約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、界面動電的に改変された水性流体の投与を含む、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するための方法を提供する。帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、好ましくは、細胞膜電位および／または伝導性の調節を提供するのに十分な量において、流体中に安定的に構成される。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、メタロプロテイナーゼおよびメタロプロテイナーゼ媒介状態に関し、より具体的には、マトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ媒介状態、ならびにＭＭＰ阻害剤およびＭＭＰ媒介状態の治療に関する。特に好ましい態様は、本明細書に開示される少なくとも１つの界面動電的に生成された流体（ガス富化（例えば、酸素富化）界面動電的に生成された流体を含む）を含む治療組成物を投与することによる、ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ９）の調節（例えば、阻害）に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、共に２００８年１０月２２日に出願の米国特許仮出願第６１／１０７，４８０号および同第６１／１０７，４５３号、ならびに２００８年１０月２４日に出願の米国一般特許出願第１２／２５８，２１０号の優先権の利益を主張するものであり、これらはともに、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
メタロプロテイナーゼは、例えば、非特許文献１に記載されるファミリーおよびサブファミリーに分類されるプロテイナーゼ（酵素）のスーパーファミリーである。メタロプロテイナーゼの例としては、コラゲナーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３）、ゼラチナーゼ（ＭＭＰ２、ＭＭＰ９）、ストロメライシン（ＭＭＰ３、ＭＭＰ１０、ＭＭＰＩＩ）、マトリリシン（ＭＭＰ７）、メタロエラスターゼ（ＭＭＰ１２）、エナメリシン（ＭＭＰ１９）、ＭＴ−ＭＭＰ（ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７）等のマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）；ＴＮＦ変換酵素（ＡＤＡＭ１０およびＴＡＣＥ）等のセクレターゼおよびシェダーゼを含む、レプロリシンもしくはアダマリシンまたはＭＤＣファミリー；プロコラーゲン処理プロテイナーゼ（ＰＣＰ）等の酵素を含む、アスタシンファミリー；ならびにアグリカナーゼ、エンドセリン変換酵素ファミリー、およびアンジオテンシン変換酵素ファミリー等の他のメタロプロテイナーゼが挙げられる。
【０００４】
集合的に、メタロプロテイナーゼは、コラーゲン、プロテオグリカン、およびフィブロネクチン等の幅広いマトリクス基質を開裂することが知られている。メタロプロテイナーゼは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等の生物学的に重要な細胞メディエータの処理または分泌、および低親和性ＩｇＥ受容体ＣＤ２３等の生物学的に重要な膜タンパク質の翻訳後タンパク質分解処理または脱落に関与する（例えば、非特許文献２を参照のこと）。
【０００５】
したがって、当然のことながら、メタロプロテイナーゼは、組織リモデリング（例えば、胚発生、骨形成、月経中の子宮リモデリング、血液脳関門の破壊等）を伴う、多くの生理的疾病プロセスにおいて重要であると考えられる。さらに、１つ以上のメタロプロテイナーゼの活性の阻害は、これらの疾病または状態、例えば：関節の炎症（特に、関節リウマチ、変形性関節炎、および痛風）、胃腸管の炎症（特に、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、および胃炎）、皮膚の炎症（特に、乾癬、湿疹、皮膚炎）等の様々な炎症性およびアレルギー性疾患；腫瘍転移または浸潤；変形性関節炎等の細胞外マトリクスの抑制されない分解に関連する疾病；骨吸収疾病（骨粗しょう症およびパジェット病等）；異常血管形成に関連する疾病；糖尿病に関連するコラーゲンリモデリングの増強、歯周病（歯肉炎等）、角膜潰瘍、皮膚の潰瘍、術後疾患（結腸吻合等）、および真皮創傷治癒；中枢および末梢神経系の脱髄疾患（多発性硬化症等）；アルツハイマー病；再狭窄およびアテローム性動脈硬化症等の心臓血管疾患において観察される細胞外マトリクスリモデリング；喘息；鼻炎；ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）において有効であり得る。
【０００６】
マクロファージエラスターゼまたはメタロエラスターゼとしても知られているＭＭＰ１２は、最初に、マウスにおいてクローン化され（非特許文献３）、１９９５年に同グループにより、ヒトにおいてもクローン化された。ＭＭＰ１２は、活性化マクロファージにおいて優先的に発現され、喫煙者からの肺胞マクロファージから（非特許文献４）、ならびにアテローム性動脈硬化症における泡沫細胞において（非特許文献５）、分泌されることが示された。ＣＯＰＤのマウスモデルは、１日当たり２本、１週間当たり６日での、６ヶ月間のマウスへのたばこの煙の投与に基づく。野生型マウスは、この処理後に肺気腫を発症した。ＭＭＰ１２ノックアウトマウスをこのモデルにおいてテストすると、それらは有意な気腫を発症せず、ＭＭＰ１２がＣＯＰＤ病因において主要な酵素であることを強く示唆している。ＣＯＰＤ（気腫および気管支炎）におけるＭＭＰ１２等のＭＭＰの役割は、非特許文献６において考察される。喫煙は、ヒト頸動脈プラークにおけるマクロファージ浸潤およびマクロファージ由来ＭＭＰ−１２発現を増加させることが、近年発見された（非特許文献７）。
【０００７】
ＭＭＰ９−（ゼラチナーゼＢ；９２ｋＤａ−ＴｙｐｅＩＶコラゲナーゼ；９２ｋＤａゼラチナーゼ）は、１９８９年に、最初に精製され、次いでクローン化および配列決定された分泌タンパク質である（非特許文献８；誤植公開、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（３６）：２２５７０，１９９０）（このプロテアーゼに関する詳細な情報および参考文献の総説については、Ｔ．Ｈ．Ｖｕ ＆ Ｚ．Ｗｅｒｂ（１９９８）（Ｉｎ：Ｍａｔｒｉｘ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，１９９８、編集：Ｗ．Ｃ．Ｐａｒｋｓ ＆ Ｒ．Ｐ．Ｍｅｃｈａｍ，ｐｐ．１１５−１４８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．ＩＳＢＮ０−１２−５４５０９０−７）を参照のこと）。
【０００８】
ＭＭＰ９の発現は通常、栄養膜、破骨細胞、好中球、およびマクロファージを含む、数個の細胞型に制限される（Ｖｕ＆Ｗｅｒｂ、上記を参照）。しかしながら、発現は、成長因子またはサイトカインへの細胞の曝露を含む、いくつかのメディエータにより、これらの同一の細胞または他の細胞型において誘起され得る。これらは、炎症反応の開始にしばしば関与する、同一のメディエータである。他の分泌ＭＭＰと同様に、ＭＭＰ９は、不活性プロ酵素として放出され、それは続いて、酵素的に活性な酵素を形成するように開裂される。インビボでのこの活性化に必要とされるプロテアーゼは知られていない。活性ＭＭＰ９対不活性酵素のバランスは、ＴＩＭＰ−１（メタロプロテイナーゼ‐１組織阻害剤）という自然発生的タンパク質との相互作用により、インビボでさらに調整される。ＴＩＭＰ−１は、ＭＭＰ９のＣ末端領域に結合し、ＭＭＰ９の触媒ドメインの阻害をもたらす。プロＭＭＰ９の誘導性発現、プロから活性ＭＭＰ９の開裂、およびＴＩＭＰ−１の存在のバランスは、局所部位に存在する触媒活性ＭＭＰ９の量を決定するために組み合わされる。タンパク質分解活性ＭＭＰ９は、ゼラチン，エラスチン、ならびに天然ＩＶ型およびＶ型コラーゲを含む、基質を攻撃するが、天然Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカン、またはラミニンに対する活性はない。
【０００９】
ＭＭＰ９の役割が様々な生理学的および病理学的プロセスに関与するデータが増えてきている。生理学的役割は、胚移植の初期段階における子宮上皮を通じた胚栄養膜の浸潤；骨の成長および発達におけるいくつかの役割；ならびに血管系から組織への炎症細胞の移動を含む。
【００１０】
酵素免疫測定法を使用して測定されるＭＭＰ９放出は、他の集団と比較して未治療の喘息患者からの流体およびＡＭ上清中で有意に増強された（非特許文献９）。また、ＭＭＰ９発現の増加が、特定の他の病的状態において観察され、それによって、心筋梗塞等の急性の冠動脈疾患をもたらす、ＣＯＰＤ、関節炎、腫瘍転移、アルツハイマー病、多発性硬化症、およびアテローム性動脈硬化症におけるプラーク破綻等の疾病プロセスにＭＭＰ９が関与していると見なされる（参照により本明細書に組み込まれる、特許文献１も参照のこと）。
【００１１】
近年、ＭＭＰ−９のレベルは、健常な対照対象と比較して、安定している喘息患者において有意に増加し、急性喘息患者においてはより高いことが示されている。ＭＭＰ−９は、気道炎症細胞の浸潤および気道過敏性の誘起において重要な役割を果たし、ＭＭＰ−９が、喘息を誘起および維持するのに重要な役割を有し得ることを示す（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３および非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０７０８７６３７Ａ３号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｎ．Ｍ．Ｈｏｏｐｅｒ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ３５４：１−６，１９９４
【非特許文献２】Ｎ．Ｍ．Ｈｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２１：２６５−２７９，１９９７
【非特許文献３】Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７：４６６４，１９９２
【非特許文献４】Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ，１９９３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８：２３８２４
【非特許文献５】Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３：１０９，１９９８
【非特許文献６】Ａｎｄｅｒｓｏｎ ａｎｄ Ｓｈｉｎａｇａｗａ，１９９９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １（１）：２９−３８
【非特許文献７】Ｍａｔｅｔｚｋｙ Ｓ，Ｆｉｓｈｂｅｉｎ Ｍ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０２：（１８），３６−３９ Ｓｕｐｐｌ．Ｓ，Ｏｃｔ．３１，２０００
【非特許文献８】Ｓ．Ｍ．Ｗｉｌｈｅｌｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４（２９）：１７２１３−１７２２１，１９８９
【非特許文献９】Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ ＆ ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，５：５８３−５９１，１９９７
【非特許文献１０】Ｖｉｇｎｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｕｔｕｍ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９／ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ ｒａｔｉｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｉｒｆｌｏｗ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １５８：１９４５−１９５０，１９９８
【非特許文献１１】Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈａｌｅｄ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０４：３５６−３６３，１９９９
【非特許文献１２】Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｓｔｈｍａ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７２：５５９−５６５，２００５、
【非特許文献１３】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ ｃａｎ ｂｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０８：１０２１−１０２６，２００１
【非特許文献１４】Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＩＣＡＭ−Ｉ ａｎｄ ＶＣＡＭ−Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１１１：１２７８−１２８４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
特定の態様は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体の、それを必要とする哺乳動物への投与を含む、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するための方法を提供する。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される。
【００１５】
特定の方法の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体中で主要な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である。特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造として、流体中に存在する溶解した酸素分子の割合は、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である。特定の態様では、全ての溶解酸素は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造に実質的に存在する。特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を実質的に有する。
【００１６】
特定の方法の態様では、イオン水溶液は、食塩溶液を含む。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、超酸素化である。
【００１７】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子の形態を含む。
【００１８】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への流体の曝露を含む。特定の実施形態では、局在界面動電効果への曝露は、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの曝露を含む。特定の態様では、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への流体の曝露は、流体を生成するために使用されるデバイスの界面動電効果を誘起する構造特性への流体の曝露を含む。
【００１９】
特定の態様では、ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、喘息および慢性閉塞性肺疾患を含むがこれに限定されない、閉塞性気道疾患を含む。特定の態様では、ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、関節リウマチ、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、および多発性硬化症のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、哺乳動物におけるアルツハイマー病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病からなる群から選択される、ＭＭＰ９の継続的または持続的発現および／または活性を特徴とする、末梢または中枢神経系の少なくとも１つの疾病または疾患を含む。
【００２０】
特定の態様では、方法は、併用療法をさらに含み、少なくとも１つの追加の治療剤が患者に投与される。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、少なくとも１つのＭＭＰの追加の阻害剤の投与を含む。特定の態様では、少なくとも１つのＭＭＰは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７，ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−１９、およびＭＭＰ−２０からなる群から選択される。特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤であり、特定の実施形態では、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤は、２つ以上の受容体鎖の構成成分をコード化するＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含む、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、ならびにＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００２１】
特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、標準的な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ピロキシカム、ジクロフェナク；プロピオン酸、ナプロキセン、フルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、およびイブプロフェン；フェナム酸、メフェナム酸、インドメタシン、スリンダク、アパゾン；ピラゾロン、フェニルブタゾン；サリチル酸塩、アスピリン；鎮痛または関節内療法、コルチコステロイド；ヒアルロン酸、ヒアルガン、シンビスク；免疫抑制剤、シクロスポリン、インターフェロン；ＴＮＦ−α阻害剤、エンブレル（登録商標）；低用量のメトトレキサート、レフニミド、ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オウラノフィン、非経口金および経口金からなる群から選択される。
【００２２】
特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、抗鬱剤、セルトラリン、フルオキセチン、パロキセチン；抗パーキンソン病剤；デプレニール、Ｌ−ドーパ、リキップ、ミラテックス；ＭＡＯＢ阻害剤、セレギン、ラサギリン；ＣＯＭＰ阻害剤、トルカポン、タスマー；Ａ−２阻害剤、ドーパミン再取り込み阻害剤、ＮＭＤＡ拮抗剤、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニスト、ニューロン一酸化窒素シンターゼの阻害剤、抗アルツハイマー病剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、メトリホナート、ドネペジル、アリセプト、エクセロン、ＥＮＡ７１３またはリバスチグミン；テトラヒドロアミノアクリジン、タクリン、コグネックス、またはＴＨＡ；ＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２阻害剤、セレコキシブ、セレブレックス、ロフェコキシブ、ビオックス；プロペントフィリン、抗卒中薬、ＮＲ２Ｂ選択的拮抗剤、グリシン部位拮抗剤、および好中球阻害因子（ＮＩＦ）からなるＣＮＳ剤群から選択される。
【００２３】
特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、エストロゲン；選択的エストロゲンモジュレータ、エストロゲン、ラロキシフェン、タモキシフェン、ドロロキシフェン、ラソフォキシフェン、Ａβ１−４０／１−４２の減少をもたらす薬剤、アミロイド凝集阻害剤、セクレターゼ阻害剤；骨粗しょう症薬、ドロロキシフェン、フォソマックス；免疫抑制剤、ｆｋ−５０６、ラパマイシン；抗癌剤、エンドスタチン、アンギオスタチン；細胞毒性薬、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテール、アルカロイド、ビンクリスチン；代謝拮抗剤、メトトレキサート；心臓血管薬、カルシウムチャネル遮断薬；脂質低下薬、スタチン；フィブラート、β遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシン−２受容体拮抗剤、および血小板凝集阻害剤からなる群から選択される。
【００２４】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質もしくは構成成分の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性のうちの少なくとも１つを改変することを含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つを改変することを含む。特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリン等からなる群から選択される少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む。特定の態様では、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、例えば、Ｇタンパク質ａサブユニットと相互作用し、Ｇタンパク質ａサブユニットは、Ｇａ_ｓ、Ｇａ_ｉ、Ｇａ_ｑ、およびＧａ_１２からなる群から選択される少なくとも１つを含み、特定の実施形態では、少なくとも１つのＧタンパク質ａサブユニットは、Ｇａ_ｑである。
【００２５】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、例えば、全細胞伝導性を調節することを含み、全細胞伝導性を調節することは、全細胞伝導性の線形または非線形の電圧依存性寄与のうちの少なくとも１つを調節することを含む。
【００２６】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、多発性硬化症、アルツハイマー病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病からなる群から選択される、少なくとも１つの状態または症状に関連する、細胞内シグナル変換の調節を含む。
【００２７】
特定の方法の態様は、細胞ネットワークまたは層への界面動電流体の投与を含み、その中の細胞間結合の調節を更に含む。特定の実施形態では、細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、細胞ネットワークまたは層は、肺上皮、気管支上皮、および腸上皮からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
【００２８】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。
【００２９】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、例えば、溶媒和電子、および界面動電的に修飾された、または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含み、溶媒和電子、または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、分子酸素により、安定化された溶媒和電子の形態を含む。
【００３０】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する、界面動電的に改変された流体の能力は、密閉された気密性容器内において、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、またはそれ以上の期間持続する。
【００３１】
特定の態様では、界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有のナノ構造中に存在する酸素の量は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。特定の態様では、治療は、局所、吸入、鼻腔内、および静脈内のうちの少なくとも１つによる投与を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】気管支上皮細胞（ＢＥＣ）における本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖｅｒａ ６０およびＳｏｌａｓ）は、それぞれ、約９０％および５０％で、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を低下させる一方で、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果のみあったことを示す。
【図２】本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖｅｒａ ６０およびＳｏｌａｓ）は、それぞれ、約８０％および７０％で、気管支上皮細胞のＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルを阻害する一方で、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果のみあったことを示す。
【図３Ａ】２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、および異なる電圧プロトコルで、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。
【図３Ｂ】２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、および異なる電圧プロトコルで、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。
【図３Ｃ】２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、および異なる電圧プロトコルで、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。
【図４Ａ】図３Ａ〜Ｃに関連する実験に関して、３つの電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、および２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。
【図４Ｂ】図３Ａ〜Ｃに関連する実験に関して、３つの電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、および２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。
【図４Ｃ】図３Ａ〜Ｃに関連する実験に関して、３つの電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、および２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。
【図５Ａ】異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。
【図５Ｂ】異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。
【図５Ｃ】異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。
【図５Ｄ】異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。
【図６Ａ】図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２（ひし形）および４０ｍＭ ＣａＣｌ_２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。
【図６Ｂ】図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２（ひし形）および４０ｍＭ ＣａＣｌ_２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。
【図６Ｃ】図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２（ひし形）および４０ｍＭ ＣａＣｌ_２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。
【図６Ｄ】図５Ａ〜Ｄに関連する実験に関して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２（ひし形）および４０ｍＭ ＣａＣｌ_２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。
【図７Ａ】上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の希釈の効果を評価した、パッチクランプ実験の結果を示す。
【図７Ｂ】上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の希釈の効果を評価した、パッチクランプ実験の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、界面動電的に改変された水性流体の投与を含む、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するための方法を提供する。帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、好ましくは、細胞膜電位および／または伝導性の調節を提供するのに十分な量において、流体中に安定的に構成される。ＭＭＰ−９発現および／または活性の調節または下方制御を含む特定の態様は、本明細書に開示されるような、ＭＭＰ９媒介疾病または状態（例えば、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、多発性硬化症、アルツハイマー病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病）を治療するための有用性を有する。
【００３４】
本明細書で使用される界面動電的に生成された流体を作製するための方法は、すでに記載されており（例えば、ＵＳ第−２００８−０２１９０８８号、ＰＣＴ／ＵＳ第２００７／０８２５７８号を参照されたい）、それらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００３５】
特定の態様は、本明細書に開示されるような、少なくとも１つの界面動電的に生成された流体（ガス富化（例えば、酸素富化）界面動電的に生成された流体を含む）を含む、治療有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ９）媒介疾病または状態を治療するための方法を提供する。
【００３６】
さらなる態様は、本明細書に開示されるような、少なくとも１つの界面動電的に生成された流体（ガス富化（例えば、酸素富化）界面動電的に生成された流体を含む）を含む、治療組成物を投与することを含む、閉塞性気道疾患を治療するための方法を提供する。特定の実施形態では、閉塞性気道疾患は、喘息および慢性閉塞性肺疾患のうちの少なくとも１つを含む。特定の態様は、関節リウマチ、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、および多発性硬化症のうちの少なくとも１つを治療することを含む。
【００３７】
さらなる態様は、心筋梗塞等の急性の冠動脈疾患をもたらす、ＣＯＰＤ、関節炎、腫瘍転移、アルツハイマー病、多発性硬化症、およびアテローム性動脈硬化症におけるプラーク破綻の治療に対して実質的な有用性を有する、新規方法および組成物を提供する。新規方法は、哺乳動物におけるアルツハイマー病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病を含むがこれに限定されない、ＭＭＰ９の継続的または持続的発現および／または活性を特徴とする、末梢または中枢神経系の疾病または疾患を治療するために有用性を有し、本明細書に記載される、治療有効量のＭＭＰ９阻害剤を哺乳動物に投与することを含む。
【００３８】
本発明の特定の態様は、認識機能障害（例えば、認知症、高齢者の認識低下、アルツハイマー病等）の治療に対して実質的な有用性を有する、新規方法および組成物を提供する。好ましくは、本明細書に記載されるようなＭＭＰ−９の阻害剤が使用される。
【００３９】
さらなる態様は、少なくとも１つの他のＭＭＰの追加の阻害剤（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−１９、およびＭＭＰ−２０の阻害剤等）の投与と組み合わせて、本明細書に開示されるような、少なくとも１つの界面動電的に生成された流体（ガス富化（例えば、酸素富化）界面動電的に生成された流体を含む）を含む、治療有効量の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、ＭＭＰ９媒介疾病または状態を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加のマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤は、特徴のある発現または活性の上昇を有する少なくとも１つのＭＭＰを阻害するのに好適である。さらなる実施形態では、少なくとも１つのマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤は、特徴のある発現または活性の上昇を有する少なくとも２つのＭＭＰを阻害するのに好適である。特定の実施形態では、少なくとも１つのマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤は、ＭＭＰ特異的であるか、もしくは特定のＭＭＰに実質的に特異的であるか、または限定された数のＭＭＰ（例えば、１〜２つのＭＭＰ、１〜３つのＭＭＰ、または約１〜約４つのＭＭＰ）を阻害する。特定の実施形態では、少なくとも１つのマトリクスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤は、少なくとも３つ、または少なくとも４つのＭＭＰ（例えば、特徴のある発現または活性の上昇を有する）を阻害する広域ＭＭＰ阻害剤である。
【００４０】
好ましい例示的な実施形態：
特定の態様は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体の、それを必要とする哺乳動物への投与を含む、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するための方法を提供する。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される。
【００４１】
特定の方法の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体中で主要な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である。特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造として、流体中に存在する溶解した酸素分子の割合は、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である。特定の態様では、全ての溶解酸素は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造に実質的に存在する。特定の実施形態では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を実質的に有する。特定の方法の態様では、イオン水溶液は、食塩溶液を含む。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、超酸素化である。特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子の形態を含む。
【００４２】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への流体の曝露を含む。特定の実施形態では、局在界面動電効果への曝露は、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの曝露を含む。特定の態様では、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への流体の曝露は、流体を生成するために使用されるデバイスの界面動電効果を誘起する構造特性への流体の曝露を含む。
【００４３】
特定の態様では、ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、喘息および慢性閉塞性肺疾患を含むがこれに限定されない、閉塞性気道疾患を含む。特定の態様では、ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、関節リウマチ、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、および多発性硬化症のうちの少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、哺乳動物におけるアルツハイマー病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病からなる群から選択される、ＭＭＰ９の継続的または持続的発現および／または活性を特徴とする、末梢または中枢神経系の少なくとも１つの疾病または疾患を含む。
【００４４】
特定の態様では、方法は、併用療法をさらに含み、少なくとも１つの追加の治療剤が患者に投与される。特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、少なくとも１つのＭＭＰの追加の阻害剤の投与を含む。特定の態様では、少なくとも１つのＭＭＰは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７，ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−１９、およびＭＭＰ−２０からなる群から選択される。特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤であり、特定の実施形態では、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤は、２つ以上の受容体鎖の構成成分をコード化するＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含む、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、ならびにＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される。
【００４５】
