脂肪組織における末梢時計の調節
コア概日振動体を制御する転写因子をコードする遺伝子（ＢＭＡＬ、Ｃｌｏｃｋ、ＮＰＡＳ、Ｐｅｒ）及びその調節標的（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ）を脂肪組織中に見出した。これらの遺伝子の概日パターンは制限給餌を用いて同調された。概日遺伝子発現プロファイルは、核ホルモン受容体リガンド（デキサメタゾン又はチアゾリジンジオン）又は３０％ウシ胎仔血清にさらした後のマウス並びに、未分化の、及び脂肪細胞で分化したヒト脂肪幹細胞にて調べられた。３つの薬剤の全てがヒト脂肪幹細胞中にて代表的な概日遺伝子の周期的な発現プロファイルを誘導した。試験した概日遺伝子は振動発現プロファイルを示し、２４乃至２８時間の位相内にある頂点及び最低点により特徴づけられる。概日遺伝子パターンはグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤を使用することにより延長された。概日パターンを延長及び短縮する調節は、それぞれ体重の増加又は減少に影響を与えるべく使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体重の増減に関連した疾病、例えば、肥満、糖尿病、免疫機能異常疾患、癌及びＡＩＤＳに関連した悪液質、並びに神経性無食欲症、双極性障害及びプラダーウィリー症候群のような代謝障害、を治療するために、脂肪組織の末梢時計を同調するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００５年６月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／６８９３１５号の出願日の利益は、米国特許法§１１９（ｅ）に基づいて請求される。
アメリカ合衆国において、肥満は多発する症状であり、成人の５０％超が、身長と体重に基づく体格指数（ＢＭＩ）の推奨される値を超えている。肥満におけるこの上昇に関連して、小児及び成人人口の両方において糖尿病の頻度が増加している。同様に、夜間過食症、神経性無食欲症及び双極性障害のような摂食及び睡眠に関連した疾患を有する多くの患者が毎年存在している。また、癌又はＡＩＤＳ患者も、多くの場合、過度の体重減少、筋肉疲労及び脂肪組織蓄積の損失を併発している。これらの疾患の全てに代謝機能の調節不能が関わっている。
【０００３】
エネルギー代謝及び脂肪組織機能は日内変化する昼／夜の周期に関連した顕著な特徴を示し、概日リズムに影響する。例としては、一日のうちで律動的に変化する中核体温や、限定されるものではないが、レプチン、アディポネクチン、ＰＡＩ−１、アンジオテンシノーゲン及びリポ蛋白質リパーゼを含む蛋白質の脂肪組織及びその他の器官からの分泌と、があり、それらは心臓血管機能及び心臓血管性疾患危険因子の調節に重要な役割を担っている。加えて、限定されるものではないが、例えばＳＲＥＢＰ／ＡＤＤ１及びＰＰＡＲαを含む主要な含脂肪細胞機能を制御するための転写因子は、肝臓、心臓及びその他の組織において概日パターンの発現を示す。視交叉上核（ＳＣＮ）に配置されている脳の中枢時計がこれらの事象を調節する上で主要な役割を担っていることは既に周知ではあるが、別の組織内に配置されている末梢時計もまた機能していることが明らかになりつつある。
【０００４】
遺伝子発現における概日リズムは、外的環境の生化学的プロセスに同調し、一定に変化する生理学的課題に応答して生物が効果的に機能することを可能にする（Ｒ．Ａｌｌａｄａらによる特許文献１（２００１年））。Ｃｌｏｃｋ（又はそのパラログＮｐａｓ２）、Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒｉｏｄ（Ｐｅｒ）及びＣｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ（Ｃｒｙ）遺伝子によりコードされる、塩基性ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ／Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍｐｌｅｍｉｎｄｅｄ（ｂＨＬＨ−ＰＡＳ）ドメインファミリーに属する遺伝子はこのプロセスにおいて中心的な役割を果たす（Ｒ．Ａｌｌａｄａら（２００１年））。ＣＬＯＣＫ及びＢＭＡＬ１のヘテロ二量体は、Ｐｅｒ及びＣｒｙの転写を推進する（Ｎ．Ｇｅｋａｋｉｓら（１９９８年）、Ｔ．Ｋ．Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎら（１９９８年）、特許文献２）。