ＮＦ−κＢの阻害剤
本発明は、癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害の処置のための式（１）および（２）の化合物、およびその製薬学的に許容され得る塩に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害の処置のための式（１）および（２）
【０００２】
【化１】
【０００３】
の化合物、およびその製薬学的に許容され得る塩に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ＮＦ−κＢ（活性化Ｂ細胞の核内因子κ−軽鎖エンハンサー）は、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＢ、ｐ５０（ＮＦ−κＢ１）およびｐ５２（ＮＦ−κＢ２）のヘテロ−またはホモ−二量体からなる転写因子のファミリーである（非特許文献１）。ＮＦ−κＢの古典的な、すなわち正規経路（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ）では、種々の細胞膜レセプターの刺激がＩκＢ（インヒビタータンパク質）のリン酸化、ユビキチン化およびプロテアソーム分解を導き、これが転写を開始するｐ６５／５０ヘテロ二量体の核内移行をもたらす。この正規経路はＩκＢβキナーゼ、２６Ｓプロテアソームまたはｐ６５のＤＮＡへの結合により効果的に遮断することができる。別の、すなわち非正規経路は、阻害的なアンキリン含有タンパク質ＮＦ−κＢ２／ｐ１００のタンパク質分解を介して調節されてｐ５２を放出し、これが典型的にはＲｅｌＢと二量体化する。さらにｐ５２／ｃ−Ｒｅｌおよびｐ５２／ｐ６５を活性化する「ハイブリッド」経路が存在する。非正規または「ハイブリッド」経路は、ＩκＢβキナーゼまたはプロテアソーム阻害剤に感受性ではない。これらの経路は、ＲｅｌＢまたはｃ−ＲｅｌのＤＮＡへの結合と拮抗することにより最も効果的に阻害される。正規および非正規経路は、特有の遺伝子群の活性化を介して特異的な疾患の様々な局面と関連している。すなわち異なる疾患状況の下で正規または非正規経路のいずれか、または双方の選択的阻害は、元にある疾患状態を改善するために最も効果的な取り組みになると考えられる。
【０００５】
ＮＦ−κＢ活性化は、癌、ＡＩＤＳ、糖尿病、心血管疾患、自己免疫疾患、ウイルス複製、敗血症性ショック、神経変性障害、毛細管拡張性運動失調（ＡＴ）、関節炎、喘息、炎症性腸疾患、および他の炎症状態、アテローム硬化症、心臓疾患、喘息、異化障害、１および２型糖尿病、老化、皮膚疾患、腎疾患、消化管疾患、膵炎、神経病理学的疾患、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、敗血症および無呼吸を含む広い様々な疾患と結び付けられた。ＮＦ−κＢの活性化は多くのヒト疾患に影響している。
【０００６】
例えばグラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）によるＮＦ−κＢの活性化は、ＮＦ−κＢ
が多くのサイトカインおよび修飾酵素の転写を過剰に活性化し、これらの長期発現が心臓および肝臓のような生命維持に必須な臓器の機能に負の影響を及ぼす恐れがあるため、敗血症ショックの発症に寄与する可能性がある（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００７】
さらに慢性のアルツハイマー病では、アミロイドβペプチドが反応性の酸素中間体の生産を生じ、そしてＮＦ−κＢ部位を介する遺伝子発現を間接的に活性化する（非特許文献４）。
【０００８】
骨の破壊的糜爛または骨溶解は、関節リウマチ（ＲＡ）、歯周病および人工関節周囲の骨溶解のような炎症状態の主な合併症である。ＲＡは約１．０％の米国の成人に影響を及ぼしている自己免疫疾患であり、その女性対男性の比は２．５対１である（非特許文献５）。その顕著な特徴は主な病状を引き起こす進行性の関節破壊である。歯周病は高い有病率であり、そして世界人口の９０％までもが罹患している可能性がある。これは成人が歯を失う主原因であることはよく知られている（非特許文献６）。その有病率にもかかわらず、歯周の骨の侵食が起こるメカニズムはほとんど知られていないが、口中に存在する病原性微生物に対する宿主の反応がこのプロセスを誘発するようである。人工関節周囲の骨溶解は、固定が無くなるまで、外因性インプラントデバイスの回りの慢性の骨吸収により生じ、これは磨耗粉粒子に対する先天性の免疫応答の結果と考えられ（非特許文献７）、後天性免疫系の成分によることはほとんどない（非特許文献８）。
【０００９】
これらの状態は明確な原因により開始され、そして択一的経路により進行するが、このような疾患の病理学的プロセスにおける重要な共通因子（１もしくは複数）は、炎症した組織のＮＦ−κＢ経路の恒常的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）活性化により駆動される炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの過剰生産である。これらの状態で見られる骨の糜爛は、骨粗鬆症のようなホルモンにより調節される全身性の骨の病気とは異なり、ほとんど炎症した組織に局在している。このような疾患に多く見られるこれらの炎症した組織も、炎症誘発性サイトカイン、すなわちＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−６を生産し、これらは次に破骨細胞分化のシグナル伝達および骨再吸収活性に関与する。このように炎症性の骨溶解は、炎症している組織中で強化された破骨細胞の漸増およびＮＦ−κＢが駆動する炎症誘発性サイトカインにより刺激された活性化の産物である。
【００１０】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管が関与する多くの慢性的な再発性炎症障害を包含する。ＩＢＤの２つの最も多い病状であるクローン病および潰瘍性大腸炎は、独特な組織病理学的および免疫応答により識別することができる（非特許文献９；非特許文献１０）。現行の処置の限られた効力および潜在的な副作用により、患者および医師はこれらの疾患の慢性的に再発する炎症的性質を管理するための新しい処置を切望している。
【００１１】
クローン病および潰瘍性大腸炎になる厳密な原因は未知のままであるが、それらは一般に正常な管腔の微生物叢に対する粘膜免疫系の不適切な持続的活性化の結果と考えられている（非特許文献１１）。その結果、存在するマクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞は活性化され、そして主にＮＦ−κＢ依存的ケモカインおよびサイトカインを分泌し始める。重要な炎症誘発性メディエーターのＮＦ−κＢ媒介型過剰生産は、ヒトＩＢＤおよび大腸炎の動物モデルの双方の開始および進行に寄与する（非特許文献１２；非特許文献１３）。特にＩＢＤ患者のマクロファージは、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ６および腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の生産増大を伴う高レベルのＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を現す（非特許文献１２）。さらにＮＦ−κＢはＴヘルパー細胞１（Ｔｈ１）およびＴヘルパー細胞２（Ｔｈ２）サイトカインの活性化に極めて重大な役割を果たし、これら双方が炎症を促進し、かつ維持するために必要である（非特許文献１４）。ＩＢＤでＮＦ−κＢが果たす中心的役割から、この経路を標的とする処置を開発するために徹底的な努力がなされた。
【００１２】
ＮＦ−κＢは、胸部、卵巣、結腸、膵臓、甲状腺、前立腺、肺、頭および首、膀胱および皮膚の腫瘍に由来する多くの癌由来細胞株で恒常的に発現することが示された（非特許文献１５）。これはまたＢ細胞リンパ腫、ホジキン病、Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性ミエローマ、慢性リンパ性白血病、および急性骨髄性白血病についても見られた。ＮＦ−κＢは防御応答の一部として正常な炎症の鍵となるメディエーターであるが、慢性炎症は癌、糖尿病および上に挙げた他の疾患の宿主を導く可能性がある。発癌プロセス、血管形成、侵襲、および腫瘍細胞の転移に重要な役割を媒介する数種の炎症誘発性遺伝子産物が同定された。中でもこれら遺伝子産物は、ＴＮＦおよびそのスーパーファミリーのメンバー、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ケモカイン、ＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、ＣＯＸ−２および５−ＬＯＸである。これらすべての遺伝子の発現は、転写因子ＮＦ−κＢにより主に調節されており、これはほとんどの腫瘍中で恒常的に活性であり、そして発癌物質（例えば喫煙）、腫瘍プロモーター、発癌性ウイルスタンパク質（ＨＩＶ−ｔａｔ、ＫＨＳＶ、ＥＢＶ−ＬＭＰ１、ＨＴＬＶ１−ｔａｘ、ＨＰＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶ）、化学療法剤、およびガンマ線照射により誘導される（非特許文献１６）。これらの考察はＮＦ−κＢを抑制する抗炎症剤が癌の防止および処置の両方に潜在能力を有するはずであることを意味している。
【００１３】
インフルエンザウイルスタンパク質のヘモアグルチニンもＮＦ−κＢを活性化し、そしてこの活性化がサイトカインのウイルス誘導およびインフルエンザに関連する症状の幾つかに寄与する可能性がある（非特許文献１７；非特許文献１８）。
【００１４】
アテローム硬化症に関連する低密度リポタンパク質からの酸化脂質がＮＦ−κＢを活性化し、これは次いで炎症性サイトカインのような他の遺伝子を活性化する（非特許文献１９）。さらにアテローム硬化症に罹り易いマウスは、アテローム発生の食事を与えた場合に、脂質の過酸化産物の蓄積、炎症遺伝子の誘導およびＮＦ−κＢ転写因子の活性化に関連する大動脈のアテローム硬化性損傷の形成に対する罹病性により、ＮＦ−κＢの活性化を現す（非特許文献１９）。アテローム硬化性に対する別の重要な要因は、ＮＦ−κＢの活性化を介して血管平滑筋細胞の増殖を刺激するトロンビンである（非特許文献２０）。ＩκＢリプレッサータンパク質（ＩκＢα）の短縮形は、イオン化照射に対する過敏性の原因となることが示され、そして恒常的レベルのＮＦ−κＢ活性化を有する毛細管拡張性運動失調（ＡＴ）細胞においてＤＮＡ合成の調節が欠損している（非特許文献２１）。このＡＴ細胞に由来するＩκＢαの突然変異は、ＮＦ−κＢ経路の恒常的活性化を生じるリプレッサータンパク質を不活性化することが示された。これらすべての知見を鑑みて、ＮＦ−κＢの異常な活性化または発現は明らかに広範な様々な病状と関連している。
【００１５】
ＨＩＶ−１の感染およびライフサイクルは、ヒト単核細胞中でＮＦ−κＢ経路と強くつながっている。ウイルス感染は、Ｔ細胞の過剰刺激および最終的消耗（これはＡＩＤＳの特徴である）を生じるＮＦ−κＢの活性化を導く（非特許文献２２を参照されたい）。例えばＨＩＶ−１の重要な受容体であるＣＣＲ５の発現は、ＮＦ−κＢにより調節される（非特許文献２３）。ＣＣＲ５プロモーターの欠失分析では、３’−遠位ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１部位の喪失が転写を＞９５％まで下げることを示した（非特許文献２３）。これらの研究は、ＮＦ−κＢの恒常的リプレッションがＣＣＲ５−受容体のメッセージに劇的な低下を引き起こすことを示唆している。ＨＩＶ−１の侵入動力学（ｅｎｔｒｙ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、標的Ｔ細胞表面上で発現したＣＣＲ５レベルにより影響を受けるので（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）、ＣＣＲ５のダウンモジュレーティング（ｄｏｗｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）は、ウイルスリザーバを生む感染細胞のプールの拡大を妨げる（ｃｏｎｓｔｒａｉｎ）ことができる。ＣＸＣＲ４発現もＮＦ−κＢにより影響を受けると報告され（非特許文献２７）、ＮＦ−κＢ阻害剤が後期感染中に現れるＸ４−向性の単離物に対して等しく効果的であることを示唆している。ＮＦ−κＢは組み込ま
れたＤＮＡ−プロ−ウイルスの転写に必要である（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。実際に、ＮＦ−κＢ活性化の欠損で、感染した患者からウイルスを排除するための主要な障害である潜伏性ウイルスを宿す細胞群の生成が導かれる（非特許文献３５）。
【００１６】
ＮＦ−κＢは炎症刺激に応答して１５０以上の標的遺伝子の発現を促進する。これらの遺伝子にはインターロイキン−１、−２、−６および腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）（これらの受容体はアポトーシスを媒介し、そして炎症の調節物質として機能する）、ならびにイムノレセプター、細胞接着分子、およびシクロオキシゲナーゼ−ＩＩおよび誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のような酵素をコードする遺伝子がある（非特許文献３６：非特許文献３７）。またＮＦ−κＢはＨＣＶおよびＨＩＶ−１のようなウイルス感染に関連する疾患の進行に重要な役割を果たす。
【００１７】
ＮＦ−κＢのファミリーのメンバーには、ＲｅｌＡ／ｐ６５、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５０／ｐ１０５（ＮＦ−κＢ１）、およびｐ５２／ｐ１００（ＮＦ−κＢ２）を含む（非特許文献３８：非特許文献３９：非特許文献４０）。Ｒｅｌファミリーのメンバーは、ＮＦ−κＢに調節される遺伝子のプロモータードメイン内に位置するシス−結合要素に明確な特異性を持つホモダイマーもしくはヘテロダイマーのいずれかとして機能する（非特許文献４１：非特許文献４２：非特許文献４３）。ＲｅｌＡ／ｐ６５およびｐ５０ヘテロダイマーからなる古典的なＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢの最もよく研究された形態である（非特許文献４４：非特許文献３８およびその中の文献）。細胞刺激の前に、古典的なＮＦ−κＢはＩκＢα阻害剤タンパク質に結合した不活性複合体として細胞質に存在する。細菌のリポ多糖、炎症性サイトカイン、またはＨＩＶ−１ Ｖｐｒタンパク質のようなＮＦ−κＢインデューサーは、ＩκＢ−キナーゼ複合体（ＩＫＫ）（これはＩκＢαをリン酸化する）を活性化することにより活性なＮＦ−κＢを細胞質の複合体から放出する（非特許文献４５：非特許文献４６：非特許文献４７：非特許文献４８：非特許文献４９）。ＩκＢのリン酸化は引き続きそれをユビキチン化し、そして２６Ｓプロテオソームにより分解するしるしをつける。遊離のＮＦ−κＢ二量体は核に移行し、ここでそれらはそれらの標的遺伝子の転写を刺激する。
【００１８】
ラセミ型のデヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）の分子設計は、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）から単離された抗生物質であるエポキシキノマイシンＣに基づいた（非特許文献５０）。ＤＨＭＥＱはラセミ体として２，５−ジメトキシアニリンから５段階で合成された。キラルカラムでのエナンチオマーの分割で、（＋）および（−）の両エナンチオマーが生じた。（−）エナンチオマーは、ＮＦ−κＢの阻害に（＋）エナンチオマーよりも有力であることが示された（非特許文献５１）。ＤＨＭＥＱはＮＦ−κＢの核への移行を特異的に阻害することが示された（非特許文献５２）。具体的にＤＨＭＥＱはｐ６５および他のＲｅｌ相同的タンパク質の特異的システイン残基を１：１の化学的量論比で共有的に修飾する（非特許文献５３）。ＮＦ−κＢ阻害剤として、ＤＨＭＥＱは様々な動物の疾患モデルで徹底的に研究され、そして広い範囲の効力が証明され、それらには充実性腫瘍、血液悪性疾患、関節炎、腸虚血およびアテローム硬化症の処置を含む（非特許文献５４）。このようにＤＨＭＥＱは癌および炎症の処置に有用となり得る（非特許文献５５）。
【００１９】
【化２】
【００２０】
ＮＦ−κＢの活性化が上記のような多くの悪性疾患に果たす役割の観点から、有効な低分子ＮＦ−κＢ阻害剤の必要性が依然として存在している。
【００２１】
ＮＦ−κＢ成分、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＲｅｌＢおよびｃ−ＲｅｌのＤＮＡへの結合を直接阻害する幾つかの系列の低分子阻害剤が見いだされた。その結果、これらの化合物がＮＦ−κＢの正規および非正規経路の両方を遮断できる。二重阻害は、正規経路のみに影響するＩκＢβキナーゼ阻害剤とは異なる。この化合物の効力は、多発性硬化症および関節リウマチの動物モデルで試験され、そして結果を本明細書に記載する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
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【発明の概要】
【００２３】
発明の要約
本発明の一観点は、 式（１）または式（２）
【００２４】
【化３】
【００２５】
の構造を有する化合物またはその製薬学的に許容され得る塩に関し、式中、ＨＥＴは飽和もしくは不飽和の単−もしくは多−環の炭素環であり、ここで１もしくは複数の環の炭素原子がＮ、Ｓ、ＰもしくはＯで置き換えられ；
各Ｒ１は独立して水素；ＣＦ３；場合によりシアノ、ハロ、ニトロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＣＯＲ３、ＮＲ４Ｒ５またはＮＨＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）で置換されてもよいフェニル；シアノ；ハロ；ニトロ；ヒドロキシル；（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ＯＨ；（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ；（Ｃ１−Ｃ６）チオアルコキシ；フェノキシ；ＣＯＲ３；ＮＲ４Ｒ５；ＮＨＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ２はＨ、Ｒ６、ＣＯＲ６、ＣＯＮＨＲ６、ＣＯＯＲ６、ＣＨ２ＯＣＯＲ６、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、あるいはＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）またはＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）の無機塩、またはグリコシル（ヘミアセタール形の炭水化物のヒドロキシル基の除去から生じる基）であり、
ここでＲ６はＣ１−Ｃ６アルキル、トリフルオロメチル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、シクロヘキシルメチルまたはフェニルであり、ここでフェニルはフッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル，（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシおよびフェニルメチルから選択される０〜４個の基で置換され、ここでフェニルメチルはフェニル環で、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル，（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、２−、３−もしくは４−ピリジニルおよび２−、４−もしくは５−ピリミジニルから選択される０〜４個の基で置換される。
【００２６】
Ｒ３は独立してヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、フェノキシまたは−ＮＲ４Ｒ５である。
【００２７】
各Ｒ４およびＲ５は独立して水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルである。
【００２８】
ｎ＝０−３。
【００２９】
ＨＥＴについてはＯＲ２基とアミド部分との間にオルトの関係が存在する（すなわちＯＲ２およびＣ（＝Ｏ）ＮＨ官能基はＨＥＴ環上の隣接原子に結合している）。
【００３０】
また本発明の一観点は、式（１）または式（２）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物に関する。
【００３１】
また本発明の一観点は、さらに癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害を処置する方法に関し、この方法はそのような処置が必要なヒトのような哺乳動物に治療に有効な量の式（１）または式（２）の化合物、またはそれらの製薬学的に許容され得る塩を投与することを含んでなる。
【００３２】
さらに本発明の一観点は、ヒトのような哺乳動物のＮＦ−κＢ経路を介して直接的または間接的に遺伝子発現およびシグナル伝達を阻害する方法に関し、この方法はそのような処置が必要な哺乳動物に治療に有効な量の式（１）または式（２）の化合物、またはそれらの製薬学的に許容され得る塩を投与することを含んでなる。
【００３３】
詳細な説明
定義
本発明を記載するために使用する用語は、本明細書中で以下の意味を有する。本発明の化合物および中間体は、ＩＵＰＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｆｏｒ
Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）またはＣＡＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）のいずれかの命名法に従い名付けることができる。
【００３４】
本明細書中、種々の炭化水素含有部分の炭素原子含量は、その部分の炭素原子の最少および最大数を示す接頭辞により示すことができ、例えば接頭辞（Ｃａ−Ｃｂ）アルキルは、整数“ａ”から“ｂ”までの炭素原子を含むアルキル部分を指す。すなわち例えば（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を指す。用語「アルキル」は、水素原子置換基のみを含む炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖を現し、ここで炭素鎖は場合により１もしくは複数の二重もしくは三重結合、または二重結合および三重結合の組み合わせを含んでもよい。アルキル基の例には限定するわけではいが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、プロペニル、プロピニル、ヘキサジエニル等がある。
【００３５】
用語「アルコキシ」は、直鎖もしくは分枝鎖の一価の飽和脂肪族鎖炭素原子鎖であり、ここで炭素原子の１つが酸素原子に置き換えられている。アルコキシ基の例には、限定するわけではいがメトキシ、エトキシおよびイソプロポキシがある。
【００３６】
用語「シクロアルキル」は、飽和および場合により不飽和の単環式もしくは二環式配列の脂肪族鎖を指す。シクロアルキル基の例には、限定するわけではいが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキセニルである。シクロアルキル基は、場合によりベンゼンのような芳香族炭化水素と縮合してインダニル等の縮合シクロアルキル基を形成することができる。
【００３７】
用語「ハロ」は、クロロ、ブロモ、フルオロまたはヨードを指す。
【００３８】
用語「置換された」とは、分子上の水素原子と異なる原子もしくは分子との交換を指す。水素原子と置き換わる原子もしくは分子を「置換基」と言う。
【００３９】
用語「ＨＥＴ」は、飽和もしくは不飽和の単もしくは多環の炭素環を指し、ここで１もしくは複数の環の炭素原子がＮ，Ｓ，ＰまたはＯで置き換えられる。用語「ＨＥＴ」は完全な飽和および不飽和環系、ならびに部分的に不飽和の環系を包含し、それらには複素環のすべての可能な異性体形を含むことを意図する（例えば、ピロリルには１Ｈ−ピロリル
および２Ｈ−ピロリルを含む）。ＨＥＴが単環式（例えば４−、５−もしくは６−員環）または二環式（例えば５／６、５／５、６／６系）の飽和複素環である例には、限定するわけではいが、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロオキサゾリル、ピペリジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピペラジニル等がある。ＨＥＴが単環式、二環式もしくは三環式の部分飽和複素環である例には、限定するわけではいが、ピロリニル、イミダゾリニル、ピラゾリニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、１，３−ベンゾジオキソラニル、２，３ジヒドロ−ｌ，４−ベンゾジオキシニル、インドリニル等がある。ＨＥＴが単環式、二環式もしくは三環式の芳香族複素環の例には、限定するわけではいが、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル、イソベンゾチエニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キノリジニル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、ピロロピリジニル、チエノピリジニル、フラノピリジニル、イソチアゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イソキサゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、ピラゾロピリジニル、イミダゾピリジニル、ピロロピラジニル、チエノピラジニル、フラノピラジニル、イソチアゾロピラジニル、チアゾロピラジニル、イソキサゾロピラジニル、オキサゾロピラジニル、ピラゾロピラジニル、イミダゾピラジニル、ピロロピリミジニル、チエノピリミジニル、フラノピリミジニル、イソチアゾピリミジニル、チアゾロピリミジニル、イソキサゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、イミダゾピリミジニル、ピロロピリダジニル、チエノピリダジニル、フラノピリダジニル、イソチアゾロピリダジニル、チアゾロピリダジニル、イソキサゾロピリダジニル、オキサゾロピリダジニル、ピラゾロピリダジニル、イミダゾピリダジニル、オキサジアゾロピリジニル、チアジアゾロピリジニル、トリアゾロピリジニル、オキサジアゾロピラジニル、チアジアゾロピラジニル、トリアゾロピラジニル、オキサジアゾロピリミジニル、チアジアゾロピリミジニル、トリアゾロピリミジニル、オキサジアゾロピリダジニル、チアジアゾロピリダジニル、トリアゾロピリダジニル、イソキサゾロトリアジニル、イソチアゾロトリアジニル、ピラゾロトリアジニル、オキサゾロトリアジニル、チアゾロトリアジニル、イミダゾトリアジニル、オキサジアゾロトリアジニル、チアジアゾロトリアジニル、トリアゾロトリアジニル、カルバゾリル等がある。
【００４０】
「治療に有効な量」という句は、（ｉ）特定の疾患、状態または障害を処置または防止する、（ｉｉ）特定の疾患、状態または障害の１もしくは複数の症状を弱め、改善し、または排除する、あるいは（ｉｉｉ）特定の疾患、状態の１もしくは複数の症状の発生を防止または遅らせる化合物の量を指す。
【００４１】
「製薬学的に許容され得る」とは、示した担体、賦形剤、希釈剤、補形剤（１もしくは複数）および／または塩が一般に化学的かつ／または物理的に製剤を構成する他の成分と適合性があり、しかもその受容体と生理学的に適合性があることを示す。
【００４２】
用語「哺乳動物」は、分類学上哺乳動物のクラスのメンバーである個々の動物に関する。哺乳動物の例には、限定するわけではいが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマおよび畜牛を含む。本発明では、好適な哺乳動物はヒトである。
【００４３】
ラセミ化合物の２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシ
クロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）キノリン−３−カルボキサミドは本明細書で実施例２に記載され、そして本明細書を通して実施例２の化合物と呼ぶ。
【００４４】
例示の態様では、本発明の化合物は式（３）に示す構造および立体化学を有する。
【００４５】
【化４】
【００４６】
この化合物は、当業者に周知の方法によりそれらのエナンチオマーに分割することができる。例には例えば結晶化により分離できるジアステレオマー塩の形成；例えば結晶化、ガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーにより分離できるジアステレオマー誘導体もしくは錯体の形成；エナンチオマー特異的試薬、例えば酵素的エステル化を用いた１つのエナンチオマーの選択的反応；またはキラルな環境での例えばキラルな支持体上で、例えば結合したキラルなリガンドを含むシリカ、あるいはキラルな溶媒の存在下でのガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーを含む。所望の立体異性体が上記の例示的分離手順の１つにより別の化学的物体に転換される場合、所望のエナンチオマー形を遊離するためにはさらなる工程が必要であると考えられる。あるいは特異的な立体異性体は、光学的に活性な出発材料を使用することにより、光学的に活性な試薬、基質、触媒または溶媒を使用した不斉合成により、あるいは１方の立体異性体をもう一方の立体異性体に不斉変換により転換することにより、合成することができる。
【００４７】
化合物が１もしくは複数のさらなるステレオジェン中心を含む場合、当業者は本明細書で具体的に説明し、そして検討する化合物のすべてのジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物が本発明の範囲に入ると理解するだろう。これらのジアステレオマーは当業者に周知な方法、例えば結晶化、ガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは合成過程の中間体はラセミ混合物として存在することができ、そして当業者に周知な方法による分離、例えば結晶化により分離できるジアステレオマー塩の形成；例えば結晶化、ガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーにより分離できるジアステレオマー誘導体もしくは錯体の形成；エナンチオマー特異的試薬、例えば酵素的エステル化を用いた１つのエナンチオマーの選択的反応；またはキラルな環境での例えばキラルな支持体上で、例えば結合したキラルなリガンドを含むシリカまたはキラルな溶媒の存在下でのガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーにかけられる。所望の立体異性体が上記の例示的分離手法の１つにより別の化学的物体に転換される場合、所望のエナンチオマー形を遊離するためにはさらなる工程が必要であると考えられる。あるいは特異的な立体異性体は、光学的に活性な出発材料を使用することにより、例えば光学的に活性な試薬、基質、触媒または溶媒を使用した不斉合成により、あるいは１方の立体異性体をもう一方の立体異性体に不斉変換により転換することにより、合成することができる。これらの方法は“Ｃｈｉｒａｌ Ｄｒｕｇｓ”，Ｃｙｎｔｈｉａ Ａ．Ｃｈａｌｌｅｎｅｒ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｗｉｌｅｙ，２００２または“Ｃｈｉｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”ｂｙ Ｂｉｎｇｙｕｎｈ Ｌｉ ａｎｄ Ｄｏｎａｌｄ Ｔ．Ｈａｙｎｉａ
ｉｎ“Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”
ｂｙ Ｓｕｎｇｇｙｕ Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｌｅｅ（Ｅｄｉｔｏｒｓ），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００５のようなテキストにさらに詳細に記載されている。
【００４８】
本発明の化合物およびその塩は、非溶媒化形態ならびに水、エタノール等のような製薬学的に許容され得る溶媒での溶媒化形態で存在できる。
【００４９】