特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、標準的な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ピロキシカム、ジクロフェナク；プロピオン酸、ナプロキセン、フルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、およびイブプロフェン；フェナム酸、メフェナム酸、インドメタシン、スリンダク、アパゾン；ピラゾロン、フェニルブタゾン；サリチル酸塩、アスピリン；鎮痛または関節内療法、コルチコステロイド；ヒアルロン酸、ヒアルガン、シンビスク；免疫抑制剤、シクロスポリン、インターフェロン；ＴＮＦ−α阻害剤、エンブレル（登録商標）；低用量のメトトレキサート、レフニミド、ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オウラノフィン、非経口金および経口金からなる群から選択される。
【００４６】
特定の実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、抗鬱剤、セルトラリン、フルオキセチン、パロキセチン；抗パーキンソン病剤；デプレニール、Ｌ−ドーパ、リキップ、ミラテックス；ＭＡＯＢ阻害剤、セレギン、ラサギリン；ＣＯＭＰ阻害剤、トルカポン、タスマー；Ａ−２阻害剤、ドーパミン再取り込み阻害剤、ＮＭＤＡ拮抗剤、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニスト、ニューロン一酸化窒素シンターゼの阻害剤、抗アルツハイマー病剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、メトリホナート、ドネペジル、アリセプト、エクセロン、ＥＮＡ７１３またはリバスチグミン；テトラヒドロアミノアクリジン、タクリン、コグネックス、またはＴＨＡ；ＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２阻害剤、セレコキシブ、セレブレックス、ロフェコキシブ、ビオックス；プロペントフィリン、抗卒中薬、ＮＲ２Ｂ選択的拮抗剤、グリシン部位拮抗剤、および好中球阻害因子（ＮＩＦ）からなるＣＮＳ剤群から選択される。
【００４７】
特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、エストロゲン；選択的エストロゲンモジュレータ、エストロゲン、ラロキシフェン、タモキシフェン、ドロロキシフェン、ラソフォキシフェン、Ａβ１−４０／１−４２の減少をもたらす薬剤、アミロイド凝集阻害剤、セクレターゼ阻害剤；骨粗しょう症薬、ドロロキシフェン、フォソマックス；免疫抑制剤、ｆｋ−５０６、ラパマイシン；抗癌剤、エンドスタチン、アンギオスタチン；細胞毒性薬、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテール、アルカロイド、ビンクリスチン；代謝拮抗剤、メトトレキサート；心臓血管薬、カルシウムチャネル遮断薬；脂質低下薬、スタチン；フィブラート、β遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシン−２受容体拮抗剤、および血小板凝集阻害剤からなる群から選択される。
【００４８】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質もしくは構成成分の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性のうちの少なくとも１つを改変することを含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つを改変することを含む。特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリン等からなる群から選択される少なくとも１つを含む。特定の実施形態では、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む。特定の態様では、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、例えば、Ｇタンパク質ａサブユニットと相互作用し、Ｇタンパク質ａサブユニットは、Ｇａ_ｓ、Ｇａ_ｉ、Ｇａ_ｑ、およびＧａ_１２からなる群から選択される少なくとも１つを含み、特定の実施形態では、少なくとも１つのＧタンパク質ａサブユニットは、Ｇａ_ｑである。
【００４９】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、例えば、全細胞伝導性を調節することを含み、全細胞伝導性を調節することは、全細胞伝導性の線形または非線形の電圧依存性寄与のうちの少なくとも１つを調節することを含む。
【００５０】
特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む。特定の方法の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、多発性硬化症、アルツハイマー病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病からなる群から選択される、少なくとも１つの状態または症状に関連する、細胞内シグナル変換の調節を含む。
【００５１】
特定の方法の態様は、細胞ネットワークまたは層への界面動電流体の投与を含み、その中の細胞間結合の調節を更に含む。特定の実施形態では、細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つを含む。特定の態様では、細胞ネットワークまたは層は、肺上皮、気管支上皮、および腸上皮からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
【００５２】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。
【００５３】
特定の方法の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、例えば、溶媒和電子、および界面動電的に修飾された、または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含み、溶媒和電子、または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、分子酸素により、安定化された溶媒和電子の形態を含む。
【００５４】
特定の態様では、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する、界面動電的に改変された流体の能力は、密閉された気密性容器内において、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、またはそれ以上の期間持続する。
【００５５】
特定の態様では、界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有のナノ構造中に存在する酸素の量は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。特定の態様では、治療は、局所、吸入、鼻腔内、および静脈内のうちの少なくとも１つによる投与を含む。
【００５６】
界面動電的に生成された流体：
本明細書で使用する「界面動電的に生成された流体」とは、本明細書に詳細される、例示的な混合デバイスにより、本明細書の実施例のために生成された出願者の本発明の界面動電的に生成された流体を指す（第ＵＳ２００８０２１９００８８号および国際公開第２００８／０５２１４３号も参照のこと、双方は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に開示され、示されるデータにより示されるように、界面動電流体は、先行技術に関連する含酸素非界面動電流体（例えば、加圧ポットの含酸素流体等）を含む、先行技術に関連する非界面動電流体である、新規の根本的に異なる流体を示す。本明細書の様々な態様に開示されるように、界面動電的に生成された流体は、以下のものを含むが、これらに限定されない、独特かつ新規の物理的および生物学的特性を有する。
【００５７】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む。
【００５８】
特定の態様では、界面動電的に生成された流体とは、本明細書に記載される、デバイス機能局在効果等の流体力学的に誘起された、局在（例えば、全流体容量に対して不均一）界面動電効果（例えば、電圧／電流パルス）の存在下で生成される流体を指す。特定の態様では、前記流体力学的に誘起された、局在界面動電効果は、本明細書に開示され、論じられるように、表面に関連した二重層および／または荷電電流効果と組み合わせる。
【００５９】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、その中に溶解されるレポーター溶質（例えば、トレハロース）の^１３Ｃ−ＮＭＲ線幅を調節するのに適している。ＮＭＲ線幅効果は、特定の実施例において、本明細書に記載される、例えば、試験流体において溶質の「回転」を測定するための間接法である。
【００６０】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、および−１．３６Ｖのうちのいずれか１つでの独特の矩形波ボルタンメトリーのピーク差異；−０．９ボルトでのポーラログラフピーク；ならびに−０．１９および−０．３ボルトでの、ポーラログラフピークの不在のうちの少なくとも１つを特徴とし、これらは、特定の実施例において、本明細書に開示されるように、界面動電的に生成された流体に対して特有である。
【００６１】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞膜伝導性（例えば、本明細書に開示されるパッチクランプ試験において測定されるように、全細胞伝導性の電位依存性寄与）を改変するのに適している。
【００６２】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの溶解酸素の量で存在する。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、大気圧で、またはほぼ大気中の酸素レベルで、溶解酸素の１５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満を有する。
【００６３】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、約８ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍの量で存在し、この場合、場合により、本明細書で、「Ｓｏｌａｓ」と称される。
【００６４】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子（例えば、分子酸素により安定化された）、ならびに界面動電的に修飾された、および／または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含み、ある実施形態では、溶媒和電子、および／または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。
【００６５】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル変換の調節を提供するのに十分な細胞膜構造または機能を改変する（例えば、膜結合タンパク質の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性を改変する）のに適しており、特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、ＴＳＬＰ受容体、β２アドレナリン受容体、ブラジキニン受容体等）、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある態様では、影響を受けたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質ａサブユニット（例えば、Ｇａ_ｓ、Ｇａ_ｉ、Ｇａ_ｑ、およびＧａ_１２）と相互作用する。
【００６６】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル変換を調節するのに適しており、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節（例えば、ホスホリパーゼＣ活性の調節、またはアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節）を含む。
【００６７】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書で記載される、様々な生物学的活性（例えば、サイトカイン、受容体、酵素および他のタンパク質、ならびに細胞内シグナル経路の調節）を特徴とする。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書に示されるように、アルブテロールおよびブデソニドとの相乗効果を示す。
【００６８】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）におけるＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を低下させる。
【００６９】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）のＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルを阻害する。
【００７０】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の生物学的効果は、本明細書に示されるように、β遮断薬、ＧＰＣＲ遮断薬、およびカルシウムチャネル遮断薬は、（例えば、制御性Ｔ細胞機能における）界面動電的に改変された水性流体の活性に影響を及ぼすことを示す、ジフテリア毒素により阻害される。
【００７１】
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の物理的および生物学的効果（例えば、細胞内シグナル変換の調整を提供するのに十分な細胞膜構造または機能を改変する能力）は、密閉された容器内（例えば、密閉された気密性容器内）において、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはそれ以上の期間持続する。
【００７２】
したがって、更なる態様は、前記界面動電的に生成された溶液および界面動電的に改変された含酸素流体または溶液を生産する方法を提供し、方法には、相対運動において、２つの離間した表面間で流体物質の流れを提供し、それらの間に混合容量を画定することであって、混合容量内およびそれを通して流動流体物質の単一パスの滞留時間は、０．０６秒以上、または０．１秒以上である、ことと、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、もしくは少なくとも６０ｐｐｍの酸素を物質に溶解し、流体または溶液を界面動電的に改変するのに適する条件下で、混合容量内で流動流体物質に酸素（Ｏ_２）を導入することと、を含む。ある態様では、酸素は、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満において、物質に注入される。特定の実施形態では、表面積の容量に対する比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００７３】
なお更なる態様は、界面動電的に改変された含酸素水性流体または溶液を生産する方法を提供し、方法には、２つの離間した表面間で流体物質の流れを提供し、それらの間に混合容量を画定することと、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満において、物質に、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、もしくは少なくとも６０ｐｐｍの酸素を注入するのに適する条件下で、混合容量内で流動流体に酸素を導入することと、を含む。ある態様では、混合容量内で流動流体物質の滞留時間は、０．０６秒以上、または０．１秒以上である。特定の実施形態では、表面積の容量に対する比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
【００７４】
特定の態様では、投与された本発明の界面動電的に改変された流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む。
【００７５】
ある実施形態では、界面動電的に改変された流体は、超酸素化（例えば、それぞれ、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの溶解酸素を含む、ＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０、およびＲＮＳ−６０）である。特定の実施形態では、界面動電的に改変された流体は、非超酸素化（例えば、１０ｐｐｍ（例えば、標準的食塩水中の環境レベルの溶解酸素）を含む、ＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓ）である。ある態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の塩分、中性、ｐＨ等は、流体の界面動電産生時に確定され、滅菌流体は、適切な経路により投与される。代替として、流体の塩分、中性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つは、流体の投与前に、投与経路に生理学的に適合するように、適切に調整される（例えば、滅菌食塩水または適切な希釈剤を用いて）。好ましくは、流体の塩分、中性、ｐＨ等のうちの少なくとも１つを調整するために使用される希釈剤および／または食塩溶液および／または緩衝組成物はまた、界面動電流体である、またはそうでなければ、相溶性である。
【００７６】
特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、食塩（例えば、任意の好適なアニオン／対イオン構成成分とともに、１つ以上の溶解塩、例えば、アルカリ金属塩（Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ等）、アルカリ土類塩（例えば、Ｍｇ、Ｃａ）等、遷移金属塩（例えば、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ等））を含む。特定の態様は、混合塩界面動電流体（例えば、様々な組み合わせおよび濃度でのＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ等）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、標準食塩水（例えば、約０．９％ ＮａＣｌまたは約０．１５Ｍ ＮａＣｌ）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、少なくとも０．０００２Ｍ、少なくとも０．０００３Ｍ、少なくとも０．００１Ｍ、少なくとも０．００５Ｍ、少なくとも０．０１Ｍ、少なくとも０．０１５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．１５Ｍ、または少なくとも０．２Ｍの濃度で、食塩を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の伝導性は、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも４０μＳ／ｃｍ、少なくとも８０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１５０μＳ／ｃｍ、少なくとも２００μＳ／ｃｍ、少なくとも３００μＳ／ｃｍ、または少なくとも５００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１５０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも２００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも３００ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも５００ｍＳ／ｃｍである。特定の態様では、本明細書に開示される、生物活性塩安定化ナノ構造（例えば、塩安定化された酸素含有のナノ構造）の形成を可能にするという条件で、本発明の界面動電的に改変された流体を調製するために、任意の塩が使用されてもよい。
【００７７】
特定の態様に従って、帯電安定化したガス含有ナノ構造を含む本発明の流体組成物の生物学的効果は、例えば、上記のように、流体のイオン構成成分を改変することによって、および／または流体のガス構成成分を改変することによって、調整（例えば、増加、減少、同調等）することができる。好ましい態様では、本発明の界面動電流体を調製するために、酸素が使用される。さらなる態様では、窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、水素、およびキセノンから選択される少なくとも１つの他のガスとともに、酸素の混合物が使用される。
【００７８】
例示的な関連した分子間相互作用：
通常、量子的特性は、１０^−１０メートル未満の素粒子に属すると考えられ、一方、日常生活の巨視的世界は、ニュートンの運動の法則に従い、素粒子が運動するという点において、古典的であると称される。
【００７９】
最近、分子は、希釈と共に大きさが増加するクラスターを形成するように記載されている。これらのクラスターは、直径において、数マイクロメートルを測定し、希釈と共に非線形に大きさが増加することが報告されている。直径で１００ナノメートルを測定する量子のコヒーレントドメインが、純水中に発生すると仮定され、コヒーレントドメインにおける水分子の集団振動が、最終的に、電磁場変動に固定される相になり得、水中で安定振動を提供し、水の集合構造を変化させる水中の溶解物質に特異的な長続きするコヒーレント振動の励起の形態において、「記憶」の一形態を提供し、これは、同様に、発達する特異的なコヒーレント振動を決定し得る。これらの振動は、連結する磁場相により安定化される場合、希釈する際の水は、更に、「種（ｓｅｅｄ）」コヒーレント振動を運び得る。分子のクラスターの大きさが増加すると、その電磁的な特徴が、対応して増幅され、水により運ばれるコヒーレント振動を増強する。
【００８０】
溶解分子のクラスターサイズの変化、および水の詳細な微視的構造にもかかわらず、コヒーレント振動の特異性は、なお、存在し得る。水の特性の変化を考慮するための１つのモデルは、結晶化に関与する考慮に基づいている。
【００８１】
ナノスケールケージを形成する、簡易プロトン化水クラスターは、出願者の以前の特許出願である国際公開第２００９／０５５７２９号に示される。プロトン化水クラスターは、一般に、Ｈ^＋（Ｈ_２０）_ｎの形態をとる。幾つかのプロトン化水クラスターは、電離層等に自然発生する。任意の特定の理論に拘束されるわけではないが、特定の態様に従って、水クラスターまたは構造の他の型（クラスター、ナノケージ等）が可能であり、これには、本発明の出力物質に与えられる、酸素および安定化した電子を含む構造が含まれる。酸素原子は、得られる構造に取り込まれ得る。セミ結合ナノケージの化学反応は、酸素および／または安定化した電子を、長期間、溶解したままにすることが可能である。医薬化合物等の他の原子または分子は、徐放目的のためにケージされ得る。溶液物質および溶解化合物の特異的化学反応は、これらの物質の相互作用により異なる。
【００８２】
混合デバイスにより処理された流体は、クラスター構造において流体の分析と一致する異なる構造特性を示すと、実験を介してすでに示されている。例えば、国際公開第２００９／０５５７２９号を参照のこと。
【００８３】
帯電安定化したナノ構造（例えば、帯電安定化した酸素含有のナノ構造）：
本出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号の「二重層効果」、「滞留時間」、「注入速度」、「気泡サイズ測定」においてすでに記載されるように、界面動電混合デバイスは、複合体と第１の物質および第２の物質の独特の、非線形流体動的相互作用、本明細書に記載される、新規の界面動電効果を提供する効果的に膨大な表面積（デバイスの面積および１００ｎｍ未満の例外的に小さい気泡の面積を含む）と接触して混合する複合体を提供する、動的乱流をおよそミリ秒で作成する。また、絶縁回転子および固定子を含む、特別に設計された混合デバイスを用いて、機能局在界面動電効果（電圧／電流）を示した。
【００８４】
当該技術分野においてよく認識されるように、電荷再分配および／または溶媒和電子は、水溶液中で、極めて不安定であることが知られている。特定の態様によれば、出願の界面動電効果（例えば、特定の態様では、溶媒和電子を含む、電荷再分配）は、出力物質（例えば、食塩溶液、イオン溶液）内で、驚くほど安定化される。実際には、本明細書に記載される、本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ）の特性および生物活性の安定性は、気密性容器内において、数ヶ月間、維持され得、本発明の溶液の特性および活性を生成する、および／または維持する、および／または媒介するように役立てることに、溶解ガス（例えば、酸素）の関与を示す。有意に、電荷再分配および／または溶媒和電子は、流体により生細胞（例えば、哺乳類細胞）と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、本発明の界面動電イオン水性流体中に安定的に構成される（例えば、国際公開第２００９／０５５７２９号からの細胞パッチクランプの実施例２３を参照のこと、および本明細書に開示されるように）。
【００８５】
本発明の界面動電流体（例えば、界面動電食塩溶液）の安定性および生物学的適合性を説明するために、「分子間相互作用」の項において本明細書で記載されるように、出願者は、水分子と水中に溶解された物質（例えば、酸素）の分子との間の相互作用が、水の集合構造を変化させ、ナノスケールケージクラスターを提供することが提案され、これには、本発明の出力物質に与えられる、酸素および／または安定化した電子を含むナノ構造が含まれる。機構に拘束されるわけではないが、特定の態様では、ナノ構造の構造は、それらが、溶解ガス（例えば、酸素）を（少なくとも、形成および／またはおよび／または安定性および／または生物活性のために）含む；細胞膜もしくはその関連した構成要素と接触した際に、界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ食塩流体）が、電荷および／または電荷効果を調節する（例えば、与えるまたは受容する）のを可能にする；ならびに、特定の態様では、生物学的に関連した形態において、溶媒和電子の安定化を提供する（例えば、運ぶ、持つ、捕獲する）。
【００８６】
特定の態様によれば、本開示により支持されるように、イオンまたは食塩（例えば、標準食塩水、ＮａＣｌ）溶液において、本発明のナノ構造は、帯電安定化した水和殻内で、少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を含み得る、帯電安定化したナノ構造（例えば、平均直径１００ｎｍ未満）を含む。追加の態様によれば、帯電安定化した水和殻は、少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を持つケージまたは空隙を含み得る。更なる態様によれば、好適な帯電安定化した水和殻の供給によって、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、溶媒和電子（例えば、安定化した溶媒和電子）を更に含み得る。
【００８７】
機構または特定の理論に拘束されるわけではないが、この優先日後、周囲（大気）気体と平衡状態にある水性液体中のイオンにより安定化された帯電安定化超微粒気泡が、提案されている（Ｂｕｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，１０４：４８６−４９８，２００７；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の態様によれば、出願者の新規の界面動電流体は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の新規の生物学的活性形態を含み、このような構造の新規の配列、クラスター、または会合を更に含み得る。
【００８８】
帯電安定化した超微粒気泡モデルによれば、水構造の短距離分子秩序は、ガス分子の存在により破壊され（例えば、非吸着イオンと初期に複合した溶解ガス分子は、短距離秩序の欠陥をもたらす）、これは、イオン性液滴の濃縮を提供し、欠陥は、水分子の第１および第２の配位圏により取り囲まれ、配位圏において、それぞれ、６および１２の空孔を占める、吸着イオン（例えば、電気二重層を形成するためのＮａ^＋イオンの「スクリーニングシェル（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｈｅｌｌ）」の捕捉）および非吸着イオン（例えば、第２の配位圏を占めるＣｌ⁻イオン）により代替的に充填される。不飽和イオン溶液（例えば、不飽和食塩溶液）において、この水和した「細胞核」は、第１および第２の配位圏が、それぞれ、６つの吸着イオンおよび５つの非吸着イオンにより充填されるまで、安定した状態を保ち、次いで、ガス分子を含有する内部空隙を生成するクーロン爆発を受け、吸着イオン（例えば、Ｎａ^＋イオン）は、得られる空隙の表面に吸着され、一方、非吸着イオン（またはそれらの幾つかの部分）は、溶液に拡散する（Ｂｕｎｋｉｎら、上記を参照）。このモデルにおいて、ナノ構造における空隙は、その表面に吸着されたイオン（例えば、Ｎａ^＋イオン）間でのクーロン爆発により崩壊されない。空隙含有のナノ構造の安定性は、空隙／気泡表面への同電荷との溶解イオンの選択的吸着、および溶解ガスと気泡内部のガスとの間の拡散平衡によるものであると仮定され、負の静電圧（得られる電気二重層により与えられる外部からの静電圧）は、界面張力に対して安定補償を提供し、気泡内部のガス圧力は、周囲圧力により均衡を保つ。モデルによれば、このような超微粒気泡の形成は、イオン構成成分を必要とし、ある態様では、粒子間の衝突媒介した会合は、より大きな秩序クラスター（配列）の形成を提供し得る（同上）。
【００８９】
帯電安定化した超微粒気泡モデルは、粒子が、ガス超微粒であり得ることを示唆するが、周囲大気と平衡状態にあるイオン溶液中のこのような構造の自然形成のみ企図し、酸素が、このような構造を形成することができるかどうかに関して、特性化されておらず、かつ未特定のままであり、同様に、溶媒和電子が、このような構造により会合および／または安定化され得るかどうかに関しても、未特定のままである。
【００９０】
特定の態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む本発明の界面動電流体は、新規であり、超微粒気泡モデルに従って、仮定非界面動電、大気の帯電安定化超微粒気泡構造とは基本的には異なる。注目すべきは、対照食塩溶液は、本明細書に開示される生物学的特性を持たないが、その一方で、出願者の帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の新規の生物学的活性形態を提供するという事実に、少なくとも一部分において由来する、本結論は、避けられない状態である。
【００９１】
本発明の特定の態様によれば、出願者の新規の界面動電デバイスおよび方法は、大気と平衡状態にあるイオン流体、またはいずれの非界面動電的に生成された流体中で自発的に発生し得る、または発生し得ない、任意の量を超えて、かなりの量の帯電安定化したナノ構造を含む、新規の界面動電的に改変された流体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む。追加の態様では、帯電安定化したナノ構造は、全て、もしくは実質的に全ての帯電安定化した酸素含有のナノ構造である、または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、界面動電流体中で主要な帯電安定化したガス含有のナノ構造種である。
【００９２】
なお更なる態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、溶媒和電子を含む、または持ち得、それによって、新規の安定化した溶媒和電子担体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、電極の新型（または逆電極）を提供し、単一の有機配位カチオンを有する従来の溶質電極と対照的に、むしろ、空隙または酸素原子を含有する空隙周辺に安定的に配列された複数のカチオンを有し、配列されたナトリウムイオンは、有機分子によってよりはむしろ、水の水和殻によって配位される。特定の態様によれば、溶媒和電子は、水分子の水和殻により収容され得る、または好ましくは、全てのカチオンにわたって分布するナノ構造の空隙内で収容され得る。ある態様では、本発明のナノ構造は、複数の配列したナトリウムカチオンにわたって溶媒和電子（一連のナトリウム原子および少なくとも１つの酸素原子にわたって分布する溶媒和電子）の分布／安定化を提供するだけでなく、空隙中の閉じ込め（ｃａｇｅｄ）酸素分子と溶媒和電子の会合または部分会合を提供することにより、溶液中の新規の「スーパー電極」を提供する。したがって、特定の態様によれば、本発明の界面動電流体と関連して現在開示される、「溶媒和電子」は、水分子による直接水和を含む従来のモデルにおいて溶媒和され得ない。代替として、乾燥電極塩を用いた限定された例では、本発明の界面動電流体中の溶媒和電子は、水溶液中の高度な秩序配列を安定化させるために、「格子接着（ｌａｔｔｉｃｅ ｇｌｕｅ）」を提供するように複数の帯電安定化したナノ構造にわたって分布され得る。
【００９３】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用することが可能である。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用することが可能である。
【００９４】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、帯電および／または帯電効果提供者（送達）として、ならびに／または帯電および／または帯電効果受容者として、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用する。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、帯電および／または帯電効果提供者として、ならびに／または帯電および／または帯電効果受容者として、細胞膜と相互作用する。
【００９５】
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、本発明の界面動電流体の観察された安定性および生物学的特性と一致し、かつ説明し、イオン水溶液（例えば、食塩溶液、ＮａＣｌ等）中の安定化した溶媒和電子を提供する、新規の電極（または逆電極）を更に提供する。
【００９６】
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノバブルを実質的に含み、その形態をとる、またはそれを発生させることができる。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有クラスターは、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の相対的に大きい配列、および／または帯電安定化した酸素含有ナノバブルもしくはそれらの配列の形成を提供する。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、疎水性表面と接触した際に、疎水性ナノバブルの形成を提供することができる。
【００９７】
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、実質的に、少なくとも１つの酸素分子を含む。ある態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、実質的に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、またはそれ以上の酸素分子を含む。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、約２０ｎｍ×１．５ｎｍのナノバブル（例えば、疎水性ナノバブル）を含む、または発生し、約１２個の酸素分子（例えば、酸素分子の大きさ（約０．３ｎｍ×０．４ｎｍ）、理想気体の仮定、およびｎ＝ＰＶ／ＲＴの適用に基づき、ここで、Ｐ＝１ａｔｍ、Ｒ＝０．０８２□０５７□Ｌ．ａｔｍ／ｍｏｌ．Ｋ；Ｔ＝２９５Ｋ；Ｖ＝ｐｒ^２ｈ＝４．７×１０^−２２Ｌ、ここで、ｒ＝１０×１０^−９ｍ、ｈ＝１．５×１０^−９ｍ、およびｎ＝１．９５×１０^−２２モル）を含む。
【００９８】
ある態様では、イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、このようなナノ構造、またはそれらの配列にある流体中に存在する、酸素分子の割合は、０．１％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である。好ましくは、この割合は、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、または約２０％以上である。追加の態様では、イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の実質的な大きさ、またはそれらの配列は、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、および１ｎｍ未満からなる群から選択される大きさである。好ましくは、この大きさは、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満である。
【００９９】
ある態様では、本発明の界面動電流体は、溶媒和電子を含む。更なる態様では、本発明の界面動電流体は、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列を含み、これらは、溶媒和電子、および特異な電荷分布（極性、対称、非対称の電荷分布）のうちの少なくとも１つを含む。ある態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列は、常磁性を有する。
【０１００】
対照的に、本発明の界面動電流体に関連して、対照加圧ポット含酸素流体（非界面動電流体）等は、このような界面動電的に生成された帯電安定化した生物学的活性ナノ構造および／または生物学的活性帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列を含まず、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調整が可能である。
【０１０１】
ガス富化流体を生成するシステム
現在開示されるシステムおよび方法は、最小の受動的損失を伴う高濃度で、ガス（例えば、酸素）を安定的に富化させることが可能である。このシステムおよび方法は、多種多様の流体に、高い割合で、多種多様のガスを富化するために効果的に使用され得る。例示のみとして、室温で、一般に、溶解酸素の約２〜３ｐｐｍ（１００万分の１）のレベルを有する、脱イオン水は、開示されたシステムおよび／または方法を用いて、少なくとも約５ｐｐｍ、少なくとも約１０ｐｐｍ、少なくとも約１５ｐｐｍ、少なくとも約２０ｐｐｍ、少なくとも約２５ｐｐｍ、少なくとも約３０ｐｐｍ、少なくとも約３５ｐｐｍ、少なくとも約４０ｐｐｍ、少なくとも約４５ｐｐｍ、少なくとも約５０ｐｐｍ、少なくとも約５５ｐｐｍ、少なくとも約６０ｐｐｍ、少なくとも約６５ｐｐｍ、少なくとも約７０ｐｐｍ、少なくとも約７５ｐｐｍ、少なくとも約８０ｐｐｍ、少なくとも約８５ｐｐｍ、少なくとも約９０ｐｐｍ、少なくとも約９５ｐｐｍ、少なくとも約１００ｐｐｍ、またはいずれかの値以上もしくはそれらの間の範囲の溶解酸素のレベルを達成することができる。特定の例示的な実施形態に従って、酸素富化水は、溶解酸素の約３０〜６０ｐｐｍのレベルで生成され得る。
【０１０２】
表１は、酸素富化食塩溶液（表１）で処置された治癒創傷、および本発明のガス富化酸素富化食塩溶液のサンプルにおいて得られた、様々な分圧測定を示す。
【０１０３】
【表１】