細胞質における翻訳後、ＰＥＲ及びＣＲＹ蛋白質は、ヘテロ二量体化し、核に転座し、かつＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１の活性を調節し、転写／翻訳フィードバックループを完成する（Ｊ．Ａ．Ｒｉｐｐｅｒｇｅｒら（２０００年）及びＥ．Ａ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊｒ．ら（１９９９年））。その結果として、これら二組の遺伝子の発現レベルは互いに逆位相振動プロファイルを呈する。加えて、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロ二量体は、複数の生理学的機能に関連している転写因子ＤＢＰ（アルブミンＤ結合蛋白質）及びＲＥＶ−ＥＲＢαをコードするものを含む概日エフェクタ遺伝子の転写を調節する（Ｊ．Ａ．Ｒｉｐｐｅｒｇｅｒら（２０００年）及びＡ．Ｂａｌｓａｌｏｂｒｅら（１９９８年））。
【０００５】
マウスにおいてｍＰｅｒ２プロモータ：ルシフェラーゼレセプターを使用した最近の研究では、生体外で２０日超の期間において持続した振動性のルシフェラーゼプロファイルを示し、それらは、視交叉上核（ＳＣＮ）におけるコア概日振動体のみならず、肝臓及び筋肉の組織片においても示した（Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏら（２００４年））。これらの末梢振動体は、ＳＣＮを外科的に切除してしまった動物においてさえも作用し続け、抹消組織内において独立した概日振動体が作用することを示す。繊維芽細胞系における複数のインビトロ試験は更にこの知見を支持するものである。これらの細胞における概日時計遺伝子Ｃｌｏｃｋ、Ｐｅｒ、Ｄｂｐ及びＢｍａｌ１の発現は、デキサメタゾン、高血清濃度又はグルコースにさらすことにより誘導され得る（Ｅ．Ｎａｇｏｓｈｉら、（２００４年））。加えて、コルチコトロピン放出因子アンタゴニストにて治療することにより患者の概日リズムを変更する方法が提唱されている（特許文献３）。また、近年の研究では、これらの分析がヒトの皮膚繊維芽まで展開されている。Ｂｍａｌ１プロモータ／ルシフェラーゼレポーター構築物で形質導入され、かつデキサメタゾンで誘導された場合、ヒト繊維芽細胞におけるルシフェラーゼ活性は約２４．５時間の概日リズムを示した（Ｓ．Ａ．Ｂｒｏｗｎら、（２００５年））。大部分のドナーの概日周期は２４〜２５時間の間に分布しているが、１９人のドナーでは、その範囲は２２．７５時間〜２６．２５時間まで広がった。
【０００６】
ヒト疾患の多くの状態では、概日リズムの変化は、脂肪組織機能の変化に関連している。例えば、双極性障害の患者が塩化リチウムのような薬物療法を受けると、急速に体重が増加し、肥満になる（Ａ．Ｆａｇｉｏｌｉｎｉら、（２００２年）、（２００３年））。双極性疾患の臨床上の顕著な特徴に、異常な睡眠パターンと無秩序な概日機能がある。最近の知見では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３における塩化リチウムの阻害効果とＲｅｖ−ｅｒｂαの調節とが関係付けられた（Ｌ．Ｙｉｎら、（２００６年））。同様に、ＴＮＦα、ＩＬ−６、アディポネクチン、レプチン及びＰＡＩ−１のような多くのアディポカインの血清レベルは強力な概日パターンを示す（Ａ．Ｇａｖｒｉｌａら（２００３年ａ、２００３年ｂ）；Ｓ．Ｅ．ｌａ Ｆｌｅｕｒら（２００１年）；Ｊ．Ｇ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｏｍら（２００３年）；Ａ．Ｎ．Ｖｇｏｎｔｚａｓら（１９９９年）；Ａ．Ｎ．Ｖｇｏｎｔｚａｓら（２００２年）及びＡ．Ｎ．Ｖｇｏｎｔｚａｓら（２００４年ａ，２００４年ｂ））。疫学的な研究により、ＰＡＩ−１の循環レベルの早朝のピークと、一般的な患者人口における心筋梗塞、突然死及び心臓麻痺の発生とが相関付けられた（Ａ．Ｊ．Ｓｔｕｎｋａｒｄら（２００４年）；Ｇ．Ｓ．Ｂｉｒｋｅｔｖｅｄｔら（１９９９年））。これと一致して、ＰＡＩ−１プロモータがＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１二量体により認識されたＤＮＡ応答要素を含むことが観察された（Ｊ．Ｇ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｏｍら（２００３年））。興味深いことに、肥満及び２型糖尿病と診断された患者は、心筋梗塞の発生とともに概日リズムの変化を呈さなくなった（Ｊ．Ｓ．Ｒａｎａら（２００３年））。これら同一の患者では慢性的にＰＡＩ−１のレベルが上昇し、概日変動の減衰をその発現において生じた（Ｊ．Ｇ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｏｍら（２００３年））。同様に、疫学的研究では、活動期間が昼夜期間に対して逆になる夜間労働者ではメタボリックシンドロームの発生が増大した（Ｕ．Ｈｏｌｍｂａｃｋら、（２００３年））。