式（１）および式（２）の選択した化合物、およびそれらの塩および溶媒和物は、１より多くの結晶形で存在することができる。式（１）および式（２）により表される化合物の多形は本発明の一部を形成し、そして異なる条件下で式（１）および式（２）の化合物の結晶化により調製することができる。例には再結晶化のために異なる溶媒または溶媒混合物の使用；異なる温度での結晶化；および結晶化中、大変急速から大変遅い冷却の範囲の様々な冷却様式を含む。また多形は式（１）または式（２）の化合物を加熱または融解し、続いて漸次または急速冷却により得ることができる。多形の存在は、例えば固体状態のＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法、示差操作熱量測定、粉末Ｘ線回折または他の類似技術により測定することができる。
【００５０】
また本発明は、同位体で標識した化合物を含み、これは式（１）および（２）により記載される化合物と同一であるが、１もしくは複数の原子が通常、自然に見いだされる原子質量もしくは質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子により置き換えられている。本発明の化合物に取り込むことができる同位体の例には、それぞれ２Ｈ，３Ｈ，１３Ｃ，１４Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，１７Ｏ，３５Ｓ，３６Ｃｌ，１２５Ｉ，１２９Ｉおよび１８Ｆのような水素、炭素、窒素、酸素、硫黄およびフッ素の同位体を含む。前記同位体および／または他の原子の他の同位体を含む本発明の化合物および化合物の製薬学的に許容され得る塩は、本発明の範囲内にある。特定の同位体で標識した本発明の化合物、例えば２Ｈ（ジューテリウム）のような同位体が取り込まれた化合物は、より高い代謝的安定性から治療上の利点、例えばインビボ半減期の上昇、または必要な投薬用量の減少を提供することができ、したがって幾つかの状況で好適となり得る。同位体で標識した本発明の式（１）および（２）の化合物、その塩および溶媒和物は一般に、同位体で標識していない試薬を容易に入手できる同位体で標識された試薬に代えて、以下のスキームおよび／または実施例に開示する手順を行うことにより調製することができる。
【００５１】
本発明の化合物と関連して本明細書で使用する製薬学的に許容され得る塩には、該化合物の製薬学的に許容され得る無機および有機塩を含む。これらの塩は、化合物の最終的単離および精製中にその場で、あるいは化合物を適切な有機もしくは無機酸と別個に反応させ、そしてそのように形成された塩を単離することにより調製できる。代表的な塩には限定するわけではないが臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、蓚酸塩、ベシル酸塩、カンシル酸塩、パルミチン酸塩、マロン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩、リンゴ酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩、ギ酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩等がある。また本発明の化合物は、有機および無機塩基から形成される製薬学的に許容され得る金属およびアミンカチオンとの塩を形成するために反応させることもできる。用語「製薬学的に許容され得る金属カチオン」とは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、鉄、亜鉛等から誘導される正に荷電した金属イオンを包含する。用語「製薬学的に許容され得るアミンカチオン」とは、そのようなカチオンを形成するために十分強力なアンモニアおよび有機窒素性塩基から誘導される正に荷電したイオンを包含する。本発明の化合物の製薬学的に許容され得る非毒性塩基付加塩に有用な塩基は、当業者によりその限界が容易に理解されるクラスを形成する（例えばＢｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１
−１９（１９７７）を参照にされたい）。
【００５２】
さらに本発明は、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグを含む。式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは、アミノ、ヒドロキシまたはカルボキシ基のような化合物の官能基質を用いて、通例の様式で形成することができる。用語「プロドラッグ」は、インビボで変換されて式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物、またはこの化合物の製薬学的に許容され得る塩または溶媒和物を生じる化合物を指す。変換は種々のメカニズムにより、例えば血中での加水分解を介して起こり得る。プロドラッグの使用に関する検討は、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，およびｉｎ Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７により提供される。例えば本発明の化合物がアルコール官能基を含む場合、プロドラッグはアルコール基中の水素原子をＣＯＲ６のような基で置き換えることにより形成されてエステルプロドラッグを提供することができ；ＣＯＮＨＲ６で置き換えてカルバメートプロドラッグを提供することができ；ＣＯＯＲ６で置き換えてカルボネートプロドラッグを提供することができ；ＣＨ２ＯＣＯＲ６で置き換えてアルキルカルボニルオキシメチルプロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ、ならびにリン酸塩およびリン酸塩プロドラッグの対応する無機塩、またはグリコシル（ヘミアセタール形の炭水化物のヒドロキシル基の除去から生じる基）を提供することができ、ここでＲ６はＣ１−Ｃ６アルキル、トリフルオロメチル、シクロプロピル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、フェニル、フェニル（フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、フェニルメチルで置換されている）、フェニルメチル（フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、２−，３−，もしくは−４−ピリジニル、２−，−４−，もしくは５−ピリミジニルで置換されている）を提供することができる。
【００５３】
ＮＦ−κＢ活性化の「下流」の事象の標的とすること、ｐ６５、ＲｅｌＢおよびｃ−ＲｅｌのＤＮＡエンハンサー配列への結合を防ぐこと、および転写の活性化に注目が集まった。この取り組みは正規および非正規経路の両方を種々の化合物を一緒に、または別々に用いてモジュレートすることを可能とする。加えて、「下流」のＮＦ−κＢ阻害剤は、多くの「上流」のＮＦ−κＢ阻害剤で観察される副作用を回避することができる。Ｒｅｌファミリーの新規かつ独占的（ｐｒｏｐｉｅｔａｒｙ）ＮＦ−κＢ阻害剤を同定するための薬物スクリーニングの規範が確立された。適切なリード分子を同定するために３つの平行した取り組みがなされた：（１）ｐ６５の結晶構造を使用した５，０００，０００化合物のイン−シリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）スクリーニング、（２）細胞に基づくスクリーニングを使用して、多様化された化合物ライブラリーの広い高処理量スクリーニング、および（３）ｐ６５の既存の阻害剤を改善するための修飾。既知のｐ６５アンタゴニスト、例えば天然物質のパルテノライド（ｐａｔｈｅｎｏｌｉｄｅ）および合成分子デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）と比較して、本発明の化合物はｐ６５（ＲｅｌＡ）に対する効力に有意な改善を示す（図７を参照にされたい）。
【００５４】
ＤＨＭＥＱまたはパルテノライドとは異なり、本発明の化合物はＲｅｌＢ（図８参照）およびｃ−Ｒｅｌも阻害することが見いだされた（表１）。すなわち化合物は正規および非正規経路の二重阻害剤、ならびに単一阻害剤である。
【００５５】
一般に本発明の化合物は、反応スキーム１および２に概略する一般的合成法により調製され、ここでスキーム中に示される“Ｒ”は以下に示す部分であり
【００５６】
【化５】
【００５７】
そしてＨＥＴは本明細書に記載する通りである。
【００５８】
反応スキーム１に関して、化合物２〜５は公開されている文献の手順に従い調製することができる（例えばＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，７７５を参照にされたい）。２，５−ジメトキシアニリン１を、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（Ｂｏｃ２Ｏ）およびトリエチルアミンを用いてメタノールまたはテトラヒドロフラン中で０℃から室温までの範囲の温度で処理することにより、保護されたアニリン誘導体２が得られた。ビス（アセトキシヨード）ベンゼンを用いてメタノール中、０℃での酸化によりケタール３が得られた。モノエポキシ化は、３０％水性過酸化水素および水性水酸化ナトリウムもしくは炭酸カリウムのような塩基を使用して、水性テトラヒドロフラン中、０℃から室温の範囲の温度で行い４を生じた。Ｂｏｃ基の選択的除去は、４／１のジクロロメタン／トリフルオロ酢酸混合物を用いて、０℃から室温の範囲の温度で行い遊離アミン５が得られた。別法として、この脱保護は三弗化ホウ素−ジエチルエーテル錯体および活性化モレキュラーシーブを、ジクロロメタンのような溶媒中で室温で使用することにより達成することができる。次いでアミン５は酸クロライド（ＲＣｌ）と、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ＬｉＯｔＢｕ）のような塩基を無水テトラヒドロフランのような溶媒中で−７８℃で使用してカップリングさせることによりケタール６が得られた。種々の酸クロライド（ＲＣｌ）は対応するカルボン酸からストレート（ｎｅａｔ）の塩化チオニル中で還流することにより調製された。ケタール６は、トリフルオロ酢酸のような酸性媒質中、ジクロロメタンのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で脱保護することによりジケトン７が得られた。７の位置選択的還元は、わずかに過剰な穏やかな還元剤、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）をメタノールのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で処理することにより達成された。
【００５９】
反応スキーム２において別の合成経路を表す。２，５−ジメトキシアニリン１を酸クロライド（ＲＣｌ）およびピリジンのような塩基で、無水テトラヒドロフランのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で処理して１０が得られた。ビス（アセトキシヨード）ベンゼンを用いて、メタノール中０℃で酸化してケタール１１が得られた。６を得るためのモノエポキシ化は、３０％水性過酸化水素および水性水酸化ナトリウムのような塩基を使用して０℃から室温の範囲の温度で達成された。ケタール６は、トリフルオロ酢酸のような酸性媒質中、ジクロロメタンのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で脱保護する
ことによりジケトン７が得られた。８を提供するための７の位置選択的還元は、わずかに過剰な穏やかな還元剤、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）をメタノールのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で処理することにより達成された。
【００６０】
反応スキーム（２）に表す一般式（７）のジケトン中間体も、ＮＦ−κＢ阻害剤として有意な活性を現すことが見いだされた。すなわち本明細書に記載する一般式（２）のジケトンは本発明の一部と考える。
【００６１】
【化６】
【００６２】
【化７】
【００６３】
本発明の製薬学的組成物は、治療に有効な量の式（１）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩、および製薬学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤または補形剤を含んでなる。本発明の好適な製薬学的組成物は治療に有効な量の式（２）の化合物、また
はその製薬学的に許容され得る塩、および製薬学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤または補形剤を含んでなる。本発明の化合物および製薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤を合わせることにより形成された製薬学的組成物は、次いで錠剤、粉剤、ロゼンジ、シロップ、注入用溶剤等のような様々な剤形で容易に投与される。これらの製薬学的組成物は所望により香料、結合剤、補形剤等のような追加成分を含むことができる。
【００６４】
このように経口投与の目的で、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよび／またはリン酸カルシウムのような種々の補形剤を含有する錠剤は、澱粉、アルギン酸および／または特定の珪酸塩複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｌｉｃａｔｅｓ）のような種々の崩壊剤と一緒に、ポリビニルピロリドン、シュクロース、ゼラチンおよび／またはアカシアなどの結合剤と共に使用することができる。さらにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような潤滑剤もしばしば製剤する目的に有用である。また類似の種類の固体組成物は、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。この目的に好適な材料には、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールがある。経口投与にエリキシル剤の水性懸濁液が望まれる場合、その中の活性な製薬学的製剤は種々の風味の甘味料、着色物質もしくは色素、および所望により乳化剤もしくは懸濁剤を、希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび／またはそれらの混合物と共に合わせることができる。
【００６５】
非経口投与には、ゴマまたは落花生油、水性プロピレングリコール、または滅菌水溶液中の本発明の化合物もしくは組成物の溶液を使用できる。そのような水溶液は必要に応じて適切に緩衝化され、そして液体の希釈物が最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張性とされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用する滅菌水性媒質は当業者に知られている標準的技術によりすべて容易に入手可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
図面は記載する本発明の具体的態様を表し、ゆえに具体的説明のみを目的とする。したがって図面は本発明の範囲を限定することを意図していない。
【図１】２種のＮＦ−κＢ依存的レポーター遺伝子、ルシフェラーゼ（Ａ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｂ）の実施例１の化合物によるＨＥＫ−２９３細胞中での濃度依存的発現阻害を表す。
【図２】実施例１の化合物はｈＰＢＭＣに対して細胞傷害効果をほとんどもたないことを示す。ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）は実施例１もしくはＤＨＭＥＱで処理され、そして生存可能な細胞の割合を薬剤処理から２４時間後に評価した。グラフは３回の反復実験の平均±標準偏差を表す。
【図３】実施例１の化合物が、ｈＰＢＭＣ中で可溶性ＩＬ−２Ｒα、ＮＦ−κＢ調節型サイトカインのＮＦ−κＢ依存的発現に及ぼす効果を表す。グラフは２回の独立した実験の平均である。
【図４】実施例１の化合物が乳癌細胞中で炎症性サイトカイン、ＩＬ−６（Ａ）およびＩＬ−８（Ｂ）の分泌を用量依存的様式で阻害する能力を表す。具体的にはＡおよびＢは、実施例１の化合物が、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αで刺激したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からＩＬ−６およびＩＬ−８の分泌に及ぼす効果を表す。細胞を示した濃度の実施例１の化合物で２時間処理し、次にＴＮＦ−αを加え、そして４時間インキュベーションを続行した。
【図５】実施例１の化合物が、ＬＰＳで刺激したマウスマクロファージ細胞中で炎症性サイトカイン、ＩＬ−６およびＰＧＥ２の分泌を用量依存的様式で阻害する能力を表す。具体的にはＡおよびＢは、実施例１の化合物が、１μｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞から可溶性ＰＧＥ２およびＩＬ−６の分泌に及ぼす効果を表す。細胞を示した濃度の化合物１で２時間処理し、次にＬＰＳを加え、そして４時間インキュベーションを続行した。
【図６】実施例１の化合物が、ＲｅｌＡ／ｐ６５の細胞質から核への移行を用量依存的様式で遮断する能力を表す。具体的には実施例１の化合物は、細胞の細胞質に活性化ＲｅｌＡ／ｐ６５の蓄積を引き起こす。Ｈｅｋ２９３細胞を、ＤＨＭＥＱまたは実施例１の化合物（示すように）で、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に３０分間処理した。インキュベーション後、細胞を抗−ｐ６５抗体（Ｃ−２０）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，サンタクルズ，カリフォルニア州）で免疫染色し、そして核をＤａｐｉでカウンター染色した。像はＡＥ３１倒立顕微鏡を使用して、エピフルオレッセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）イルミネーター（Ｍｏｔｉｃ，Ｘｉａｍｅｎ，中国）およびＰｒｏｇＲｅｓ Ｃ３カメラ（ＪＥＮＯＰＴＩＫ，イェーナ，ドイツ）を用いて撮った。ｐ６５および対応する核の個々の像は、最後の図にまとめた。対照処理細胞（ＤＭＳＯのみ）は、ＴＮＦα刺激でｐ６５の核内蓄積を示す。ＴＮＦαにより誘導されたｐ６５の核内蓄積は、１〜１２μＭの実施例１の化合物で有意に遮断されたが、ＤＨＭＥＱには同じ効果を得るためにより高濃度が必要であった。
【図７】実施例２の化合物はｐ６５（ＲｅｌＡ）のＤＮＡへの結合を、正規経路でＤＨＭＥＱおよびパルテノライドよりも強く阻害することを示す。
【図８】実施例２の化合物はＲｅｌＢのＤＮＡへの結合を、非正規経路で阻害するが（ＩＣ５０〜２μＭ）、ＤＨＭＥＱおよびパルテノライドは阻害しない（ＩＣ５０＞２０μＭ）ことを示す。
【図９】実施例２の化合物は、異種移植マウスでボルデゾミブ（ＰＳ−３４１）のようにＲＰＭＩ８２２６腫瘍増殖を減少させたことを示す。ＰＳ−３４１（１ｍｇ／ｋｇ ｉｖ日 １，４／週 ｘ ４週）も実施例２の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ ｉｐ ＱＤｘ２１）処置のいずれもこの実験では賦形剤処置に比べて統計的に有意な腫瘍の増殖阻害を達成しなかった（Ｐ＞０．１０）。
【図１０】実施例２の化合物は、エタネルセプトのような抗炎症効力をコラーゲン誘導型の関節リウマチ（ＣＩＡ）のマウスモデルで現したことを示す。実施例２の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．ｑｄ２１−３５）およびエタネルセプト（５０μｇ／マウス ｉｐ ｑｄ２１−３５）処置群は、両方とも統計的に有意な抗炎症効果を達成した（賦形剤処置群に比べてＰ＜０．０５）。
【図１１】実施例２の化合物（１０μＭで）はヒトＰ４５０およびｈＥＲＧと相互作用しない（＜５０％阻害）ことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
実施例の態様では、製薬学的調製物は単位剤形である。そのような形態では、調製物は適切な量の有効成分を含有する単位用量に分割されている。単位剤形は包装された調製物であることができ、例えば包装された錠剤、カプセルおよびバイアルもしくはアンプル中の粉末であることができる。また単位剤形はカプセル、カシェーまたは錠剤自体であることもでき、あるいは適切な数の任意のこのような包装形態であることができる。
【００６８】
特定量の有効成分を含む種々の製薬学的組成物の調製法は、当業者に知られている。例
えば製薬学的組成物の調製法については、引用により全部、本明細書に編入するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照にされたい。
【００６９】
本発明の一つの態様では、本発明の化合物を少なくとも１種の追加の治療薬と合わせることができる。
【実施例１】
【００７０】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ニコチンアミド（８ａ）の調製。
【００７１】
Ａ．ｔｅｒｔ−ブチル２，５−ジメトキシフェニルカルバメート（２）の調製
氷浴中の２，５−ジメトキシアニリン１（５０ｇ，３２６ミリモル）の溶液（１ＬのＭｅＯＨ中）に、不活性窒素雰囲気下でトリエチルアミン（５５ｍＬ，３９７ミリモル）、続いてＢｏｃ２Ｏ（７８ｇ，３５９ミリモル）（１５０ｍＬのメタノール中）を滴下様式で加えた。反応混合物を一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィーにより不完全と判断された後、さらにＢｏｃ２Ｏ（２２ｇ，６９ミリモル）およびトリエチルアミン（５５ｍＬ，３９７ミリモル）を加え、そしてこの溶液を３日間撹拌した。メタノールを除去し、そして残渣を酢酸エチルに溶解し、これを希釈塩酸（２ｘ）およびブラインですすいだ後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、続いて濾過し、そして溶媒を蒸発させて５０ｇ（６１％）のｔｅｒｔ−ブチル ２，５−ジメトキシフェニルカルバメート（２）を茶色い油として得た。１Ｈ ＮＭＲは文献で報告された値と一致した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，７７５）。
【００７２】
Ｂ．ｔｅｒｔ−ブチル ６，６−ジメトキシ−３−オキソシクロヘキサ−１，４−ジエニルカルバメート（３）の調製
化合物２（２９ｇ，１１５ミリモル）のメタノール性溶液（７００ｍＬ）を氷浴中で冷却した後、さらにビス（アセトキシヨード）ベンゼン（６２ｇ，１９４ミリモル）を３０分間にわたり６回に分けて加えた。溶液を氷浴中で２時間撹拌し、次いで室温とし、そして一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１．５Ｌ）で希釈し、そして水、希釈塩酸およびブラインですすいだ。水性相を酢酸エチルで１回逆抽出し、そして有機相を合わせた後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、続いて濾過し、そして溶媒を蒸発させた。生じた液体は、ヘプタン中の酢酸エチルの勾配（０〜２％）を使用してシリカゲルで精製して、６．９ｇ（２１％）（３）を黄−オレンジ色の固体を得た。材料は１Ｈ ＮＭＲにより十分に純粋（約９５％）であり、これは文献で報告された値と一致した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
１９９８，７７５）。
【００７３】
Ｃ．ｔｅｒｔ−ブチル ２，２−ジメトキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イルカルバメート（４）の調製
テトラヒドロフラン（９３ｍＬ）中の化合物３（３．４ｇ，１２．７モル）を、氷浴中で冷却した。この撹拌溶液に、滴下様式で過酸化水素（３０％水性，２２ｍＬ）および水性水酸化ナトリウム（１Ｍ，６１ｍＬ）を、２つの別個の添加漏斗をクライゼンアダプターを利用して使用して直列で加えた。反応混合物は氷浴中で３０分間、次いで室温で５時間撹拌した。フラスコを氷浴中で冷却し、そして過酸化物を二酸化マンガンで慎重にクエンチした。混合物をシリカゲルの小ベット上で濾過し、続いてシリカゲルを酢酸エチルですすいだ後、混合物をブラインで洗浄した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして蒸発させた。生じた油をペンタンで処理してオフホワイト色の固体を沈殿させ、溶媒を蒸発させた後、２ｇ（５６％）の化合物（４）を得た。１Ｈ ＮＭＲは混合物中に２０％の出発材料を示し、これは次の段階で容易に除去された（ＴＦＡで処理）。生
成物の１Ｈ ＮＭＲは文献で報告された値と一致した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，７７５）。
【００７４】
Ｄ．４−アミノ−５，５−ジメトキシ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン（５）の調製
化合物４（３００ｍｇ，１．１ミリモル）の溶液（６ｍＬの無水ジクロロメタン中）を、氷浴中で不活性窒素雰囲気下で撹拌した。この溶液にトリフルオロ酢酸（１．５ｍＬ）を滴下し、そして溶液を室温とし、３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにより完全と判断された後、溶媒を蒸発させ、そして残渣を酢酸エチルに溶解した。固体の重炭酸ナトリウム（２ｇ）を慎重に加え、そして溶液を１０分間撹拌した。塩を濾過し、そして酢酸エチルですすいだ後、溶媒を蒸発させた。粗化合物はヘプタン中の酢酸エチルの勾配（０〜１００％）を使用してシリカゲルで精製した。１００％酢酸エチルで溶出した生成物は、１７８ｍｇ（９１％）の化合物（５）を与えた。生成物の１Ｈ ＮＭＲは文献で報告された値と一致した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，７７５）。
【００７５】
Ｅ．Ｎ−（２，２−ジメトキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシニコチンアミド（６ａ）の調製
２−ヒドロキシコニチン酸（１１２ｍｇ，０．８１ミリモル）および塩化チオニル（６５０ｍＬ，８．９ミリモル）の混合物を３０分間、加熱還流した。室温に冷却した後、過剰な塩化チオニルを真空下で除去し、そして生じた酸クロライドを不活性な窒素雰囲気下で保存した。別に無水テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中にアミン５（１００ｍｇ，０．５４ミリモル）を含有するフラスコを不活性な窒素雰囲気下で−７８℃に冷却し、その後リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１Ｍのテトラヒドロフラン中、５４０ｍＬ，０．５４ミリモル）を滴下した。この溶液を３０分間撹拌した後、粗２−ヒドロキシニコチノイルクロライド（１ｍＬのテトラヒドロフラン中）を滴下した。反応混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで室温に温め、そして１時間撹拌した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）では、所望の、および過アシル化生成物の両方が示された。次いで反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和塩化アンモニウム次いでブラインですすぎ、そして水性相を酢酸エチルで逆抽出し、続いてブラインで洗浄した。合わせた有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濾過し、そして溶媒を蒸発させて１６９ｍｇの粗材料を得た。ヘプタン中の酢酸エチルの勾配（５０〜１００％）を使用してシリカゲルでのクロマトグラフィーで、生成物と出発材料の５６ｍｇの混合物、所望の生成物と過アシル化生成物の５６ｍｇの混合物、および３１ｍｇの主に過アシル化生成物が得られた（粗収率：９９％）。所望の生成物／過アシル化材料の５６ｍｇの混合物をメタノール（１．４ｍＬ）および水（２００ｍＬ）に溶解した後、炭酸カリウム（９ｍｇ，〜１当量）を加えた。反応物は室温で２時間撹拌した後、薄層クロマトグラフィーにより完全であると判断された。溶液を酢酸エチルで希釈し、そしてブラインで洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶媒を蒸発させて５０ｍｇの化合物６ａを得た。この生成物の構造は１Ｈ
ＮＭＲにより確認された。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１２．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．６２（ｍ，ＩＨ），７．５５（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【００７６】
Ｆ．Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシニコチンアミド（７ａ）の調製
無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中の６ａ（５０ｍｇ，０．１６ミリモル）溶液に、ゆっくりとトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を室温で加えた。一晩撹拌した後、ＬＣ−ＭＳは２７％の出発材料が残っていることを示した。さらにトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を加え、そして反応混合物をさらに２４時間撹拌し、この時点で完了と判断された。溶液を氷浴中で冷却し、そしてさらにジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈した後、飽和重炭酸ナ
トリウム溶液を撹拌している混合物がアルカリ性になるまでゆっくりと加えた。次いで混合物を分配し、そして有機溶媒を取り出し、そしてブラインですすいだ。水性層を酢酸エチルで２回抽出し、そして有機層をブラインで洗浄した。すべての有機物をプールし、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濾過し、そして溶媒を蒸発させて７ａを明黄色の固体として得た（３０ｍｇ，７１％）。ＬＣ−ＭＳは８０％純度を示し、そしてこの材料をさらに精製せずに次の工程で使用した。
【００７７】
Ｇ．（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ニコチンアミド（８ａ）の調製
０℃に冷却したメタノール（４ｍＬ）中の化合物７ａ（３０ｍｇ，０．０９２ミリモル，８０％純度）溶液に、不活性窒素雰囲気下でトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３０ｍｇ，０．１４２ミリモル）を１回で加えた。この溶液をこの温度で１５分間撹拌した後、室温とした。さらに４５分間撹拌した後、反応はＴＬＣにより完了したと判断された。メタノールを約２ｍＬ容量まで蒸発させ、そしてフラスコを氷浴中で１０分間冷却した。次いで沈殿を濾過し、そしてメタノールですすいだ（２ ｘ ３ｍＬ）。高吸引下で乾燥した後、１０ｍｇ（４２％収率）の化合物８ａが淡黄色の固体として単離された。この純度はＨＰＬＣにより９５％であった（Ｒｅｓｔｅｋ Ｐｉｎｎａｃｌｅ ＩＩ カラム、Ｃ１８，５μ，２５０ ｘ ４．６ｍｍ；移動相：水中５％ アセトニトリルで５分、次いで２０分間にわたり水中５〜１００％のアセトニトリル；流速：１．５ｍＬ／分；検出器：３１６ｎｍ（ＶＷＤ）。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認した。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．５０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．３５（ｍ，ＩＨ），７．８５（ｍ，ＩＨ），６．９０（ｍ，ＩＨ），６．５５（ｍ，２Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２】
【００７８】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）キノリン−３−カルボキサミド（８ｂ）。
【００７９】
実施例１の方法を使用するが、工程Ｅの２−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸に代えて使用して、２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）キノリン−３−カルボキサミドを調製した。