ＭＭＰ−９媒介状態
ＭＭＰ−９は、いくつかの種類の癌（例えば、乳癌、胃癌、子宮内膜癌、膠芽腫、および原発性中枢神経系リンパ腫（ＰＣＮＳＬ））、心臓血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症および再狭窄）、精神神経疾患（例えば、統合失調症および双極性疾患）、肺疾患（例えば、喘息および慢性気管支炎）、神経炎症性変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病としても知られる）、および糖尿病性網膜症）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、エリテマトーデス、および関節リウマチ）、ならびに神経系関連疾患および状態（例えば、哺乳動物における脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、片頭痛、脳アミロイド血管症、ＨＩＶ関連認知症（エイズ）、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病）を含むがこれに限定されない、多くの種類の疾病、疾患、および／または状態に関与すると考えられる。
【０１０４】
兆候
創傷治癒。ＭＭＰ−９は、ヌードマウスにおける無瘢痕創傷治癒に関与することが示されている（Ｍａｎｕｅｌ ａｎｄ Ｇａｗｒｏｎｓｋａ−Ｋｏｚａｋ，Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２５：５０５−５１４，２００６）。具体的に、ＭａｎｕｅｌおよびＧａｗｒｏｎｓｋａ−Ｋｏｚａｋは、損傷後の皮膚組織が、創傷治癒のリモデリング相中に、野生型マウスと比較して、高レベルのＭＭＰ−９ ｍＲＮＡおよびタンパク質を有することを示した。別の試験は、ＭＭＰ−９が創傷後のヒト口腔粘膜において高度に発現されたことを発見した。創傷治癒は、ケラチン生成細胞移動および肉芽組織リモデリングを必要とするため、試験は、したがって、創傷治癒において、ＭＭＰ−９がケラチン生成細胞移動および肉芽組織リモデリングに関与することを示した（Ｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ．７０：１７６−８２，１９９４）。これらの結果は、ＭＭＰ−９が創傷治癒において重要な役割を果たすことを示す。しかしながら、より近年の試験は、少なくとも部分的長期の炎症の理由から、糖尿病患者からの潰瘍における不十分な創傷治癒をもたらしたことを示した（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ，３２：１１７−１１９，２００９）。この結果は、ＭＭＰ−９が創傷治癒のリモデリング相中に必要である一方で、潰瘍の十分な治癒を阻害することを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、創傷および同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０５】
癌。近年の総説は、異なる癌におけるＭＭＰ−９の役割を説明する（Ｒｙｂａｋｏｗｓｋｉ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２００９，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ９０４８３６，７ ｐａｇｅｓ）。より具体的には、総説は、ＭＭＰ−９ ｍＲＮＡの発現を増加させる遺伝子の突然変異が、いくつかの種類の癌のリスクの増加、ならびに腫瘍のより重度の進行および／または転移のより大きい動力学にどのように頻繁に関連するのかを考察する。さらに、いくつかの試験は、この特定の遺伝子の突然変異が悪性腫瘍、腫瘍の成長、ならびに結腸直腸癌、乳癌、胃癌、および膀胱癌におけるリンパ節転移の重症度に関連したことを示している。さらに、正常な胃粘膜と比較した胃癌からの腫瘍におけるＭＭＰ−９レベルを検査した近年の試験は、癌が、有意に増加したレベルのＭＭＰ−９タンパク質を有したこと、および増加が、患者の悪化した生存に有意に関連したことを示した（Ｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，４：１２７−１２７，２００６）。別の試験は、ＭＭＰ−９ ｍＲＮＡおよびＭＭＰ−９活性が正常な脳よりも神経膠腫においてより高く、かつ腫瘍の重症度により強く関連していたことを示した（Ｆｏｒｓｙｔｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７９：１８２８−１８３５，１９９９）。これらの試験は、ＭＭＰ−９が多くの種類の癌の病因において重要な役割を果たすことを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、特定の癌（例えば、結腸直腸癌、乳癌、胃癌、神経膠腫、および膀胱癌）および同様の状態を治療し、リンパ節転移を制限し、癌の状態に関連する合併症を緩和するための実質的な有用性を有する。
【０１０６】
肺疾患（例えば、喘息および慢性気管支炎）。近年、ＭＭＰ−９のレベルは、健常な対照対象と比較して、安定している喘息患者において有意に増加し、急性喘息患者においてはより高いことが示されている。ＭＭＰ−９は、気道炎症細胞の浸潤および気道過敏性の誘起において重要な役割を果たし、ＭＭＰ−９が、喘息を誘起および維持するのに重要な役割を有し得ることを示す（Ｖｉｇｎｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｕｔｕｍ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９／ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ ｒａｔｉｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｉｒｆｌｏｗ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １５８：１９４５−１９５０，１９９８、Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈａｌｅｄ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０４：３５６−３６３，１９９９、Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｓｔｈｍａ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７２：５５９−５６５，２００５、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ ｃａｎ ｂｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０８：１０２１−１０２６，２００１、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＩＣＡＭ−Ｉ ａｎｄ ＶＣＡＭ−Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；ｌ ｌ ｌ：１２７８-１２８４）。さらに、近年の試験は、ＭＭＰ−９を使用した肺尖部治療が、１）密着結合に見られるタンパク質の免疫染色の減少、および２）ウイルスによる感染効率の増加（例えば、上皮の側底面へのウイルスのアクセス）をもたらしたことを示し、それらの両方は、バリア機能の崩壊を示す（Ｖｅｒｍｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｌｕｎｇ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ，２９６：Ｌ７５１−Ｌ７６２，２００９）。これらの試験は、ＭＭＰ−９が肺疾患（例えば、喘息および慢性気管支炎）の病因において重要な役割を果たすことを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、肺疾患（例えば、喘息および慢性気管支炎）ならびに同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０７】
心臓血管疾患。近年の総説は、心臓血管疾患（例えば、ＣＨＤ、アテローム性動脈硬化症、および高血圧）におけるＭＭＰ−９の役割を説明する（Ｒｙｂａｋｏｗｓｋｉ，２００９）。より具体的には、総説は、ＭＭＰ−９ ｍＲＮＡの発現を増加させる遺伝子の突然変異が、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）の進行および死亡率の増加、アテローム性動脈硬化症の増加、ならびに高血圧の進行の増加にどのように関連するのかを考察する。さらなる試験では、より高いＭＭＰ−９と冠動脈拡張症、より高いＭＭＰ−９と肥大型心筋症、およびより高いＭＭＰ−９と高血圧患者との間の相関関係が見られた。これらの試験は、ＭＭＰ−９が心臓血管疾患（例えば、ＣＨＤ、アテローム性動脈硬化症、および高血圧）の病因において重要な役割を果たすことを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、心臓血管疾患（例えば、ＣＨＤ、アテローム性動脈硬化症、および高血圧）ならびに同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０８】
精神神経疾患。近年の総説は、精神神経疾患（例えば、統合失調症および双極性気分障害）におけるＭＭＰ−９の役割を説明する（Ｒｙｂａｋｏｗｓｋｉ．，２００９）。より具体的には、再総説は、双極性気分障害を有する患者が、健常な対照対象と比較して、ＭＭＰ−９ ｍＲＮＡの発現を増加させる遺伝子の突然変異の有意な有病率をどのように有したのかを考察する。しかしながら、統合失調症患者は、正常患者と比較して、ＭＭＰ−９ ｍＲＮＡの発現を増加させる遺伝子の突然変異の有意に低い関連を示した。これらの試験は、ＭＭＰ−９が精神神経疾患（例えば、統合失調症および双極性気分障害）において相関的な役割を有することを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、精神神経疾患（例えば、統合失調症および双極性気分障害）ならびに同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１０９】
神経炎症性変性疾患。数年にわたり、ＭＭＰ−９は、アルツハイマー病およびＡＬＳ等の疾病の病因に関与すると見なされてきた。ＭＭＰ−９の発現の増加はまた、死後アルツハイマー病およびＡＬＳ脳組織において報告されている（Ｌｏｒｅｎｚｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．４３：１９１−６，２００３）。Ｌｏｒｅｎｚｌらはまた、アルツハイマー病患者における血漿中で循環するＭＭＰ−９のレベルの増加を報告した。興味深いことに、近年の試験は、ＭＭＰ−９が綿密に凝集したアミロイド−β原線維を分解することができ、かつアミロイドを含んだ脳からのプラークの継続しているクリアランスに寄与し得ることを示した（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８１：２４５６６−７４，２００６）。別の近年の試験は、対照と比較して、死後ハンチントン病患者サンプルの大脳皮質および小脳において、ＭＭＰ−９の発現の増加を示した（Ｓｉｌｖｅｒｓｔｒｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０：１０９８−１１０３，２００９）。これらの試験は、ＭＭＰ−９が神経炎症性変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、およびＡＬＳ）において重要な役割を有することを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、神経炎症性変性疾患（例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、およびＡＬＳ）ならびに同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１１０】
ＨＩＶ関連認知症（エイズ）。ＭＭＰ−９は、細胞外マトリクスの分解に関わり、血液脳関門の力の低下をもたらし、それは、ＭＭＰ−９があまりに活性である場合、血液脳関門機能障害をもたらし得る。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、ＭＭＰ−９の産生を有意に下方制御し（本明細書において以下を参照のこと）、それにより、血液脳関門の回復力を増加させ、それにより、脳のＨＩＶ感染およびその後の認知症を低減することができる。
【０１１１】
自己免疫疾患。数年にわたって、試験は、多発性硬化症、ＳＬＥ、および関節リウマチを含むがこれに限定されない、多くの自己免疫疾患からの体液におけるＭＭＰ−９の存在または存在の増加を示している。近年の総説は、多発性硬化症、ＳＬＥ、および関節リウマチに罹患した患者からの血清、脳脊髄液（ＣＳＦ）、および滑液中のＭＭＰ−９の存在および量を検査した試験を考察および要約した（Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２６：２９９−３０７，２００６）。概して、各試験は、対照と比較して、それぞれの体液中のＭＭＰ−９の増加を発見した。別の試験では、Ａｉｎｉａｌａらが、血清ＭＭＰ−９の増加および神経精神的兆候（例えば、認知機能障害等の少なくとも１つの神経精神症状を有する患者）と、小血管の脳血管障害と、ＳＬＥを有する患者における脳虚血事象のリスクの増加との間の相関関係を発見した（Ａｉｎｉａｌａ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ ５０：８５８−６５，２００４）。
【０１１２】
関節リウマチに関して、試験は、患者血清および滑液中のＭＭＰ−９レベルの実質的な上昇を示した（Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，７８：１６１−７１，１９９６）。試験はまた、関節リウマチにおけるＭＭＰ−９の源が関節リウマチ滑膜からであることを発見した。原位置逆転写酵素ＰＣＲは、ＭＭＰ−９転写物がいくつかの異なる種類のリウマチ滑膜細胞において産生されたことを発見した。別の試験では、ＭＭＰ−９レベルは、変形性関節炎からの関節液と比較して、関節リウマチからの関節液中において実質的により高いことがわかった（Ｓｅｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，７：１９７−２０９，２００９）。さらに、試験は、関節リウマチ患者からの関節液中の活性ＭＭＰ−９濃度が関節リウマチ滑膜におけるＭＭＰ−９陽性細胞と、およびリンパ球のびまん性浸潤に関して、正に相関していたことを示した。これらの結果は、活性ＭＭＰ−９が関節リウマチの関節破壊に活発に関与することを示す。
【０１１３】
多発性硬化症に関して、試験は、ＭＭＰ−９が多発性硬化症の急性期病変において優位を占めることを示している。いくつかの試験はまた、血清およびＣＳＦ中のＭＭＰ−９のレベルが、患者が有する疾病の種類に応じて異なることを示している。具体的に、１つの試験は、短い罹患期間および再発寛解型多発性硬化症が、原発性進行性多発性硬化症よりもはるかに高いレベルのＭＭＰ−９を有したことを示した（Ａｖｏｌｉｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ，１３６：４６−５３，２００３）。しかしながら、原発性進行性多発性硬化症は、不活性多発性硬化症を有する患者よりもはるかに高いレベルのＭＭＰ−９を有した。近年の試験は、女性多発性硬化症患者から採取される末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からのＭＭＰ−９の産生に対する、エストリオール（抗炎症特性を有する妊娠ホルモン）の効果を検査した（Ｇｏｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ８９：１０７６−８３，２００９）。Ｇｏｌｄらは、ＭＭＰ−９の産生が再発寛解型の多発性硬化症を有する患者からのＰＢＭＣにおいて有意に減少したことを示した。興味深いことに、このＭＭＰ−９の減少は、ＥＡＥマウスモデルにおいて示されるように、ＭＲＩ上の造影病変の減少、ならびに中枢神経系へのＴ細胞およびマクロファージ浸潤の減少に関連した。
【０１１４】
これらの試験は、ＭＭＰ−９が自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、ＳＬＥ、および関節リウマチ）において重要な役割を有することを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、ＳＬＥ、および関節リウマチ）ならびに同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１１５】
偏頭痛。近年、試験は、片頭痛発作中の片頭痛患者におけるＭＭＰ−９の産生の増加を示しており、片頭痛発作が炎症および／または血液脳関門崩壊構成成分を有することを示す。これらの試験は、ＭＭＰ−９が片頭痛発作に関与することを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、片頭痛発作および同様の状態を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１１６】
脳卒中。細胞外マトリクスのリモデリング、およびより具体的には、血液脳関門の分解へのＭＭＰ−９の関与は、当該技術分野において長い間認められてきた。脳卒中後の回復におけるＭＭＰ−９の役割が検査されてきた（Ｃｌａｒｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２３８：５３−５６，１９９７）。Ｃｌａｒｋらは、ＭＭＰ−９活性が梗塞の２日後に梗塞組織において著しく上昇することを示した。興味深いことに、脳卒中により死亡した患者は、２日目に始まり、死亡まで続いた、活性ＭＭＰ−９レベルの上昇を有し、長期の活性ＭＭＰ−９が脳卒中に起因する死亡に関与することを示す。これらの試験は、ＭＭＰ−９が脳卒中の回復に関与することを示す。出願者は、ＢＥＣモデルを使用して、本発明の界面動電的に改変された流体がＭＭＰ−９の産生を優位に下方制御したことを本明細書に示す。特定の実施形態によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、脳卒中および同様の状態から回復する患者を治療するための実質的な有用性を有する。
【０１１７】
ＭＭＰ阻害剤：
多くのメタロプロテイナーゼ阻害剤が知られている（例えば、Ｂｅｃｋｅｔｔ Ｒ．Ｐ．ａｎｄ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍ．，１９９８，Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，８（３）：２５９−２８２、およびＷｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９９（９）：２７３５−２７７６によるＭＭＰ阻害剤の総説を参照のこと）。国際公開第０２／０７４７６７号は、ＭＭＰ阻害剤として、特に強力なＭＭＰ１２阻害剤として有用である、処方のヒダントイン誘導体を開示する。米国特許出願第１１／７２１，５９０号（第２００８００３２９９７号として公開された）は、メタロプロテイナーゼの阻害剤であり、ＭＭＰ１２およびＭＭＰ９等のＭＭＰの阻害において特に特に興味深い、ヒダントイン誘導体のさらなるグループを開示する。ＭＭＰ１２およびＭＭＰ９等のＭＭＰを阻害するための新規トリアゾロン誘導体は、米国特許出願第１０／５９３５４３号（第２００７０２１９２１７号として公開された）に開示される。追加のＭＭＰ１２およびＭＭＰ９阻害剤は、第１１／５０９，４９０号（第２００６０２８７３３８号として公開された）に開示される（また、１０／８３１２６５号（第２００４０２５９８９６号として公開された）も参照のこと）。
【０１１８】
追加の例示的なＭＭＰ阻害剤は、以下の表２に要約される。
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【０１１９】
【表２−１】