【０００７】
関節炎疾患の症状は、概日パターンを呈することが示されてきた（Ｎ．Ｇ．Ａｒｖｉｄｓｏｎら（１９９７年）；Ｍ．Ｃｕｔｏｌｏら（２００３年））。グルココルチコイドを用いた治療のタイミングは、関節リウマチに罹患した患者における朝のこわばりの重症度に有意な効果を有することを示した（Ｎ．Ｇ．Ａｒｖｉｄｓｏｎら（１９９７年））。また、ヒトにおいてプロラクチンリズムを変更するために薬剤を投与するタイミングは、関節リウマチの治療として提唱されてきた（特許文献４）。
【０００８】
中枢神経系の視交叉上核及びその他の部位は、概日リズムの制御において主要な役割を呈し、標的となる器官の交感神経支配により直接的に作用し、かつグルココルチコイドの放出及びその他の循環する全身性要因により間接的に作用する（Ｐ．Ｌ．Ｌｏｗｒｅｙら（２００４））。それにも関わらず、最近の結果からは、末梢組織がある程度の概日リズムの自立性を有していることが示唆されている（Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏら（２００４年）；Ｌ．Ｄ．Ｗｉｌｓｂａｃｈｅｒら（２００２年））。単離されたラットの心筋細胞は、グルコースではなく、血清ショック又はノルエピネフリンにさらされた後に活性化される固有の概日装置を示した。（Ｄ．Ｊ．Ｄｕｒｇａｎら、（２００５年））。マイクロアレイ及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析では、肝臓、心臓及びその他の組織は、概日転写装置をコードする遺伝子を発現することが示された（Ｓ．Ｐａｎｄａら（２００２年ｂ）；Ｋ．Ｆ．Ｓｔｏｒｃｈら（２００２年）；Ｈ．Ｒ．Ｕｅｄａら（２００２年）；Ｍ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇ（２００６年）；Ｍ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら（２００２年））。これらの遺伝子の相対的なレベルは日内変動し、一時的に平行な発現プロファイルにおいて、１０％までのトランスクリプトームがそれらとともにクラスタする（Ｓ．Ｐａｎｄａら（２００２年ｂ）；Ｋ．Ｆ．Ｓｔｏｒｃｈら（２００２年）；Ｈ．Ｒ．Ｕｅｄａら（２００２年））。その上、Ｐｅｒ２プロモータ／ルシフェラーゼレポーター構築物遺伝子導入マウスから単離された肝臓、心臓及び筋肉は、レポーター遺伝子の独立した振動発現を示し、ＳＣＮインプットが不在である場合でも２０日まで概日リズムを維持した（Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏら（２００４年））。
【０００９】
脂肪代謝を調節する概日転写調節装置に関する文献の数は増大している。インビトロにおけるトランスフェクションの研究では、ＰＡＳドメインファミリーメンバーであるＢＭＡＬ１及びＥＰＡＳ２は脂質生成転写調節因子であることが明らかとなった（Ｓ．Ｓｈｉｍｂａら（２００５年）；Ｓ．Ｓｈｉｍｂａら（２００４年））。同様に、Ｒｅｖ−ｅｒｂαは、転写標的でもあり、同様に脂質生成調節因子でもある。最近の研究では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β−媒介機構がＲｅｖ−ｅｒｂαを制御することを示している（Ｌ．Ｙｉｎら（２００６年））。インビボの研究では、ＢＭＡＬ１及びＣＬＯＣＫ機能の損失は、マウスモデルにおいてグルコース及びトリグリセリドの循環レベルの日周期性の損失に関係していることが示されている（Ｒ．Ｄ．Ｒｕｄｉｃら（２００４年））。更に、コア概日調節因子Ｃｌｏｃｋが突然変異したマウスでは、これらが過食、肥満になり、かつメタボリック症候群に関連した病的状態となるので、日周的な摂食行動を失う（Ｆ．Ｗ．Ｔｕｒｅｋら（２００５年））。
【００１０】
多くの全身的な特徴が、生物の日内周期及び概日リズムに影響を及ぼす（Ｃｚｅｉｓｌｅｒら（１９９９年））。ヒトにおいて特徴付けられる最良のものの幾らかは、体温、メラトニンレベル及びグルココルチコイドレベルであり、２４時間の間に顕著な頂点（ピーク）と最低点とを示し、これは個人において十分に保持される。日周変動に一致する発現プロファイルを呈することが示されている更なる蛋白質が存在する。それらの幾らかを以下の表に要約する。