【００８０】
Ａ．Ｎ−（２，２−ジメトキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシキノリン−３−カルボキサミド（６ｂ）の調製
２−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸（５２８ｍｇ，２．８ミリモル）を含む乾燥丸底フラスコに、塩化チオニル（４ｍＬ，５７ミリモル）を加えた。混合物を２０分間、加熱還流した後、塩化チオニルをロータリーエバポレーターで蒸発させた。別のフラスコで、アミン５（４３０ｍｇ，２．３ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（１７ｍＬ）に溶解し、そして不活性な窒素雰囲気下で−７８℃に冷却した。冷却したアミン溶液に、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１Ｍのテトラヒドロフラン中；３ｍＬ，３ミリモル）を加え、続いて１５分間撹拌した。次いで酸クロライドをテトラヒドロフラン（１２ｍＬ）中で懸濁し、そして冷却アミン溶液に直接加えた。反応混合物を一晩撹拌し、その間に室温になった。次いで反応物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮して５５０ｍｇの粗物質を得、これは１０％のＯ−アロイル化生成物を含んだ（ＬＣ−ＭＳにより定めたように）。固体は２５ｍｇの炭酸カリウムを含有する８／１のメタノール／水（９ｍＬ）中で１時間撹拌し、その後、酢酸エチルで希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム溶液およびブラインで洗浄した。酢酸エチルを無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して少量のエステルを含む固体を得た。次いで生成物は小さいシリカプラグで精製し、９５／５のジクロロメタン／酢酸エチ
ルで溶出して、５３０ｍｇの淡黄色の固体（６４％収率）を得た。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１２．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｍ，ＩＨ），７．８０（ｍ，ＩＨ），７．６５（ｍ，ＩＨ），７．４０（ｍ，２Ｈ），５．６０（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【００８１】
Ｂ．Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシキノリン−３−カルボキサミド（７ｂ）の調製
Ｎ−（２，２−ジメトキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシキノリン−３−カルボキサミド（６５ｍｇ，０．１８ミリモル）を含有するフラスコに、トリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を１回で加えた。溶液を３時間撹拌した後、反応をＬＣ−ＭＳにより判断した。トリフルオロ酢酸を真空下で除去し、そして生成物を窒素ガスで乾燥して５７ｍｇ（１００％）の表題生成物を得、これは約１５％の副産物を含み、これは加水分解生成物であることが示唆された（アミドおよびエポキシドの両位置で；Ｍ＋ ２０４）。この固体をさらに特性決定または精製することなく次の工程に使用した。
【００８２】
Ｃ．（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）キノリン−３−カルボキサミド（８ｂ）の調製
上記で得た化合物を、２／１のテトラヒドロフラン／メタノール混合物（３６ｍＬ）に溶解し、そして０℃に冷却した。次いでトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを一回で加え、そして反応を室温とした。３０分間撹拌した後、反応はＬＣ−ＭＳにより完了したと判断した。次いで溶媒を蒸発させ、そしてメタノール（５ｍＬ）を加えた。混合物を簡単に超音波処理し、そして氷浴中で１５分間冷却した。次いで固体を濾過し、そしてメタノールですすぎ（２ ｘ ２ｍＬ）、集め、高真空下で乾燥させて１８ｍｇ（７８％）の生成物を得た。純度はＨＰＬＣにより９４％であった（Ｒｅｓｔｅｋ Ｐｉｎｎａｃｌｅ
ＩＩ カラム，Ｃ１８，５μ，１５０ ｘ ４．６ｍｍ；移動相：水中５％アセトニトリルで５分間（０．１％ ＴＦＡ）、次いで２０分間にわたり水中５〜１００％のアセトニトリル（０．１％ トリフルオロ酢酸）；流速：１．５ｍＬ／分；検出器：３１６ｎｍ（ＶＷＤ））。生成物構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認した。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．５０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｍ，ＩＨ），８．００（ｍ，ＩＨ），７．７５（ｍ，ＩＨ），７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｍ，１Ｈ），６．６５（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３】
【００８３】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピコリンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．２０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．２０（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．４５（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例４】
【００８４】
（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．４５（ｍ，２Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例５】
【００８５】
（±）−６−クロロ−４−ヒドロキシ−キノリン−３−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１３．１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．５０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．９０（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例６】
【００８６】
（±）−４−ヒドロキシ−８−トリフルオロメチル−キノリン−３−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．７５（ｍ，１Ｈ），８．６０（ｍ，１Ｈ），８．２５（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例７】
【００８７】
（±）−５−クロロ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．６５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．２５（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．５５（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例８】
【００８８】
（±）−４−ヒドロキシ−２−フェニルピリミジン−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−ｅｎ−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．００（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．７５（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｍ，３Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例９】
【００８９】
（±）−３−ヒドロキシ−キノキサリン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ
ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．００（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１０】
【００９０】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−６−メチル−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．２０（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），６．４０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１１】
【００９１】
（±）−４−ヒドロキシ−２−ピペリジン−１−イル−ピリミジン−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．５０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），６．５０（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，４Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），１．６（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１２】
【００９２】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピコリンアミド，メシレート。１Ｈ ＮＭＲ
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），５．００（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），３．２０（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１３】
【００９３】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピコリンアミドトリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．６０（ｂｒ．ｓ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１４】
【００９４】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピコリンアミド トシレート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．２０（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），７．１０（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），２．２（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１５】
【００９５】
（±）−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１６】
【００９６】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−メトキシ−ニコチンアミド． １Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．４０（ｍ，１Ｈ），８．３５（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１７】
【００９７】
（±）−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド メシレート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），
１０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１８】
【００９８】
（±）−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミドトリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ）４．９０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１９】
【００９９】
（±）−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド トシレート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），７．１（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ）４．９０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），２．２（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２０】
【０１００】
（±）−３−メトキシ−ピリジン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），７．００（ｍ，ＩＨ），５．７０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２１】
【０１０１】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−メトキシ−ニコチンアミドトリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．４０（ｍ，１Ｈ），８．３５（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，ＩＨ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２２】
【０１０２】
（±）−３−メトキシ−ピリジン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド トリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．４０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，ＩＨ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２３】
【０１０３】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−６−トリフルオロメチル−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２４】
【０１０４】
（±）−４−ヒドロキシ−２−メチル−ピリミジン−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．４０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１１．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｍ，ＩＨ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２５】
【０１０５】
（±）−２−メトキシ−キノリン−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｍ，１Ｈ），８．１０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｍ，ＩＨ），６．９０（ｍ，２Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２６】
【０１０６】
（±）−３−メトキシ−ピラジン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド． １Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），８．３５（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，ＩＨ），６．７０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２７】
【０１０７】
（±）−１−クロロ−４−ヒドロキシ−イソキノリン−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．４０（ｍ，２Ｈ），８．１０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２８】
【０１０８】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシキノリン−３−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｍ，１Ｈ），８．００（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．５（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２９】
【０１０９】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−８−メトキシキノリン−７−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．１０（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３０】
【０１１０】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−メトキシ−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，ＩＨ），４．２０（ｍ，１Ｈ），４．１０（ｓ，３Ｈ），３．９５（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３１】
【０１１１】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−３−メトキシキノリン−２−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），８．００（ｍ，２Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３２】
【０１１２】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−８−メトキシキノリン−７−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．２０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），８．１０（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｓ，３Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３３】
【０１１３】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−８−メトキシキノリン−７−カルボキサミドトリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．２０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），８．１０（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３４】
【０１１４】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−３−ヒドロキシイソニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．３０（ｓ，１Ｈ），８．００（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｓ，１Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３５】
【０１１５】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−メトキシキノリン−３−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．００（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，２Ｈ），７．７５（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｓ，３Ｈ），４．００（ｓ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３６】
【０１１６】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−６−メトキシキノリン−３−カルボキサミド．１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．５０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．９０（ｍ，ＩＨ），７．５０（ｍ，ＩＨ），７．４０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，４Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３７】
【０１１７】
（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで６−ヒドロキシベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例３８】
【０１１８】
（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−５−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで６−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−５−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−５−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例３９】
【０１１９】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピペリジン−２−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで３−ヒドロキシピペリジン−２−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピペリジン−２−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４０】
【０１２０】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで３−ヒドロキシピラジン−２−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミドを調製するこことができる。
【実施例４１】
【０１２１】
（±）−５−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリミジン−４−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで５−ヒドロキシピリミジン−４−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−５−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリミジン−４−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４２】
【０１２２】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１，８−ナフチリジン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで２−ヒドロキシ−１，８−ナフチリジン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１，８−ナフチリジン−３−カルボキサミドを調製することができる
。
【実施例４３】
【０１２３】
（±）−７−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで７−ヒドロキシ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−７−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４４】
【０１２４】
（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリダジン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで４−ヒドロキシ−ピリダジン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリダジン−３−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４５】
【０１２５】
（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４６】
【０１２６】
４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）フラン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで４−ヒドロキシフラン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）フラン−３−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４７】
【０１２７】
（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）チオフェン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで４−ヒドロキシチオフェン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）チオフェン−３−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４８】
【０１２８】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）イソチアゾール−４−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで３−ヒドロキシイソチアゾール−４−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）イソチアゾール−４−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４９】
【０１２９】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）イソキサゾール−４−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで３−ヒドロキシイソキサゾール−４−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）イソキサゾール−４−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例５０】
【０１３０】
（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで６−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−５−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例５１】
【０１３１】
（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで６−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例５２】
【０１３２】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）モルホリン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで２−ヒドロキシモルホリン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）モルホリン−３−カルボキサミドを調製することができる。
【０１３３】
実施例１の化合物による細胞内でのＮＦ−κＢの阻害 ２つのレポーター細胞アッセイを使用して、実施例１の化合物がＮＦ−κＢが駆動する転写を阻害する能力を測定した。第１アッセイは、３つのＮＦ−κＢプロモーター要素を含む安定に組み込まれたｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃレポータープラスミドを用いた２９３−細胞に基づくアッセイであった。第２のアッセイは、４つのＮＦ−κＢプロモーター要素を含む安定に組み込まれたｐＴＲＨ１−ＮＦ−κＢ−ｄｓｃＧＦＰレポーターを用いた２９３−細胞に基づくアッセイであった。細胞を０、０．２、１、１０、２０および４０μＭの実施例１の化合物で２時間処理し、次いで２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで１８時間誘導した。誘導後、発光または蛍光を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ２３００プレートリーダーを使用して定量した。図１ＡおよびＢはそれぞれ発光および蛍光データから作成した用量応答曲線を示す。実施例１の化合物は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を用量依存的様式で阻害することが観察され、１６．２±１．１μＭのＩＣ５０中央値（５０％の阻害濃度）であった。また実施例１の化合物は、緑色蛍光タンパク質遺伝子の発現も用量依存的様式で阻害し、６．２±０．５μＭのＩＣ５０中央値であった。これらの値は３回の独立した実験±標準誤差から作成した中央値を表す。対照として、０．５％ ＤＭＳＯ処理および未処理細胞と比較して、実施例１の担体がルシフェラーゼの発現またはアッセイの読み取りに影響を及ぼさないこ
とが確認された。ＤＭＳＯ処理群でのアッセイからの出力にわずかな減少があったが、統計的に有意ではなかった。対照の結果として、薬剤処理したサンプルにおける活性の低下をＤＭＳＯ処理サンプルと比較した。
【０１３４】