【０１２０】
【表２−２】

【０１２１】
【表２−３】

【０１２２】
【表２−４】

【０１２３】
【表２−５】

【０１２４】
【表２−６】

【０１２５】
【表２−７】

【０１２６】
【表２−８】

【０１２７】
【表２−９】

【０１２８】
【表２−１０】

【０１２９】
【表２−１１】

【０１３０】
【表２−１２】

【０１３１】
【表２−１３】

【０１３２】
【表２−１４】

【０１３３】
【表２−１５】

【０１３４】
【表２−１６】

【０１３５】
【表２−１７】

【０１３６】
【表２−１８】

【０１３７】
【表２−１９】

【０１３８】
【表２−２０】

【０１３９】
【表２−２１】

【０１４０】
【表２−２２】

【０１４１】
【表２−２３】

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治療方法
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患、障害、もしくは状態、またはそれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害する、または予防することを指し、かつこれらの意味を含意し、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療的に（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）」とは、本明細書に定義されるように、治療の行為を指す。
【０１４２】
「治療有効量」は、疾患、障害、もしくは状態、またはこれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害する、または予防するために十分である、本明細書に提供される本発明を実践する経過において利用されるいずれかの化合物の任意の量である。
【０１４３】
本明細書のある実施形態は、ある状態または疾患と関連する炎症の少なくとも１つの症状を予防するまたは緩和することによる対象に対する治療組成物および治療方法に関する。炎症性疾患と関連する多くの状態または疾患は、ステロイド、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、およびレフルノミド等を含む免疫抑制剤、アスピリン、アセトアミノフェンおよびＣＯＸ−２阻害剤等の非ステロイド系抗炎症剤、金剤、ならびに抗マラリア治療剤を用いて治療されている。
【０１４４】
投与経路および形態
本明細書で使用されるとき、「対象」は、いずれかの生物体、好ましくは、動物、更に好ましくは、哺乳類、およびなお更に好ましくは、ヒトを指し得る。
【０１４５】
特定の例示的な実施形態では、本発明のガス富化流体は、治療組成物が、炎症の少なくとも１つの症状を予防する、または緩和するように、単独で、または別の治療剤と組み合わせて、治療組成物として機能し得る。本発明の治療組成物は、それを必要とする対象に投与することができる、組成物を含む。ある実施形態では、治療組成物製剤はまた、担体、アジュバント、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、香料、および結合剤からなる群から選択される、少なくとも１つの添加剤も含み得る。
【０１４６】
本明細書で使用されるとき、「医薬的に許容可能な担体」および「担体」は、概して、非毒性の、不活性固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入物質、またはあらゆる型の製剤補助物質を指す。医薬的に許容可能な担体としての機能を果たし得る物質の幾つかの限定されない例としては、ラクトース、グルコース、およびスクロース等の糖類；コーンスターチおよびポテトスターチ等のデンプン；セルロース、およびその誘導体である、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬用ワックス等の賦形剤；ピーナッツオイル、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油等の油類；プロピレングリコール等のグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性の相溶性潤滑剤、があり、考案者の判断に従って、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料、および香料であり、保存料および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。特定の態様では、このような担体および賦形剤は、本発明のガス富化流体または溶液であり得る。
【０１４７】
本明細書に記載の医薬的に許容可能な担体としては、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、または希釈剤が、当業者には既知である。一般に、医薬的に許容可能な担体は、治療剤に対して化学的に不活性であり、使用条件下で、有害な副作用または毒性がない。医薬的に許容可能な担体は、ポリマーおよびポリマーマトリクス、ナノ粒子、超微粒気泡等を含み得る。
【０１４８】
本発明の治療ガス富化流体に加えて、治療組成物は、追加の非ガス富化水または他の溶媒等の不活性希釈剤、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル等の可溶化剤および乳化剤、ならびにこれらの組み合わせを更に含み得る。当業者により明らかであるように、特定の治療組成物の新規の改善された製剤、新規のガス富化治療流体、および新規のガス富化治療流体を送達する新規の方法は、同一の、同様の、または異なる組成物のガス富化流体と１つ以上の不活性希釈剤を差し替えることにより得られ得る。例えば、従来の水は、ガス富化流体を提供するために、水もしくは脱イオン水に酸素を混合することにより生成されたガス富化流体により差し替える、または補完され得る。
【０１４９】
ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、１つ以上の治療剤と組み合わせ得る、および／または単独で使用され得る。特定の実施形態では、ガス富化流体を抱合することは、脱イオン水、食塩溶液等の当該技術分野において既知の１つ以上の溶液を、１つ以上のガス富化流体と差し替えることを含み、それによって、対象に送達するための改善された治療組成物を提供し得る。
【０１５０】
ある実施形態は、本発明のガス富化流体、医薬組成物、もしくは他の治療剤、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは溶媒、ならびに少なくとも１つの医薬担体もしくは希釈剤を含む、治療組成物を提供する。これらの医薬組成物は、前述の疾患または状態の予防および治療、ならびに上記のように、療法において、使用され得る。好ましくは、担体は、医薬的に許容可能でなければならず、適合する、即ち、組成物中の他の成分において有害効果がないものでなければならない。担体は、固体または液体であり得、好ましくは、単位用量の製剤、例えば、活性成分の０．０５〜９５重量％を含有し得る錠剤として、製剤化される。
【０１５１】
可能な投与経路としては、経口、舌下、口腔、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、大槽内、膀胱内、髄腔内、または静脈内）、直腸、局所（経皮、膣内、眼球内、耳内、鼻腔内、吸入、および移植可能なデバイスまたは物質の注射または挿入を含む）が含まれる。
【０１５２】
投与経路
特定の対象に対する投与の最適な手段は、治療される疾患もしくは状態の性質および重症度、または使用される治療法の性質、ならびに治療組成物もしくは追加の治療剤の性質により異なる。ある実施形態では、経口または局所投与が好ましい。
【０１５３】
経口投与に好適な製剤は、それぞれ既定量の活性化合物を含有する、錠剤、カプセル、カシェ剤、シロップ、エリキシル剤、チューインガム、「ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）」剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、トローチ剤、もしくはゲルコーティングされたアンプルのような個別単位として、粉末もしくは顆粒として、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として、提供し得る。
【０１５４】
舌下または口腔投与等による経粘膜的方法に好適な製剤は、活性化合物および一般に香味ベース、例えば、砂糖およびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤、パッチ剤、錠剤等、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースアカシアのような不活性ベース中に活性化合物を含むパステル剤を含む。
【０１５５】
非経口投与に好適な製剤は、一般に、既定濃度の活性ガス富化流体および可能な別の治療剤を含有する滅菌水溶液を含み、溶液は、好ましくは、対象とするレシピエントの血液を含んだ等張液である。非経口投与に好適な更なる製剤は、界面活性剤およびシクロデキストリン等の生理学的に好適な共溶媒および／または錯化剤を含有する製剤を含む。水中油型乳剤はまた、ガス富化流体の非経口投与用の製剤に好適であり得る。このような溶液は、好ましくは、静脈内投与されるが、皮下または筋肉内注射により投与されてもよい。
【０１５６】
尿道、直腸、または膣内投与に好適な製剤は、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、吸収性固形物質、潅水等を含む。製剤は、座薬ベースを形成する１つ以上の固体担体、例えば、ココアバター中に、活性成分を含む、単位用量座薬として提供するのが好ましい。代替として、本発明のガス富化流体を用いた結腸洗浄は、結腸または直腸投与用に製剤化され得る。
【０１５７】
局所、眼球内、耳内、または鼻内投与に好適な製剤は、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、ゲル剤（ヒドロゲル等）、スプレー剤、分散性粉末および顆粒、エマルジョン、流動噴射剤を用いたスプレー剤またはエアロゾル（例えば、リポソームスプレー剤、点鼻剤、鼻腔用スプレー剤等）、ならびに油を含む。このような製剤に好適な担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの組み合わせを含む。経鼻または鼻腔内投与は、定量のこれらの製剤またはその他のいずれかを含み得る。同様に、耳内または眼球内は、点滴剤、軟膏、刺激流体（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ ｆｌｕｉｄ）等を含み得る。
【０１５８】
本発明の製剤は、あらゆる好適な方法、一般に、液体もしくは微粉化した固体担体、またはその双方を有する活性化合物を、ガス富化流体と、必要とされる比率で均一かつ緊密に任意に混合し、次いで、必要であれば、得られた混合物を所望の形状に付形することにより調製され得る。
【０１５９】
例えば、錠剤は、活性成分の粉末または顆粒、および１つ以上の任意成分、例えば、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤または界面活性分散剤を含む均質混合物を圧縮するか、または粉末活性成分および本発明のガス富化流体の均質混合物を成形することにより調製し得る。
【０１６０】
吸入による投与に好適な製剤は、種々の型の定量加圧エアロゾル、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る微粒子粉末またはミスト剤を含む。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。口からの肺投与に関しては、気管支樹への送達を確実にするために、粉末または液滴の粒度は、一般に、０．５〜１０μＭ、好ましくは１〜５μＭである。鼻投与に関しては、鼻腔における保留を確実にするために、１０〜５００μＭの粒度が好ましい。
【０１６１】
定量吸入器は、液化噴射剤中の治療剤の懸濁液または溶液製剤を一般に含有する加圧エアロゾルディスペンサーである。ある実施形態では、本明細書に開示されるように、本発明のガス富化流体は、標準液化噴射剤に加えて、またはその代わりに、使用され得る。使用の際に、これらのデバイスは、計量した量、一般に１０〜１５０μＬを送達するように適合させた弁を経て製剤を放出して、治療剤およびガス富化流体を含有する微粒子噴霧を生じる。好適な噴射剤は、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびこれらの混合物を含む。
【０１６２】
製剤は、１つ以上の共溶媒、例えば、エタノール界面活性剤、例えば、オレイン酸または三オレイン酸ソルビタン、酸化防止剤、および好適な風味剤を更に含有し得る。ネブライザーは、商業的に入手可能なデバイスであり、それは、狭いベンチュリ穴を通る圧縮ガス（一般に空気または酸素）の加速によるか、あるいは超音波撹拌のいずれかにより、活性成分の溶液または懸濁液を治療エアロゾルミストに変換するデバイスである。ネブライザーで用いるのに好適な製剤は、ガス富化流体中の別の治療剤からなり、製剤の４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満を含む。加えて、他の担体は、蒸留水、滅菌水、または希釈水性アルコール溶液等を利用し、好ましくは、例えば、塩化ナトリウム等の塩の添加により、体液と等張にされるものであり得る。任意の添加剤は、特に、製剤が滅菌調製されていない場合は、防腐剤を含み、メチルヒドロキシ−ベンゾエート、酸化防止剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、および界面活性剤を含み得る。
【０１６３】
吸入による投与に好適な製剤は、吸入器により送達されるか、または鼻からの吸入により鼻腔に取り入れられ得る微粉砕散剤を含む。吸入器において、散剤を、一般にゼラチンまたはプラスチック製のカプセルまたはカートリッジに入れ、それらを原位置で突き刺すかまたは開けて、散剤が、吸入時にデバイスから引き出される空気によるか、または手動ポンプにより送達される。吸入器において採用される散剤は、活性成分だけからなるか、または活性成分、好適な粉末希釈剤、例えばラクトース、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。活性成分は、一般に、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを含む。上に具体的に言及された成分に加えて、本発明の製剤は、課題となる製剤の型を考慮して、当業者には既知の他の薬剤を含み得る。例えば、経口投与に好適な製剤は、香味料を含み得、経鼻投与に好適な製剤は、香料を含み得る。
【０１６４】
本発明の治療組成物は、個々の治療剤として、あるいは、治療剤と組み合わせて、調合薬と共に使用可能なあらゆる従来の方法により投与され得る。
【０１６５】
当然のことながら、投与される用量は、特定の薬剤の薬力学的特性、ならびにその投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態、および体重；症状の性質および範囲；同時治療の種類；治療頻度；ならびに所望の効果のような既知の要因により異なり得る。活性成分の１日投与量は、体重の１キログラム（ｋｇ）あたり約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）であり、好ましくは、０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量であることが期待され得る。
【０１６６】
用量形態（投与に好適な組成物）は、単位あたり活性成分の約１ｍｇ〜約５００ｍｇを包含する。これらの医薬組成物では、活性成分は、通常、組成物の総重量に基づいて、約０．５〜９５重量％の量で存在し得る。
【０１６７】
軟膏、ペースト剤、フォーム剤、咬合剤（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、クリーム剤、およびゲル剤はまた、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、シリコン、ベントナイト、シリカ酸、およびタルク、またはこれらの混合物のような賦形剤も含有し得る。散剤およびスプレー剤はまた、ラクトース、タルク、シリカ酸、水酸化アルミニウム、およびケイ酸カルシウム、またはこれらの物質の混合物のような賦形剤も含有し得る。ナノ結晶抗菌性金属の溶液は、エアロゾル医薬品を製造するために日常的に使用される既知の手段のいずれかによりエアロゾルまたはスプレー剤に変換され得る。概して、このような方法は、通常、不活性担体ガスを用いて、溶液の容器を加圧すること、または加圧するための手段を提供すること、および小さい穴から加圧したガスを通過させることを含む。スプレー剤は、窒素、二酸化炭素、および他の不活性ガス等の常用の噴射剤を更に含有し得る。加えて、ミクロスフェアまたはナノ粒子は、対象に治療化合物を投与するために必要とされるいずれかの経路において、本発明のガス富化治療組成物または流体と共に採用され得る。
【０１６８】
注射用製剤は、アンプルおよびバイアル等の単位用量または多用量を密閉した容器中に存在し得、使用直前に、滅菌液体賦形剤、またはガス富化流体の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。即時注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。注射可能な組成物のために効果的な医薬担体の必要条件は、当業者には公知である。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．，２３８−２５０（１９８２）およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，６２２−６３０（１９８６）を参照のこと。
【０１６９】
局所投与に好適な製剤としては、本発明のガス富化流体および任意に追加の治療および香味、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのような不活性ベース中のガス富化流体および任意に追加の治療剤を含むパステル剤；好適な液体キャリア中のガス富化流体および任意に追加の治療剤を含むうがい薬または含嗽液；ならびにクリーム剤、エマルジョン、ゲル剤等が挙げられる。
【０１７０】
追加として、直腸投与に好適な製剤としては、乳化ベースまたは水溶性ベースのような様々なベースと混合することにより座薬として示され得る。膣内投与に好適な製剤としては、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、または活性成分に加えて、当該技術分野で適切であることが知られているキャリア等を含有するスプレー剤として示され得る。
【０１７１】
好適な医薬キャリアは、本分野における標準的な参照テキスト「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）」に記載されている。
【０１７２】
本発明の文脈において、対象、特に、動物、具体的には、ヒトに投与される用量は、適当なタイムフレーム上で動物の治療反応をもたらすのに十分であるべきである。当業者は、投与量が、動物の状態、動物の体重、ならびに治療されるべき状態を含む、様々な要因により異なり得ることを理解されよう。好適な用量は、所望の反応に影響を及ぼすことが知られている、対象における、治療組成物の濃度をもたらし得るものである。
【０１７３】
用量の大きさはまた、投与の経路、タイミングおよび頻度、ならびに治療組成物の投与および所望の生理的効果を伴い得る、いかなる副作用の存在、性質、および範囲によっても決定され得る。
【０１７４】
組み合わせの化合物は、（１）共製剤における化合物の組み合わせにより同時に、または（２）別々の医薬製剤において、交代で、即ち、連続的に、順次に、並行で、または同時に、送達することにより、投与され得ることが認識されよう。交互の治療において、第２、および任意に第３の活性成分の投与の遅延が、活性成分の組み合わせの相乗的な治療効果の利益を損失するべきではない。（１）あるいは（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態によれば、理想的には、組み合わせは、最も有効な結果を達成するように投与されるべきである。（１）あるいは（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態では、理想的には、組み合わせは、活性成分のそれぞれのピーク血漿濃度を達成するために投与されるべきである。組み合わせ共製剤の投与による１日に１回１錠レジメン（ｏｎｅ ｐｉｌｌ ｏｎｃｅ−ｐｅｒ−ｄａｙ ｒｅｇｉｍｅｎ）は、炎症性神経変性疾患に罹患している何人かの患者に実行可能であり得る。ある実施形態によれば、組み合わせの活性成分の効果的なピーク血漿濃度は、約０．００１〜１００μＭの範囲であり得る。最適なピーク血漿濃度は、特定の患者について処方される製剤および投与レジメンにより達成され得る。本発明の流体およびグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）またはこれらのいずれかの生理学的に機能的な誘導体は、同時に与えられるか、または順次与えられるかいずれにせよ、個々に、複数で、または任意のこれらの組み合わせで、投与され得ることもまた理解されよう。概して、交互の治療（２）の間、有効投与量の各化合物は連続的に投与され、共製剤治療（１）においては、有効投与量の２つ以上の化合物が、一緒に投与される。
【０１７５】
本発明の組み合わせは、単位投薬形態において、医薬製剤として適宜に表され得る。都合の良い単位投与製剤は、それぞれ、１ｍｇ〜１ｇの任意の量（例えば、１０ｍｇ〜３００ｍｇであるが、これに限定されない）で活性成分を含む。例えば、グルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）と組み合わせた、本発明の流体の相乗効果は、広い比にわたって、例えば、１：５０〜５０：１（本発明の流体：グルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド））で実現され得る。１つの実施形態では、比は、１：１０〜１０：１の範囲であり得る。別の実施形態では、丸剤、錠剤、キャプレット、またはカプセル剤のような共製剤の組み合わせ投与形態における、グルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）に対する本発明の流体の重量／重量比は、約１、即ち、ほぼ等量の本発明の流体およびグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）であり得る。他の例示的な共製剤では、より多いか、または少ない本発明の流体およびグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）が存在し得る。１つの実施形態では、各化合物は、単独で使用される場合に抗炎症活性を示す量で組み合わせて利用され得る。前記組み合わせの化合物の他の比および量は、本発明の範囲内で企図される。
【０１７６】
単位投与形態は、本発明の流体および、例えば、グルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）、またはこれらのうちのいずれかの生理学的に機能的な誘導体、ならびに医薬的に許容可能な担体を更に含み得る。
【０１７７】
治療で使用するのに必要とされる本発明の組み合わせ中の活性成分の量は、治療されている状態の性質、ならびに患者の年齢および状態を含む、様々な要因に従って変化し、最終的には、主治医または健康管理者の自由裁量であることが、当業者には、認識されよう。考慮されるべき要因としては、投与経路および製剤の性質、動物の体重、年齢および全身状態、ならびに治療されるべき疾患の性質および重症度が挙げられる。
【０１７８】
同時投与または順次投与のための単位投与形態にある任意の２つの活性成分と、第３の活性成分とを組み合わせることも可能である。３つの部分の組み合わせは、同時にまたは順次に投与され得る。順次投与される場合、組み合わせは、２つまたは３つの投与物で投与され得る。ある実施形態によれば、本発明の流体およびグルココルチコイドステロイド（例えば、ブデソニド）の３つの部分の組み合わせは、任意の順序で投与され得る。
【０１７９】
特定の態様に従って、本発明の界面動電的に改変された流体は、本明細書に開示される表示の例示的な属を含むがこれに限定されない、ＭＭＰ−９媒介状態を治療するための実質的な有用性を有する。さらなる態様によると、本発明の界面動電的に改変された流体は、例示的な属の様々な亜属を治療するための有用性を有し、属の少なくとも１つの表示は、亜属のそれぞれから除外される。
【実施例】
【０１８０】
実施例１
（本発明の界面動電的に改変された流体およびアルブテロールの相乗効果を示した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、ヒト気管支収縮（ヒト喘息モデル）の当該技術分野において認識されている動物モデルにおいて、生体内でアルブテロールを用いて、相乗延長効果（例えば、気管支収縮の抑制）を提供し、したがって、患者のアルブテロール使用量の減少を提供する。本実施例において開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０１８１】
第１の実験。第１の実験において、メタコリン誘発された気管収縮と共に気道機能における気管支拡張剤の効果について、１６匹のモルモットを評価した。最適用量の決定後、各動物は、１動物あたり２５０μＬにおいて、標的用量の１２．５μｇの硫酸アルブテロールを送達するように、５０μｇ／ｍＬで投薬された。試験は、体重およびベースラインＰｅｎＨ値に対して無作為化ブロック設計であった。２つの群（ＡおよびＢ）には、１つまたは２つの希釈剤中の５０μｇ／ｍＬ硫酸アルブテロールの２５０μＬの気道内注入を与えた：Ａ群は、酸素を添加せずに、本発明のデバイスを通過させた脱イオン水であり、一方、Ｂ群は、本発明のガス富化水であった。各群は、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏ ｓｐｒａｙｅｒを用いて、溶液と共に気管内に投薬された。加えて、動物は、各治療群がプレチスモグラフおよび記録ユニットを供給するネブライザー内で均一に示されるように、ＢＵＸＣＯプレチスモグラフユニットにわたって階層化された。アルブテロールを投与してから２時間後、それらのベースラインＰｅｎＨ値の少なくとも７５％を示した動物は、データ分析には含まれなかった。この除外基準は、気管支拡張剤を用いた気管支保護を観察するための欠陥が、投与エラーと関連し得る過去の試験に基づく。結果として、対照群から１匹の動物が、データ分析から除外された。動物は、５０％超の気管支収縮があると、動物は、保護されていないと見なされた。Ｂ群の動物のうちの５０％は、１０時間まで（試験が終了する時点）、気管支収縮から保護された。
【０１８２】
第２の実験。オスのモルモットにおける、硫酸アルブテロールの単独投与、または希釈剤として投与する際、メタコリン誘発された気管支収縮に対する本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０１、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ１６７６−０３）の保護効果を評価するために、大量の動物を用いて、追加の一連の実験を行った。
【０１８３】
材料および方法。モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）からのハートレー系アルビノ、Ｃｒｌ：（ＨＡ）ＢＲであった。体重：処置の開始時で、約３２５±５０ｇ。群数は、１群あたり７匹のオス動物を有する、３２匹であった（加えて、２４匹の予備が、動物の同一バッチを形成する）。食事；全ての動物は、指定された処置時を除いては、標準の認定されたペレット式の市販の実験食（ＰＭＩ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ ５０２６；ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を自由に摂食させた。投与経路は、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒを介した気道内注入および全身吸入を介したメタコリン刺激であった。気管内経路は、試験物質／対照溶液への肺暴露を最大限にするように選択された。全身吸入刺激は、上気道過敏性反応（即ち、気管支収縮）を引き起こすために、メタコリン刺激に対して選択されている。処置の継続は、１日であった。