【００１１】
【表１】
中枢概日時計とこれらの末梢系との関係は十分に定義されるに留めた。末梢組織は、中枢時計とのバランスにて幾らか作用しており、中枢時計とバランスをとる及び／又は相殺するように作用するという事実が存在する。これは、睡眠の損失とは無関係な、遠距離旅行においてしばしば経験される不快感（時差ぼけ）の原因となる。末梢時計は、身体の概日リズムをリセットするために、中枢時計と協力して作用する。
【００１２】
概日機能の損失及び疾患の発症に何らかの関連があることは明らかではあるが、抹消時計の存在及び脂肪組織の生理学における概日遺伝子の役割は、本発明の出願時には明記されなかった、２００５年６月１０日の優先日後に公開されて、本願より前に出願された文献において、ある種の時計遺伝子の遺伝子発現が、マウスの歯周脂肪組織において概日パターンを示したことが報告されている（Ｈ．Ａｎｄｏら（２００５年））。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１５１５９０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／００５９８４８号
【特許文献３】米国特許第６４３２９８９号
【特許文献４】米国特許第５９０５０８３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記した懸案を鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の発明者は、コア概日振動体（ＢＭＡＬ、Ｃｌｏｃｋ、ＮＰＡＳ、Ｐｅｒ）及びその調節すべき標的（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂ）を制御する転写因子をコードする遺伝子が脂肪組織中に認められることを発見した。これらの遺伝子の概日パターンは制限給餌を使用することにより同調される。概日遺伝子の発現プロファイルは、核ホルモン受容体リガンド（デキサメタゾン又はチアゾリジンジオン）又は３０％のウシ胎仔血清にさらした後、マウスと、未分化ヒトＡＳＣ及び脂肪細胞分化ヒトＡＳＣと、において解析した。三種類の薬剤の全てが、代表的な概日遺伝子の周期的発現プロファイルの開始を誘導した。ウシ胎仔血清の応答は、核ホルモン受容体リガンドの応答より約４時間前進した。同様に、誘導薬剤に対する脂肪細胞分化細胞の応答は、それらのドナーの一致した未分化の対照と比較して加速されていた。全般的に見れば、試験した概日遺伝子は、２４−２８時間の位相の間に存在する頂点と最低点とにより特徴付けられる振動発現プロファイルを示した。更に、個々のドナーは、概日遺伝子発現の位相の長さに変化を示した。従って、核ホルモン受容体リガンドはヒト脂肪組織内において概日転写装置に影響を与え、かつこれらの化合物に対する応答は、細胞分化の関数として変化し得ることを実証した。概日パターンはまた、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータの阻害剤を使用することにより長くなった。概日パターンを長くしたり、短くしたりするという調節は、体重の増加又は減少にそれぞれ影響を与えるために使用できる。
【００１５】
本発明は、代謝障害の治療における標的として脂肪組織における概日リズムに関連した「時計」遺伝子を使用する方法を提供する。概日転写装置をコード化する遺伝子がマウスの褐色脂肪組織並びに皮下及び内臓の白色脂肪組織において振動発現プロファイルを示した。餌へのアクセスを一時的に制限するような環境からの刺激により、マウス組織においてこれらの遺伝子の発現の位相を８時間までシフトすることが示された。加えて、マウスの脂肪組織トランスクリプトームの少なくとも２０乃至２５％が振動発現プロファイルを呈した。また、単離されたヒト脂肪幹細胞を、ヒト脂肪組織における概日機構の解析のための代理のインビトロモデルとして提供することができる可能性も示された。ヒトＡＳＣにおける概日遺伝子誘導の一時的な動力学は、それらの分化状態の関数として変化する。マウスの脂肪細胞は、コルチコステロンのような核ホルモン受容体リガンド又は経口抗糖尿病薬のような外因性の薬剤への応答に対して、前脂肪細胞から分化する。チアゾリジンジオンを糖尿病患者に投与する一日のうちの時間は、その治療効果に有意に影響を与えるであろう。脂肪組織における末梢時計の概日パターンを知ることによって、ある種の薬剤を投与するのに最も効果的な時間を容易に決定することができるであろう。本発明の一態様において、肥満又はその他の体重増加を治療及び予防する上の標的として「時計」遺伝子を使用する方法が提供された。