実施例１の化合物の細胞傷害プロファイル 実施例１の化合物の細胞傷害性は、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣｓ）について測定された。図２を参照にされたい。活性アッセイの場合のように、ｈＰＢＭＣｓを０、０．２、１、１０、２０および４０μＭの実施例１の化合物で２時間処理し、次いで２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで４８時間誘導した。生存可能細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存能アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ ＃ Ｇ７５７３））を使用して測定した。代表的な実験を図２に示す。グラフが示すように、実施例１の化合物を用いてこれらの細胞に対して検出できる毒性は、試験した４０μＭまでほとんどなかった。対照的に、ＤＨＭＥＱは４０μＭで６０％より高い細胞増殖の阻害を現した。０．５％のＤＭＳＯで処理した細胞は、未処理ｈＰＢＭＣｓに比べて検出できる細胞傷害効果を示さなかった。選択性指数（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ：細胞傷害性ＣＣ５０対阻害性ＩＣ５０の比）を実施例１の化合物に割り当てる。上記阻害および毒性実験で得られた結果に基づき、実施例１の化合物はＤＨＭＥＱに比べてより高い選択性を現した（すなわちより高い活性およびより低い細胞傷害性）。
【０１３５】
可溶性ＩＬ−２ＲαはＮＦ−κＢにより転写的に調節される 図３はｓＩＬ−２Ｒαの血清レベルが実施例１で処理した細胞により影響され得ることを示す。ヒトＰＢＭＣｓを０、０．２、１、１０、２０および４０μＭの実施例１の化合物で処理すると同時にＰＨＡ−Ｐで活性化した。細胞をさらに３日間培養し、そして培地をマーカーの評価のために回収した。図３はｓＩＬ−２ＲαがＰＨＡ−Ｐの活性化により有意に誘導されたことを示す。さらにグラフでは、ｓＩＬ−２Ｒαが実施例１の化合物の添加に用量依存的様式で影響され、１０μＭの実施例１の化合物で統計的に有意な効果が生じたことを示す。
【０１３６】
実施例１の化合物によるＩＬ−６およびＩＬ−８分泌の阻害 過去数年にわたり、乳癌に関する徹底的な研究で、ＨＥＲ２、エストロゲンレセプター（ＥＲ）の過剰発現、およびｐ５３、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を含む遺伝子の突然変異が、核内因子κＢを含む複数の脈管形成性アポトーシス促進レギュレーターの誘導を介して乳癌の発症および進行に重要な役割を果たすという認識に至った。ＮＦ−κＢはしばしば、乳癌、膀胱癌、前立腺癌および黒色腫で恒常的に活性化される。多くの研究でＮＦ−κＢの恒常的活性化が乳癌細胞株のホルモン非依存的増殖の進行に貢献することが示された。
【０１３７】
ＮＦ−κＢシグナル伝達経路は、ＩＬ−６およびＩＬ−８を恒常的に分泌することが示されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で恒常的に活性化される一方、ＴＮＦ−αの添加がさらにこの分泌を加速する（図４ＡおよびＢを参照にされたい）。この実施例１の化合物は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１からの恒常的なＩＬ−６およびＩＬ−８分泌を用量依存的様式で阻害することが観察された。たとえ細胞がＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で刺激された場合でも、２０μＭの実施例１の化合物はこれらの細胞からＩＬ−６およびＩＬ−８の分泌を完全に阻害した（図４ＡおよびＢを参照）。
【０１３８】
マクロファージは免疫反応、アレルギーおよび炎症に重要な役割を果たす。過剰なマクロファージの活性化は、充実性腫瘍、糖尿病、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経疾患を増す。ゆえに過剰なマクロファージの活性を抑制することはこれらの疾患に化学療法として有用となるはずである。細胞培養実験には、マウス細胞株ＲＡＷ２６４．７がマクロファージのモデルとしてしばしば使用される。微生物およびリポ多糖（ＬＰＳ）のようなその生産物に反応して、マクロファージはインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを含む様々な炎症性サイトカインを、核内因子ＮＦ−κＢの活性化を介し
て分泌し、ならびにＮＦ−κＢ−依存的誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）を発現する。ＮＦ−κＢは細胞外シグナルにより主にマクロファージ内の様々なＴｏｌｌ−様受容体を介して活性化される。免疫系による微生物感染の検出および応答は、Ｔｏｌｌ−様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれるパターン認識受容体のファミリーに依存する。これらの受容体は、グラム陽性および陰性細菌、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、菌・カビ、および原生動物に由来する分子を含む病原体に関連する分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するように進化的に保存されており、そしてそれらはかなりの標的特異性を表す。ＴＬＲ４はグラム陰性細菌のＬＰＳに対する効果的な宿主細胞応答に重要である。
【０１３９】
ＬＰＳ刺激はプロスタグランジンＥ２の原因である酵素ＣＯＸ−２の発現を誘導する。実施例１の化合物での前処理は、６〜１２時間で発現の強い阻害を生じた。このＬＰＳが誘導するＣＯＸ−２発現の減少は、図５Ａに示すように、下流のＰＧＥ２合成の減少により示されるように用量依存的であった。
【０１４０】
炎症性サイトカインＩＬ−６は、図５Ｂに示すように実施例１の化合物により用量依存的様式で阻害された。この阻害はＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株におけるＩＬ−６の阻害と合致する。
【０１４１】
ＲｅｌＡ／ｐ６５の免疫染色 実施例１の化合物は細胞の細胞質内に活性化ＲｅｌＡ／ｐ６５の蓄積を引き起こす。Ｈｅｋ２９３細胞をＤＨＭＥＱまたは実施例１の化合物（示すような）でＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に３０分間処理した。インキュベーション後、細胞を抗−ｐ６５抗体（Ｃ−２０）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，サンタクルズ，カリフォルニア州）で免疫染色し、そして核はＤａｐｉを用いてカウンター染色した。像はＡＥ３１倒立顕微鏡を使用してエピフルオレッセンスイルミネーター（Ｍｏｔｉｃ，厦門，中国）およびＰｒｏｇＲｅｓ Ｃ３ カメラ（ＪＥＮＯＰＴＩＫ，イェーナ，ドイツ）を用いて撮影した。ｐ６５および対応する核の個々の像は、図面の最後にまとめた。対照処理細胞（ＤＭＳＯのみ）は、ＴＮＦα刺激でｐ６５の核内蓄積を現した。ＴＮＦαにより誘導されるｐ６５の核内蓄積は、１〜１２μＭの実施例１の化合物により有意に遮断され、一方、ＤＨＭＥＱは同じ効果を達成するためにより高い濃度を要した。図６を参照にされたい。
【０１４２】
Ｔｒａｎｓ ＡＭ ＮＦ−κＢファミリーＤＮＡ結合ＥＬＩＳＡ 薬剤化合物に暴露した活性化核抽出物または精製組換えＮＦ−κＢタンパク質からのＮＦ−κＢヘテロ二量体またはホモ二量体サブユニットの結合活性を、Ｔｒａｎｓ ＡＭ ＮＦ−κＢファミリー結合ＥＬＩＳＡ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）により評価した。ＴＮＦα活性化ＨｅｌａまたはＲａｊｉ細胞（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）由来の３〜５μｇの核抽出物、または２０ｎｇの精製組換えタンパク質（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆからｐ６５およびｐ５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚからのｐ５２）を、室温で１時間、ＤＴＴを含まない完全溶解バッファー（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）で希釈した２０μＬの薬剤化合物とインキュベーションした。次いで処理したサンプルを、ＮＦ−κＢコンセンサスオリゴヌクレオチドでプレコートしたマイクロプレートウェル中の３０μＬの完全結合バッファー（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ：ＤＴＴを含む）に移した。対照には、溶解バッファーを含有するが抽出物もしくは組換えタンパク質を含まない非特異的結合（ＮＳＢ）ウェル（バックグラウンド用）、ＤＭＳＯのみで処理した核抽出物または組換えタンパク質（最大の結合用）、および抽出物／タンパク質に競合物として２０ｐｍｏｌｅの遊離野生型ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド、または特異性を証明するための対照として２０ｐｍｏｌｅの遊離変異体ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドを加えたウェルを含んだ。プレートを室温で１時間、ゆっくりと振盪しながらインキュベーションし、そして２００μＬの１ｘ洗浄バッファーで３回洗浄した。プレートに結合したＮＦ−κＢ ｐ６
５、ｐ５０、ｐ５２、ＲｅｌＢまたはｃ−Ｒｅｌサブユニットは、そのサブユニットに特異的な１００μＬの１次抗体（１：１０００に１ｘ抗体バッファーで希釈）で検出した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、次いで２００μＬの１ｘ洗浄バッファーで３回洗浄した。次に１００μＬのＨＲＰ結合ヤギ抗−ウサギ抗体（１：１，０００に１ｘ抗体バッファーで希釈）を各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションし、次いで２００μＬの１ｘ洗浄バッファーで４回洗浄した。１００μＬの室温発色溶液を各ウェルに加えた。反応物は媒質が暗青色に発色するまで２〜１０分間現像し（使用した抽出物のロットまたは組換えタンパク質のロットのサブユニット活性に依存する）、次いで反応は１００μＬの停止溶液で止めて黄色い色を生じた。吸収は４５０ｎｍでＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＤＴＸ ８８０ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用して記録し、６２０ｎｍの参照波長値を引いた。図７および８は実施例２、ＤＨＭＥＱおよびパルテノライドのＲｅｌＡおよびＲｅｌＢのＮＦ−κＢ部位への阻害効果を具体的に説明する。
【０１４３】
実施例１および２の化合物に加えて、表１は他の化合物が１）ＮＦ−κＢが駆動するルシフェラーゼおよびＧＦＰのＨＥＫ２９３細胞中での発現、２）Ｉｌ−６およびＰＧＥ２のＲＡＷ２６４細胞からの放出、３）および３）ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５０およびｐ５２のＮＦ−κＢ部位への結合を阻害するそれらの活性について列挙する。
【０１４４】
【表１】
【０１４５】
一連のインビトロ実験において、本発明のＮＦ−κＢ阻害剤は、サイトカインの放出および広いスペクトルの癌細胞株の増殖を防いだ。これらの化合物は、チトクロームＰ４５０の活性を阻害せず、またはｈＥＲＧチャンネルを遮断しなかった。数種の化合物が齧歯類の疾患モデルで効力試験について評価された。我々は初めに、正規および非正規経路の両方で恒常的活性化の高い発生率を有する多発性骨髄腫において、この化合物のインビボ効力を得ようとした。ヒトＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫の異種移植片モデルでは、実施例２の化合物は、この適応症の最も重要な治療となると認められているＰＳ−３４１（ボルテゾミブ、Ｖｅｌｃａｄｅ（商標））と同じレベルの腫瘍増殖の減少を達成した（図９を参照にされたい）。さらに実施例２の化合物は、ＰＳ−３４１よりもよく忍容（ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）された。しかし統計的分析では、ＰＳ−３４１も実施例２の処置も統計的
に有意な腫瘍増殖阻害を達成しないことが明らかとなった（Ｐ＞０．０５）。
【０１４６】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の阻害またはｐ６５（ＲｅｌＡ）のダウンレギュレーションは、癌細胞株に対する照射（ＩＲ）−誘導型の細胞傷害性を増強することができる。この実験では、新規な低分子ｐ６５（ＲｅｌＡ）阻害剤が、野生型のマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）またはＰＡＲＰ−１−／−またはｐ６５−／−ＭＥＦｓで放射線増感剤として評価された。クローン原性生存率アッセイ（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｓｓａｙ）において、ｐ６５−／− ＭＥＦｓはｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓよりもＩＲに対して２倍以上感度が高いことが見いだされ、これはＮＦ−κＢの活性化が放射線耐性を付与することを示す。実施例２の化合物（１．４μＭ、非細胞傷害用量）とのインキュベーションで、ｐ６５＋／＋ＭＥＦｓを放射線増感した（ＩＲ単独での２．３Ｇｙに比べて、ＩＲ＋実施例２の化合物で１．５ＧｙのＬＤ５０値）。実施例２の化合物はｐ６５−／− ＭＥＦｓの放射線増感に更なる効果はなく、これは実施例２の化合物の薬理学的効果がｐ６５を介して媒介されることを示す。同様の放射線増感効果は、ｐ６５−／− ＭＥＦｓではなくｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓでｐ６５の発現レベルをダウンレギュレートする（＞９５％まで）ＲＮＡ干渉技術により観察された。次いで実施例２の化合物を、ＰＡＲＰ−１＋／＋またはＰＡＲＰ−１−／− ＭＥＦｓで試験した。実施例２の化合物（１．４μＭ）処理またはｐ６５のｓｉＲＮＡダウンレギュレーションのいずれかがＰＡＲＰ−１＋／＋の放射線感受性を上げたが、ＩＲに対してＰＡＲＰ−１−／− ＭＥＦｓは上げず、ＰＡＲＰ−１はＮＦ−κＢ経路の活性化の上流にあることを示唆している。ＭＥＦｓでは実施例２の化合物またはｐ６５ｓｉＲＮＡによるＮＦ−κＢの阻害も確認された。ＮＦ−κＢ−依存的ルシフェラーゼ発現は、ｐ６５＋／＋
ＭＥＦｓで１０ＧｙのＩＲ後に２．５−倍まで増加した。実施例２の化合物またはｐ６５ ｓｉＲＮＡの処理で、ルシフェラーゼ遺伝子の転写は有意に減少した。同様に、ＩＲはｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓの核抽出物ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を２倍まで増加し、これはこれらの細胞中で実施例２の化合物のインキュベーションまたはｐ６５ ｓｉＲＮＡ処理のいずれかで有意に減少した。このｐ６５阻害剤は、以前にＰＡＲＰ−１阻害剤が可能であることが示されたようにインビトロでの放射線活性を増強できることを証明した。放射線増感剤として実施例２の化合物の潜在的有用性を完全に調査するためは、さらにインビボの実験が必要である。
【０１４７】
実験の別の目的は、酵素および放射性リガンド結合アッセイで、実施例２の化合物の活性を評価することであった。この実験で採用した方法は、信頼性および再現性を最大にするために科学文献から適合させた。参照標準は、得られた結果の有効性を確実にするために、各アッセイに絶対不可欠として行った。提示する場合、ＩＣ５０値はＭａｔｈＩＱｅａ（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．，英国）を使用して、非線形最小二乗法回帰分析（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ，ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により決定した。阻害定数（Ｋ３／４）が提示される場合、Ｋ３／４値は試験化合物の観察されたＩＣ５０、このアッセイに使用した放射性リガンド濃度、およびリガンドのＫ１に関する歴史的値（実験的に得られた値）を使用して、Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｐｒｕｓｏｆｆ（非特許文献５６）の式を使用して算出した。提示される場合、競合的結合曲線の傾斜を定めるＨｉｌｌ係数（ｎ１／２）はＭａｔｈＩＱｅａを使用して算出した。１．０からかなり異なるＨｉｌｌ係数は、結合置換が単一結合部位で質量作用の法則には従わないことを示唆する可能性がある。ＩＣ５０、Ｋ３／４および／またはｎ１／２データが平均の標準誤差（ＳＥＭ）無しに提示される場合、データは定量的になるためには不十分である。必要に応じて、個々の応答がこの報告に対して補遺に提示される。結果は、５０％より高い阻害は無かったので、予想されるＩＣ５０および／またはＫ３／４値無しで図１１に示す。
【０１４８】
ＲＮＡ干渉スクリーニングでは、ＮＦ−κＢの正規および非正規経路でｐ５３およびｒ
ａｓ突然変異が合成致死性になると確認された（非特許文献５７：非特許文献５８）。ＮＦ−κＢ部位に対してＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢおよびｃ−ｒｅｌの結合と拮抗する阻害剤を合成し、そしてこのように正規および非正規経路の両方を阻害する。１つのそのような例示化合物である実施例２の化合物は、野生型およびｐ６５−／−マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）で放射線増感剤として評価され、そしてｐ５３欠失およびＫＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ）変異体乳癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で放射線増感剤および化学療法剤として評価された。クローン原性生存率アッセイで、照射（ＩＲ）に対してｐ６５−／−
ＭＥＦｓはｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓよりも２倍以上感受性が高いことが分かり、これはＮＦ−κＢの活性化が放射線耐性を付与することを示す。実施例２の化合物（１．４μＭ、非細胞傷害濃度）とのインキュベーションで、ｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓは放射線増感された（ＩＲ単独での２．３Ｇｙに比べて、ＩＲ＋実施例２の化合物で１．５ＧｙのＬＤ５０値）。実施例２の化合物はｐ６５−／− ＭＥＦｓの放射線増感には効果はなく、これは実施例２の化合物の放射線増感効果がｐ６５を介して媒介されることを示した。同様の放射線増感効果は、ＲＮＡ干渉技術を使用することにより、ｐ６５−／− ＭＥＦｓではなくｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓでｐ６５の発現レベルを９５％より高くダウンレギュレートすることが観察された。ＭＥＦｓで実施例２の化合物またはｐ６５ｓｉＲＮＡによるＮＦ−κＢの阻害も確認された。ＮＦ−κＢ−依存的ルシフェラーゼ発現は、ｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓで１０ ＧｙのＩＲ後に２．５−倍まで増加した。実施例２の化合物またはｐ６５ ｓｉＲＮＡの処理で、ルシフェラーゼ発現は有意に減少した。同様に、ＩＲはｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓの核抽出物ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を２倍まで増加し、この増加はこれらの細胞中で実施例２の化合物のインキュベーションまたはｐ６５ ｓｉＲＮＡ処理のいずれかで有意に減少した。
【０１４９】
実施例２の化合物は、恒常的にＮＦ−κＢが活性化されているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞でも実験した。最初に実施例２の化合物を単剤として乳癌細胞の増殖について試験した。実施例２の化合物に対する重要な細胞傷害性効果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して０．４μＭのＬＤ５０値で観察された。次いで実施例２の化合物の相乗的効果が、これら細胞で照射を用いて試験された。０．２μＭの実施例２の化合物とのインキュベーションで、１．５倍まで照射効果を有意に強化することが観察された（ＩＲのみについての２．５５Ｇｙと比較して、ＩＲ＋実施例２の化合物については１．６６Ｇｙ ＩＲのＬＤ５０値）。これらの記載された実験は、ＮＦ−κＢのＲｅｌ阻害剤が正規経路の遮断を介して放射能を強化できることを示す。またこれは、ｐ５３およびＫＲＡＳ突然変異を持つ腫瘍細胞を、恐らく正規および非正規経路の両方の遮断を介して選択的に殺すことができる。
【０１５０】
最近の関節リウマチの全ゲノムに関する実験で、この疾患の新たに同定されたリスク因子としてｃ−ＲｅｌをコードするＲＥＬ座が同定された（非特許文献５９）。ｃ−ＲｅｌはＮＦ−κＢの正規および非正規経路の両方を媒介するＮＦ−κＢファミリーの転写因子の一員である。ｃ−Ｒｅｌが欠失した遺伝子を持つマウスは、コラーゲンが誘導する関節炎に耐性である。ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＡおよびＲｅｌＢのＮＦ−κＢ部位への結合を遮断する低分子量阻害剤が合成された。実施例２の化合物の抗炎症活性、コラーゲン誘導型関節炎のマウスモデルで、ＮＦ−κＢの正規および非正規経路の両方の二重阻害剤。ＴＮＦαブロッカーであるエタネルセプトを用いた実施例２の化合物の効果を、関節リウマチモデルで比較した。オスＤＢＡマウスの尾にウシＣＩＩ型コラーゲンを１日および２１日に注射することにより関節炎を発症させた。動物群（ｎ＝１０）を、１）偽操作、２）賦形剤（ＤＭＳＯ），、３）エタネルセプト（５０μｇ／マウス、ｉ．ｐ．２１日〜３５日毎日）、４）実施例２の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．２１日〜３５日毎日）、５）実施例２の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．２１日〜３５日毎日）、６）実施例２の化合物（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．２１日〜３５日毎日）で処置した。関節炎指数スコアにより評価した時、実施例２の化合物の処置は、マウス後足の紅斑および浮腫を有意に減少し
、これはエタネルセプトの処置に匹敵した（図１０）。エタネルセプトおよび実施例２の化合物の両方とも足の浮腫を減少させた（Ｐ＜０．０１対賦形剤群）。体重の減少における有意差は、実験したすべてのマウスで観察されなかった。３５日目の関節の組織学的評価で、実施例２の化合物またはエタネルセプトを用いて処置したマウスの炎症に有意な減少が明らかとなった。ミエロペルオキシダーゼ活性の測定は、同時に実施例２の化合物またはエタネルセプト処置による顆粒球リソゾーム特異的酵素の減少を示した。結論として我々は、ＮＦ−κＢのＲｅｌ阻害剤がマウスの炎症性関節炎の発症を防ぐことができるということを証明した。マウスの関節リウマチモデルにおいて、実施例２の化合物の抗炎症活性は、エタネルセプトの活性に匹敵した。実施例２の化合物の効力は、マウスに良く忍容される用量で達成された。
【０１５１】
本発明のＮＦ−κＢ阻害剤は、大腸炎の動物モデルで抗炎症剤として、充実性腫瘍の放射線処置の放射線増感剤として、単独または種々の認可された癌薬剤と組み合わせた化学療法剤として試験されているところである。正規および非正規経路の二重阻害剤、および正規経路の単独阻害剤の両方が特性決定されているところである。
【０１５２】
さらに記載することなく、当業者はこれまでの記載および具体的実施例を使用して、本発明の化合物を作成および使用し、そして特許請求する方法を実施することができる。本発明は様々な具体的材料、手法および実施例を参照にして本明細書に記載され、そして具体的に説明されたが、本発明はその目的のために選択された材料および手法の特定の組み合わせに限定されないことを理解されたい。当業者には想定されるようなそのような詳細の多くの変更を包含することができる。本出願全体を通して引用するすべての特許、特許出願および他の文献は、それら全部を参照により本明細書に編入する。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害の処置のための式（１）および（２）
【０００２】
【化１】
【０００３】
の化合物、およびその製薬学的に許容され得る塩に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ＮＦ−κＢ（活性化Ｂ細胞の核内因子κ−軽鎖エンハンサー）は、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＢ、ｐ５０（ＮＦ−κＢ１）およびｐ５２（ＮＦ−κＢ２）のヘテロ−またはホモ−二量体からなる転写因子のファミリーである（非特許文献１）。ＮＦ−κＢの古典的な、すなわち正規経路（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｐａｔｈｗａｙ）では、種々の細胞膜レセプターの刺激がＩκＢ（インヒビタータンパク質）のリン酸化、ユビキチン化およびプロテアソーム分解を導き、これが転写を開始するｐ６５／５０ヘテロ二量体の核内移行をもたらす。この正規経路はＩκＢβキナーゼ、２６Ｓプロテアソームまたはｐ６５のＤＮＡへの結合により効果的に遮断することができる。別の、すなわち非正規経路は、阻害的なアンキリン含有タンパク質ＮＦ−κＢ２／ｐ１００のタンパク質分解を介して調節されてｐ５２を放出し、これが典型的にはＲｅｌＢと二量体化する。さらにｐ５２／ｃ−Ｒｅｌおよびｐ５２／ｐ６５を活性化する「ハイブリッド」経路が存在する。非正規または「ハイブリッド」経路は、ＩκＢβキナーゼまたはプロテアソーム阻害剤に感受性ではない。これらの経路は、ＲｅｌＢまたはｃ−ＲｅｌのＤＮＡへの結合と拮抗することにより最も効果的に阻害される。正規および非正規経路は、特有の遺伝子群の活性化を介して特異的な疾患の様々な局面と関連している。すなわち異なる疾患状況の下で正規または非正規経路のいずれか、または双方の選択的阻害は、元にある疾患状態を改善するために最も効果的な取り組みになると考えられる。
【０００５】
ＮＦ−κＢ活性化は、癌、ＡＩＤＳ、糖尿病、心血管疾患、自己免疫疾患、ウイルス複製、敗血症性ショック、神経変性障害、毛細管拡張性運動失調（ＡＴ）、関節炎、喘息、炎症性腸疾患、および他の炎症状態、アテローム硬化症、心臓疾患、喘息、異化障害、１および２型糖尿病、老化、皮膚疾患、腎疾患、消化管疾患、膵炎、神経病理学的疾患、肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、敗血症および無呼吸を含む広い様々な疾患と結び付けられた。ＮＦ−κＢの活性化は多くのヒト疾患に影響している。
【０００６】
例えばグラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）によるＮＦ−κＢの活性化は、ＮＦ−κＢ
が多くのサイトカインおよび修飾酵素の転写を過剰に活性化し、これらの長期発現が心臓および肝臓のような生命維持に必須な臓器の機能に負の影響を及ぼす恐れがあるため、敗血症ショックの発症に寄与する可能性がある（非特許文献２；非特許文献３）。
【０００７】
さらに慢性のアルツハイマー病では、アミロイドβペプチドが反応性の酸素中間体の生産を生じ、そしてＮＦ−κＢ部位を介する遺伝子発現を間接的に活性化する（非特許文献４）。
【０００８】
骨の破壊的糜爛または骨溶解は、関節リウマチ（ＲＡ）、歯周病および人工関節周囲の骨溶解のような炎症状態の主な合併症である。ＲＡは約１．０％の米国の成人に影響を及ぼしている自己免疫疾患であり、その女性対男性の比は２．５対１である（非特許文献５）。その顕著な特徴は主な病状を引き起こす進行性の関節破壊である。歯周病は高い有病率であり、そして世界人口の９０％までもが罹患している可能性がある。これは成人が歯を失う主原因であることはよく知られている（非特許文献６）。その有病率にもかかわらず、歯周の骨の侵食が起こるメカニズムはほとんど知られていないが、口中に存在する病原性微生物に対する宿主の反応がこのプロセスを誘発するようである。人工関節周囲の骨溶解は、固定が無くなるまで、外因性インプラントデバイスの回りの慢性の骨吸収により生じ、これは磨耗粉粒子に対する先天性の免疫応答の結果と考えられ（非特許文献７）、後天性免疫系の成分によることはほとんどない（非特許文献８）。
【０００９】
これらの状態は明確な原因により開始され、そして択一的経路により進行するが、このような疾患の病理学的プロセスにおける重要な共通因子（１もしくは複数）は、炎症した組織のＮＦ−κＢ経路の恒常的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）活性化により駆動される炎症性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカインの過剰生産である。これらの状態で見られる骨の糜爛は、骨粗鬆症のようなホルモンにより調節される全身性の骨の病気とは異なり、ほとんど炎症した組織に局在している。このような疾患に多く見られるこれらの炎症した組織も、炎症誘発性サイトカイン、すなわちＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−６を生産し、これらは次に破骨細胞分化のシグナル伝達および骨再吸収活性に関与する。このように炎症性の骨溶解は、炎症している組織中で強化された破骨細胞の漸増およびＮＦ−κＢが駆動する炎症誘発性サイトカインにより刺激された活性化の産物である。
【００１０】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、胃腸管が関与する多くの慢性的な再発性炎症障害を包含する。ＩＢＤの２つの最も多い病状であるクローン病および潰瘍性大腸炎は、独特な組織病理学的および免疫応答により識別することができる（非特許文献９；非特許文献１０）。現行の処置の限られた効力および潜在的な副作用により、患者および医師はこれらの疾患の慢性的に再発する炎症的性質を管理するための新しい処置を切望している。
【００１１】
クローン病および潰瘍性大腸炎になる厳密な原因は未知のままであるが、それらは一般に正常な管腔の微生物叢に対する粘膜免疫系の不適切な持続的活性化の結果と考えられている（非特許文献１１）。その結果、存在するマクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞は活性化され、そして主にＮＦ−κＢ依存的ケモカインおよびサイトカインを分泌し始める。重要な炎症誘発性メディエーターのＮＦ−κＢ媒介型過剰生産は、ヒトＩＢＤおよび大腸炎の動物モデルの双方の開始および進行に寄与する（非特許文献１２；非特許文献１３）。特にＩＢＤ患者のマクロファージは、インターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ６および腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）の生産増大を伴う高レベルのＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を現す（非特許文献１２）。さらにＮＦ−κＢはＴヘルパー細胞１（Ｔｈ１）およびＴヘルパー細胞２（Ｔｈ２）サイトカインの活性化に極めて重大な役割を果たし、これら双方が炎症を促進し、かつ維持するために必要である（非特許文献１４）。ＩＢＤでＮＦ−κＢが果たす中心的役割から、この経路を標的とする処置を開発するために徹底的な努力がなされた。
【００１２】
ＮＦ−κＢは、胸部、卵巣、結腸、膵臓、甲状腺、前立腺、肺、頭および首、膀胱および皮膚の腫瘍に由来する多くの癌由来細胞株で恒常的に発現することが示された（非特許文献１５）。これはまたＢ細胞リンパ腫、ホジキン病、Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病、急性リンパ芽球性白血病、多発性ミエローマ、慢性リンパ性白血病、および急性骨髄性白血病についても見られた。ＮＦ−κＢは防御応答の一部として正常な炎症の鍵となるメディエーターであるが、慢性炎症は癌、糖尿病および上に挙げた他の疾患の宿主を導く可能性がある。発癌プロセス、血管形成、侵襲、および腫瘍細胞の転移に重要な役割を媒介する数種の炎症誘発性遺伝子産物が同定された。中でもこれら遺伝子産物は、ＴＮＦおよびそのスーパーファミリーのメンバー、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、ケモカイン、ＭＭＰ−９、ＶＥＧＦ、ＣＯＸ−２および５−ＬＯＸである。これらすべての遺伝子の発現は、転写因子ＮＦ−κＢにより主に調節されており、これはほとんどの腫瘍中で恒常的に活性であり、そして発癌物質（例えば喫煙）、腫瘍プロモーター、発癌性ウイルスタンパク質（ＨＩＶ−ｔａｔ、ＫＨＳＶ、ＥＢＶ−ＬＭＰ１、ＨＴＬＶ１−ｔａｘ、ＨＰＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶ）、化学療法剤、およびガンマ線照射により誘導される（非特許文献１６）。これらの考察はＮＦ−κＢを抑制する抗炎症剤が癌の防止および処置の両方に潜在能力を有するはずであることを意味している。