【０１８４】
実験設計。全ての動物は、ＴＡ／対照投与してから２時間後、メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）の吸入暴露を行った。全ての動物は、２５０μＬの用量容量を受容した。したがって、硫酸アルブテロールは、（対照物質および４つの試験物質において）０、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬの濃度まで希釈された。投薬する３０分前、４つの異なる濃度（０、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬ）の硫酸アルブテロール溶液は、これらの４つの試験物質溶液（ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０１、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ１６７６−０３）のそれぞれにおいて、ｌ Ｏｘストック（５００μｇ／ｍＬ）中で作製された。これらの濃度の硫酸アルブテロールはまた、非界面動電的に生成された対照流体（対照１）中でも作製された。投与溶液は、適切な希釈の各ストック溶液を作製することにより調製された。全てのストックおよび投与溶液は、調製されるとすぐに、氷上で維持した。試験／対照物質を作製してから１時間以内に、投与を完了した。メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）の溶液は、投与日に調製した。
【０１８５】
各動物に、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒを用いて、試験または対照物質の気道内注入を行った。動物は、一晩絶食させ、イソフルレンを用いて麻酔をかけ、喉頭を、喉頭鏡（または好適な代替物）下で可視化し、マイクロ噴霧器（ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ）の先端を気管に挿入した。試験物質または対照物質の用量容量の２５０μＬ／動物を投与した。メタコリンエアロゾルは、Ｂｕｘｃｏバイアス流動ポンプからの空気が供給されたエアロネブ超音波ネブライザーを用いて、混合チャンバの空気吸入口に生成された。同様に、この混合チャンバは、４つの個々の全身無拘束プレチスモグラフを供給し、わずかに負圧下で動作されたそれぞれは、排気ラインに位置する仕切り弁によって維持した。真空ポンプを使用して、必要とされる流速で、吸入チャンバを排出した。
【０１８６】
試験の主相を開始する前に、１２匹の予備動物を、３つの群（ｎ＝４／群）に割り付けて、動物が、重症であるが、非致命的急性気管支収縮を誘発するようにメタコリンに暴露され得る、最大暴露期間を決定した。４匹の動物は、３０秒間、メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）に暴露され、エアロゾルを開始してから１０分後まで、呼吸パラメータを測定した。メタコリンネブライザー濃度および／またはエアロゾル化の暴露時間は、Ｐｅｎｈの一過性増加を特徴とするように、重症であるが、非致命的急性／可逆性気管支収縮を誘発するように適切に調整された。
【０１８７】
試験物質投与前（１日目）、また、投薬してから２、６、１０、１４、１８、２２、および２６時間後の時点で、動物をチャンバ内に入れ、メタコリンへのエアロゾル刺激の開始後、換気パラメータ（１回換気量、呼吸速度、誘導分時排出量）およびｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ Ｐｅｎｈを、Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ ＸＡシステムを用いて、１０分間測定した。動物がチャンバ内にいる時点で、ベースラインの値は、１分間記録され、次いで、メタコリンネブライザー濃度の５００μｇ／ｍＬを、３０秒間、エアロゾル化し、動物は、換気パラメータを連続的に評価した際、更に１０分間、エアロゾルに暴露された。Ｐｅｎｈは、気管支収縮の指標として使用され、Ｐｅｎｈは、ピーク吸気流、ピーク呼気流、および呼気時間から得られた誘導値である。Ｐｅｎｈ＝（ピーク呼気流／ピーク吸気流）＊（呼気時間／呼気容量の６５％を呼気するため時間−１）。
【０１８８】
メタコリン刺激の事前投与時、重症の急性気管支収縮を示さなかった動物は、差し替えられた。投与してから２時間後、それらのベースラインＰｅｎｈＰｅｎｅｓ値の少なくとも７５％を示す、どの動物も、データ分析には含まれなかった。呼吸パラメータは、２０秒法として記録された。非生理的であると見なされたデータは、更に分析から除外された。Ｐｅｎｈの変化は、１５分間にわたりプロットされ、Ｐｅｎｈ値は、濃度曲線下面積として表された。数値データは、群平均値および標準偏差（規定通りに）の算出がなされた。
【０１８９】
結果。本実験からの結果は、アルブテロールの不在下で、本発明の界面動電的に生成された流体の投与は、２６時間まで測定した際、ベースライン％平均のＰｅｎＨ値における明らかな効果がなかったことを示した。しかしながら、驚いたことには、本発明の界面動電的に生成された流体中で製剤化されたアルブテロールの投与（２５μｇのアルブテロール／動物群に対して代表的なデータを示す）（試験した全ての酸素レベルで；周囲、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍ）は、対照流体と比較して、アルブテロールの抗気管支収縮作用の顕著な延長を生じた。つまり、メタコリンの結果は、少なくとも２６時間で、アルブテロールの気管支拡張の延長を示した。出願者はまた、ＲＤＣ１６７６と生理食塩水対照との間の全ての酸素レベルで一貫した差異があったことを示した。全て４つのＲＤＣ１６７６流体を合成すると、全処置と生理食塩水との差異であるｐ値は、０．０３であった。
【０１９０】
したがって、特定の態様によれば、本発明の界面動電的に生成された溶液は、アルブテロールとの相乗的延長作用を提供し、故に、患者のアルブテロール使用量の軽減を提供し、更に効率的な費用効率が高い薬物使用、より少ない副作用を可能にし、かつ患者が治療され、アルブテロールによる治療に反応し得る期間を増大させる。
【０１９１】
実施例２
（サイトカイン発現に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を示した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、対照流体と比較して、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびエオタキシン）、炎症性酵素（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ−９）、アレルゲン応答（ＭＨＣ クラスＩＩ、ＣＤ２３、Ｂ７−１、およびＢ７−２）、ならびにＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５）の産生を低下させ、対照流体と比較して、抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ１Ｒ−α、ＴＩＭＰ）を増加させた。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０１９２】
特定の態様では、ヒト混合リンパ球は、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ酸素富化流体または対照流体中のＴ３抗原またはＰＨＡで刺激し、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦｂ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、レプチン、ＴＮＦ−β、ＴＦＧ−β、およびＮＧＦの変化を評価した。示されるように、試験した、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびエオタキシン）、炎症性酵素（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ−９）、アレルゲン応答（ＭＨＣ クラスＩＩ、ＣＤ２３、Ｂ７−１、およびＢ７−２）、ならびにＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５）は、試験流体対対照流体において、減少した。対照的に、試験した抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ１Ｒ−α、ＴＩＭＰ）は、試験流体対対照流体において、増加した。
【０１９３】
さらに、出願者は、アレルギー性超過敏反応を評価するために、オボアルブミン感作を含む、当該技術分野において認識されているモデル系を使用した。研究されたエンドポイントは、反応の特定の細胞学的成分および細胞成分、ならびにタンパク質およびＬＤＨの血清学測定であった。エオタキシン、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１Ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−Ａ、およびＶＣＡＭの分析を含む、サイトカイン分析を行った。
【０１９４】
簡潔に述べると、オスのＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットに、１日目、２日目、および３日目のそれぞれで１回、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）_３）（２００ｍｇ／ｍＬ）を含有する溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）中で０．５ｍＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）グレードＶ（Ａ５５０３−１Ｇ、Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射した。研究は、２×２要因配置無作為化（４群）の処置であった。免疫反応を生じさせるまでの２週間の待機期間後、ラットは、暴露されるか、あるいは、ＲＤＣ１６７６−００（Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ社独自のデバイスを通して処理した滅菌食塩水）、あるいはＲＤＣ１６７６−０１（更に添加された酸素を用いて、Ｒｅｖａｌｅｓｉｏ社独自のデバイスを通して処理した滅菌食塩水）のいずれかを用いて、１週間、処置された。１日１回の１週間の処置の終了時に、２つの群は、半分に分けられ、各群において、ラットの５０％は、吸入により食塩水あるいはＯＶＡ刺激のいずれかを受容した。
【０１９５】
具体的には、初期シリアル化してから１４日後、１２匹のラットを、連続７日間、毎日３０分間、吸入によりＲＤＣ１６７６−００に暴露した。システムを通る気流速度を、１０リットル／分で設定した。計１２匹のラットを、噴霧物質をエアロネブの１２のサブチャンバに入れ、均一に分布させる単一ポートを有する、パイチャンバ中に整列させた。
【０１９６】
初期シリアル化してから１５日後、１２匹のラットを、連続７日間、毎日３０分間、超音波噴霧によりＲＤＣ１６７６−０１に暴した。気流はまた、１０リットル／分で設定され、同一のネブライザーおよびチャンバを使用した。第１に、ＲＤＣ１６７６−００を噴霧し、ＲＤＣ１６７６−０１を噴霧する前に、エアロネブチャンバを完全に乾燥させた。
【０１９７】
最終の噴霧処置をしてから約２時間後、ＲＤＣ１６７６−００群からの６匹のラットを、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（モデル１Ａ−１Ｂ）を用いて、気管内注入により送達されるＯＶＡ（食塩水中１％）で、再刺激した。ＲＤＣ１６７６−００群からの他の６匹のラットを、気管内注入により送達される対照群として食塩水で刺激した。翌日、手順をＲＤＣ１６７６−０１群で繰り返した。
【０１９８】
再刺激してから２４時間後、各群において全てのラットは、ペントバルビタールナトリウムを過剰摂取させることにより安楽死させた。全血サンプルは、下大静脈から採血し、２つの別個の採血管のＱｉａｇｅｎ ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ ＴｕｂｅおよびＱｉａｇｅｎ ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｔｕｂｅに入れた。このモデルにおいて、肺の炎症と関連することで既知のサイトカイン発現のマーカーの変化を評価するために、肺の臓器を処置して、ＲＴ−ＰＣＲのための気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体および肺組織を得た。肺の右側上の４つの肺葉の整合性を保つために、片側洗浄技術を採用した。左「大」葉を洗浄し、一方、４つの右葉は、縛られ、ＴＲＩ−ｚｏｌ（登録商標）を直ちに入れられ、均質化され、更なる処置のために実験室に送られた。
【０１９９】
ＢＡＬ分析。肺洗浄物を、収集し、細胞を沈殿させるために、４℃で、６００〜８００ｇで、１０分間遠心分離を行った。浮遊物を、新しい管に移し、−８０℃で冷凍させた。気管支洗浄液（「ＢＡＬ」）を、２つのアリコートに分取した。第１のアリコートを沈降させ、浮遊物を破砕したドライアイス上で急冷凍し、−８０℃中に入れ、更なる処置のために実験室に出荷した。存在するタンパク質およびＬＤＨの量は、それぞれ、血清タンパク質のレベル（タンパク質は、本実験等の場合、刺激される際、膜を漏出する血清成分である）および細胞死を示す。独自の試験側は、対照物よりもわずかに少ないタンパク質を示した。
【０２００】
気管支洗浄液の第２のアリコートは、総タンパク質およびＬＤＨ含有量について評価し、細胞学的検査に供された。処置群は、総細胞が、食塩水対照群よりも多いことを示した。更に、対照群に対して処置群において、好酸球の増加があった。対照群に対して処置群において、わずかに異なる多形核球細胞もあった。
【０２０１】
血液分析。１つの管に１．２〜２．０ｍＬの血液を移すことにより、全血を分析し、少なくとも３０分間、血液を凝固させた。残りの血液サンプル（約３．５〜５．０ｍＬ）は、ＴＲＩ−ｚｏｌ（登録商標）またはＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）を用いて、ＲＮＡ抽出のために保存した。次に、凝固させた血液サンプルを、室温で、１２００ｇで、１０分間、遠心分離を行った。血清（浮遊物）を除去し、２つの新しい管に入れ、血清を−８０℃で保存した。
【０２０２】
Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＢ−１２６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を利用するＲＮＡ抽出に関しては、０．２ｍＬの全血または血漿あたり２０μＬの５Ｎ酢酸が補完される、０．７５ｍＬのＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ ＢＤに、０．２ｍＬの全血または血漿を添加した。管を振盪し、−８０℃で保存した。ＰＡＸｇｅｎｅ（登録商標）を利用して、管を、約２時間、室温でインキュベートした。次いで、管をそれらの側に置き、−２０℃の冷凍庫で２４時間保存し、次いで、長期保存のため、−８０℃へ移動させた。
【０２０３】
Ｌｕｍｉｎｅｘ分析。Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームにより、マイクロビーズ分析は、抗体関連の結合反応に対する基質として利用され、これは、光度ユニットにおいて、読み出され、定量化標準と比較することができる。各血液サンプルは、２つのサンプルとして同時に検査した。測定ユニットは、光度ユニットであり、群は、ＯＶＡ刺激された対照群、ＯＶＡ刺激された処置群、および食塩水刺激された独自の流体による処置群に分けられた。
【０２０４】
アジレント遺伝子アレイデータ生成のために、肺組織を単離し、ＴＲＩ試薬（ＴＲ１１８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）中に浸水した。簡潔に述べると、約１ｍＬのＴＲＩ試薬を、各管中の５０〜１００ｍｇの組織に添加した。サンプルは、ガラス製Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）またはＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザーを用いて、ＴＲＩ試薬中で均質化された。サンプルは、−８０℃で保存した。
【０２０５】
血液サンプルからの結果。各血液サンプルは、２つのサンプルに分けられ、サンプルは、同時に検査した。測定のユニットは、光度のユニットおよび群であり、左から右に向かって、ＯＶＡ刺激された対照、ＯＶＡ刺激されたＲｅｖａｌｅｓｉｏ処置、次いで、食塩水刺激された処置、および食塩水刺激されたＲｅｖａｌｅｓｉｏ処置である。概説を容易にするために、ＲＤＣ１６７６−０１群は共に、グレー影付き背景で強調表示され、一方、食塩水対照処置群は、影なし背景である。
【０２０６】
概して、２つの左の群と比較すると、ＲＤＣ１６７６−０１群データの広がりは、若干大きく、一方、全体として、ＲＤＣ１６７６−０１群の特定のサイトカインレベルは、対照処置群のサンプルよりも小さく、一般に、２群間での約３０％の数値の差異がある。概して、最右の２つの群を比較すると、ＲＤＣ１６７６−０１群は、ＲＤＣ１６７６−００群と比較して、わずかに高い数値を有する。
【０２０７】
出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＲＡＮＴＥＳ（ＩＬ−８スーパーファミリー）のレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったと判定した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体が、食塩水のみで暴露された群により産生されたものと比較して、ＭＣＰ−１をより低いレベルで産生させたことを示した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＴＮＦαのレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったと判定した。
【０２０８】
さらに、出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＭＩＰ−１αのレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったことを示した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体が、食塩水のみで暴露された群により産生されたものと比較して、ＩＬ−１αをより低いレベルで産生させたことを示した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＶｃａｍのレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったことを観察した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体での処理後に産生されるＩＬ−１βのレベルが、食塩水のみで暴露された群により産生されるものよりも低かったことを観察した。出願者は、本発明の界面動電的に改変された流体が、食塩水のみで暴露された群により産生されたものと比較して、エオタキシンおよびＭＣＰ−３をより低いレベルで産生させたことを示した。
【０２０９】
要約すると、既知の感作に対する炎症反応のこの標準アッセイは、少なくとも血液サンプルにおいて、著しい臨床的かつ血清学的作用を生じた。加えて、著しい数の対照動物が、プロセスにおいて、生理学的にストレスを感じ、危うく死亡するところであったが、ＲＤＣ１６７６−０１処置群のいずれも、このような臨床的なストレス効果を示さなかった。次いで、これは、ＲＤＣ１６７６−０１処置群と、ＯＶＡ刺激群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群との間で約３０％の差異を有する、サイトカインの血中濃度において、反映された。対照的に、ＲＤＣ１６７６−０１処置群と、ＯＶＡ無刺激群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群との間でのサイトカイン、細胞、および血清学的プロファイルの小量、かつごくわずかな変化があり、これは、流体自体の最小限のベースラインの変化を単に示すと考えられる。
【０２１０】
実施例３
（Ｔ細胞増殖を調節するための本発明の界面動電的に改変された流体の効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、比較的に低下した増殖により示されるように、制御性Ｔ細胞機能を改善した。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０２１１】
Ｔ細胞を制御するための本明細書に開示される特定の実施形態の能力を、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することにより研究した。一般に、これらの刺激を受けたＴ細胞は増殖する。しかしながら、制御性Ｔ細胞の導入において、通常のＴ細胞増殖は、抑制される。
【０２１２】
方法。簡潔に述べると、選別に使用されるＦＩＴＣ共役型抗ＣＤ２５（ＡＣＴ−１）抗体は、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から購入した。使用した他の抗体は、以下の通りであった。ＣＤ３（可溶条件に対してＨＩＴ３ａ）、ＧＩＴＲ（ＰＥ共役型）、ＣＤ４（Ｃｙ−５およびＦＩＴＣ共役型）、ＣＤ２５（ＡＰＣ共役型）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２クローン）、ＣＤ１２７−ＡＰＣ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ（ＰＥ共役型）、ＦｏｘＰ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、マウスＩｇＧ１（イソタイプ制御）、およびＸＣＬ１抗体。全ての抗体は、製造業者の取扱説明書に従って使用した。
【０２１３】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｒｏｓｅｔｔｅキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、末梢全血から単離された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥ、および抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体でインキュベートした。細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ／ｎＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５反応性Ｔ細胞にＦＡＣＳＡｒｉａを用いて、フローサイトメトリーにより選別された。
【０２１４】
丸底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、抑制アッセイを行った。指示されたように、３．７５×１０３ ＣＤ４＋ＣＤ２５陰性反応性Ｔ細胞、３．７５×１０３ 自己Ｔ制御性、３．７５×１０４ 同種照射ＣＤ３減損ＰＢＭＣを添加した。全てのウェルは、抗ＣＤ３（５．０ｕｇ／ｍＬで、クローンＨＩＴ３ａ）で補完した。Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清で補完したＲＰＭＩ １６４０培地中で、３７℃で、７日間、培養された。インキュベーションが終了する１６時間前、１．０ｍＣｉの^３Ｈ−チミジンを、各ウェルに添加した。プレートは、Ｔｏｍｔｅｃ細胞ハーベスターを用いて収穫し、^３Ｈ−チミジン組み込みは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒシンチレーションカウンターを用いて決定した。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＳｔｅｍＳｅｐヒトＣＤ３＋Ｔ細胞枯渇（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、次いで、４０Ｇｙの照射を用いて、Ｔ細胞から枯渇した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなった。
【０２１５】
制御性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８条件で刺激を受け、次いで、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｒｅｄ生存能の染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびに表面マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７で染色した。細胞は、Ｌｙｚｅ／Ｆｉｘ ＰｈｏｓＦｌｏｗ（登録商標）緩衝液中で固定し、変性Ｐｅｒｍｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（登録商標）中で透過した。次いで、細胞をそれぞれの特定の選択された分子に対して抗体で染色した。
【０２１６】
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、統計的分析を行った。両側不対スチューデントｔ検定を使用することにより２群間の比較を行った。１方向ＡＮＯＶＡを使用することにより３群間の比較を行った。０．０５未満のＰ値が、有意であると見なされた（両側）。２群間の相関は、ｒ値が、０．７を上回るか、または−０．７未満である場合、スピアマン係数を介して統計的に有意であることを決定した（両側）。
【０２１７】
結果。制御性Ｔ細胞の増殖は、ディーゼル排出微粒子状物質（ＥＰＡからのＰＭ）で細胞を刺激することにより研究された。出願者は、ＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）で刺激された細胞が分泌されたＩＬ−１０の低下を生じた一方で、本開示の流体の存在下で、ＰＭに曝露される細胞（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、ＩＬ−１０の維持された産生またはわずかに低下した産生を生じたと判定した。更に、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０、先端ジフテリア毒素分子；標準市販濃度の１：５０の希釈）を、本発明の流体サンプルに滴定し、ＩＬ−１０の増加のＲｅｖ媒介された効果を遮断した。Ｒｅｖのみによる処置が、食塩水および培地対照と比較して、より高いＩＬ−１０レベルを生じたことに留意されたい。同様の結果を、それぞれ、ＧＩＴＲ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ５、およびＦｏｘｐ３で得た。
【０２１８】
出願者はまた、トリプターゼを評価する末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）から得られる、ＡＡ ＰＢＭＣデータを得た。ＡＡ ＰＢＭＣデータは、粒子状物質（ＰＭ）で刺激された細胞が、高レベルのトリプターゼを示した際、上記のＴ制御性細胞データと一致したが、一方、本開示の流体の存在下で、ＰＭによる処置した細胞（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）は、食塩水および培地対照のものと同様に有意に低いトリプターゼレベルを生じた。Ｔ制御性細胞からのデータと一致して、ＤＴ３９０への暴露は、トリプターゼレベルにおけるＲｅｖ媒介効果を遮断し、ＰＭのみ（−Ｒｅｖ、Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）に見られたように、細胞中に上昇したレベルのトリプターゼを生じた。Ｒｅｖのみによる処置は、食塩水および培地対照と比較してより低いトリプターゼレベルを生じた。
【０２１９】
要約すると、出願者は、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、増殖の低下を観察し、アッセイにおいて、比較的に低下した増殖により示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖが、制御性Ｔ細胞機能を改善したことを示す。更に、証拠は、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断がＴｒｅｇ機能におけるＲｅｖｅｒａの活性に影響を及ぼすことを示す。