本発明の別の態様において、真性糖尿病を治療する方法における標的又はインジケータとして「時計」遺伝子を使用する方法が提供された。本発明の別の態様において、非限定的ではあるが、神経性無食欲症及び夜間過食症を含む摂食障害の治療において、標的として「時計」遺伝子を使用する方法が提供された。本発明の更に別の態様において、非限定的ではあるが、癌性悪液質及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患した患者の消耗性症候群を含む栄養欠乏状態の治療において、標的として「時計」遺伝子を使用する方法が提供された。本発明のその他の目的及び特徴は、以下の開示及び添付された特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
【００１６】
本発明の一実施形態において、「時計」遺伝子は、脂肪組織蓄積部において概日時計の様式にて発現されることが示された。本発明の別の実施形態において、脂肪組織末梢「時計」遺伝子は、非限定的ではあるが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤、グルココルチコイド及びチアゾリジンジオンを含む外因性薬剤の投与により同調される。本発明の別の実施形態において、脂肪組織末梢「時計」遺伝子は、給餌予定を変更することにより同調される。本発明の更に別の実施形態において、非限定的ではあるが、グルココルチコイド、チアゾリジンジオン、甲状腺ホルモン及びその他の核ホルモン受容体リガンドを含む外因性薬剤を使用して脂肪組織末梢「時計」遺伝子を操作することにより、肥満が阻止されるか、又は緩和される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（定義）
「概日リズム」は、生物体により示される事象及び生化学的現象の日内変化するリズムを参照する。これらの事象は、一日の明期／暗期の周期によって調節され、かつ哺乳動物においては、視交叉上核によって中枢的に調節されている。
【００１８】
「ＰＡＳファミリー」は、周期的な／ＡＲＮＴ（アリル炭化水素核トランスポーター）／Ｓｉｍ蛋白質において見出されるドメインと相同する蛋白質のファミリーを参照する。ＰＡＳドメインは、概日リズムの調節に関与する時計遺伝子と関係している。
【００１９】
「ＨＬＨファミリー」は、蛋白質の塩基性ヘリックスループヘリックスファミリーを参照する。ｂＨＬＨは転写調節蛋白質間のヘテロ二量体化を促進するべく機能する。
「ＣＬＯＣＫ」は、視交叉上核（ＳＣＮ）の概日時計の正の調節を行う転写複合体を形成するためにＢＭＡＬ１とヘテロ二量体化するＰＡＳドメイン／ｂＨＬＨ蛋白質を参照する。
【００２０】
「ＢＭＡＬ−１」は、視交叉上核（ＳＣＮ）の概日時計の正の調節を行い、かつ脳及び末梢組織のその他の領域にてＮＰＡＳ２及びその他の蛋白質と二量体化する転写複合体を形成するためにＣＬＯＣＫとヘテロ二量体化するＰＡＳドメイン／ｂＨＬＨ蛋白質を参照する。
【００２１】
「ＮＰＡＳ２」は、脳及びその他の組織にて概日時計の正の調節を行う転写複合体を形成するためにＢＭＡＬ−１と二量体化するＰＡＳドメイン／ｂＨＬＨ蛋白質を参照する。
「ＰＥＲ」は、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体により調節される周期的な蛋白質を参照する。ＰＥＲ蛋白質は、ＣＬＯＣＫ及びＮＰＡＳ２での発現にて振動する負の転写調節複合体を形成するためにＣＲＹとともに作用する。ＰＥＲ蛋白質は中枢時計組織及び末梢時計組織の両方において発現される。
【００２２】
「ＣＲＹ」はＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体により調節されるクリプトクロム蛋白質を参照する。ＣＲＹ蛋白質は、ＣＬＯＣＫ及びＮＰＡＳ２での発現にて振動する負の転写調節複合体を形成するためにＰＥＲとともに作用する。ＣＲＹ蛋白質は中枢時計組織及び末梢時計組織の両方において発現される。
【００２３】
「ＤＥＣ」は、ＳＴＲＡ１３及びＳＨＡＲＰとしても知られているＤｅｌｅｔｅｄ ｉｎ Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｃａｎｃｅｒ（ＤＥＣ）蛋白質を参照し、ｂＨＬＨファミリーのメンバーであり、概日時計の様式にて調節され、かつ低酸素症に応答する。
【００２４】
「核ホルモン受容体」は、非限定的ではあるが、グルココルチコイド、トリアゾリジンジオン、ビタミンＤ３、甲状腺ホルモン、エストロジェン及びアンドロゲンを含む周知の及び未知のリガンドにより活性化される転写調節蛋白質のファミリーを参照する。核ホルモン受容体は複数の代謝機能において主要な役割を呈し、同ファミリーのメンバーは末梢時計組織において概日の発現パターンの徴候を示す。