【００１３】
インフルエンザウイルスタンパク質のヘモアグルチニンもＮＦ−κＢを活性化し、そしてこの活性化がサイトカインのウイルス誘導およびインフルエンザに関連する症状の幾つかに寄与する可能性がある（非特許文献１７；非特許文献１８）。
【００１４】
アテローム硬化症に関連する低密度リポタンパク質からの酸化脂質がＮＦ−κＢを活性化し、これは次いで炎症性サイトカインのような他の遺伝子を活性化する（非特許文献１９）。さらにアテローム硬化症に罹り易いマウスは、アテローム発生の食事を与えた場合に、脂質の過酸化産物の蓄積、炎症遺伝子の誘導およびＮＦ−κＢ転写因子の活性化に関連する大動脈のアテローム硬化性損傷の形成に対する罹病性により、ＮＦ−κＢの活性化を現す（非特許文献１９）。アテローム硬化性に対する別の重要な要因は、ＮＦ−κＢの活性化を介して血管平滑筋細胞の増殖を刺激するトロンビンである（非特許文献２０）。ＩκＢリプレッサータンパク質（ＩκＢα）の短縮形は、イオン化照射に対する過敏性の原因となることが示され、そして恒常的レベルのＮＦ−κＢ活性化を有する毛細管拡張性運動失調（ＡＴ）細胞においてＤＮＡ合成の調節が欠損している（非特許文献２１）。このＡＴ細胞に由来するＩκＢαの突然変異は、ＮＦ−κＢ経路の恒常的活性化を生じるリプレッサータンパク質を不活性化することが示された。これらすべての知見を鑑みて、ＮＦ−κＢの異常な活性化または発現は明らかに広範な様々な病状と関連している。
【００１５】
ＨＩＶ−１の感染およびライフサイクルは、ヒト単核細胞中でＮＦ−κＢ経路と強くつながっている。ウイルス感染は、Ｔ細胞の過剰刺激および最終的消耗（これはＡＩＤＳの特徴である）を生じるＮＦ−κＢの活性化を導く（非特許文献２２を参照されたい）。例えばＨＩＶ−１の重要な受容体であるＣＣＲ５の発現は、ＮＦ−κＢにより調節される（非特許文献２３）。ＣＣＲ５プロモーターの欠失分析では、３’−遠位ＮＦ−κＢ／ＡＰ−１部位の喪失が転写を＞９５％まで下げることを示した（非特許文献２３）。これらの研究は、ＮＦ−κＢの恒常的リプレッションがＣＣＲ５−受容体のメッセージに劇的な低下を引き起こすことを示唆している。ＨＩＶ−１の侵入動力学（ｅｎｔｒｙ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）は、標的Ｔ細胞表面上で発現したＣＣＲ５レベルにより影響を受けるので（非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６）、ＣＣＲ５のダウンモジュレーティング（ｄｏｗｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）は、ウイルスリザーバを生む感染細胞のプールの拡大を妨げる（ｃｏｎｓｔｒａｉｎ）ことができる。ＣＸＣＲ４発現もＮＦ−κＢにより影響を受けると報告され（非特許文献２７）、ＮＦ−κＢ阻害剤が後期感染中に現れるＸ４−向性の単離物に対して等しく効果的であることを示唆している。ＮＦ−κＢは組み込ま
れたＤＮＡ−プロ−ウイルスの転写に必要である（非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１；非特許文献３２；非特許文献３３；非特許文献３４）。実際に、ＮＦ−κＢ活性化の欠損で、感染した患者からウイルスを排除するための主要な障害である潜伏性ウイルスを宿す細胞群の生成が導かれる（非特許文献３５）。
【００１６】
ＮＦ−κＢは炎症刺激に応答して１５０以上の標的遺伝子の発現を促進する。これらの遺伝子にはインターロイキン−１、−２、−６および腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）（これらの受容体はアポトーシスを媒介し、そして炎症の調節物質として機能する）、ならびにイムノレセプター、細胞接着分子、およびシクロオキシゲナーゼ−ＩＩおよび誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）のような酵素をコードする遺伝子がある（非特許文献３６：非特許文献３７）。またＮＦ−κＢはＨＣＶおよびＨＩＶ−１のようなウイルス感染に関連する疾患の進行に重要な役割を果たす。
【００１７】
ＮＦ−κＢのファミリーのメンバーには、ＲｅｌＡ／ｐ６５、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５０／ｐ１０５（ＮＦ−κＢ１）、およびｐ５２／ｐ１００（ＮＦ−κＢ２）を含む（非特許文献３８：非特許文献３９：非特許文献４０）。Ｒｅｌファミリーのメンバーは、ＮＦ−κＢに調節される遺伝子のプロモータードメイン内に位置するシス−結合要素に明確な特異性を持つホモダイマーもしくはヘテロダイマーのいずれかとして機能する（非特許文献４１：非特許文献４２：非特許文献４３）。ＲｅｌＡ／ｐ６５およびｐ５０ヘテロダイマーからなる古典的なＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢの最もよく研究された形態である（非特許文献４４：非特許文献３８およびその中の文献）。細胞刺激の前に、古典的なＮＦ−κＢはＩκＢα阻害剤タンパク質に結合した不活性複合体として細胞質に存在する。細菌のリポ多糖、炎症性サイトカイン、またはＨＩＶ−１ Ｖｐｒタンパク質のようなＮＦ−κＢインデューサーは、ＩκＢ−キナーゼ複合体（ＩＫＫ）（これはＩκＢαをリン酸化する）を活性化することにより活性なＮＦ−κＢを細胞質の複合体から放出する（非特許文献４５：非特許文献４６：非特許文献４７：非特許文献４８：非特許文献４９）。ＩκＢのリン酸化は引き続きそれをユビキチン化し、そして２６Ｓプロテオソームにより分解するしるしをつける。遊離のＮＦ−κＢ二量体は核に移行し、ここでそれらはそれらの標的遺伝子の転写を刺激する。
【００１８】
ラセミ型のデヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）の分子設計は、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）から単離された抗生物質であるエポキシキノマイシンＣに基づいた（非特許文献５０）。ＤＨＭＥＱはラセミ体として２，５−ジメトキシアニリンから５段階で合成された。キラルカラムでのエナンチオマーの分割で、（＋）および（−）の両エナンチオマーが生じた。（−）エナンチオマーは、ＮＦ−κＢの阻害に（＋）エナンチオマーよりも有力であることが示された（非特許文献５１）。ＤＨＭＥＱはＮＦ−κＢの核への移行を特異的に阻害することが示された（非特許文献５２）。具体的にＤＨＭＥＱはｐ６５および他のＲｅｌ相同的タンパク質の特異的システイン残基を１：１の化学的量論比で共有的に修飾する（非特許文献５３）。ＮＦ−κＢ阻害剤として、ＤＨＭＥＱは様々な動物の疾患モデルで徹底的に研究され、そして広い範囲の効力が証明され、それらには充実性腫瘍、血液悪性疾患、関節炎、腸虚血およびアテローム硬化症の処置を含む（非特許文献５４）。このようにＤＨＭＥＱは癌および炎症の処置に有用となり得る（非特許文献５５）。
【００１９】
【化２】
【００２０】
ＮＦ−κＢの活性化が上記のような多くの悪性疾患に果たす役割の観点から、有効な低分子ＮＦ−κＢ阻害剤の必要性が依然として存在している。
【００２１】
ＮＦ−κＢ成分、ｐ６５（ＲｅｌＡ）、ＲｅｌＢおよびｃ−ＲｅｌのＤＮＡへの結合を直接阻害する幾つかの系列の低分子阻害剤が見いだされた。その結果、これらの化合物がＮＦ−κＢの正規および非正規経路の両方を遮断できる。二重阻害は、正規経路のみに影響するＩκＢβキナーゼ阻害剤とは異なる。この化合物の効力は、多発性硬化症および関節リウマチの動物モデルで試験され、そして結果を本明細書に記載する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２２】
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【発明の概要】
【００２３】
発明の要約
本発明の一観点は、 式（１）または式（２）
【００２４】
【化３】
【００２５】
の構造を有する化合物またはその製薬学的に許容され得る塩に関し、式中、ＨＥＴは飽和もしくは不飽和の単−もしくは多−環の炭素環であり、ここで１もしくは複数の環の炭素原子がＮ、Ｓ、ＰもしくはＯで置き換えられ；
各Ｒ１は独立して水素；ＣＦ３；場合によりシアノ、ハロ、ニトロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、ＣＯＲ３、ＮＲ４Ｒ５またはＮＨＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）で置換されてもよいフェニル；シアノ；ハロ；ニトロ；ヒドロキシル；（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ＯＨ；（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ；（Ｃ１−Ｃ６）チオアルコキシ；フェノキシ；ＣＯＲ３；ＮＲ４Ｒ５；ＮＨＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ２はＨ、Ｒ６、ＣＯＲ６、ＣＯＮＨＲ６、ＣＯＯＲ６、ＣＨ２ＯＣＯＲ６、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、あるいはＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）またはＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）の無機塩、またはグリコシル（ヘミアセタール形の炭水化物のヒドロキシル基の除去から生じる基）であり、
ここでＲ６はＣ１−Ｃ６アルキル、トリフルオロメチル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、シクロヘキシルメチルまたはフェニルであり、ここでフェニルはフッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル，（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシおよびフェニルメチルから選択される０〜４個の基で置換され、ここでフェニルメチルはフェニル環で、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル，（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、２−、３−もしくは４−ピリジニルおよび２−、４−もしくは５−ピリミジニルから選択される０〜４個の基で置換される。
【００２６】
Ｒ３は独立してヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、フェノキシまたは−ＮＲ４Ｒ５である。
【００２７】
各Ｒ４およびＲ５は独立して水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルである。
【００２８】
ｎ＝０−３。
【００２９】
ＨＥＴについてはＯＲ２基とアミド部分との間にオルトの関係が存在する（すなわちＯＲ２およびＣ（＝Ｏ）ＮＨ官能基はＨＥＴ環上の隣接原子に結合している）。
【００３０】
また本発明の一観点は、式（１）または式（２）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩、および製薬学的に許容され得る担体を含んでなる製薬学的組成物に関する。
【００３１】
また本発明の一観点は、さらに癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害を処置する方法に関し、この方法はそのような処置が必要なヒトのような哺乳動物に治療に有効な量の式（１）または式（２）の化合物、またはそれらの製薬学的に許容され得る塩を投与することを含んでなる。
【００３２】
さらに本発明の一観点は、ヒトのような哺乳動物のＮＦ−κＢ経路を介して直接的または間接的に遺伝子発現およびシグナル伝達を阻害する方法に関し、この方法はそのような処置が必要な哺乳動物に治療に有効な量の式（１）または式（２）の化合物、またはそれらの製薬学的に許容され得る塩を投与することを含んでなる。
【００３３】
詳細な説明
定義
本発明を記載するために使用する用語は、本明細書中で以下の意味を有する。本発明の化合物および中間体は、ＩＵＰＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｆｏｒ
Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）またはＣＡＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ）のいずれかの命名法に従い名付けることができる。
【００３４】
本明細書中、種々の炭化水素含有部分の炭素原子含量は、その部分の炭素原子の最少および最大数を示す接頭辞により示すことができ、例えば接頭辞（Ｃａ−Ｃｂ）アルキルは、整数“ａ”から“ｂ”までの炭素原子を含むアルキル部分を指す。すなわち例えば（Ｃ１−Ｃ６）アルキルは１〜６個の炭素原子を含むアルキル基を指す。用語「アルキル」は、水素原子置換基のみを含む炭素原子の直鎖もしくは分枝鎖を現し、ここで炭素鎖は場合により１もしくは複数の二重もしくは三重結合、または二重結合および三重結合の組み合わせを含んでもよい。アルキル基の例には限定するわけではいが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、プロペニル、プロピニル、ヘキサジエニル等がある。
【００３５】
用語「アルコキシ」は、直鎖もしくは分枝鎖の一価の飽和脂肪族鎖炭素原子鎖であり、ここで炭素原子の１つが酸素原子に置き換えられている。アルコキシ基の例には、限定するわけではいがメトキシ、エトキシおよびイソプロポキシがある。
【００３６】
用語「シクロアルキル」は、飽和および場合により不飽和の単環式もしくは二環式配列の脂肪族鎖を指す。シクロアルキル基の例には、限定するわけではいが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキセニルである。シクロアルキル基は、場合によりベンゼンのような芳香族炭化水素と縮合してインダニル等の縮合シクロアルキル基を形成することができる。
【００３７】
用語「ハロ」は、クロロ、ブロモ、フルオロまたはヨードを指す。
【００３８】
用語「置換された」とは、分子上の水素原子と異なる原子もしくは分子との交換を指す。水素原子と置き換わる原子もしくは分子を「置換基」と言う。
【００３９】
用語「ＨＥＴ」は、飽和もしくは不飽和の単もしくは多環の炭素環を指し、ここで１もしくは複数の環の炭素原子がＮ，Ｓ，ＰまたはＯで置き換えられる。用語「ＨＥＴ」は完全な飽和および不飽和環系、ならびに部分的に不飽和の環系を包含し、それらには複素環のすべての可能な異性体形を含むことを意図する（例えば、ピロリルには１Ｈ−ピロリル
および２Ｈ−ピロリルを含む）。ＨＥＴが単環式（例えば４−、５−もしくは６−員環）または二環式（例えば５／６、５／５、６／６系）の飽和複素環である例には、限定するわけではいが、テトラヒドロフラニル、ピロリジニル、テトラヒドロチエニル、ジヒドロオキサゾリル、ピペリジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、ジオキサニル、モルホリニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ピペラジニル等がある。ＨＥＴが単環式、二環式もしくは三環式の部分飽和複素環である例には、限定するわけではいが、ピロリニル、イミダゾリニル、ピラゾリニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、１，３−ベンゾジオキソラニル、２，３ジヒドロ−ｌ，４−ベンゾジオキシニル、インドリニル等がある。ＨＥＴが単環式、二環式もしくは三環式の芳香族複素環の例には、限定するわけではいが、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピラゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，５−チアジアゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，５−オキサジアゾリル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、イソベンゾフラニル、ベンゾチエニル、イソベンゾチエニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾピラゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、キノリジニル、フタラジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、ピロロピリジニル、チエノピリジニル、フラノピリジニル、イソチアゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イソキサゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、ピラゾロピリジニル、イミダゾピリジニル、ピロロピラジニル、チエノピラジニル、フラノピラジニル、イソチアゾロピラジニル、チアゾロピラジニル、イソキサゾロピラジニル、オキサゾロピラジニル、ピラゾロピラジニル、イミダゾピラジニル、ピロロピリミジニル、チエノピリミジニル、フラノピリミジニル、イソチアゾピリミジニル、チアゾロピリミジニル、イソキサゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、イミダゾピリミジニル、ピロロピリダジニル、チエノピリダジニル、フラノピリダジニル、イソチアゾロピリダジニル、チアゾロピリダジニル、イソキサゾロピリダジニル、オキサゾロピリダジニル、ピラゾロピリダジニル、イミダゾピリダジニル、オキサジアゾロピリジニル、チアジアゾロピリジニル、トリアゾロピリジニル、オキサジアゾロピラジニル、チアジアゾロピラジニル、トリアゾロピラジニル、オキサジアゾロピリミジニル、チアジアゾロピリミジニル、トリアゾロピリミジニル、オキサジアゾロピリダジニル、チアジアゾロピリダジニル、トリアゾロピリダジニル、イソキサゾロトリアジニル、イソチアゾロトリアジニル、ピラゾロトリアジニル、オキサゾロトリアジニル、チアゾロトリアジニル、イミダゾトリアジニル、オキサジアゾロトリアジニル、チアジアゾロトリアジニル、トリアゾロトリアジニル、カルバゾリル等がある。
【００４０】
「治療に有効な量」という句は、（ｉ）特定の疾患、状態または障害を処置または防止する、（ｉｉ）特定の疾患、状態または障害の１もしくは複数の症状を弱め、改善し、または排除する、あるいは（ｉｉｉ）特定の疾患、状態の１もしくは複数の症状の発生を防止または遅らせる化合物の量を指す。
【００４１】
「製薬学的に許容され得る」とは、示した担体、賦形剤、希釈剤、補形剤（１もしくは複数）および／または塩が一般に化学的かつ／または物理的に製剤を構成する他の成分と適合性があり、しかもその受容体と生理学的に適合性があることを示す。
【００４２】
用語「哺乳動物」は、分類学上哺乳動物のクラスのメンバーである個々の動物に関する。哺乳動物の例には、限定するわけではいが、ヒト、イヌ、ネコ、ウマおよび畜牛を含む。本発明では、好適な哺乳動物はヒトである。
【００４３】
ラセミ化合物の２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシ
クロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）キノリン−３−カルボキサミドは本明細書で実施例２に記載され、そして本明細書を通して実施例２の化合物と呼ぶ。
【００４４】
例示の態様では、本発明の化合物は式（３）に示す構造および立体化学を有する。
【００４５】
【化４】
【００４６】
この化合物は、当業者に周知の方法によりそれらのエナンチオマーに分割することができる。例には例えば結晶化により分離できるジアステレオマー塩の形成；例えば結晶化、ガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーにより分離できるジアステレオマー誘導体もしくは錯体の形成；エナンチオマー特異的試薬、例えば酵素的エステル化を用いた１つのエナンチオマーの選択的反応；またはキラルな環境での例えばキラルな支持体上で、例えば結合したキラルなリガンドを含むシリカ、あるいはキラルな溶媒の存在下でのガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーを含む。所望の立体異性体が上記の例示的分離手順の１つにより別の化学的物体に転換される場合、所望のエナンチオマー形を遊離するためにはさらなる工程が必要であると考えられる。あるいは特異的な立体異性体は、光学的に活性な出発材料を使用することにより、光学的に活性な試薬、基質、触媒または溶媒を使用した不斉合成により、あるいは１方の立体異性体をもう一方の立体異性体に不斉変換により転換することにより、合成することができる。
【００４７】
化合物が１もしくは複数のさらなるステレオジェン中心を含む場合、当業者は本明細書で具体的に説明し、そして検討する化合物のすべてのジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物が本発明の範囲に入ると理解するだろう。これらのジアステレオマーは当業者に周知な方法、例えば結晶化、ガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーにより単離することができる。あるいは合成過程の中間体はラセミ混合物として存在することができ、そして当業者に周知な方法による分離、例えば結晶化により分離できるジアステレオマー塩の形成；例えば結晶化、ガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーにより分離できるジアステレオマー誘導体もしくは錯体の形成；エナンチオマー特異的試薬、例えば酵素的エステル化を用いた１つのエナンチオマーの選択的反応；またはキラルな環境での例えばキラルな支持体上で、例えば結合したキラルなリガンドを含むシリカまたはキラルな溶媒の存在下でのガス−液体もしくは液体クロマトグラフィーにかけられる。所望の立体異性体が上記の例示的分離手法の１つにより別の化学的物体に転換される場合、所望のエナンチオマー形を遊離するためにはさらなる工程が必要であると考えられる。あるいは特異的な立体異性体は、光学的に活性な出発材料を使用することにより、例えば光学的に活性な試薬、基質、触媒または溶媒を使用した不斉合成により、あるいは１方の立体異性体をもう一方の立体異性体に不斉変換により転換することにより、合成することができる。これらの方法は“Ｃｈｉｒａｌ Ｄｒｕｇｓ”，Ｃｙｎｔｈｉａ Ａ．Ｃｈａｌｌｅｎｅｒ（Ｅｄｉｔｏｒ），Ｗｉｌｅｙ，２００２または“Ｃｈｉｒａｌ Ｄｒｕｇ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ”ｂｙ Ｂｉｎｇｙｕｎｈ Ｌｉ ａｎｄ Ｄｏｎａｌｄ Ｔ．Ｈａｙｎｉａ
ｉｎ“Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”
ｂｙ Ｓｕｎｇｇｙｕ Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ Ｌｅｅ（Ｅｄｉｔｏｒｓ），ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，２００５のようなテキストにさらに詳細に記載されている。
【００４８】
本発明の化合物およびその塩は、非溶媒化形態ならびに水、エタノール等のような製薬学的に許容され得る溶媒での溶媒化形態で存在できる。
【００４９】
式（１）および式（２）の選択した化合物、およびそれらの塩および溶媒和物は、１より多くの結晶形で存在することができる。式（１）および式（２）により表される化合物の多形は本発明の一部を形成し、そして異なる条件下で式（１）および式（２）の化合物の結晶化により調製することができる。例には再結晶化のために異なる溶媒または溶媒混合物の使用；異なる温度での結晶化；および結晶化中、大変急速から大変遅い冷却の範囲の様々な冷却様式を含む。また多形は式（１）または式（２）の化合物を加熱または融解し、続いて漸次または急速冷却により得ることができる。多形の存在は、例えば固体状態のＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法、示差操作熱量測定、粉末Ｘ線回折または他の類似技術により測定することができる。
【００５０】
また本発明は、同位体で標識した化合物を含み、これは式（１）および（２）により記載される化合物と同一であるが、１もしくは複数の原子が通常、自然に見いだされる原子質量もしくは質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子により置き換えられている。本発明の化合物に取り込むことができる同位体の例には、それぞれ２Ｈ，３Ｈ，１３Ｃ，１４Ｃ，１５Ｎ，１８Ｏ，１７Ｏ，３５Ｓ，３６Ｃｌ，１２５Ｉ，１２９Ｉおよび１８Ｆのような水素、炭素、窒素、酸素、硫黄およびフッ素の同位体を含む。前記同位体および／または他の原子の他の同位体を含む本発明の化合物および化合物の製薬学的に許容され得る塩は、本発明の範囲内にある。特定の同位体で標識した本発明の化合物、例えば２Ｈ（ジューテリウム）のような同位体が取り込まれた化合物は、より高い代謝的安定性から治療上の利点、例えばインビボ半減期の上昇、または必要な投薬用量の減少を提供することができ、したがって幾つかの状況で好適となり得る。同位体で標識した本発明の式（１）および（２）の化合物、その塩および溶媒和物は一般に、同位体で標識していない試薬を容易に入手できる同位体で標識された試薬に代えて、以下のスキームおよび／または実施例に開示する手順を行うことにより調製することができる。
【００５１】
本発明の化合物と関連して本明細書で使用する製薬学的に許容され得る塩には、該化合物の製薬学的に許容され得る無機および有機塩を含む。これらの塩は、化合物の最終的単離および精製中にその場で、あるいは化合物を適切な有機もしくは無機酸と別個に反応させ、そしてそのように形成された塩を単離することにより調製できる。代表的な塩には限定するわけではないが臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、蓚酸塩、ベシル酸塩、カンシル酸塩、パルミチン酸塩、マロン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩、リンゴ酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トシル酸塩、ギ酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩およびラウリルスルホン酸塩等がある。また本発明の化合物は、有機および無機塩基から形成される製薬学的に許容され得る金属およびアミンカチオンとの塩を形成するために反応させることもできる。用語「製薬学的に許容され得る金属カチオン」とは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、鉄、亜鉛等から誘導される正に荷電した金属イオンを包含する。用語「製薬学的に許容され得るアミンカチオン」とは、そのようなカチオンを形成するために十分強力なアンモニアおよび有機窒素性塩基から誘導される正に荷電したイオンを包含する。本発明の化合物の製薬学的に許容され得る非毒性塩基付加塩に有用な塩基は、当業者によりその限界が容易に理解されるクラスを形成する（例えばＢｅｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６：１
−１９（１９７７）を参照にされたい）。
【００５２】
さらに本発明は、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグを含む。式（Ｉ）の化合物のプロドラッグは、アミノ、ヒドロキシまたはカルボキシ基のような化合物の官能基質を用いて、通例の様式で形成することができる。用語「プロドラッグ」は、インビボで変換されて式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物、またはこの化合物の製薬学的に許容され得る塩または溶媒和物を生じる化合物を指す。変換は種々のメカニズムにより、例えば血中での加水分解を介して起こり得る。プロドラッグの使用に関する検討は、Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｅｌｌａ，“Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｖｏｌ．１４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ，およびｉｎ Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，ｅｄ．Ｅｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７により提供される。例えば本発明の化合物がアルコール官能基を含む場合、プロドラッグはアルコール基中の水素原子をＣＯＲ６のような基で置き換えることにより形成されてエステルプロドラッグを提供することができ；ＣＯＮＨＲ６で置き換えてカルバメートプロドラッグを提供することができ；ＣＯＯＲ６で置き換えてカルボネートプロドラッグを提供することができ；ＣＨ２ＯＣＯＲ６で置き換えてアルキルカルボニルオキシメチルプロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ；Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）で置き換えてリン酸塩プロドラッグを提供することができ、ならびにリン酸塩およびリン酸塩プロドラッグの対応する無機塩、またはグリコシル（ヘミアセタール形の炭水化物のヒドロキシル基の除去から生じる基）を提供することができ、ここでＲ６はＣ１−Ｃ６アルキル、トリフルオロメチル、シクロプロピル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチル、フェニル、フェニル（フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、フェニルメチルで置換されている）、フェニルメチル（フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、２−，３−，もしくは−４−ピリジニル、２−，−４−，もしくは５−ピリミジニルで置換されている）を提供することができる。
【００５３】
ＮＦ−κＢ活性化の「下流」の事象の標的とすること、ｐ６５、ＲｅｌＢおよびｃ−ＲｅｌのＤＮＡエンハンサー配列への結合を防ぐこと、および転写の活性化に注目が集まった。この取り組みは正規および非正規経路の両方を種々の化合物を一緒に、または別々に用いてモジュレートすることを可能とする。加えて、「下流」のＮＦ−κＢ阻害剤は、多くの「上流」のＮＦ−κＢ阻害剤で観察される副作用を回避することができる。Ｒｅｌファミリーの新規かつ独占的（ｐｒｏｐｉｅｔａｒｙ）ＮＦ−κＢ阻害剤を同定するための薬物スクリーニングの規範が確立された。適切なリード分子を同定するために３つの平行した取り組みがなされた：（１）ｐ６５の結晶構造を使用した５，０００，０００化合物のイン−シリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）スクリーニング、（２）細胞に基づくスクリーニングを使用して、多様化された化合物ライブラリーの広い高処理量スクリーニング、および（３）ｐ６５の既存の阻害剤を改善するための修飾。既知のｐ６５アンタゴニスト、例えば天然物質のパルテノライド（ｐａｔｈｅｎｏｌｉｄｅ）および合成分子デヒドロキシメチルエポキシキノマイシン（ＤＨＭＥＱ）と比較して、本発明の化合物はｐ６５（ＲｅｌＡ）に対する効力に有意な改善を示す（図７を参照にされたい）。
【００５４】
ＤＨＭＥＱまたはパルテノライドとは異なり、本発明の化合物はＲｅｌＢ（図８参照）およびｃ−Ｒｅｌも阻害することが見いだされた（表１）。すなわち化合物は正規および非正規経路の二重阻害剤、ならびに単一阻害剤である。
【００５５】