実施例４
（本発明の界面動電的に改変された流体とブデソニドとの間の相乗効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、アレルギー喘息に対する当該技術分野において認識されている動物モデルにおいて、インビボでブデソニドを用いて、相乗抗炎症効果を提供した。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０２２０】
出願者は、最初に、Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットオボアルブミン感作モデルにおいて、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ−１６７６−０３）の気道抗炎症特性を評価するために実験を行った。Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットは、気道機能における試験材料の効果を決定するための当該技術分野において認識されているモデルであり、この系統は、例えば、アレルギー喘息のモデルとして幅広く使用されている。このモデルにおいてオボアルブミン感作により誘発された気道病変および生化学的変化は、ヒトに観察されたものと類似している（Ｅｌｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ ８８：９５１−６０，１９９１、Ｓｉｒｏｉｓ ＆ Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２６：９−１５，２００１）。吸入経路は、試験材料または対照溶液への肺暴露を最大限にするように選択された。オボアルブミン感作動物は、オボアルブミン刺激する前の７日間、ブデソニド単独で、または試験材料ＲＤＣ １６７６−０３と組み合わせて、処置された。刺激してから６時間および２４時間後、全血数ならびに幾つかの炎症性および抗炎症サイトカインのレベル、ならびに様々な呼吸パラメータを測定して、様々な炎症性パラメータにおける試験材料を投与する任意の有益な効果を推定した。
【０２２１】
材料および方法：
実験の開始時で、約２７５±５０ｇの体重がある、Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットの系統Ｂｎ／Ｃｒｌを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｋｉｎｇｓｔｏｎから取得した。全ての動物研究は、ＰＣＳ−ＭＴＬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を得て行われた。研究時、動物の使用およびケアは、ＵＳＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｏｕｎｃｉｌならびにＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅのガイドラインに従って行われた。
【０２２２】
感作。実験の１日目に、動物（各処置群において１４匹の動物）は、１ｍＬの０．９％ 塩化ナトリウムあたり２ｍｇ オボアルブミン／１００ｍｇ 水酸化アルミニウムの新しく調製された溶液の１ｍＬの腹腔内注射の投与により感作され、次いで、３日目に注射を繰り返した。
【０２２３】
処置。処置初期感作から１５日後、動物に、対照（生理食塩水）または試験溶液（界面動電的に生成された流体ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ−１６７６−０３）への噴霧暴露を施し、連続７日間、１日１回１５分間、単独で、またはブデソニドと組み合わせて投与した。動物は、約２０Ｌの全身チャンバ中で投薬され、試験環境は、Ｂｕｘｃｏバイアス流動ポンプからの空気が供給されたエアロネブ超音波ネブライザーを用いて、チャンバの空気入口に生成された。気流速度は、１０リットル／分で設定された。
【０２２４】
オボアルブミン刺激。２１日目に、試験溶液で処置してから２時間後、全ての動物は、１％ オボアルブミン噴霧溶液で、１５分間、刺激された（気流２Ｌ／分で全身チャンバ中）。
【０２２５】
サンプル収集。オボアルブミン刺激してから６および２４時間の時点で、血液サンプルは、全および差動血液細胞数、ならびに様々な炎症性および抗炎症サイトカインのレベルを測定するために、採血された。加えて、オボアルブミン刺激してから６および２４時間直後、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ Ｐｅｎｈおよび１回換気量を、Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ ＸＡシステムを用いて、１０分間測定した。
【０２２６】
結果：
好酸球数：予想されるように、ブデソニドによる処置（「ＮＳ＋ブデソニド７５０μｇ／Ｋｇ」；細かい斜線の棒グラフ）は、生理食塩水「ＮＳ」単独での対照による処置と比較して、刺激された動物における全好酸球数を低下させた。追加として、本発明の流体「ＲＤＣ１６７６−０３」単独による処置は、好酸球数を有意に低下させなかったが、それでもなお、好酸球数を低下させる際、ブデソニドとの実質的な相乗効果（「ＲＤＣ１６７６−０３＋ブデソニド７５０μｇ／Ｋｇ」）を示した。同様に、好酸球率はまた、同様の傾向を示した。ＲＤＣ１６７６−０３またはブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇ単独では、刺激された動物において、好酸球率において有意な効果を有さなかったが、組み合わせた２つは、好酸球率を有意に低下させた。
【０２２７】
したがって、出願者は、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−０３）は、ヒトアレルギー喘息に対する当該分野において認識されているラットモデルにおいて、好酸球数（「好酸球率」および全数）を有意に低下させるように、ブデソニドと組み合わせて、実質的な相乗的有用性を有すると判定した。
【０２２８】
呼吸パラメータ：
出願者はまた、オボアルブミン刺激から６および２４時間後、直後に測定されるように、Ｐｅｎｈおよび１回換気量における試験流体の観察された効果を示した。Ｐｅｎｈは、ピーク吸気流、ピーク呼気流、および呼気時間から得られた誘導値であり、ｐｅｎｈ値の低下は、肺機能の有益な結果を反映する。
【０２２９】
Ｐｅｎｈ＝（ピーク呼気流／ピーク吸気流）＊（呼気時間／呼気容量の６５％を呼気するため時間−１）。
【０２３０】
ブデソニド（５００および７５０ｕｇ／ｋｇの双方で）単独での、または試験流体のいずれかとの組み合わせによる処置は、刺激直後のＰｅｎｈ値に有意に影響を及ぼさなかった。しかしながら、刺激から６時間後、ＲＤＣ１６７６−０３単独での、またはブデソニド５００もしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせによる処置を行った動物は、Ｐｅｎｈ値の大幅な低下を示した。この低下の範囲は、刺激してから２４時間後には消失したが、ブデソニドおよびＲＤＣ流体の相乗効果の傾向は、この時点で更に観察された。
【０２３１】
１回換気量は、呼気終末位から吸気中の肺に吸い込まれる空気容量であり、これは、安静呼吸の間の呼気中、受動的に肺を排気される。ブデソニド単独により処置される動物は、刺激直後、１回換気量の変化がないことを示した。しかしながら、ＲＤＣ１６７６−０３単独では、この初期時点でさえ、１回換気量における有意な促進効果があった。さらに、ブデソニド（５００および７５０ｕｇ／ｋｇの双方）と組み合わせたＲＤＣ１６７６−０３は、この時点で、１回換気量の測定における更になお顕著な効果があった。刺激から６時間後、ＲＤＣ１６７６−０３単独では、１回換気量の有意な増加を生じるのに十分であり、単独で、または組み合わせた、治療レジメンへのブデソニドの添加は、１回換気量における更なる効果がなかった。しかしながら、これらの早期時点で観察された任意の効果は、２４時間の時点までに消失した。
【０２３２】
総合すれば、刺激してから６時間後、１回換気量の増加およびＰｅｎｈ値の低下により証明されるように、これらのデータは、ＲＤＣ１６７６−０３単独で、またはブデソニドと組み合わせて、気道炎症の著しい緩和を提供したことを示す。
【０２３３】
サイトカイン分析：
上記で論じられた生理学的パラメータに見られる効果の機構を分析するために、多数の炎症性ならびに抗炎症サイトカインは、刺激してから６および２４時間後、次いで、生理学的測定の直後、採血された血液サンプルにおいて測定された。
【０２３４】
出願者は、Ｒｅｖ ６０（またはＲＤＣ１６７６−０３）単独では、刺激してから６および２４時間後の双方で、有意にエオタキシンの血液レベルを低下させたことを観察した。ブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇはまた、これらの時点の双方で、血液エオタキシンレベルを軽減したが、一方、ブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇ単独は、後の時点で、顕著な効果があった。しかしながら、試験溶液Ｒｅｖ ６０単独では、双方の時点で、ブデソニドの双方の濃度よりも更に著しく強力な（血液エオタキシンレベルを低下させる際）効果を示した。エオタキシンは、喘息の肺およびアレルギー反応における他の組織（例えば、クローン病の腸）に好酸球を蓄積し、かつ好酸球を誘引することで知られている、小量のＣ−Ｃケモカインである。エオタキシンは、Ｇタンパク質共役型受容体ＣＣＲ３に結合する。ＣＣＲ３は、Ｔｈ２リンパ球、好塩基球およびマスト細胞等の多くの細胞型により発現されるが、Ｔｈ２リンパ球によるこの受容体の発現は、これらの細胞が、好酸球動員を調節する際、特定の対象となる。幾つかの研究は、喘息肺における、エオタキシンおよびＣＣＲ３の産生増加、ならびにこれらの分子と気道過敏性との間の関連を構築することを示している（Ｅｏｔａｘｉｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｔｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ ｔｏ ｔｈｅ ａｓｔｈｍａｔｉｃ ｌｕｎｇ，Ｄｏｌｏｒｅｓ Ｍ Ｃｏｎｒｏｙ ａｎｄ Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｊ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１，２：１５０−１５６において総説）。
【０２３５】
総合すれば、これらの結果は、ＲＤＣ１６７６−０３単独での、またはブデソニドと組み合わせた処置が、オボアルブミン刺激から２４時間後、総好酸球数および血中濃度を著しく低下させることができることを強く示唆する。これは、刺激してから早ければ６時間後に観察された、血液中のエオタキシンレベルの大幅な低下と相関する。
【０２３６】
２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンγの血液レベルはまた、Ｒｅｖ ６０単独での、またはブデソニドと組み合わせた処置の結果として、刺激してから６時間後に、著しく増強される。出願者は、インターフェロンγおよびＩＬ１０における効果を、それぞれ観察した。Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせたＲｅｖ６０は、刺激してから最長６時間、刺激された動物において、ＩＬ１０の血液レベルを著しく増加させた。同様に、Ｒｅｖ ６０単独で、またはブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇもしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせたＲｅｖ ６０は、刺激してから６時間後、ＩＦＮγの血液レベルを著しく増加させた。これらの抗炎症サイトカインの増加は、刺激してから６時間後に見られる、生理学的呼吸パラメータに見られる有益な効果を、少なくともある程度、十分に説明し得る。これらのサイトカインにおける効果は、刺激してから２４時間後、もはや観察されなかった（データは示さず）。
【０２３７】
ＲａｎｔｅｓまたはＣＣＬ５は、循環型Ｔ細胞により発現したサイトカインであり、Ｔ細胞、好酸球および好塩基球に対して走化性であり、炎症性部位に白血球を動員するのに積極的な役割を果たす。Ｒａｎｔｅｓはまた、例えば、好酸球カチオン性タンパク質を放出する好酸球を活性化する。好酸球の密度を変化させ、好酸球を低濃度にし、これは、一般的な細胞活性化の状態を示すと考えられる。Ｒａｎｔｅｓはまた、好酸球に対して特異的な酸化的代謝の強力な活性剤でもある。
【０２３８】
出願者は、Ｒａｎｔｅｓの全身レベルは、Ｒｅｖ ６０単独で、またはブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇもしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせて処置された動物において、刺激してから６時間後、著しく低下したが、２４時間後は、低下しなかったことを観察した。前と同様に、ブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇおよびＲｅｖ ６０の明らかな相乗効果があった。同様の下方傾向は、ＫＣまたはＩＬ８、ＭＣＰ３、ＩＬ１ｂ、ＧＣＳＦ、ＴＧＦｂ、ならびにＮＧＦ等の多くの他の炎症性サイトカインにおいて観察され、Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニドと組み合わせて処置された動物において、刺激してから６時間後、あるいは２４時間後のいずれかで観察された。
【０２３９】
実施例５
（細胞間密着結合に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、細胞間密着結合を調節することが示された。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０２４０】
特定の態様によれば、本発明の拡散処理された治療流体は、細胞間密着結合を調節するための実質的な有用性を有し、これには、肺および全身送達と関連するもの、ならびに例示的なポリペプチドサケカルシトニン（ｓＣＴ）を含む、ポリペプチドのバイオアベイラビリティが挙げられる。
【０２４１】
実施例の要約。サケカルシトニン（ｓＣＴ）は、３，４３２ダルトンの分子量を有する、３２個のアミノ酸ペプチドである。カルシトニンの肺送達は、モデル系（例えば、げっ歯類モデル系、ラットモデル系等）において、肺薬物送達（例えば、気管内薬物送達）を強化するための方法を調査するために、広範囲にわたって研究されている。特定の例示的な態様によれば、本発明の拡散処理された治療流体は、細胞間密着結合、例えば、ラットモデル系において、肺および全身送達と関連するもの、ならびにｓＣＴのバイオアベイラビリティを調節する（例えば、強化する）ために実質的な有用性を有する。
【０２４２】
方法：
気管内薬物送達。特定の実施形態によれば、ｓＣＴは、本発明の治療流体中で製剤化され、気管内薬物送達デバイスを用いて、ラットに投与される。ある態様では、げっ歯類気管内薬物送達のために設計されたＰｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏ−Ｓｐｒａｙｅｒデバイスを使用して、良好な肺送達を可能にさせるが、当該技術分野において理解されるように、ペプチドの不良な全身バイオアベイラビリティをもたらす比較的低い肺胞沈着がある。特定の態様によれば、この当該分野において認識されているモデル系を使用して、本発明の拡散処理した治療流体が、細胞間密着結合（肺および全身送達と関連するもの、ならびにポリペプチドのバイオアベイラビリティを含む）を調節する（例えば、強化する）ために実質的な有用性を有することを確認した。
【０２４３】
動物群および用量。ある態様では、ラットは、以下の３つの群のうちの１つに割り付けられる（１群あたりｎ＝６）：ａ）滅菌食塩水、ｂ）Ｏ_２富化しない基礎液（「基礎液」）、またはｃ）本発明の拡散処理された治療流体（「本発明の富化ベースの溶液」）。本発明の富化ベースの溶液は、例えば、０．９％ 食塩水中で酸素を注入することにより形成される。好ましくは、基礎液は、上皮細胞の低浸透圧崩壊の可能性を最小化するように、約０．９％ 食塩水を含む。ある実施形態では、ｓＣＴは、基礎液および本発明の富化ベースの溶液において、別々に再構成され、６０分以内で、それぞれの動物群に気道内注入により送達される（１動物あたり２００μＬ中の１０μｇ ｓＣＴ）。
【０２４４】
アッセイ。特定の態様では、血液サンプル（例えば、２００μＬ）を採取し、投薬する前、ならびに投薬してから５、１０、２０、３０、６０、１２０、および２４０分後、ＥＤＴＡコーティングされた管に挿入する。血漿を、収穫し、ＥＬＩＳＡを用いて、ｓＣＴのアッセイを行うまで、−７０℃以下で保存した。
【０２４５】
アジレント遺伝子アレイデータ生成のために、肺組織を単離し、ＴＲＩ試薬（ＴＲ１１８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）中に浸水した。簡潔に述べると、約１ｍＬのＴＲＩ試薬を、各管中の５０〜１００ｍｇの組織に添加した。サンプルは、ガラス製Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）またはＰｏｌｙｔｒｏｎ（登録商標）ホモジナイザーを用いて、ＴＲＩ試薬中で均質化された。サンプルは、−８０℃で保存した。
【０２４６】
結果：
密着結合の強化。出願者は、ＲＤＣ１６７６−０１（更に添加された酸素を用いて、本開示の独自のデバイスを通して処理した滅菌食塩水、本開示のガス富化界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））が、全身送達およびｓＣＴのバイオアベイラビリティを低下させたことを観察した。特定の態様によれば、全身送達の低下は、ｓＣＴの吸着の低下に由来し、肺密着結合の強化に由来する可能性が最も高い。ＲＤＣ１６７６−００は、本開示の方法に従って処理したが、酸素化されていない、滅菌食塩水を示す。
【０２４７】
追加として、特定の態様によれば、密着結合関連タンパク質は、肺組織中で上方調節された。出願者は、結合接着分子ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４、および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１）のそれぞれの上方調節を示した。
【０２４８】
実施例６
（全細胞伝導性に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に改変された流体は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において行われたパッチクランプ分析により示されるように、全細胞伝導性を減少させた。本発明の界面動電的に生成された流体（ＲＮＳ−６０）で灌流された気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において行われたパッチクランプ分析は、ＲＮＳ−６０への暴露が、全細胞伝導性の低下をもたらしたことを明らかにした。さらに、全細胞伝導性を劇的に増加させたｃＡＭＰ刺激「カクテル」での刺激はまた、全細胞伝導性の薬物感受性部分も増加させ、これは、基本条件下で観察されたものよりも１０倍高かった。本実施例に開示される結果は、出願者の国際公開第２００９／０５５７２９号にも開示されている。
【０２４９】
パッチクランプ研究を行い、膜構造、膜電位、または膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、ならびにカルシウム依存性細胞伝達システムのうちの少なくとも１つの調節により細胞内シグナル変換を調節するための本発明の界面動電的に生成された流体の有用性を更に確認した。
【０２５０】
要約。出願者は、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して、本開示の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ、ガス富化した界面動電的に生成された流体）で増加したことを示した。追加として、出願者は、微粒子状物質（ＰＭ）で刺激されたＴ制御性細胞の文脈において、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、Ｔ制御性細胞の増殖の低下があり、例えば、アッセイにおいて、比較的低下した増殖により示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖは、制御性Ｔ細胞機能を改善したことを示した。更に、本発明の流体への暴露は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、ＩＬ−１０の維持された、または若干低下した産生を生じた。同様に、粒子状物質（ＰＭ）で刺激された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）プロファイルの文脈において、データは、本開示の流体（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）への暴露は、食塩水および培地対照のレベルと同様の有意に低いトリプターゼレベルをもたらすことを示した。追加として、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０）効果は、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断が、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ機能における界面動電的に生成された流体の活性に影響を及ぼすことを示す。更に、追加の態様によれば、出願者は、本発明の流体に暴露されると、密着結合関連タンパク質が、肺組織中で上方調節されたことを示した。出願者は、結合接着分子ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４、および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１）のそれぞれの上方調節を示した。パッチクランプ研究を行い、前記有用性を更に調査および確認した。
【０２５１】
材料および方法：
気管支上皮細胞株Ｃａｌｕ−３は、パッチクランプ研究に使用した。Ｃａｌｕ−３気管支上皮細胞（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ−５５）は、実験する時まで、ガラス製のカバースリップ上に１０％ ＦＢＳで補完した、１：１のＨａｍ Ｆ１２とＤＭＥＭ培地の混合物において、増殖させた。簡潔に述べると、全細胞電圧クランプデバイスを使用して、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水、場合によっては、「薬物」と称される）に暴露された、Ｃａｌｕ−３細胞における効果を測定した。
【０２５２】
パッチクランプ法を利用して、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性における試験材料（ＲＮＳ−６０）の効果を評価した。具体的には、全細胞電圧クランプは、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−メチルＤ−グルカミンでｐＨを７．４まで調整）からなる浸液中で、気管支上皮細胞株Ｃａｌｕ−３上で行った。基礎電流は、ＲＮＳ−６０が細胞に灌流された後、測定された。
【０２５３】
更に具体的には、パッチピペットは、２段階のＮａｒｉｓｈｉｇｅ ＰＢ−７ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｐｕｌｌｅｒを用いて、ホウケイ酸ガラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から引き上げ、次いで、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ ＭＦ−９マイクロフォージ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＵＳＡ，Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ，ＮＹ）を用いて、６〜１２メガオームの抵抗までファイヤーポリッシュされた。ピペットは、１３５ ＫＣｌ、１０ ＮａＣｌ、５ ＥＧＴＡ、１０ Ｈｅｐｅｓを含有する細胞内液（ｍＭ中）で充填され、ＮＭＤＧ（Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）を用いてｐＨを７．４まで調整した。
【０２５４】
培養されたＣａｌｕ−３細胞は、以下の細胞外溶液（ｍＭ）：１３５ ＮａＣｌ、５ ＫＣｌ、１．２ ＣａＣｌ２、０．５ ＭｇＣｌ２、および１０ Ｈｅｐｅｓ（遊離酸）を含有する、チャンバ中に入れ、ＮＭＤＧを用いてｐＨを７．４まで調整した。
【０２５５】
細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の４０Ｘ ＤＩＣ対物レンズを用いて見た。細胞接着型ギガシールを構築した後、軽度の吸引を適用して、全細胞構成に侵入し、全細胞構成を得た。侵入直後、細胞は、−１２０、−６０、−４０、および０ｍＶで電圧クランプされ、±１００ｍＶ間の電圧ステップ（５００ｍｓ／ステップ）で刺激された。対照条件下で、全細胞電流を収集した後、同一の細胞を、上記の対照流体と同一の細胞外溶質およびｐＨを含む、試験流体を用いて、浴槽を通して灌流し、異なる保持電位で全細胞電流を、同一のプロトコルを用いて記録した。
【０２５６】
電気生理学的データは、Ａｘｏｎ Ｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器を用いて取得し、１０ｋＨｚで低域フィルタリングして、１４００Ａ Ｄｉｇｉｄａｔａ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてデジタル化した。ｐＣＬＡＭＰ １０．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、データを取得し、分析した。電流（Ｉ）−電圧（Ｖ）関係（全細胞伝導性）は、ステップに、約４００ミリ秒で実際の電流値、対保持電位（Ｖ）をプロットすることにより得た。Ｉ／Ｖ関係の傾きは、全細胞伝導性である。
【０２５７】
薬物および薬品。示される時にはいつでも、細胞は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（５００ｍＭ）、ＩＢＭＸ（イソブチル−１−メチルキサンチン、２００ｍＭ）、およびホルスコリン（１０ｍＭ）を含有する、ｃＡＭＰ刺激カクテルで刺激された。Ｈ２Ｏ溶液中の２５ｍＭ ストックからｃＡＭＰ類似体８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を使用した。１０ｍＭ ホルスコリンおよび２００ｍＭ ＩＢＭＸストック溶液の双方を含有するＤＭＳＯ溶液からホルスコリン（Ｓｉｇｍａ）およびＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。
【０２５８】
パッチクランプの結果：
出願者は、基礎（ｃＡＭＰなし）条件下で、０ｍＶの保持電位から＋／−１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を判定した。代表的な透写図（対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下での値からの試験平均値の減算により得た複合「差分」透写図を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、少量ではあるが、試験条件による、伝導性の著しい変化を反映する。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体）により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶであった。過分極条件下で、全細胞伝導性の低下があった。
【０２５９】