【００２５】
「脂肪組織」は、非限定的ではあるが、皮下部位、網嚢部位、生殖腺部位、肩甲骨部位、骨髄、乳房部位及び機械的部位を含む幼若な生物及び成熟した生物の身体中に配置される脂肪蓄積部を参照する。
【００２６】
「成人幹細胞」は分化した胎児後組織に見出される任意の未分化細胞を参照し、それ自体が再生可能であり、かつ（ある種の制限を伴って）分化して、それから始まりかつ広範囲のその他のタイプの細胞になる組織の特定の型の細胞を生成する。
【００２７】
「ＡＤＣ」なる用語は、脂肪由来成人幹細胞を参照し、哺乳動物又はその他の脊椎動物由来の任意の脂肪蓄積部からのコラゲナーゼ消化及び分画遠心法により単離される。
【実施例１】
【００２８】
（材料及び方法）
全ての材料は、特に明記されていない限り、シグマ／アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）社（ミズーリ州セントルイス所在）又はフィッシャー サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社（ペンシルバニア州ピッツバーグ所在）より入手した。
【００２９】
（インビボの概日試験）
試験は、ジャクソン ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（メーン州バーハーバー所在）から入手した８−１０週齢の雄ＡＫＲ／Ｊマウスを使用して行った。動物は、２週間の間、１２時間は明期：１２時間は暗期の厳密な条件にて、標準的な随時の給餌（Ｐｕｒｉｎａ５０１５）にて順応させた。この間、全ての動物は、人間との接触により誘導されるストレスを低減するために、スタッフによって頻繁に取り扱われた。順応期間の後、４時間毎に４８時間にわたって、１群が３又は５匹の動物が屠殺された。一時的な給餌制限試験の動物は、随時食餌にアクセスできる対照群と、１２時間の明所期間のみ食餌にアクセスできる制限給餌（ＲＦ）群とに分けた。７日間の制限給餌期間の間、各動物について、個々の体重及び食物摂取量を毎日モニタリングし、動物を２４時間にわたり、４時間毎に１群３匹ずつ屠殺した。動物は、ＣＯ２による窒息及び頸椎脱臼により屠殺され、血清、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）、精巣上体ＷＡＴ（ｅＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）及び肝臓を採取した。
【００３０】
（マウス組織における定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））
全ＲＮＡは、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（モレキュラーリサーチセンター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ））を製造業者の仕様書に従って使用し、回収した組織から精製した。全ＲＮＡの約２μｇをＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）を使用して、２０μＬの反応物中にて４２℃でＯｌｉｇｏ ｄＴを用いて１時間、逆転写した。興味のある遺伝子のプライマーはプライマーエキスプレス（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を使用して確認した。これらの試験にて使用したプライマーの全リストを表１に列挙した。ｑＲＴ−ＰＣＲは７９００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、汎用される周期条件（９５℃にて１０分間；９５℃の４０サイクルにて１５秒間；そして６０℃にて１分間）の下に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、希釈したｃＤＮＡサンプル上にて実施した。全ての結果は、サイクロフィリンＢ発現対照に対して補正した。
【００３１】
【表２】
（血清分析）