一般に本発明の化合物は、反応スキーム１および２に概略する一般的合成法により調製され、ここでスキーム中に示される“Ｒ”は以下に示す部分であり
【００５６】
【化５】
【００５７】
そしてＨＥＴは本明細書に記載する通りである。
【００５８】
反応スキーム１に関して、化合物２〜５は公開されている文献の手順に従い調製することができる（例えばＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，７７５を参照にされたい）。２，５−ジメトキシアニリン１を、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（Ｂｏｃ２Ｏ）およびトリエチルアミンを用いてメタノールまたはテトラヒドロフラン中で０℃から室温までの範囲の温度で処理することにより、保護されたアニリン誘導体２が得られた。ビス（アセトキシヨード）ベンゼンを用いてメタノール中、０℃での酸化によりケタール３が得られた。モノエポキシ化は、３０％水性過酸化水素および水性水酸化ナトリウムもしくは炭酸カリウムのような塩基を使用して、水性テトラヒドロフラン中、０℃から室温の範囲の温度で行い４を生じた。Ｂｏｃ基の選択的除去は、４／１のジクロロメタン／トリフルオロ酢酸混合物を用いて、０℃から室温の範囲の温度で行い遊離アミン５が得られた。別法として、この脱保護は三弗化ホウ素−ジエチルエーテル錯体および活性化モレキュラーシーブを、ジクロロメタンのような溶媒中で室温で使用することにより達成することができる。次いでアミン５は酸クロライド（ＲＣｌ）と、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（ＬｉＯｔＢｕ）のような塩基を無水テトラヒドロフランのような溶媒中で−７８℃で使用してカップリングさせることによりケタール６が得られた。種々の酸クロライド（ＲＣｌ）は対応するカルボン酸からストレート（ｎｅａｔ）の塩化チオニル中で還流することにより調製された。ケタール６は、トリフルオロ酢酸のような酸性媒質中、ジクロロメタンのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で脱保護することによりジケトン７が得られた。７の位置選択的還元は、わずかに過剰な穏やかな還元剤、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）をメタノールのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で処理することにより達成された。
【００５９】
反応スキーム２において別の合成経路を表す。２，５−ジメトキシアニリン１を酸クロライド（ＲＣｌ）およびピリジンのような塩基で、無水テトラヒドロフランのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で処理して１０が得られた。ビス（アセトキシヨード）ベンゼンを用いて、メタノール中０℃で酸化してケタール１１が得られた。６を得るためのモノエポキシ化は、３０％水性過酸化水素および水性水酸化ナトリウムのような塩基を使用して０℃から室温の範囲の温度で達成された。ケタール６は、トリフルオロ酢酸のような酸性媒質中、ジクロロメタンのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で脱保護する
ことによりジケトン７が得られた。８を提供するための７の位置選択的還元は、わずかに過剰な穏やかな還元剤、例えばトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３）をメタノールのような溶媒中で０℃から室温の範囲の温度で処理することにより達成された。
【００６０】
反応スキーム（２）に表す一般式（７）のジケトン中間体も、ＮＦ−κＢ阻害剤として有意な活性を現すことが見いだされた。すなわち本明細書に記載する一般式（２）のジケトンは本発明の一部と考える。
【００６１】
【化６】
【００６２】
【化７】
【００６３】
本発明の製薬学的組成物は、治療に有効な量の式（１）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩、および製薬学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤または補形剤を含んでなる。本発明の好適な製薬学的組成物は治療に有効な量の式（２）の化合物、また
はその製薬学的に許容され得る塩、および製薬学的に許容され得る担体、賦形剤、希釈剤または補形剤を含んでなる。本発明の化合物および製薬学的に許容され得る担体、賦形剤または希釈剤を合わせることにより形成された製薬学的組成物は、次いで錠剤、粉剤、ロゼンジ、シロップ、注入用溶剤等のような様々な剤形で容易に投与される。これらの製薬学的組成物は所望により香料、結合剤、補形剤等のような追加成分を含むことができる。
【００６４】
このように経口投与の目的で、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウムおよび／またはリン酸カルシウムのような種々の補形剤を含有する錠剤は、澱粉、アルギン酸および／または特定の珪酸塩複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｌｉｃａｔｅｓ）のような種々の崩壊剤と一緒に、ポリビニルピロリドン、シュクロース、ゼラチンおよび／またはアカシアなどの結合剤と共に使用することができる。さらにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような潤滑剤もしばしば製剤する目的に有用である。また類似の種類の固体組成物は、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することができる。この目的に好適な材料には、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールがある。経口投与にエリキシル剤の水性懸濁液が望まれる場合、その中の活性な製薬学的製剤は種々の風味の甘味料、着色物質もしくは色素、および所望により乳化剤もしくは懸濁剤を、希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび／またはそれらの混合物と共に合わせることができる。
【００６５】
非経口投与には、ゴマまたは落花生油、水性プロピレングリコール、または滅菌水溶液中の本発明の化合物もしくは組成物の溶液を使用できる。そのような水溶液は必要に応じて適切に緩衝化され、そして液体の希釈物が最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張性とされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用する滅菌水性媒質は当業者に知られている標準的技術によりすべて容易に入手可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
図面は記載する本発明の具体的態様を表し、ゆえに具体的説明のみを目的とする。したがって図面は本発明の範囲を限定することを意図していない。
【図１】２種のＮＦ−κＢ依存的レポーター遺伝子、ルシフェラーゼ（Ａ）および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｂ）の実施例１の化合物によるＨＥＫ−２９３細胞中での濃度依存的発現阻害を表す。
【図２】実施例１の化合物はｈＰＢＭＣに対して細胞傷害効果をほとんどもたないことを示す。ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）は実施例１もしくはＤＨＭＥＱで処理され、そして生存可能な細胞の割合を薬剤処理から２４時間後に評価した。グラフは３回の反復実験の平均±標準偏差を表す。
【図３】実施例１の化合物が、ｈＰＢＭＣ中で可溶性ＩＬ−２Ｒα、ＮＦ−κＢ調節型サイトカインのＮＦ−κＢ依存的発現に及ぼす効果を表す。グラフは２回の独立した実験の平均である。
【図４】実施例１の化合物が乳癌細胞中で炎症性サイトカイン、ＩＬ−６（Ａ）およびＩＬ−８（Ｂ）の分泌を用量依存的様式で阻害する能力を表す。具体的にはＡおよびＢは、実施例１の化合物が、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ−αで刺激したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からＩＬ−６およびＩＬ−８の分泌に及ぼす効果を表す。細胞を示した濃度の実施例１の化合物で２時間処理し、次にＴＮＦ−αを加え、そして４時間インキュベーションを続行した。
【図５】実施例１の化合物が、ＬＰＳで刺激したマウスマクロファージ細胞中で炎症性サイトカイン、ＩＬ−６およびＰＧＥ２の分泌を用量依存的様式で阻害する能力を表す。具体的にはＡおよびＢは、実施例１の化合物が、１μｇ／ｍＬのＬＰＳで刺激したＲＡＷ２６４．７細胞から可溶性ＰＧＥ２およびＩＬ−６の分泌に及ぼす効果を表す。細胞を示した濃度の化合物１で２時間処理し、次にＬＰＳを加え、そして４時間インキュベーションを続行した。
【図６】実施例１の化合物が、ＲｅｌＡ／ｐ６５の細胞質から核への移行を用量依存的様式で遮断する能力を表す。具体的には実施例１の化合物は、細胞の細胞質に活性化ＲｅｌＡ／ｐ６５の蓄積を引き起こす。Ｈｅｋ２９３細胞を、ＤＨＭＥＱまたは実施例１の化合物（示すように）で、ＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に３０分間処理した。インキュベーション後、細胞を抗−ｐ６５抗体（Ｃ−２０）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，サンタクルズ，カリフォルニア州）で免疫染色し、そして核をＤａｐｉでカウンター染色した。像はＡＥ３１倒立顕微鏡を使用して、エピフルオレッセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）イルミネーター（Ｍｏｔｉｃ，Ｘｉａｍｅｎ，中国）およびＰｒｏｇＲｅｓ Ｃ３カメラ（ＪＥＮＯＰＴＩＫ，イェーナ，ドイツ）を用いて撮った。ｐ６５および対応する核の個々の像は、最後の図にまとめた。対照処理細胞（ＤＭＳＯのみ）は、ＴＮＦα刺激でｐ６５の核内蓄積を示す。ＴＮＦαにより誘導されたｐ６５の核内蓄積は、１〜１２μＭの実施例１の化合物で有意に遮断されたが、ＤＨＭＥＱには同じ効果を得るためにより高濃度が必要であった。
【図７】実施例２の化合物はｐ６５（ＲｅｌＡ）のＤＮＡへの結合を、正規経路でＤＨＭＥＱおよびパルテノライドよりも強く阻害することを示す。
【図８】実施例２の化合物はＲｅｌＢのＤＮＡへの結合を、非正規経路で阻害するが（ＩＣ５０〜２μＭ）、ＤＨＭＥＱおよびパルテノライドは阻害しない（ＩＣ５０＞２０μＭ）ことを示す。
【図９】実施例２の化合物は、異種移植マウスでボルデゾミブ（ＰＳ−３４１）のようにＲＰＭＩ８２２６腫瘍増殖を減少させたことを示す。ＰＳ−３４１（１ｍｇ／ｋｇ ｉｖ日 １，４／週 ｘ ４週）も実施例２の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ ｉｐ ＱＤｘ２１）処置のいずれもこの実験では賦形剤処置に比べて統計的に有意な腫瘍の増殖阻害を達成しなかった（Ｐ＞０．１０）。
【図１０】実施例２の化合物は、エタネルセプトのような抗炎症効力をコラーゲン誘導型の関節リウマチ（ＣＩＡ）のマウスモデルで現したことを示す。実施例２の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．ｑｄ２１−３５）およびエタネルセプト（５０μｇ／マウス ｉｐ ｑｄ２１−３５）処置群は、両方とも統計的に有意な抗炎症効果を達成した（賦形剤処置群に比べてＰ＜０．０５）。
【図１１】実施例２の化合物（１０μＭで）はヒトＰ４５０およびｈＥＲＧと相互作用しない（＜５０％阻害）ことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
実施例の態様では、製薬学的調製物は単位剤形である。そのような形態では、調製物は適切な量の有効成分を含有する単位用量に分割されている。単位剤形は包装された調製物であることができ、例えば包装された錠剤、カプセルおよびバイアルもしくはアンプル中の粉末であることができる。また単位剤形はカプセル、カシェーまたは錠剤自体であることもでき、あるいは適切な数の任意のこのような包装形態であることができる。
【００６８】
特定量の有効成分を含む種々の製薬学的組成物の調製法は、当業者に知られている。例
えば製薬学的組成物の調製法については、引用により全部、本明細書に編入するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２１ｓｔ ｅｄ．（２００５）を参照にされたい。
【００６９】
本発明の一つの態様では、本発明の化合物を少なくとも１種の追加の治療薬と合わせることができる。
【実施例１】
【００７０】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ニコチンアミド（８ａ）の調製。
【００７１】
Ａ．ｔｅｒｔ−ブチル２，５−ジメトキシフェニルカルバメート（２）の調製
氷浴中の２，５−ジメトキシアニリン１（５０ｇ，３２６ミリモル）の溶液（１ＬのＭｅＯＨ中）に、不活性窒素雰囲気下でトリエチルアミン（５５ｍＬ，３９７ミリモル）、続いてＢｏｃ２Ｏ（７８ｇ，３５９ミリモル）（１５０ｍＬのメタノール中）を滴下様式で加えた。反応混合物を一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィーにより不完全と判断された後、さらにＢｏｃ２Ｏ（２２ｇ，６９ミリモル）およびトリエチルアミン（５５ｍＬ，３９７ミリモル）を加え、そしてこの溶液を３日間撹拌した。メタノールを除去し、そして残渣を酢酸エチルに溶解し、これを希釈塩酸（２ｘ）およびブラインですすいだ後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、続いて濾過し、そして溶媒を蒸発させて５０ｇ（６１％）のｔｅｒｔ−ブチル ２，５−ジメトキシフェニルカルバメート（２）を茶色い油として得た。１Ｈ ＮＭＲは文献で報告された値と一致した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，７７５）。
【００７２】
Ｂ．ｔｅｒｔ−ブチル ６，６−ジメトキシ−３−オキソシクロヘキサ−１，４−ジエニルカルバメート（３）の調製
化合物２（２９ｇ，１１５ミリモル）のメタノール性溶液（７００ｍＬ）を氷浴中で冷却した後、さらにビス（アセトキシヨード）ベンゼン（６２ｇ，１９４ミリモル）を３０分間にわたり６回に分けて加えた。溶液を氷浴中で２時間撹拌し、次いで室温とし、そして一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（１．５Ｌ）で希釈し、そして水、希釈塩酸およびブラインですすいだ。水性相を酢酸エチルで１回逆抽出し、そして有機相を合わせた後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、続いて濾過し、そして溶媒を蒸発させた。生じた液体は、ヘプタン中の酢酸エチルの勾配（０〜２％）を使用してシリカゲルで精製して、６．９ｇ（２１％）（３）を黄−オレンジ色の固体を得た。材料は１Ｈ ＮＭＲにより十分に純粋（約９５％）であり、これは文献で報告された値と一致した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
１９９８，７７５）。
【００７３】
Ｃ．ｔｅｒｔ−ブチル ２，２−ジメトキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イルカルバメート（４）の調製
テトラヒドロフラン（９３ｍＬ）中の化合物３（３．４ｇ，１２．７モル）を、氷浴中で冷却した。この撹拌溶液に、滴下様式で過酸化水素（３０％水性，２２ｍＬ）および水性水酸化ナトリウム（１Ｍ，６１ｍＬ）を、２つの別個の添加漏斗をクライゼンアダプターを利用して使用して直列で加えた。反応混合物は氷浴中で３０分間、次いで室温で５時間撹拌した。フラスコを氷浴中で冷却し、そして過酸化物を二酸化マンガンで慎重にクエンチした。混合物をシリカゲルの小ベット上で濾過し、続いてシリカゲルを酢酸エチルですすいだ後、混合物をブラインで洗浄した。有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして蒸発させた。生じた油をペンタンで処理してオフホワイト色の固体を沈殿させ、溶媒を蒸発させた後、２ｇ（５６％）の化合物（４）を得た。１Ｈ ＮＭＲは混合物中に２０％の出発材料を示し、これは次の段階で容易に除去された（ＴＦＡで処理）。生
成物の１Ｈ ＮＭＲは文献で報告された値と一致した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，７７５）。
【００７４】
Ｄ．４−アミノ−５，５−ジメトキシ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−２−オン（５）の調製
化合物４（３００ｍｇ，１．１ミリモル）の溶液（６ｍＬの無水ジクロロメタン中）を、氷浴中で不活性窒素雰囲気下で撹拌した。この溶液にトリフルオロ酢酸（１．５ｍＬ）を滴下し、そして溶液を室温とし、３時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーにより完全と判断された後、溶媒を蒸発させ、そして残渣を酢酸エチルに溶解した。固体の重炭酸ナトリウム（２ｇ）を慎重に加え、そして溶液を１０分間撹拌した。塩を濾過し、そして酢酸エチルですすいだ後、溶媒を蒸発させた。粗化合物はヘプタン中の酢酸エチルの勾配（０〜１００％）を使用してシリカゲルで精製した。１００％酢酸エチルで溶出した生成物は、１７８ｍｇ（９１％）の化合物（５）を与えた。生成物の１Ｈ ＮＭＲは文献で報告された値と一致した（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １９９８，７７５）。
【００７５】
Ｅ．Ｎ−（２，２−ジメトキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシニコチンアミド（６ａ）の調製
２−ヒドロキシコニチン酸（１１２ｍｇ，０．８１ミリモル）および塩化チオニル（６５０ｍＬ，８．９ミリモル）の混合物を３０分間、加熱還流した。室温に冷却した後、過剰な塩化チオニルを真空下で除去し、そして生じた酸クロライドを不活性な窒素雰囲気下で保存した。別に無水テトラヒドロフラン（４ｍＬ）中にアミン５（１００ｍｇ，０．５４ミリモル）を含有するフラスコを不活性な窒素雰囲気下で−７８℃に冷却し、その後リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１Ｍのテトラヒドロフラン中、５４０ｍＬ，０．５４ミリモル）を滴下した。この溶液を３０分間撹拌した後、粗２−ヒドロキシニコチノイルクロライド（１ｍＬのテトラヒドロフラン中）を滴下した。反応混合物を−７８℃で３０分間撹拌し、次いで室温に温め、そして１時間撹拌した。液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）では、所望の、および過アシル化生成物の両方が示された。次いで反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和塩化アンモニウム次いでブラインですすぎ、そして水性相を酢酸エチルで逆抽出し、続いてブラインで洗浄した。合わせた有機物を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濾過し、そして溶媒を蒸発させて１６９ｍｇの粗材料を得た。ヘプタン中の酢酸エチルの勾配（５０〜１００％）を使用してシリカゲルでのクロマトグラフィーで、生成物と出発材料の５６ｍｇの混合物、所望の生成物と過アシル化生成物の５６ｍｇの混合物、および３１ｍｇの主に過アシル化生成物が得られた（粗収率：９９％）。所望の生成物／過アシル化材料の５６ｍｇの混合物をメタノール（１．４ｍＬ）および水（２００ｍＬ）に溶解した後、炭酸カリウム（９ｍｇ，〜１当量）を加えた。反応物は室温で２時間撹拌した後、薄層クロマトグラフィーにより完全であると判断された。溶液を酢酸エチルで希釈し、そしてブラインで洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして溶媒を蒸発させて５０ｍｇの化合物６ａを得た。この生成物の構造は１Ｈ
ＮＭＲにより確認された。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１２．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．６２（ｍ，ＩＨ），７．５５（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【００７６】
Ｆ．Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシニコチンアミド（７ａ）の調製
無水ジクロロメタン（２ｍＬ）中の６ａ（５０ｍｇ，０．１６ミリモル）溶液に、ゆっくりとトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を室温で加えた。一晩撹拌した後、ＬＣ−ＭＳは２７％の出発材料が残っていることを示した。さらにトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）を加え、そして反応混合物をさらに２４時間撹拌し、この時点で完了と判断された。溶液を氷浴中で冷却し、そしてさらにジクロロメタン（１０ｍＬ）で希釈した後、飽和重炭酸ナ
トリウム溶液を撹拌している混合物がアルカリ性になるまでゆっくりと加えた。次いで混合物を分配し、そして有機溶媒を取り出し、そしてブラインですすいだ。水性層を酢酸エチルで２回抽出し、そして有機層をブラインで洗浄した。すべての有機物をプールし、そして無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濾過し、そして溶媒を蒸発させて７ａを明黄色の固体として得た（３０ｍｇ，７１％）。ＬＣ−ＭＳは８０％純度を示し、そしてこの材料をさらに精製せずに次の工程で使用した。
【００７７】
Ｇ．（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ニコチンアミド（８ａ）の調製
０℃に冷却したメタノール（４ｍＬ）中の化合物７ａ（３０ｍｇ，０．０９２ミリモル，８０％純度）溶液に、不活性窒素雰囲気下でトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３０ｍｇ，０．１４２ミリモル）を１回で加えた。この溶液をこの温度で１５分間撹拌した後、室温とした。さらに４５分間撹拌した後、反応はＴＬＣにより完了したと判断された。メタノールを約２ｍＬ容量まで蒸発させ、そしてフラスコを氷浴中で１０分間冷却した。次いで沈殿を濾過し、そしてメタノールですすいだ（２ ｘ ３ｍＬ）。高吸引下で乾燥した後、１０ｍｇ（４２％収率）の化合物８ａが淡黄色の固体として単離された。この純度はＨＰＬＣにより９５％であった（Ｒｅｓｔｅｋ Ｐｉｎｎａｃｌｅ ＩＩ カラム、Ｃ１８，５μ，２５０ ｘ ４．６ｍｍ；移動相：水中５％ アセトニトリルで５分、次いで２０分間にわたり水中５〜１００％のアセトニトリル；流速：１．５ｍＬ／分；検出器：３１６ｎｍ（ＶＷＤ）。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認した。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．５０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．３５（ｍ，ＩＨ），７．８５（ｍ，ＩＨ），６．９０（ｍ，ＩＨ），６．５５（ｍ，２Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２】
【００７８】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）キノリン−３−カルボキサミド（８ｂ）。
【００７９】
実施例１の方法を使用するが、工程Ｅの２−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸に代えて使用して、２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）キノリン−３−カルボキサミドを調製した。
【００８０】
Ａ．Ｎ−（２，２−ジメトキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシキノリン−３−カルボキサミド（６ｂ）の調製
２−ヒドロキシキノリン−３−カルボン酸（５２８ｍｇ，２．８ミリモル）を含む乾燥丸底フラスコに、塩化チオニル（４ｍＬ，５７ミリモル）を加えた。混合物を２０分間、加熱還流した後、塩化チオニルをロータリーエバポレーターで蒸発させた。別のフラスコで、アミン５（４３０ｍｇ，２．３ミリモル）を無水テトラヒドロフラン（１７ｍＬ）に溶解し、そして不活性な窒素雰囲気下で−７８℃に冷却した。冷却したアミン溶液に、リチウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１Ｍのテトラヒドロフラン中；３ｍＬ，３ミリモル）を加え、続いて１５分間撹拌した。次いで酸クロライドをテトラヒドロフラン（１２ｍＬ）中で懸濁し、そして冷却アミン溶液に直接加えた。反応混合物を一晩撹拌し、その間に室温になった。次いで反応物を酢酸エチルで希釈し、ブラインで洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮して５５０ｍｇの粗物質を得、これは１０％のＯ−アロイル化生成物を含んだ（ＬＣ−ＭＳにより定めたように）。固体は２５ｍｇの炭酸カリウムを含有する８／１のメタノール／水（９ｍＬ）中で１時間撹拌し、その後、酢酸エチルで希釈し、そして飽和重炭酸ナトリウム溶液およびブラインで洗浄した。酢酸エチルを無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして濃縮して少量のエステルを含む固体を得た。次いで生成物は小さいシリカプラグで精製し、９５／５のジクロロメタン／酢酸エチ
ルで溶出して、５３０ｍｇの淡黄色の固体（６４％収率）を得た。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認した。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１２．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｍ，ＩＨ），７．８０（ｍ，ＩＨ），７．６５（ｍ，ＩＨ），７．４０（ｍ，２Ｈ），５．６０（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７０（ｓ，３Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【００８１】
Ｂ．Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシキノリン−３−カルボキサミド（７ｂ）の調製
Ｎ−（２，２−ジメトキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシキノリン−３−カルボキサミド（６５ｍｇ，０．１８ミリモル）を含有するフラスコに、トリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を１回で加えた。溶液を３時間撹拌した後、反応をＬＣ−ＭＳにより判断した。トリフルオロ酢酸を真空下で除去し、そして生成物を窒素ガスで乾燥して５７ｍｇ（１００％）の表題生成物を得、これは約１５％の副産物を含み、これは加水分解生成物であることが示唆された（アミドおよびエポキシドの両位置で；Ｍ＋ ２０４）。この固体をさらに特性決定または精製することなく次の工程に使用した。
【００８２】
Ｃ．（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）キノリン−３−カルボキサミド（８ｂ）の調製
上記で得た化合物を、２／１のテトラヒドロフラン／メタノール混合物（３６ｍＬ）に溶解し、そして０℃に冷却した。次いでトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを一回で加え、そして反応を室温とした。３０分間撹拌した後、反応はＬＣ−ＭＳにより完了したと判断した。次いで溶媒を蒸発させ、そしてメタノール（５ｍＬ）を加えた。混合物を簡単に超音波処理し、そして氷浴中で１５分間冷却した。次いで固体を濾過し、そしてメタノールですすぎ（２ ｘ ２ｍＬ）、集め、高真空下で乾燥させて１８ｍｇ（７８％）の生成物を得た。純度はＨＰＬＣにより９４％であった（Ｒｅｓｔｅｋ Ｐｉｎｎａｃｌｅ
ＩＩ カラム，Ｃ１８，５μ，１５０ ｘ ４．６ｍｍ；移動相：水中５％アセトニトリルで５分間（０．１％ ＴＦＡ）、次いで２０分間にわたり水中５〜１００％のアセトニトリル（０．１％ トリフルオロ酢酸）；流速：１．５ｍＬ／分；検出器：３１６ｎｍ（ＶＷＤ））。生成物構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認した。ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．５０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｍ，ＩＨ），８．００（ｍ，ＩＨ），７．７５（ｍ，ＩＨ），７．４０（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｍ，１Ｈ），６．６５（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３】
【００８３】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピコリンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．２０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．２０（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．４５（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例４】
【００８４】
（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．４５（ｍ，２Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例５】
【００８５】
（±）−６−クロロ−４−ヒドロキシ−キノリン−３−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１３．１（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．５０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．９０（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例６】
【００８６】
（±）−４−ヒドロキシ−８−トリフルオロメチル−キノリン−３−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．７５（ｍ，１Ｈ），８．６０（ｍ，１Ｈ），８．２５（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例７】
【００８７】
（±）−５−クロロ−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．６５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．２５（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．５５（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例８】
【００８８】
（±）−４−ヒドロキシ−２−フェニルピリミジン−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−ｅｎ−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．００（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．７５（ｍ，１Ｈ），８．２０（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｍ，３Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例９】