さらに、出願者は、基礎条件下で、−４０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を判定した。代表的な透写図（対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下での値からの試験平均値の減算により、複合差分透写図を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、少量ではあるが、試験条件による、伝導性の著しい変化を反映した。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体）により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶであった。値は、０ｍＶ プロトコルを用いて得たものと比較的同様であった。
【０２６０】
出願者は、基礎条件下で、−６０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を判定した。代表的な透写図（対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下での値からの試験平均値の減算により、複合差分透写図を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、微量であるが、試験条件による、伝導性の著しい変化を反映した。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶであった。値は、０ｍＶ プロトコルを用いて得たものと比較的同様であった。
【０２６１】
出願者はまた、基礎条件下で、−１２０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を判定した。代表的な透写図（対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下での値からの試験平均値の減算により、複合差分透写図を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、微量であるが、試験条件による、伝導性の著しい変化を反映した。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶであった。値は、０ｍＶ プロトコルを用いて得たものと比較的同様であった。
【０２６２】
さらに、出願者は、ｃＡＭＰ刺激された条件下で、様々な保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて得られる、全細胞電流を判定した。代表的な透写図は、ｎ＝５細胞の平均である。代表的な透写図（対照であり、次いで、ｃＡＭＰ刺激し、次いで、薬物含有溶液で灌流した後の全細胞透写図）は、ｎ＝１２細胞の平均で作製した。対照条件下（ｃＡＭＰのみ）での値からの薬物＋ｃＡＭＰの試験平均値の減算により、複合「差分」透写図（０ｍＶおよび−４０ｍＶにおける電圧プロトコルに対応する）を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、全ての条件下で、高線形であり、試験条件による、伝導性の変化を反映した。
【０２６３】
出願は、ｃＡＭＰ刺激された条件下で、様々な保持電位から±１００ｍＶにステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を示した。代表的な透写図（対照であり、次いで、ｃＡＭＰ刺激し、次いで、薬物含有溶液で灌流した後の全細胞透写図）は、ｎ＝５細胞の平均で作製した。対照条件下（ｃＡＭＰのみ）での値からの薬物＋ｃＡＭＰの試験平均値の減算により、複合「差分」透写図（−６０ｍＶおよび−１２０ｍＶにおける電圧プロトコルに対応する）を得た。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、全ての条件下で、高線形であり、試験条件による、伝導性の変化を反映した。
【０２６４】
出願者はまた、ｃＡＭＰ活性化電流における保持電位の効果を示した。全細胞伝導性における薬物（本発明の界面動電的に生成された流体、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）の効果は、異なる電圧プロトコル（０、−４０、−６０、−１２０ｍＶの保持電位）下で観察された。基礎条件下で、薬物感受性全細胞電流は、全ての保持電位（電圧感度の低い寄与）で同一であった。しかしながら、ｃＡＭＰ活性化条件において、薬物感受性電流は、更に高く、印加した電圧プロトコルに対して感受性があった。電流−電圧関係は、高度に非線形である。これは、減算された電流において更に観察され、０ｍＶでの全細胞伝導性の寄与は、各プロトコルに対して更に減算された（ｎ＝５）。
【０２６５】
実施例の概要。したがって、特定の態様によれば、データは、基礎条件下で、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）の少量ではあるが、一貫した効果があることを示す。全細胞伝導性における薬物の効果を増強するために、実験はまた、ｃＡＭＰ刺激「カクテル」での刺激後、薬物を灌流することにより行われ、これは、全細胞伝導性を劇的に増加させた。興味深いことに、このプロトコルはまた、全細胞伝導性の薬物感受性部分も増加させ、これは、基礎条件下で観測されたものよりも１０倍高かった。追加として、ｃＡＭＰ刺激の存在下で、薬物は、様々な電圧プロトコルに対して異なる効果を示し、界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性の寄与に影響を及ぼすことを示す。伝導性の線形成分の減少もあり、これは、別の経路（例えば、イオンチャネル、電位依存陽イオンチャネル等）の阻害への薬物の少なくとも１つの寄与を更に示唆している。
【０２６６】
特定の態様では、機構に拘束されるわけではないが、出願者のデータは、原形質膜から遮断されるか、または回収される、チャネルの変化を生成する、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）と一致する。
【０２６７】
出願者の他のデータを総合すれば、本発明の特定の態様は、膜構造、膜電位もしくは膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、およびカルシウム依存性の細胞内シグナリングシステムのうちの少なくとも１つの調節を含む、細胞内シグナル変換を調節するための組成物および方法を提供し、これは、ＧＰＣＲおよび／またはｇタンパク質、ならびにＴＳＬＰが挙げられるが、これらに限定されない、膜構造（例えば、膜および／または膜タンパク質、受容体、または他の成分）の電気化学および／または立体構造の変化を与えるための本発明の界面動電的に生成された溶液の使用を含む。追加の態様によれば、これらの効果は、遺伝子発現を調節し、例えば、個々の伝達成分の半減期等に依存して、持続し得る。
【０２６８】
実施例７
（全細胞伝導性に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を判定した）
要約。本発明の界面動電的に生成された流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）で灌流されたＣａｌｕ−３細胞において行われたパッチクランプ分析は、（ｉ）ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓへの暴露が、全細胞伝導性の増加をもたらした、（ｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の暴露が、１５分間のインキュベーション時間で明らかな、非線形伝導性の増加を生じた、および（ｉｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の暴露が、カルシウム透過性チャネルにおけるＲＮＳ−６０食塩水の効果を生じたことを示した。出願者は、パッチクランプ研究を行い、本明細書に記載される、全細胞電流を調節するための有用性を含む、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。２セットの実験を行った。
【０２６９】
第１のセットの実験のデータの概要は、Ｓｏｌａｓ食塩水を用いて得た全細胞伝導性（電流−電圧関係）は、双方のインキュベーション時間（１５分間、２時間）、および全ての電圧プロトコルに対して、高度な線形であることを示す。しかしながら、Ｓｏｌａｓを用いた、更に長時間のインキュベーション（２時間）が、全細胞伝導性を増加させたことは明らかである。ＲＮＳ−６０への細胞の暴露は、デルタ電流（Ｒｅｖ−Ｓｏｌ減算）に示されるように、非線形伝導性の増加を生じ、これは、１５分間のインキュベーション時間でのみ明らかである。この非線形電流におけるＲＮＳ−６０の効果は、消失し、その代わりに、２時間のインキュベーション時間での高度な線形がある。全ての電圧プロトコルで存在するが、非線形全細胞伝導性の寄与は、上で観察されるように、電圧感受性があった。
【０２７０】
第２のセットの実験のデータの概要は、非線形電流において、ＲＮＳ−６０食塩水の効果があることを示し、これは、外液中の高カルシウムにおいて明らかにされた。非線形全細胞伝導性の寄与は、電圧感受性ではあるが、双方の電圧プロトコルに存在し、カルシウム透過性チャネルにおけるＲＮＳ−６０食塩水の効果を示す。
【０２７１】
第１のセットの実験（伝導性の増加、および非線形電圧調節された伝導性の活性化）
第１のセットの実験のための方法。一般的なパッチクランプ法に関しては、上記を参照のこと。以下の第１のセットの実験において、パッチクランプ研究を行い、基礎条件下で、Ｃａｌｕ−３細胞を用いて、０ｍＶ保持電位、−１２０ｍＶ、あるいは−６０ｍＶのいずれかからステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を調節するための、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。
【０２７２】
いずれの場合にも、全細胞伝導性は、１５分間、あるいは２時間のいずれかでインキュベートされた細胞から得た、電流−電圧関係から得た。本研究において、群は、ＳｏｌａｓあるいはＲＮＳ−６０食塩水溶液に対して、既定の時間で得た。得られたデータは、５〜９個の細胞に対して、平均値±ＳＥＭ全細胞電流として表す。
【０２７３】
結果。図３Ａ〜Ｃは、２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、および異なる電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。結果は、ＲＮＳ−６０（黒丸）は、Ｓｏｌａｓ（白丸）よりも全細胞伝導性におけるより大きな効果があることを示す。実験において、同様の結果が、３つの電圧プロトコルにおいて、および１５分および２時間のインキュベーション時点で見られた。
【０２７４】
図４Ａ〜Ｃは、３つの電圧プロトコル（「デルタ電流」））（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、および２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからのＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。これらのデータは、ＲＮＳ−６０を用いた１５分間の時点で、２時間の時点で、不在する非線形電位依存性成分があることを示した。前の実験等の場合、「生理」食塩水を用いたデータは、参照として使用された、非常に一貫した、時間依存性伝導性を得た。本結果は、ＳｏｌａｓあるいはＲＮＳ−６０食塩水のいずれかと群を一致させることにより得られ、基礎条件（ｃＡＭＰなし、または任意の他の刺激なし）下で、ＲＮＳ−６０食塩水へのＣａｌｕ−３細胞の暴露は、時間依存性効果を生成し、より短期のインキュベーション時間（１５分間）で、電圧調節された伝導性の活性化と一致することを示す。この現象は、２時間のインキュベーション時点では明らかではなかった。本明細書の他の箇所で記載されるように、線形成分は、伝導性が、ｃＡＭＰ「カクテル」での刺激により増加する際、更に明らかである。それでもなお、２時間のインキュベーション時間は、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ食塩水の双方に対してより高い線形伝導性を示し、この場合、ＲＮＳ−６０食塩水は、Ｓｏｌａｓ単独と比較して、全細胞伝導性が倍になった。この証拠は、全細胞伝導性への少なくとも２つの寄与、即ち、非線形電圧調整された伝導性および線形伝導性の活性化が、ＲＮＳ−６０食塩水により影響を受け、これは、更に長時間のインキュベーション時間で、更に明らかである。
【０２７５】
第２のセットの実験（カルシウム透過性チャネルにおける効果）
第２のセットの実験のための方法。一般的なパッチクランプ法に関しては、上記を参照のこと。以下の第２のセットの実験において、なお更なるパッチクランプ研究を行い、基礎条件下で、Ｃａｌｕ−３細胞を用いて、０ｍＶあるいは−１２０ｍＶのいずれかの保持電位からステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を調節するための、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。
【０２７６】
いずれの場合にも、全細胞伝導性は、いずれかの食塩水を用いて、１５分間、インキュベートされた細胞から得た電流−電圧関係から得た。全細胞伝導性へのカルシウム透過性チャネルの寄与があるかどうか、および全細胞伝導性のこの部分が、ＲＮＳ−６０食塩水を用いたインキュベーションにより影響を受けるかどうかを決定するために、細胞は、インキュベーション期間後、生理食塩水中にパッチされた（高ＮａＣｌの外部溶液を伴うが、内部溶液は、高ＫＣｌを含有する）。次いで、外部食塩水は、ＮａＣｌをＣｓＣｌにより置換した溶液と置換し、主要な外部陽イオンを置換することにより、伝導性の変化があるかどうかを判定した。これらの条件下で、同一の細胞は、次いで、カルシウム入力ステップが、更に明らかにされるように、増加濃度のカルシウムに暴露された。
【０２７７】
結果：図５Ａ〜Ｄは、異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。これらの実験において、１５分間の一時点を使用した。Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）に関して、結果は、１）外部溶液として、ＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（四角印）を用いて、対照（ひし形印）と比較した際、線形挙動と共に全細胞伝導性が増加したこと、ならびに２）２０ｍＭ ＣａＣｌ_２（丸印）および４０ｍＭ ＣａＣｌ_２（三角印）の双方で、ＣａＣｌ_２は、非線形法において、全細胞伝導性を増加させたことを示す。ＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ）に関して、結果は、１）外部溶液として、ＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（四角印）を用いて、対照（ひし形印）と比較した際、全細胞伝導性における効果がほとんどなかったこと、ならびに２）４０ｍＭでのＣａＣｌ_２（三角印）は、非線形法において、全細胞伝導性を増加させたことを示す。
【０２７８】
図６Ａ〜Ｄは、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２（ひし形印）および４０ｍＭ ＣａＣｌ_２（四角印）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図５に示す）の減算から生じるグラフを示す。結果は、ＳｏｌａｓおよびＲＮＳ−６０溶液は共に、カルシウム誘発された非線形全細胞伝導性を活性化したことを示す。ＲＮＳ−６０（投与量反応性を示す）を用いた場合の効果が、より大きく、ＲＮＳ−６０を用いた場合のみ、より高いカルシウム濃度で増加した。更に、より高いカルシウム濃度で、非線形カルシウム依存性伝導性はまた、電圧プロトコルにより増加した。
【０２７９】
この第２のセットの実験のデータは、Ｃａｌｕ−３細胞中で得られた全細胞伝導性データに対して、ＲＮＳ−６０食塩水およびＳｏｌａｓ食塩水の効果を更に示す。データは、いずれかの食塩水を用いた１５分間のインキュベーションは、全細胞伝導性における明らかな効果を生じることを示し、これは、ＲＮＳ−６０を用いた場合、最も明らかであり、外部カルシウムが増加する際、ＲＮＳ−６０食塩水は、全細胞伝導性のカルシウム依存性非線形成分を増加させることをさらに示す。
【０２８０】
蓄積された証拠は、イオンチャネルのＲｅｖａｌｅｓｉｏ食塩水による活性化を示唆し、これは、基底細胞伝導性への異なる寄与をなす。
【０２８１】
出願者の他のデータ（例えば、出願者の他の実施例のデータ）を総合すれば、本発明の特定の態様は、膜構造、膜電位もしくは膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、脂質成分、または細胞により置換可能な細胞内成分（例えば、カルシウム依存性の細胞シグナリングシステム等のシグナル経路）のうちの少なくとも１つの調節を含む、細胞内シグナル変換を調節するための組成物および方法を提供し、これには、ＧＰＣＲおよび／またはｇタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない、膜構造（例えば、膜および／または膜タンパク質、受容体、または他の膜成分）の電気化学および／または立体構造の変化を与えるための本発明の界面動電的に生成された溶液の使用を含む。追加の態様によれば、これらの効果は、遺伝子発現を調節し、例えば、個々の伝達成分の半減期等に依存して、持続し得る。
【０２８２】
実施例８
（全細胞伝導性に対する本発明の界面動電的に改変された流体の効果を調査し、用量反応曲線を生成した）
要約。本実施例において、出願者は、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の希釈の効果を評価した。
【０２８３】
方法。一般的なパッチクランプ法に関しては、上記を参照のこと。以下の実験において、パッチクランプ試験を行い、全細胞電流を調節するための、本発明の界面動電的に生成された食塩流体（ＲＮＳ−６０）の有用性を更に確認した。具体的に、実験は、本発明の界面動電的に生成された食塩流体の希釈の効果を評価した。溶液は、１００％（Ｒｅｖ）、７５％（３：４）、５０％（１：１）、２５％（４：３）、および０％（Ｓａｌ）の濃度で、生理食塩水中で本発明の界面動電的に生成された食塩流体を希釈することによって作製した。
【０２８４】
結果。図７ＡおよびＢは、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、希釈された界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。パネルＡは、グラフに示されるように、各希釈されたサンプルに対する全細胞伝導性の電圧対電流を示す（Ｒｅｖ、３：４、１：１、４：３、およびＳａｌ）。パネルＢは、生理食塩水への希釈を比較する、希釈量対電流の変化を示す。結果は、ＲＮＳ−６０溶液の作用機構が、線形線量反応の形で生じることを示す。
【０２８５】
実施例９
（本発明の界面動電的に生成された流体、ならびに非界面動電的対照加圧ポット流体による一次気管支上皮細胞（ＢＥＣ）の処置は、気道炎症性経路のＭＭＰ９およびＴＳＬＰの２つの主要なタンパク質の発現および／または活性の軽減を生じた）
要約。出願者は、ここで、（Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙバイオセンサー、Ｏｃｔｅｔ Ｒａｐｉｄ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＲＥＤ）（ｆｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）を用いて）、生理食塩水と比較して、本開示の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ；ガス富化界面動電的に生成された流体）の存在下で、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合が濃度依存性であり、結合親和性が増加したことを示している。追加として、ディーゼル排出微粒子状物質（ＰＭ、標準の市販源）で刺激されたＴ制御性細胞の文脈において、出願者のデータは、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、Ｔ制御性細胞の増殖の低下を示し、例えば、アッセイにおいて、比較的低下した増殖により示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖは、制御性Ｔ細胞機能を改善したことを示した。更に、本発明の流体への暴露は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、ＩＬ−１０の維持された産生または若干低下した産生を生じた。同様に、粒子状物質（ＰＭ）で刺激された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）プロファイルの文脈において、データは、本開示の流体（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）への暴露は、食塩水および培地対照のレベルと同様の有意に低いトリプターゼレベルをもたらすことを示した。追加として、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０、先端ジフテリア毒素分子；標準市販濃度の１：５０の希釈）は、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ機能への界面動電的に生成された流体の活性が機能する効果のβ遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断をもたらした。更に、出願者は、本発明の流体に暴露されると、密着結合関連タンパク質（例えば、ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４、および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１））が、肺組織中で上方調節されたことを示した。更に、パッチクランプ試験に示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ；例えば、Ｃａｌｕ−３）において、全細胞伝導性の調節（例えば、過分極条件下で）に影響を及ぼし、追加の態様によれば、全細胞伝導性の調節は、イオンチャネルの調節を反映する。
【０２８６】
本実施例において、出願者は、気道炎症性経路の２つの主要なタンパク質の産生の効果を測定するために、追加の実験を行うことによりこれらの発見を拡大している。具体的には、ＭＭＰ９およびＴＳＬＰは、一次気管支上皮細胞（ＢＥＣ）においてアッセイされた。
【０２８７】
材料および方法：
市販の一次ヒト気管支上皮細胞（ＢＥＣ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，ＧｅｒｍａｎｙからのＨＢＥｐＣ−ｃ）を、これらの研究のために使用した。約５０，０００細胞を、約８０％の密集度に到達するまで、１２ウェルプレートの各ウェル中に平板培養した。次いで、ＦＡＣＳ分析のために引き上げられる前に、ディーゼル排出微粒子状物質（ＤＥＰまたはＰＭ）と共に、１：１０の希釈（１ｍＬの気道上皮成長培地中の１００μＬ）で、生理食塩水、対照流体Ｓｏｌａｓ、非界面動電的対照加圧ポット流体、または試験流体Ｒｅｖｅｒａ ６０を用いて、細胞を、６時間処置した。ＭＭＰ９およびＴＳＬＰ受容体抗体は共に、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得し、製造業者の仕様書のように使用した。
【０２８８】
結果：
図１および２において、ＤＥＰは、ディーゼル排出微粒子状物質（ＰＭ、標準の市販源）単独に曝露された細胞を示し、「ＮＳ」は、生理食塩水単独に曝露された細胞を示し、「ＤＥＰ＋ＮＳ」は、生理食塩水の存在下で、微粒子状物質で処置された細胞を示し、「Ｒｅｖｅｒａ ６０」とは、試験材料にのみに曝露された細胞を指し、「ＤＥＰ＋Ｒｅｖｅｒａ ６０」とは、試験材料Ｒｅｖｅｒａ ６０の存在下で、微粒子状物質で処置された細胞を指す。加えて、「Ｓｏｌａｓ」および「ＤＥＰ＋Ｓｏｌａｓ」は、それぞれ、対照流体Ｓｏｌａｓ単独、または微粒子状物質と組み合わせた対照流体に曝露された細胞を示す。「ＰＰ６０」は、非界面動電的対照加圧ポット流体に曝露された細胞を示し、「ＤＥＰ＋ＰＰ６０」は、非界面動電的対照加圧ポット流体の存在下で、微粒子状物質で処置された細胞を指す（すなわち、６０ｐｐｍの溶解酸素を有する）。
【０２８９】
図１は、試験材料Ｒｅｖｅｒａ ６０が、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を約９０％低下させることを示す。Ｓｏｌａｓは、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現の５５％の低下をもたらしたが、一方、生理食塩水は、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現の同様のレベルの低下を生じなかった（約２０％の低下）。更に、非界面動電的対照加圧ポット流体ＰＰ６０は、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現の５０％の低下をもたらした。
【０２９０】
ＴＳＬＰ受容体の発現を低下させる本発明のＲｅｖｅｒａ ６０、Ｓｏｌａｓ、およびＰＰ６０溶液の効果は、ＴＳＬＰが、アレルギー喘息の病理生物学において極めて重要な役割を果たし、ＴＳＬＰ受容体機能の局所抗体媒介遮断がアレルギー性疾患を緩和したことを示す、近年の研究結果を考慮すると、重大な発見である（Ｌｉｕ，ＹＪ，Ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ：Ｍａｓｔｅｒ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０３：２６９−２７３，２００６、Ａｌ− Ｓｈａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＴＳＬＰ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ａｓｔｈｍａ ｍｏｄｅｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０２：８２９−８３９，２００５、およびＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｃａｌ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＴＳＬＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｉｒｗａｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，Ａｕｇ ２９．（Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ））。
【０２９１】