メラトニン及びレプチン用の市販のＥＬＩＺＡキット（メラトニンはニュージャージー州フランダーズ所在のリサーチ ダイアゴノスティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社製；カタログ番号ＲＥ５４０２１、レプチンはミズーリ州セントルイス所在のリンコ リサーチ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製；カタログ番号ＥＺＭＬ−８２Ｋ）及びコルチコステロン用のラジオイムノアッセイ用キット（ニューヨーク州オレンジバーグ所在のエムピー バイオメディカルズ（Ｍｐ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社製；カタログ番号＃０７−１２０１０２）を、製造業者の仕様書に従って使用した。定量は、１群ｎ＝３−５匹の動物から個々の時点にて採取され、プールされた血清サンプルについて実施した。コルチコステロンの定量は、プールしたサンプルにて３回実施した。
【００３２】
（周期分析）
ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られた概日データの周期は、Ｔｉｍｅ Ｓｅｒｉｅｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｓｉｎｏｒ ｖ．６．０ソフトウェア（エキスパート ソフト テクノロジー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｓｏｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）社製）を使用して試験した。各データセットは、一般的な以下の余弦式モデルに適合した。
【００３３】
【数１】
上式において、Ａは振幅であり、Ｔは期間（２４時間）であり、かつＭはＭＥＳＯＲ（リズム補正平均値）（Ｃ．Ｂｉｎｇｈａｍら（１９８２年）；Ｗ．Ｎｅｌｓｏｎら（１９７９年））である。モデル（ＡＮＯＶＡ）は、０．９５０確率水準にて有効であるものとして設定した。各データセットの適合度はＫ−Ｓ検定（コルモゴロフースミルノフ検定）、ｋ２検定、平均及びＱ検定（ユングボックスＱ統計適合度仮説）を用いて検定し、報告された個々のデータセットはこれらの試験の各々に対する基準に適合した。
【００３４】
（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドマイクロアレイ遺伝子発現解析）
ＲＮＡ強度は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（カリフォルニア州パロアルトに所在のアジレント テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製）における電気泳動により評価した。二本鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールズバッド所在のインビトロージェン社製）を使用して、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーと組み合わせて、約９μｇの全ＲＮＡから合成した。ビオチン付加ｃＲＮＡは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＩＶＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（カリフォルニア州サンタクララ所在のアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製）を使用してインビトロにて転写され、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓａｍｐｌｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｌｅを使用して精製された。１０μｇの精製したｃＲＮＡは９４℃にて３５分間フラグメンテーションバッファー（２００ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ８．１、５００ｍＭの酢酸カリウム、１５０ｍＭの酢酸マグネシウム）中にてインキュベートすることにより断片化し、氷上にて冷却した。６．５μｇの断片化したビオチン標識ｃＲＮＡは、１４０００を超える実証されたマウス遺伝子と照合できるＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０Ａ ２．０Ａｒｒａｙ（アフィメトリックス社製）とハイブリダイズした。アレイは、一定した回転数（６０ｒｐｍ）にて４５℃にて１６時間インキュベートし、洗浄し、その後、１０μｇ／ｍＬのストレプタビジン−Ｒフィコエリトリン（カリフォルニア州バーリンガムに所在のベクトル ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）を用いて２５℃にて１０分間、次に３μｇ／ｍＬのビオチン付加ヤギ抗ストレプタビジン抗体（ベクトル ラボラトリーズ社製）にて２５℃にて１０分間染色した。