【００８９】
（±）−３−ヒドロキシ−キノキサリン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ
ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．００（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１０】
【００９０】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−６−メチル−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１２．２０（ｓ，１Ｈ），８．２５（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），６．４０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），２．３５（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１１】
【００９１】
（±）−４−ヒドロキシ−２−ピペリジン−１−イル−ピリミジン−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：８．５０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），６．５０（ｍ，１Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），３．８５（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，４Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），１．６（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１２】
【００９２】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピコリンアミド，メシレート。１Ｈ ＮＭＲ
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），５．００（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），３．２０（ｍ，１Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１３】
【００９３】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピコリンアミドトリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．６０（ｂｒ．ｓ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１４】
【００９４】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピコリンアミド トシレート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．２０（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，１Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），７．１０（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），２．２（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１５】
【００９５】
（±）−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１６】
【００９６】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−メトキシ−ニコチンアミド． １Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．４０（ｍ，１Ｈ），８．３５（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１７】
【００９７】
（±）−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド メシレート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），
１０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１８】
【００９８】
（±）−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミドトリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ）４．９０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例１９】
【００９９】
（±）−３−ヒドロキシ−キノリン−２−カルボン酸−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド トシレート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．９０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，３Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），７．４０（ｍ，２Ｈ），７．１（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ）４．９０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．５０（ｍ，１Ｈ），２．２（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２０】
【０１００】
（±）−３−メトキシ−ピリジン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），７．００（ｍ，ＩＨ），５．７０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２１】
【０１０１】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−メトキシ−ニコチンアミドトリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．７０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．４０（ｍ，１Ｈ），８．３５（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，ＩＨ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２２】
【０１０２】
（±）−３−メトキシ−ピリジン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド トリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．４０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，１Ｈ），７．６５（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，ＩＨ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２３】
【０１０３】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−６−トリフルオロメチル−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２４】
【０１０４】
（±）−４−ヒドロキシ−２−メチル−ピリミジン−５−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １３．４０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１１．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｍ，ＩＨ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２５】
【０１０５】
（±）−２−メトキシ−キノリン−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．８０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｍ，１Ｈ），８．１０（ｍ，１Ｈ），７．８０（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｍ，ＩＨ），６．９０（ｍ，２Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２６】
【０１０６】
（±）−３−メトキシ−ピラジン−２−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド． １Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．６０（ｓ，１Ｈ），８．３５（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，ＩＨ），６．７０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），４．００（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２７】
【０１０７】
（±）−１−クロロ−４−ヒドロキシ−イソキノリン−３−カルボン酸（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−アミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．４０（ｍ，２Ｈ），８．１０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２８】
【０１０８】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−ヒドロキシキノリン−３−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １２．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），１０．３０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｍ，１Ｈ），８．００（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．５（ｍ，２Ｈ），７．３０（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例２９】
【０１０９】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−８−メトキシキノリン−７−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．１０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．１０（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），８．０５（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），４．３５（ｓ，３Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３０】
【０１１０】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサ−ビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−メトキシ−ニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），８．３０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，１Ｈ），７．２０（ｍ，ＩＨ），４．２０（ｍ，１Ｈ），４．１０（ｓ，３Ｈ），３．９５（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３１】
【０１１１】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−３−メトキシキノリン−２−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １０．６０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．０５（ｓ，１Ｈ），８．００（ｍ，２Ｈ），７．６０（ｍ，２Ｈ），６．８０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．８０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，１Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３２】
【０１１２】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−８−メトキシキノリン−７−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．２０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），８．１０（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｓ，３Ｈ），４．２０（ｍ，１Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３３】
【０１１３】
（±）−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−８−メトキシキノリン−７−カルボキサミドトリフルオロアセテート。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．２０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ），８．５０（ｍ，１Ｈ），８．１０（ｍ，１Ｈ），７．９０（ｍ，１Ｈ），７．７０（ｍ，１Ｈ），７．００（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｓ，３Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３４】
【０１１４】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−３−ヒドロキシイソニコチンアミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．３０（ｓ，１Ｈ），８．００（ｍ，１Ｈ），７．４０（ｍ，１Ｈ），４．２０（ｓ，１Ｈ），４．００（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３５】
【０１１５】
（±）−Ｎ−（２，５−ジオキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−２−メトキシキノリン−３−カルボキサミド。１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ １１．００（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），９．００（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｍ，２Ｈ），７．７５（ｍ，２Ｈ），７．５０（ｍ，１Ｈ），４．４０（ｓ，３Ｈ），４．００（ｓ，１Ｈ），３．９０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３６】
【０１１６】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−６−メトキシキノリン−３−カルボキサミド．１Ｈ ＮＭＲ．ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１２．５０（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），８．９０（ｍ，ＩＨ），７．５０（ｍ，ＩＨ），７．４０（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｍ，１Ｈ），６．６０（ｍ，１Ｈ），４．９０（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｍ，４Ｈ），３．４０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【実施例３７】
【０１１７】
（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで６−ヒドロキシベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−５−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例３８】
【０１１８】
（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−５−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで６−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−５−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ベンゾ［ｄ］チアゾール−５−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例３９】
【０１１９】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピペリジン−２−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで３−ヒドロキシピペリジン−２−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピペリジン−２−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４０】
【０１２０】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで３−ヒドロキシピラジン−２−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピラジン−２−カルボキサミドを調製するこことができる。
【実施例４１】
【０１２１】
（±）−５−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリミジン−４−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで５−ヒドロキシピリミジン−４−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−５−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリミジン−４−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４２】
【０１２２】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１，８−ナフチリジン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで２−ヒドロキシ−１，８−ナフチリジン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１，８−ナフチリジン−３−カルボキサミドを調製することができる
。
【実施例４３】
【０１２３】
（±）−７−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで７−ヒドロキシ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−７−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４４】
【０１２４】
（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリダジン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで４−ヒドロキシ−ピリダジン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）ピリダジン−３−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４５】
【０１２５】
（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで４−ヒドロキシ−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４６】
【０１２６】
４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）フラン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで４−ヒドロキシフラン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）フラン−３−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４７】
【０１２７】
（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）チオフェン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで４−ヒドロキシチオフェン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−４−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）チオフェン−３−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４８】
【０１２８】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）イソチアゾール−４−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで３−ヒドロキシイソチアゾール−４−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）イソチアゾール−４−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例４９】
【０１２９】
（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）イソキサゾール−４−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで３−ヒドロキシイソキサゾール−４−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−３−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）イソキサゾール−４−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例５０】
【０１３０】
（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで６−ヒドロキシ−１Ｈ−インドール−５−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−インドール−５−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例５１】
【０１３１】
（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで６−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−６−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−５−カルボキサミドを調製することができる。
【実施例５２】
【０１３２】
（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）モルホリン−３−カルボキサミド。実施例１の方法を採用するが、工程Ｅで２−ヒドロキシモルホリン−３−カルボン酸を２−ヒドロキシニコチン酸の代わりに使用して、（±）−２−ヒドロキシ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−５−オキソ−７−オキサビシクロ［４．１．０］ヘプタ−３−エン−３−イル）モルホリン−３−カルボキサミドを調製することができる。
【０１３３】
実施例１の化合物による細胞内でのＮＦ−κＢの阻害 ２つのレポーター細胞アッセイを使用して、実施例１の化合物がＮＦ−κＢが駆動する転写を阻害する能力を測定した。第１アッセイは、３つのＮＦ−κＢプロモーター要素を含む安定に組み込まれたｐＮＦ−κＢ−ｌｕｃレポータープラスミドを用いた２９３−細胞に基づくアッセイであった。第２のアッセイは、４つのＮＦ−κＢプロモーター要素を含む安定に組み込まれたｐＴＲＨ１−ＮＦ−κＢ−ｄｓｃＧＦＰレポーターを用いた２９３−細胞に基づくアッセイであった。細胞を０、０．２、１、１０、２０および４０μＭの実施例１の化合物で２時間処理し、次いで２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで１８時間誘導した。誘導後、発光または蛍光を、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ２３００プレートリーダーを使用して定量した。図１ＡおよびＢはそれぞれ発光および蛍光データから作成した用量応答曲線を示す。実施例１の化合物は、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を用量依存的様式で阻害することが観察され、１６．２±１．１μＭのＩＣ５０中央値（５０％の阻害濃度）であった。また実施例１の化合物は、緑色蛍光タンパク質遺伝子の発現も用量依存的様式で阻害し、６．２±０．５μＭのＩＣ５０中央値であった。これらの値は３回の独立した実験±標準誤差から作成した中央値を表す。対照として、０．５％ ＤＭＳＯ処理および未処理細胞と比較して、実施例１の担体がルシフェラーゼの発現またはアッセイの読み取りに影響を及ぼさないこ
とが確認された。ＤＭＳＯ処理群でのアッセイからの出力にわずかな減少があったが、統計的に有意ではなかった。対照の結果として、薬剤処理したサンプルにおける活性の低下をＤＭＳＯ処理サンプルと比較した。
【０１３４】
実施例１の化合物の細胞傷害プロファイル 実施例１の化合物の細胞傷害性は、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣｓ）について測定された。図２を参照にされたい。活性アッセイの場合のように、ｈＰＢＭＣｓを０、０．２、１、１０、２０および４０μＭの実施例１の化合物で２時間処理し、次いで２０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで４８時間誘導した。生存可能細胞数は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存能アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ（ｃａｔ ＃ Ｇ７５７３））を使用して測定した。代表的な実験を図２に示す。グラフが示すように、実施例１の化合物を用いてこれらの細胞に対して検出できる毒性は、試験した４０μＭまでほとんどなかった。対照的に、ＤＨＭＥＱは４０μＭで６０％より高い細胞増殖の阻害を現した。０．５％のＤＭＳＯで処理した細胞は、未処理ｈＰＢＭＣｓに比べて検出できる細胞傷害効果を示さなかった。選択性指数（ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ：細胞傷害性ＣＣ５０対阻害性ＩＣ５０の比）を実施例１の化合物に割り当てる。上記阻害および毒性実験で得られた結果に基づき、実施例１の化合物はＤＨＭＥＱに比べてより高い選択性を現した（すなわちより高い活性およびより低い細胞傷害性）。
【０１３５】
可溶性ＩＬ−２ＲαはＮＦ−κＢにより転写的に調節される 図３はｓＩＬ−２Ｒαの血清レベルが実施例１で処理した細胞により影響され得ることを示す。ヒトＰＢＭＣｓを０、０．２、１、１０、２０および４０μＭの実施例１の化合物で処理すると同時にＰＨＡ−Ｐで活性化した。細胞をさらに３日間培養し、そして培地をマーカーの評価のために回収した。図３はｓＩＬ−２ＲαがＰＨＡ−Ｐの活性化により有意に誘導されたことを示す。さらにグラフでは、ｓＩＬ−２Ｒαが実施例１の化合物の添加に用量依存的様式で影響され、１０μＭの実施例１の化合物で統計的に有意な効果が生じたことを示す。
【０１３６】
実施例１の化合物によるＩＬ−６およびＩＬ−８分泌の阻害 過去数年にわたり、乳癌に関する徹底的な研究で、ＨＥＲ２、エストロゲンレセプター（ＥＲ）の過剰発現、およびｐ５３、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を含む遺伝子の突然変異が、核内因子κＢを含む複数の脈管形成性アポトーシス促進レギュレーターの誘導を介して乳癌の発症および進行に重要な役割を果たすという認識に至った。ＮＦ−κＢはしばしば、乳癌、膀胱癌、前立腺癌および黒色腫で恒常的に活性化される。多くの研究でＮＦ−κＢの恒常的活性化が乳癌細胞株のホルモン非依存的増殖の進行に貢献することが示された。
【０１３７】
ＮＦ−κＢシグナル伝達経路は、ＩＬ−６およびＩＬ−８を恒常的に分泌することが示されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で恒常的に活性化される一方、ＴＮＦ−αの添加がさらにこの分泌を加速する（図４ＡおよびＢを参照にされたい）。この実施例１の化合物は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１からの恒常的なＩＬ−６およびＩＬ−８分泌を用量依存的様式で阻害することが観察された。たとえ細胞がＴＮＦ−α（２０ｎｇ／ｍＬ）で刺激された場合でも、２０μＭの実施例１の化合物はこれらの細胞からＩＬ−６およびＩＬ−８の分泌を完全に阻害した（図４ＡおよびＢを参照）。
【０１３８】
マクロファージは免疫反応、アレルギーおよび炎症に重要な役割を果たす。過剰なマクロファージの活性化は、充実性腫瘍、糖尿病、およびアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経疾患を増す。ゆえに過剰なマクロファージの活性を抑制することはこれらの疾患に化学療法として有用となるはずである。細胞培養実験には、マウス細胞株ＲＡＷ２６４．７がマクロファージのモデルとしてしばしば使用される。微生物およびリポ多糖（ＬＰＳ）のようなその生産物に反応して、マクロファージはインターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを含む様々な炎症性サイトカインを、核内因子ＮＦ−κＢの活性化を介し