同様に、図２は、ＤＥＰ媒介されたＭＭＰ９の増加における、Ｒｅｖｅｒａ ６０、Ｓｏｌａｓ、非界面動電的対照加圧ポット流体（ＰＰ６０）、および生理食塩水の効果を示す。具体的には、Ｒｅｖｅｒａ ６０は、気管支上皮細胞において、ＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルの約８０％を阻害し、Ｓｏｌａｓは、約７０％の阻害効果があり、一方、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果の約２０％の低下があった。更に、非界面動電的対照加圧ポット流体ＰＰ６０は、ＤＥＰ誘発された細胞表面付着ＭＭＰ９レベルの発現の約３０％の低下をもたらした。ＭＭＰ−９は、喘息において、気道炎症および気管支リモデリングに関与する主要なプロテイナーゼのうちの１つである。近年では、ＭＭＰ−９のレベルは、健常な対照対象と比較して、安定した喘息に罹患する患者において、有意に増加し、急性喘息患者においてさらに高いことを示している。ＭＭＰ−９は、気道炎症細胞の侵入および気道過敏性の誘発に重要な役割を果たし、ＭＭＰ−９が、喘息を誘発し、保持するのに重要な役割を果たし得ることを示す（Ｖｉｇｎｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｕｔｕｍ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９／ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ ｒａｔｉｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｉｒｆｌｏｗ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １５８：１９４５−１９５０，１９９８、Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈａｌｅｄ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０４：３５６−３６３，１９９９、Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｓｔｈｍａ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７２：５５９−５６５，２００５、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ ｃａｎ ｂｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０８：１０２１−１０２６，２００１、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＩＣＡＭ−Ｉ ａｎｄ ＶＣＡＭ−Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１１１：１２７８−１２８４）。
【０２９２】
したがって、追加の態様によれば、本発明の界面動電的に生成された流体は、ＴＳＬＰ受容体の発現を調節するため（例えば、低下させる）、ならびに／またはＭＭＰ−９の発現および／または活性を阻害するために、実質的な治療的有用性を有し、これには、例えば、炎症および喘息の治療のためを含む。
【０２９３】
さらなる態様によれば、非界面動電的対照加圧ポット流体（すなわち、６０ｐｐｍの溶解酸素）は、ＴＳＬＰ受容体の発現を調節するため（例えば、低下させる）、ならびに／またはＭＭＰ−９の発現および／または活性を阻害するために、実質的な治療的有用性を有し、これには、例えば、炎症および喘息の治療のためが含まれる。機構に拘束されるわけではないが、出願者の収集データは、本システムにおける非界面動電的対照加圧ポット流体は、出願者の界面動電的に生成された流体の機構とは異なる機構によって媒介される。これは、効果が比較的小さいためだけではなく、非界面動電的対照加圧ポット流体が、出願者の界面動電的に生成された流体による活性を示す他のアッセイにおいて、活性を示さなかったためでもある。それでもなお、本システムにおける非界面動電的対照加圧ポット流体の本明細書に開示された活性の出願者の発見は、本明細書に開示されるように、喘息および関連する状態との関連におけるそのような加圧ポット流体のための新規の使用を表す。
【０２９４】
したがって、特定の態様に従って、出願者の界面動電的に生成された流体の投与を含む本発明の方法は、免疫系の疾患、アレルギー性炎症、アレルギー性気道炎症、ＤＣ媒介炎症Ｔｈ２反応、アトピー性皮膚炎、アトピー性湿疹、喘息、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、および食物アレルギー、炎症性関節炎、関節リウマチ、ならびに乾癬からなるＴＳＬＰ媒介群から選択される、少なくとも１つの疾病または状態の治療に適用可能である調節（ＴＳＬＰ発現および／または活性の下方制御）を提供する。
【０２９５】
本明細書に開示される結果は、上皮細胞−ＤＣの干渉におけるアレルギー性炎症のマスタースイッチとしのＴＳＬＰの当該技術分野において認識されている役割と完全に一致しており（Ｙｏｎｇ−Ｊｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：２６９−２７３，２００６）、ＴＳＬＰＲに欠けているマウスの表現型とさらに一致しており（例えば、吸入抗原に反応して、喘息を発症しない；Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．、上記を参照、およびＡｌ−Ｓｈａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：８２９−８３９，２００５）、結果は、抗ＴＳＬＰＲでＯＶＡ−ＤＣを前処理することから得られた（例えば、好酸球およびリンパ球浸潤、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５レベルの有意な低下をもたらす）。
【０２９６】
現在開示される対象物はさらに、ＴＳＬＰＲがＤＣに感作されたアレルギー性疾患において果たす役割を明らかにし、出願者の界面動電的に生成された流体の投与を含む新規の組成物および方法を提供する。
【０２９７】
実施例１０
（創傷治癒に対する界面動電流体の効果を判定した）
ガス富化流体（酸素で富化された）の効果は、培養されたヒト表皮角化細胞が創傷をふさぐ能力に対して試験された。本実施例に開示される結果は、出願者の公開出願米国第２００８／０１３９６７４号および国際公開第２００８／１１５２９０号にも開示されている。
【０２９８】
ヒト表皮角化細胞は、通常の陰核切除から得、脱同定された、新生児包皮から単離された。包皮は、ＰＢＳ中で２回洗浄され、表皮から真皮を分離させるために、２．４Ｕ／ｍＬのＤｉｓｐａｓｅ ＩＩ中でインキュベートした。表皮は、０．２５％ トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートし、大豆トリプシンインヒビターで中和し、撹拌し、７０ｕｍの篩を通過させ、細胞を分離した。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、０．０７ｍＭ ＣａＣｌ_２、ヒトケラチン生成細胞増殖補助剤（０．２％ ヒドロコルチゾン、０．２ｎｇ／ｍＬ ヒト上皮細胞増殖因子）、およびペニシリン／ストレプトマイシン、アンフォテラシン（ａｍｐｈｏｔｅｒａｃｉｎ）抗生物質カクテルが補充された細胞培地（Ｍ１５４）中に再懸濁した。ケラチン生成細胞懸濁液は、コーティングしていない１２ウェル培養皿上に平板培養し、初期播種してから２４時間後、および４８時間ごとに、培地を取り換えた。
【０２９９】
細胞合流に到達してから、無菌のｐ１０００ピペットチップを用いて線形傷を作成し、均一の無細胞創傷を生じた。単層は、あらゆる細胞残屑を除去するために、ダルベッコＰＢＳで数回洗浄した。次いで、創傷単層を以下の培地でインキュベートした。ｉ）完全増殖培地（本実施例に上記される）、ｉｉ）酸素のないせん断されたバージョンの食塩水を用いて１：１で希釈された完全増殖培地（開示される拡散デバイスを用いて処理されるが、ガスを添加しない対照流体）、およびｉｉｉ）酸素富化食塩水を用いて１：１で希釈された完全増殖培地。各研究は、３重に行われた。
【０３００】
インキュベーション前、ウェルは、それぞれの培地で充填され、各ウェルの上部に２５×２５ｍｍのガラス製のカバースリップを置くことにより密閉された。創傷してから６、１２、２４、および４８時間後、酸素測定を行い、培養物を推測した。
【０３０１】
結果。創傷してから６時間後、食塩水およびガス富化培地中の創傷の端部は、本明細書に開示される拡散デバイスを用いて処理されるが、ガスを添加しない対照培地中のものよりも更にひだ状であった。創傷してから１２時間後、全て３つの培地中の創傷の端部は、創傷の中心部に向かって移動する縁に沿ってケラチン生成細胞を有する、凸凹が現れた。ケラチン生成細胞を移動する定量化は、食塩水およびガス富化培地中のケラチン生成細胞移動とほぼ同レベルを示した。
【０３０２】
実施例１１
（改善された創傷治癒に対する界面動電流体の効果を判定した）
試験は、本明細書に開示される実施形態に従って処理された酸素富化食塩溶液に暴露された創傷の改善された治癒特性を決定するために行われた。この実験において、ブタの皮膚切除生検創傷上に包帯をした。包帯は、酸素富化食塩溶液に浸潤した、または、対照群の包帯は、酸素富化されていない食塩水に浸潤した。顕微鏡により、１）表皮化、２）新血管形成、３）表皮分化、４）マスト細胞移動、および５）有糸分裂を含む、幾つかの要因を、研究により評価した。本実施例に開示される結果は、出願者の公開された米国特許出願第２００８／０１３９６７４号および国際公開第２００８／１１５２９０号にも開示されている。
【０３０３】
結果。外面的に、創傷は、異なる速度で、治癒するように思われた。酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、４日目〜１１日目で、創傷治癒の増加を示した。しかしながら、創傷は共に、ほぼ同時に治癒を完了すると考えられた。試験は、３日目〜１１日目で、酸素富化食塩溶液で処置した創傷の新表皮は、生理食塩水で処置した創傷の表皮の２倍〜４倍の速度で移動したことを示した。試験はまた、１５日〜２２日で、酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、更に成熟した表皮層の早期形成により証明されるように、更に高速で分化したことも示した。全ての段階で、通常の治癒と関連する表皮に生じる肥厚は、酸素富化食塩溶液により処置した創傷内で生じなかった。
【０３０４】
いずれかの特定の理論に拘束されるわけではないが、酸素富化食塩溶液は、創傷内の一酸化窒素の局在レベルを増加し得ることが考えられる。一酸化窒素は、創傷治癒において、成長因子、コラーゲン沈着、炎症、マスト細胞移動、表皮肥厚、および新血管形成を調節する。更に、一酸化窒素は、酸素により調節される誘導酵素により産生される。
【０３０５】
したがって、いずれかの特定の理論に拘束されるわけではないが、本発明のガス富化流体は、一酸化窒素産生を刺激し得、これは、創傷治癒効果のスペクトルに従って、これらの実験に見られる。
【０３０６】
治癒するブタの表皮は、１５日目〜２２日目で、酸素富化食塩水群において、早期分化を経験した。マスト細胞移動の場合は、酸素富化溶液に対する初期および後期移動においても差異が生じた。有糸分裂のレベルに対する最終的な結果は、染色の困難により確認できなかった。
【０３０７】
結果は、酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、処置しなかった創傷よりもはるかに高い治癒特性を示したことを示す。更に、結果は、正常の表皮／皮膚の輪郭を有する、更に分化した表皮を示す。
【０３０８】
参照による組み込み
本願において言及される、および／または出願データシートに挙げられている、上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３０９】
本明細書の図面および詳細な説明は、制限的方法よりむしろ例示的なものであると見なされ、かつ開示される特定の形態および例に対して本発明を限定することを意図しないことを理解されるべきである。それとは逆に、本発明には、以下の特許請求により定義されるように、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者には明らかな任意の更なる修正、変更、再配置、置換、代替、設計選択、および実施形態が含まれる。したがって、以下の特許請求は、全てのこのような更なる修正、変更、再配置、置換、代替、設計選択、および実施形態を包含すると解釈されるべきであることを意図する。
【０３１０】
前述の実施形態は、異なる他の成分内に含有された、または接続された、異なる成分を示す。このような示された構築物は、単に例示的であり、かつ実際に、同一の機能性を達成する多くの他の構築物が実施され得ることを理解されるものとする。概念的な意味において、同一の機能性を達成するための成分の任意の配置は、所望の機能性を達成するように、効果的に「会合」される。故に、特定の機能性を達成するために組み合わせた本明細書の２つの成分は、構築物または媒介の成分に関係なく、所望の機能性を達成するように、互いに「会合する」と見なされ得る。同様に、このように会合された２つの成分はまた、所望の機能性を達成するように、互いに、「操作可能に接続される」または「操作可能に連結される」ものとして見られ得る。
【０３１１】
本発明の特定の実施形態を示し、記載するが、本明細書の教示に基づいて、本発明およびその広範な態様から逸脱することなく、変更および修正がなされ得ることは、当業者には明らかであるため、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲内にあるように、それらの範囲内で全てのこのような変更および修正を包含するものとする。更に、本発明が、単に添付の特許請求の範囲により定義されるものであることを理解されよう。一般に、本明細書、および特に、添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の主要部）に使用される用語は、一般的に、「開放的な（ｏｐｅｎ）」用語（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜が含まれるが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として解釈されるものとし、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも〜を有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」として解釈されるものとし、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「〜が含まれるが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として解釈されるものとする等）として、意図されるものであることは、当業者には理解されよう。特定の数の導入される特許請求の範囲の記述が意図される場合、このような意図は、特許請求の範囲中に明確に引用され、このような記述がない場合、このような意図は存在しないことは、当業者には更に理解されよう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲の記述を導入するために、前置きの語句「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」の使用を含有し得る。しかしながら、このような語句の使用は、同一の請求項が前置きの語句「１つ以上」または「少なくとも１つの」、および「ａ」または「ａｎ」等の不定冠詞を含むときでさえも、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による特許請求の範囲の記述の導入が、ただ１つのこのような記述を含む発明へのこのような導入された特許請求の範囲の記述を含むいかなる特定の特許請求の範囲を制限することを意味すると解釈するべきではない（例えば、「ａ」および「ａｎ」は、典型的には、「少なくとも１つの」または「１つ以上」を意味すると解釈されるべきである）；同じことが特許請求の範囲の記述の導入に使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、特定の数の導入される特許請求の範囲の記述が明確に引用される場合であっても、このような記述は、少なくとも引用される数（例えば、他の修飾語句なしの「２つの記述」の単なる記述は、一般に少なくとも２つの記述、または２つ以上の記述を意味する）を意味すると一般に解釈すべきことは、当業者には認識されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するための方法であって、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有し、ＭＭＰ９媒介状態または疾病を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体の、それを必要とする哺乳動物への投与を含む、方法。
【請求項２】
前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、前記流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、前記イオン水性流体中に安定的に構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、前記流体中で主要な帯電安定化したガス含有ナノ構造種である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造として、前記流体中に存在する溶解した酸素分子の割合は、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
全ての溶解酸素は、前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造に実質的に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を実質的に有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記イオン水溶液は、食塩溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記流体は、超酸素化である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記流体は、溶媒和電子の形態を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への前記流体の曝露を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記局在界面動電効果への曝露は、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの曝露を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への前記流体の曝露は、前記流体を生成するために使用されるデバイスの界面動電効果を誘起する構造特性への前記流体の曝露を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、閉塞性気道疾患を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記閉塞性気道疾患は、喘息および慢性閉塞性肺疾患のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、関節リウマチ、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、および多発性硬化症のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＭＰ９媒介状態または疾病は、哺乳動物におけるアルツハイマー病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病からなる群から選択される、ＭＭＰ９の継続的または持続的発現および／または活性を特徴とする、末梢または中枢神経系の少なくとも１つの疾病または疾患を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
併用療法を含み、少なくとも１つの追加の治療剤が、前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの追加の治療剤は、少なくとも１つのＭＭＰの追加の阻害剤の投与を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのＭＭＰは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１８、ＭＭＰ−１９、およびＭＭＰ−２０からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの追加の治療剤は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲ拮抗剤は、２つ以上の受容体鎖の構成成分をコード化するＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含む、ＴＳＬＰおよび前記ＴＳＬＰ受容体に特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、ならびにＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの追加の治療剤は、標準的な非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ピロキシカム、ジクロフェナク；プロピオン酸、ナプロキセン、フルビプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、およびイブプロフェン；フェナム酸、メフェナム酸、インドメタシン、スリンダク、アパゾン；ピラゾロン、フェニルブタゾン；サリチル酸塩、アスピリン；鎮痛または関節内療法、コルチコステロイド；ヒアルロン酸、ヒアルガン、シンビスク；免疫抑制剤、シクロスポリン、インターフェロン；ＴＮＦ−α阻害剤、エンブレル（登録商標）；低用量のメトトレキサート、レフニミド、ヒドロキシクロロキン、ｄ−ペニシラミン、オウラノフィン、非経口金および経口金からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの追加の治療剤は、抗鬱剤、セルトラリン、フルオキセチン、パロキセチン；抗パーキンソン病剤；デプレニール、Ｌ−ドーパ、リキップ、ミラテックス；ＭＡＯＢ阻害剤、セレギン、ラサギリン；ＣＯＭＰ阻害剤、トルカポン、タスマー；Ａ−２阻害剤、ドーパミン再取り込み阻害剤、ＮＭＤＡ拮抗剤、ニコチンアゴニスト、ドーパミンアゴニスト、ニューロン一酸化窒素シンターゼの阻害剤、抗アルツハイマー病剤；アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、メトリホナート、ドネペジル、アリセプト、エクセロン、ＥＮＡ７１３またはリバスチグミン；テトラヒドロアミノアクリジン、タクリン、コグネックス、またはＴＨＡ；ＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２阻害剤、セレコキシブ、セレブレックス、ロフェコキシブ、ビオックス；プロペントフィリン、抗卒中薬、ＮＲ２Ｂ選択的拮抗剤、グリシン部位拮抗剤、および好中球阻害因子（ＮＩＦ）からなるＣＮＳ剤群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの追加の治療剤は、エストロゲン；選択的エストロゲンモジュレータ、エストロゲン、ラロキシフェン、タモキシフェン、ドロロキシフェン、ラソフォキシフェン、Ａβ１−４０／１−４２の減少をもたらす薬剤、アミロイド凝集阻害剤、セクレターゼ阻害剤；骨粗しょう症薬、ドロロキシフェン、フォソマックス；免疫抑制剤、ｆｋ−５０６、ラパマイシン；抗癌剤、エンドスタチン、アンギオスタチン；細胞毒性薬、アドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチン、エトポシド、タキソール、タキソテール、アルカロイド、ビンクリスチン；代謝拮抗剤、メトトレキサート；心臓血管薬、カルシウムチャネル遮断薬；脂質低下薬、スタチン；フィブラート、β遮断薬、ＡＣＥ阻害剤、アンジオテンシン−２受容体拮抗剤、および血小板凝集阻害剤からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、膜結合タンパク質もしくは構成成分の立体配座、リガンド結合活性、および触媒活性のうちの少なくとも１つを改変することを含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つを改変することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリン等からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質ａサブユニットと相互作用する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｇタンパク質ａサブユニットは、Ｇａ_ｓ、Ｇａ_ｉ、Ｇａ_ｑ、およびＧａ_１２からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのＧタンパク質ａサブユニットは、Ｇａ_ｑである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、全細胞伝導性を調節することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３２】
全細胞伝導性を調節することは、前記全細胞伝導性の線形および非線形の電圧依存性寄与のうちの少なくとも１つを調節することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節を含む、細胞内シグナル変換の調節を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３５】
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３６】
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節は、閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、喘息、関節リウマチ、変形性関節炎、アテローム性動脈硬化症、癌、多発性硬化症、アルツハイマー病、脳卒中／脳虚血、頭部外傷、脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、片頭痛、脳アミロイド血管症、エイズ、加齢関連認知低下、軽度認識障害、およびプリオン病からなる群から選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する、細胞内シグナル変換の調節を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項３７】
細胞ネットワークまたは層への前記界面動電流体の投与を含み、その中の細胞間結合の調節を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞ネットワークまたは層は、肺上皮、気管支上皮、および腸上皮からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、前記流体中の前記酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子、および界面動電的に修飾された、または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記溶媒和電子、または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種の形態は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記界面動電的に改変された水性流体は、分子酸素により、安定化された溶媒和電子の形態を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節する前記能力は、密閉された気密性容器内において、少なくとも２ヵ月間、少なくとも３ヵ月間、少なくとも４ヵ月間、少なくとも５ヵ月間、少なくとも６ヵ月間、少なくとも１２ヵ月間、またはそれ以上の期間持続する、請求項２に記載の方法。
【請求項４５】
前記界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有のナノ構造中に存在する酸素の量は、大気圧で少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
治療は、局所、吸入、鼻腔内、および静脈内のうちの少なくとも１つによる投与を含む、請求項１に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【公表番号】特表２０１２−５０６４５３（Ｐ２０１２−５０６４５３Ａ）
【公表日】平成２４年３月１５日（２０１２．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３３３５５（Ｐ２０１１−５３３３５５）
【出願日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１７４４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４８４５５
【国際公開日】平成２２年４月２９日（２０１０．４．２９）
【出願人】（５１０１１５７７５）レバレジオ　コーポレイション (10)
【Ｆターム（参考）】