ）の一部として行われることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）のオリーブポリフェノール抽出物が２５℃未満の温度に冷却されて油脂を分離させて表面に浮上させ、該油脂がついでデカントにより除去されることを特徴とする請求項１９に記載の工程。
【請求項２３】
さらにグリコシダーゼ活性とエステラーゼ活性を有した酵素を用いて酵素処理ステップが行われ、オレウロペインがヒドロキシチロソールまたはチロソールに変換されて、オリーブ副産物中間物を収量し、加水分解したオレウロペインおよび／またはジメチルオレウロペインの含有量が副産物中の初期のセコロイド含有量の５０ｗｔ％であることを特徴とする請求項１〜２２のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項２４】
酵素処理ステップがステップ（ｂ）の前に行われることを特徴とする請求項２１に記載の工程。
【請求項２５】
酵素処理ステップがステップ（ｂ）中に行われることを特徴とする請求項２１に記載の工程。
【請求項２６】
酵素処理ステップにおいて、副産物または低減ポリフェノールオキシダーゼ活性副産物が酵素混合物と接触し、エステラーゼ活性およびグリコシダーゼ活性が同時に起きることを特徴とする請求項２１〜２３のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項２７】
酵素混合物が微生物源から分離された酵素を含んでいることを特徴とする請求項２４に記載の工程。
【請求項２８】
酵素処理ステップが２０〜８０℃、好ましくは３５〜６５℃、より好ましくは５０〜６０℃の温度範囲で行われることを特徴とする請求項２１〜２５のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項２９】
オリーブポリフェノール濃縮物を乾燥する最終のステップが行われて、固体、好ましくは粉状オリーブポリフェノール濃縮物が得られることを特徴とする請求項１〜２８のいずれかひとつに記載の工程。
【請求項３０】
乾燥ステップにおいてスプレー乾燥または真空乾燥が行われることを特徴とする請求項２７に記載の工程。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００８−５０２３３９（Ｐ２００８−５０２３３９Ａ）
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１６０５９（Ｐ２００７−５１６０５９）
【出願日】平成１７年４月２０日（２００５．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１０７６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５９８６
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０６４１４８６４）ナトラセウティカル インダストリアル エセ．エレ．ウ． (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月３１日（２００８．１．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月２０日（２００５．４．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１０７６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／００５９８６
【国際公開日】平成１８年１月１９日（２００６．１．１９）
【出願人】（５０６４１４８６４）ナトラセウティカル インダストリアル エセ．エレ．ウ． (1)
【Ｆターム（参考）】
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