て分泌し、ならびにＮＦ−κＢ−依存的誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）およびシクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）を発現する。ＮＦ−κＢは細胞外シグナルにより主にマクロファージ内の様々なＴｏｌｌ−様受容体を介して活性化される。免疫系による微生物感染の検出および応答は、Ｔｏｌｌ−様受容体（ＴＬＲ）と呼ばれるパターン認識受容体のファミリーに依存する。これらの受容体は、グラム陽性および陰性細菌、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、菌・カビ、および原生動物に由来する分子を含む病原体に関連する分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識するように進化的に保存されており、そしてそれらはかなりの標的特異性を表す。ＴＬＲ４はグラム陰性細菌のＬＰＳに対する効果的な宿主細胞応答に重要である。
【０１３９】
ＬＰＳ刺激はプロスタグランジンＥ２の原因である酵素ＣＯＸ−２の発現を誘導する。実施例１の化合物での前処理は、６〜１２時間で発現の強い阻害を生じた。このＬＰＳが誘導するＣＯＸ−２発現の減少は、図５Ａに示すように、下流のＰＧＥ２合成の減少により示されるように用量依存的であった。
【０１４０】
炎症性サイトカインＩＬ−６は、図５Ｂに示すように実施例１の化合物により用量依存的様式で阻害された。この阻害はＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞株におけるＩＬ−６の阻害と合致する。
【０１４１】
ＲｅｌＡ／ｐ６５の免疫染色 実施例１の化合物は細胞の細胞質内に活性化ＲｅｌＡ／ｐ６５の蓄積を引き起こす。Ｈｅｋ２９３細胞をＤＨＭＥＱまたは実施例１の化合物（示すような）でＴＮＦα（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に３０分間処理した。インキュベーション後、細胞を抗−ｐ６５抗体（Ｃ−２０）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，サンタクルズ，カリフォルニア州）で免疫染色し、そして核はＤａｐｉを用いてカウンター染色した。像はＡＥ３１倒立顕微鏡を使用してエピフルオレッセンスイルミネーター（Ｍｏｔｉｃ，厦門，中国）およびＰｒｏｇＲｅｓ Ｃ３ カメラ（ＪＥＮＯＰＴＩＫ，イェーナ，ドイツ）を用いて撮影した。ｐ６５および対応する核の個々の像は、図面の最後にまとめた。対照処理細胞（ＤＭＳＯのみ）は、ＴＮＦα刺激でｐ６５の核内蓄積を現した。ＴＮＦαにより誘導されるｐ６５の核内蓄積は、１〜１２μＭの実施例１の化合物により有意に遮断され、一方、ＤＨＭＥＱは同じ効果を達成するためにより高い濃度を要した。図６を参照にされたい。
【０１４２】
Ｔｒａｎｓ ＡＭ ＮＦ−κＢファミリーＤＮＡ結合ＥＬＩＳＡ 薬剤化合物に暴露した活性化核抽出物または精製組換えＮＦ−κＢタンパク質からのＮＦ−κＢヘテロ二量体またはホモ二量体サブユニットの結合活性を、Ｔｒａｎｓ ＡＭ ＮＦ−κＢファミリー結合ＥＬＩＳＡ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）により評価した。ＴＮＦα活性化ＨｅｌａまたはＲａｊｉ細胞（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）由来の３〜５μｇの核抽出物、または２０ｎｇの精製組換えタンパク質（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆからｐ６５およびｐ５０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚからのｐ５２）を、室温で１時間、ＤＴＴを含まない完全溶解バッファー（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）で希釈した２０μＬの薬剤化合物とインキュベーションした。次いで処理したサンプルを、ＮＦ−κＢコンセンサスオリゴヌクレオチドでプレコートしたマイクロプレートウェル中の３０μＬの完全結合バッファー（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ：ＤＴＴを含む）に移した。対照には、溶解バッファーを含有するが抽出物もしくは組換えタンパク質を含まない非特異的結合（ＮＳＢ）ウェル（バックグラウンド用）、ＤＭＳＯのみで処理した核抽出物または組換えタンパク質（最大の結合用）、および抽出物／タンパク質に競合物として２０ｐｍｏｌｅの遊離野生型ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチド、または特異性を証明するための対照として２０ｐｍｏｌｅの遊離変異体ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドを加えたウェルを含んだ。プレートを室温で１時間、ゆっくりと振盪しながらインキュベーションし、そして２００μＬの１ｘ洗浄バッファーで３回洗浄した。プレートに結合したＮＦ−κＢ ｐ６
５、ｐ５０、ｐ５２、ＲｅｌＢまたはｃ−Ｒｅｌサブユニットは、そのサブユニットに特異的な１００μＬの１次抗体（１：１０００に１ｘ抗体バッファーで希釈）で検出した。プレートを室温で１時間インキュベーションし、次いで２００μＬの１ｘ洗浄バッファーで３回洗浄した。次に１００μＬのＨＲＰ結合ヤギ抗−ウサギ抗体（１：１，０００に１ｘ抗体バッファーで希釈）を各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベーションし、次いで２００μＬの１ｘ洗浄バッファーで４回洗浄した。１００μＬの室温発色溶液を各ウェルに加えた。反応物は媒質が暗青色に発色するまで２〜１０分間現像し（使用した抽出物のロットまたは組換えタンパク質のロットのサブユニット活性に依存する）、次いで反応は１００μＬの停止溶液で止めて黄色い色を生じた。吸収は４５０ｎｍでＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＤＴＸ ８８０ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを使用して記録し、６２０ｎｍの参照波長値を引いた。図７および８は実施例２、ＤＨＭＥＱおよびパルテノライドのＲｅｌＡおよびＲｅｌＢのＮＦ−κＢ部位への阻害効果を具体的に説明する。
【０１４３】
実施例１および２の化合物に加えて、表１は他の化合物が１）ＮＦ−κＢが駆動するルシフェラーゼおよびＧＦＰのＨＥＫ２９３細胞中での発現、２）Ｉｌ−６およびＰＧＥ２のＲＡＷ２６４細胞からの放出、３）および３）ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｃ−Ｒｅｌ、ｐ５０およびｐ５２のＮＦ−κＢ部位への結合を阻害するそれらの活性について列挙する。
【０１４４】
【表１】
【０１４５】
一連のインビトロ実験において、本発明のＮＦ−κＢ阻害剤は、サイトカインの放出および広いスペクトルの癌細胞株の増殖を防いだ。これらの化合物は、チトクロームＰ４５０の活性を阻害せず、またはｈＥＲＧチャンネルを遮断しなかった。数種の化合物が齧歯類の疾患モデルで効力試験について評価された。我々は初めに、正規および非正規経路の両方で恒常的活性化の高い発生率を有する多発性骨髄腫において、この化合物のインビボ効力を得ようとした。ヒトＲＰＭＩ８２２６多発性骨髄腫の異種移植片モデルでは、実施例２の化合物は、この適応症の最も重要な治療となると認められているＰＳ−３４１（ボルテゾミブ、Ｖｅｌｃａｄｅ（商標））と同じレベルの腫瘍増殖の減少を達成した（図９を参照にされたい）。さらに実施例２の化合物は、ＰＳ−３４１よりもよく忍容（ｔｏｌｅｒａｔｅｄ）された。しかし統計的分析では、ＰＳ−３４１も実施例２の処置も統計的
に有意な腫瘍増殖阻害を達成しないことが明らかとなった（Ｐ＞０．０５）。
【０１４６】
ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ−１（ＰＡＲＰ−１）の阻害またはｐ６５（ＲｅｌＡ）のダウンレギュレーションは、癌細胞株に対する照射（ＩＲ）−誘導型の細胞傷害性を増強することができる。この実験では、新規な低分子ｐ６５（ＲｅｌＡ）阻害剤が、野生型のマウス胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）またはＰＡＲＰ−１−／−またはｐ６５−／−ＭＥＦｓで放射線増感剤として評価された。クローン原性生存率アッセイ（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｓｓａｙ）において、ｐ６５−／− ＭＥＦｓはｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓよりもＩＲに対して２倍以上感度が高いことが見いだされ、これはＮＦ−κＢの活性化が放射線耐性を付与することを示す。実施例２の化合物（１．４μＭ、非細胞傷害用量）とのインキュベーションで、ｐ６５＋／＋ＭＥＦｓを放射線増感した（ＩＲ単独での２．３Ｇｙに比べて、ＩＲ＋実施例２の化合物で１．５ＧｙのＬＤ５０値）。実施例２の化合物はｐ６５−／− ＭＥＦｓの放射線増感に更なる効果はなく、これは実施例２の化合物の薬理学的効果がｐ６５を介して媒介されることを示す。同様の放射線増感効果は、ｐ６５−／− ＭＥＦｓではなくｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓでｐ６５の発現レベルをダウンレギュレートする（＞９５％まで）ＲＮＡ干渉技術により観察された。次いで実施例２の化合物を、ＰＡＲＰ−１＋／＋またはＰＡＲＰ−１−／− ＭＥＦｓで試験した。実施例２の化合物（１．４μＭ）処理またはｐ６５のｓｉＲＮＡダウンレギュレーションのいずれかがＰＡＲＰ−１＋／＋の放射線感受性を上げたが、ＩＲに対してＰＡＲＰ−１−／− ＭＥＦｓは上げず、ＰＡＲＰ−１はＮＦ−κＢ経路の活性化の上流にあることを示唆している。ＭＥＦｓでは実施例２の化合物またはｐ６５ｓｉＲＮＡによるＮＦ−κＢの阻害も確認された。ＮＦ−κＢ−依存的ルシフェラーゼ発現は、ｐ６５＋／＋
ＭＥＦｓで１０ＧｙのＩＲ後に２．５−倍まで増加した。実施例２の化合物またはｐ６５ ｓｉＲＮＡの処理で、ルシフェラーゼ遺伝子の転写は有意に減少した。同様に、ＩＲはｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓの核抽出物ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を２倍まで増加し、これはこれらの細胞中で実施例２の化合物のインキュベーションまたはｐ６５ ｓｉＲＮＡ処理のいずれかで有意に減少した。このｐ６５阻害剤は、以前にＰＡＲＰ−１阻害剤が可能であることが示されたようにインビトロでの放射線活性を増強できることを証明した。放射線増感剤として実施例２の化合物の潜在的有用性を完全に調査するためは、さらにインビボの実験が必要である。
【０１４７】
実験の別の目的は、酵素および放射性リガンド結合アッセイで、実施例２の化合物の活性を評価することであった。この実験で採用した方法は、信頼性および再現性を最大にするために科学文献から適合させた。参照標準は、得られた結果の有効性を確実にするために、各アッセイに絶対不可欠として行った。提示する場合、ＩＣ５０値はＭａｔｈＩＱｅａ（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．，英国）を使用して、非線形最小二乗法回帰分析（ｎｏｎ−ｌｉｎｅａｒ，ｌｅａｓｔ ｓｑｕａｒｅｓ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により決定した。阻害定数（Ｋ３／４）が提示される場合、Ｋ３／４値は試験化合物の観察されたＩＣ５０、このアッセイに使用した放射性リガンド濃度、およびリガンドのＫ１に関する歴史的値（実験的に得られた値）を使用して、Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｐｒｕｓｏｆｆ（非特許文献５６）の式を使用して算出した。提示される場合、競合的結合曲線の傾斜を定めるＨｉｌｌ係数（ｎ１／２）はＭａｔｈＩＱｅａを使用して算出した。１．０からかなり異なるＨｉｌｌ係数は、結合置換が単一結合部位で質量作用の法則には従わないことを示唆する可能性がある。ＩＣ５０、Ｋ３／４および／またはｎ１／２データが平均の標準誤差（ＳＥＭ）無しに提示される場合、データは定量的になるためには不十分である。必要に応じて、個々の応答がこの報告に対して補遺に提示される。結果は、５０％より高い阻害は無かったので、予想されるＩＣ５０および／またはＫ３／４値無しで図１１に示す。
【０１４８】
ＲＮＡ干渉スクリーニングでは、ＮＦ−κＢの正規および非正規経路でｐ５３およびｒ
ａｓ突然変異が合成致死性になると確認された（非特許文献５７：非特許文献５８）。ＮＦ−κＢ部位に対してＲｅｌＡ（ｐ６５）、ＲｅｌＢおよびｃ−ｒｅｌの結合と拮抗する阻害剤を合成し、そしてこのように正規および非正規経路の両方を阻害する。１つのそのような例示化合物である実施例２の化合物は、野生型およびｐ６５−／−マウスの胚性繊維芽細胞（ＭＥＦｓ）で放射線増感剤として評価され、そしてｐ５３欠失およびＫＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ）変異体乳癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１で放射線増感剤および化学療法剤として評価された。クローン原性生存率アッセイで、照射（ＩＲ）に対してｐ６５−／−
ＭＥＦｓはｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓよりも２倍以上感受性が高いことが分かり、これはＮＦ−κＢの活性化が放射線耐性を付与することを示す。実施例２の化合物（１．４μＭ、非細胞傷害濃度）とのインキュベーションで、ｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓは放射線増感された（ＩＲ単独での２．３Ｇｙに比べて、ＩＲ＋実施例２の化合物で１．５ＧｙのＬＤ５０値）。実施例２の化合物はｐ６５−／− ＭＥＦｓの放射線増感には効果はなく、これは実施例２の化合物の放射線増感効果がｐ６５を介して媒介されることを示した。同様の放射線増感効果は、ＲＮＡ干渉技術を使用することにより、ｐ６５−／− ＭＥＦｓではなくｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓでｐ６５の発現レベルを９５％より高くダウンレギュレートすることが観察された。ＭＥＦｓで実施例２の化合物またはｐ６５ｓｉＲＮＡによるＮＦ−κＢの阻害も確認された。ＮＦ−κＢ−依存的ルシフェラーゼ発現は、ｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓで１０ ＧｙのＩＲ後に２．５−倍まで増加した。実施例２の化合物またはｐ６５ ｓｉＲＮＡの処理で、ルシフェラーゼ発現は有意に減少した。同様に、ＩＲはｐ６５＋／＋ ＭＥＦｓの核抽出物ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を２倍まで増加し、この増加はこれらの細胞中で実施例２の化合物のインキュベーションまたはｐ６５ ｓｉＲＮＡ処理のいずれかで有意に減少した。
【０１４９】
実施例２の化合物は、恒常的にＮＦ−κＢが活性化されているＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞でも実験した。最初に実施例２の化合物を単剤として乳癌細胞の増殖について試験した。実施例２の化合物に対する重要な細胞傷害性効果は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して０．４μＭのＬＤ５０値で観察された。次いで実施例２の化合物の相乗的効果が、これら細胞で照射を用いて試験された。０．２μＭの実施例２の化合物とのインキュベーションで、１．５倍まで照射効果を有意に強化することが観察された（ＩＲのみについての２．５５Ｇｙと比較して、ＩＲ＋実施例２の化合物については１．６６Ｇｙ ＩＲのＬＤ５０値）。これらの記載された実験は、ＮＦ−κＢのＲｅｌ阻害剤が正規経路の遮断を介して放射能を強化できることを示す。またこれは、ｐ５３およびＫＲＡＳ突然変異を持つ腫瘍細胞を、恐らく正規および非正規経路の両方の遮断を介して選択的に殺すことができる。
【０１５０】
最近の関節リウマチの全ゲノムに関する実験で、この疾患の新たに同定されたリスク因子としてｃ−ＲｅｌをコードするＲＥＬ座が同定された（非特許文献５９）。ｃ−ＲｅｌはＮＦ−κＢの正規および非正規経路の両方を媒介するＮＦ−κＢファミリーの転写因子の一員である。ｃ−Ｒｅｌが欠失した遺伝子を持つマウスは、コラーゲンが誘導する関節炎に耐性である。ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＡおよびＲｅｌＢのＮＦ−κＢ部位への結合を遮断する低分子量阻害剤が合成された。実施例２の化合物の抗炎症活性、コラーゲン誘導型関節炎のマウスモデルで、ＮＦ−κＢの正規および非正規経路の両方の二重阻害剤。ＴＮＦαブロッカーであるエタネルセプトを用いた実施例２の化合物の効果を、関節リウマチモデルで比較した。オスＤＢＡマウスの尾にウシＣＩＩ型コラーゲンを１日および２１日に注射することにより関節炎を発症させた。動物群（ｎ＝１０）を、１）偽操作、２）賦形剤（ＤＭＳＯ），、３）エタネルセプト（５０μｇ／マウス、ｉ．ｐ．２１日〜３５日毎日）、４）実施例２の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．２１日〜３５日毎日）、５）実施例２の化合物（１５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．２１日〜３５日毎日）、６）実施例２の化合物（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．２１日〜３５日毎日）で処置した。関節炎指数スコアにより評価した時、実施例２の化合物の処置は、マウス後足の紅斑および浮腫を有意に減少し
、これはエタネルセプトの処置に匹敵した（図１０）。エタネルセプトおよび実施例２の化合物の両方とも足の浮腫を減少させた（Ｐ＜０．０１対賦形剤群）。体重の減少における有意差は、実験したすべてのマウスで観察されなかった。３５日目の関節の組織学的評価で、実施例２の化合物またはエタネルセプトを用いて処置したマウスの炎症に有意な減少が明らかとなった。ミエロペルオキシダーゼ活性の測定は、同時に実施例２の化合物またはエタネルセプト処置による顆粒球リソゾーム特異的酵素の減少を示した。結論として我々は、ＮＦ−κＢのＲｅｌ阻害剤がマウスの炎症性関節炎の発症を防ぐことができるということを証明した。マウスの関節リウマチモデルにおいて、実施例２の化合物の抗炎症活性は、エタネルセプトの活性に匹敵した。実施例２の化合物の効力は、マウスに良く忍容される用量で達成された。
【０１５１】
本発明のＮＦ−κＢ阻害剤は、大腸炎の動物モデルで抗炎症剤として、充実性腫瘍の放射線処置の放射線増感剤として、単独または種々の認可された癌薬剤と組み合わせた化学療法剤として試験されているところである。正規および非正規経路の二重阻害剤、および正規経路の単独阻害剤の両方が特性決定されているところである。
【０１５２】
さらに記載することなく、当業者はこれまでの記載および具体的実施例を使用して、本発明の化合物を作成および使用し、そして特許請求する方法を実施することができる。本発明は様々な具体的材料、手法および実施例を参照にして本明細書に記載され、そして具体的に説明されたが、本発明はその目的のために選択された材料および手法の特定の組み合わせに限定されないことを理解されたい。当業者には想定されるようなそのような詳細の多くの変更を包含することができる。本出願全体を通して引用するすべての特許、特許出願および他の文献は、それら全部を参照により本明細書に編入する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）または式（２）
【化１】
［式中、
ＨＥＴは飽和もしくは不飽和の単−もしくは多−環の炭素環であり、ここで１もしくは複数の環の炭素原子がＮ、Ｓ、ＰもしくはＯで置き換えられ；
各Ｒ１は独立して水素；ＣＦ３；場合によりシアノ、ハロ、ニトロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル，（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ＯＨ，（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ，ＣＯＲ３，ＮＲ４Ｒ５またはＮＨＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）で置換されてもよいフェニル；シアノ；ハロ；ニトロ；ヒドロキシル；（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ＯＨ；（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ；（Ｃ１−Ｃ６）チオアルコキシ；フェノキシ；ＣＯＲ３；ＮＲ４Ｒ５；ＮＨＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ２はＨ、Ｒ６、ＣＯＲ６、ＣＯＮＨＲ６、ＣＯＯＲ６、ＣＨ２ＯＣＯＲ６、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）またはＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、あるいはＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）またはＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）のグリコシルもしくは無機塩であり；
Ｒ６はＣ１−Ｃ６アルキル、トリフルオロメチル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、シクロヘキシルメチルまたはフェニルであり、ここでフェニルはフッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル，（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシおよびフェニルメチルから選択される０〜４個の基で置換され、ここでフェニルメチルはフェニル環で、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル，（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、２−、３−もしくは４−ピリジニルおよび２−、４−もしくは５−ピリミジニルから選択される０〜４個の基で置換され；
Ｒ３は独立してヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、フェノキシまたは−ＮＲ４Ｒ５であり；
各Ｒ４およびＲ５は独立して水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルであり；そして
ｎ＝０−３、
ここでＨＥＴについてはＯＲ２基とアミド部分との間にオルトの関係が存在する］
の化合物またはその製薬学的塩。
【請求項２】
Ｒ２＝Ｈである請求項１の化合物。
【請求項３】
ＨＥＴがピリジルであり、そしてｎ＝０である請求項１または２の化合物。
【請求項４】
式（３）
【化２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびｎは請求項１に定義した通りである］
の構造を有する請求項１の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩。
【請求項５】
Ｒ２＝Ｈである請求項４の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の式（１）または式（２）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩と製薬学的に有効な希釈剤または担体とを組み合わせて含んでなる製薬学的組成物。
【請求項７】
請求項４に記載の式（３）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩と製薬学的に有効な希釈剤または担体とを組み合わせて含んでなる製薬学的組成物。
【請求項８】
ＮＦ−κＢの活性化の阻害に関連する哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置が必要な哺乳動物に有効量の請求項１に記載の式（１）または式（２）の化合物またはそれらの製薬学的に許容され得る塩を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項９】
疾患が癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＦ−κＢの活性化の阻害と関連する哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置が必要な哺乳動物に有効量の請求項４に記載の式（３）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１１】
疾患が癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が癌である請求項９または１１の方法。
【請求項１３】
疾患が糖尿病である請求項９または１１の方法。
【請求項１】
式（１）または式（２）
【化１】
［式中、
ＨＥＴは飽和もしくは不飽和の単−もしくは多−環の炭素環であり、ここで１もしくは複数の環の炭素原子がＮ、Ｓ、ＰもしくはＯで置き換えられ；
各Ｒ１は独立して水素；ＣＦ３；場合によりシアノ、ハロ、ニトロ、ヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル，（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ＯＨ，（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ，ＣＯＲ３，ＮＲ４Ｒ５またはＮＨＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）で置換されてもよいフェニル；シアノ；ハロ；ニトロ；ヒドロキシル；（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；（Ｃ１−Ｃ６）アルキル−ＯＨ；（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ；（Ｃ１−Ｃ６）チオアルコキシ；フェノキシ；ＣＯＲ３；ＮＲ４Ｒ５；ＮＨＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ６）アルキル；またはＳＯ２ＮＲ４Ｒ５であり；
Ｒ２はＨ、Ｒ６、ＣＯＲ６、ＣＯＮＨＲ６、ＣＯＯＲ６、ＣＨ２ＯＣＯＲ６、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）またはＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、あるいはＰ（Ｏ）（ＯＨ）２、Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣＨ２ＯＣＯ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）（ＯＣ１−Ｃ６）アルキル）またはＰ（Ｏ）（ＯＨ）（Ｃ１−Ｃ６）アルキル）のグリコシルもしくは無機塩であり；
Ｒ６はＣ１−Ｃ６アルキル、トリフルオロメチル、（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキル、シクロヘキシルメチルまたはフェニルであり、ここでフェニルはフッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル，（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシおよびフェニルメチルから選択される０〜４個の基で置換され、ここでフェニルメチルはフェニル環で、フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、トリフルオロメチル、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル，（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、２−、３−もしくは４−ピリジニルおよび２−、４−もしくは５−ピリミジニルから選択される０〜４個の基で置換され；
Ｒ３は独立してヒドロキシル、（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ、フェノキシまたは−ＮＲ４Ｒ５であり；
各Ｒ４およびＲ５は独立して水素、（Ｃ１−Ｃ６）アルキルまたは（Ｃ３−Ｃ６）シクロアルキルであり；そして
ｎ＝０−３、
ここでＨＥＴについてはＯＲ２基とアミド部分との間にオルトの関係が存在する］
の化合物またはその製薬学的塩。
【請求項２】
Ｒ２＝Ｈである請求項１の化合物。
【請求項３】
ＨＥＴがピリジルであり、そしてｎ＝０である請求項１または２の化合物。
【請求項４】
式（３）
【化２】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびｎは請求項１に定義した通りである］
の構造を有する請求項１の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩。
【請求項５】
Ｒ２＝Ｈである請求項４の化合物。
【請求項６】
請求項１に記載の式（１）または式（２）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩と製薬学的に有効な希釈剤または担体とを組み合わせて含んでなる製薬学的組成物。
【請求項７】
請求項４に記載の式（３）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩と製薬学的に有効な希釈剤または担体とを組み合わせて含んでなる製薬学的組成物。
【請求項８】
ＮＦ−κＢの活性化の阻害に関連する哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置が必要な哺乳動物に有効量の請求項１に記載の式（１）または式（２）の化合物またはそれらの製薬学的に許容され得る塩を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項９】
疾患が癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＮＦ−κＢの活性化の阻害と関連する哺乳動物の疾患を処置する方法であって、処置が必要な哺乳動物に有効量の請求項４に記載の式（３）の化合物、またはその製薬学的に許容され得る塩を投与することを含んでなる上記方法。
【請求項１１】
疾患が癌、炎症、自己免疫疾患、糖尿病および糖尿病合併症、感染、心血管疾患および虚血性再灌流障害からなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
疾患が癌である請求項９または１１の方法。
【請求項１３】
疾患が糖尿病である請求項９または１１の方法。
【図２】
【図１１】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２０１２−５２１９９８（Ｐ２０１２−５２１９９８Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０２２２９（Ｐ２０１２−５０２２２９）
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８６１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１４６０
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３３６６９）プロフエクタス・バイオサイエンシズ・インコーポレーテツド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２５日（２０１０．３．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２８６１０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１１１４６０
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５１１２３３６６９）プロフエクタス・バイオサイエンシズ・インコーポレーテツド (2)
【Ｆターム（参考）】
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