次にアレイを、ストレプタビジン−Ｒフィコエリトリンを用いて２５℃にて１０分間再び染色した。洗浄及び染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００を使用してアレイをスキャニングした。画素強度を測定し、発現シグナルを解析し、特徴を市販のソフトウェアパッケージである、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．１．２（アフィメトリックス社製）を使用して抽出した。データマイニング及び統計学的解析は、Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｏｌ ｖ．３．０（アフィメトリックス社製）アルゴリズムを使用して実施した。個々の試験を比較するために、アレイは、２５００の標的強度値まで全体にスケール化した。各サンプル中における各遺伝子発現のＡｂｓｏｌｕｔｅ ｃａｌｌ（発現がある（ｐｒｅｓｅｎｔ）、境界の（ｍａｒｇｉｎａｌ）、発現がない（ａｂｓｅｎｔ））、変化の方向、及びサンプル間の遺伝子発現の倍率変化は、上述のソフトウェアを使用して特定した。
【００３５】
（マイクロアレイデータのスペクトル解析）
遺伝子ｘのＮ個のサンプル（ｘ０，ｘ１，ｘ２，・・・ｘＮ−１）の一連のマイクロアレイ発現値は、離散フーリエ変換（ＤＦＴ）アルゴリズムを使用して、時間ドメインから周波数ドメインへと変換した。
【００３６】
【数２】
周波数：
【００３７】
【数３】
を有する有意な正弦成分を有する時系列は、そのピリオドグラムが平坦な線に近づく純粋なランダム系列と異なり、その周波数にて、高い確率にてピーク（ピリオドグラム）を示した（Ｍ．Ｂ．Ｐｒｅｓｔｌｅｙ（１９８１年））。観察された周期性の有意性は、近年推奨されているＦｉｓｈｅｒのｇ−統計量により評価した（Ｓ．Ｗｉｃｈｅｒｔら（２００４年））。複数のテストを行うという問題を解決するために、誤検出率（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ（ＦＤＲ））法を、複数の比較において使用した（Ｙ．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら（２００１年））。この方法は実際のデータに適応でき、ＦＤＲを制御するために示された（Ｓ．Ｗｉｃｋｅｒｔら（２００４年）；Ｙ．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら（２００１年））。
【００３８】
（概日遺伝子の特定及び注釈）
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ解析により検出された概日発現遺伝子は、プローブセット番号をＤＡＶＩＤデータベース中の遺伝子情報と一致させることにより、特定及び注釈した。
【００３９】
（ヒト脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）の単離及び伸張）
全てのプロトコルは、試験前に、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ、ルイジアナ州バトンルージュ所在）にて検討され、かつ承認された。皮下脂肪組織部位からの脂肪吸引による吸引物は地方の形成外科病院によって美容手術を受けた女性被験者から得た。組織は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて３−４回洗浄し、予め３７℃に加温した１％のウシ血清及び０．１％のコラゲナーゼタイプＩ（ニュージャージー州レイクウッド所在のワーシントン バイオケミカル コーポレイション（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社）を加えた当量のＰＢＳに懸濁させた。次に組織を３７℃の振盪水浴中に置いて、６０分間連続攪拌し、室温にて、３００−５００Ｘｇにて５分間遠心分離した。成熟した脂肪細胞を含む上澄み液を吸引した。ペレットは、間質血管成分（ＳＶＦ）として特定した。ＳＶＦの一部は、低温保存培地（１０％ジメチルスルホキシド、１０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ’ｓ、８０％ウシ胎仔血清）に再懸濁させ、エタノール−ジャケット型閉鎖容器中にて−８０℃にて凍結させ、液体窒素中にて保存した。ＳＶＦの一部は、コロニー形成単位試験（以下に記載）に使用した。ＳＶＦの残りの細胞は懸濁させ、直後に、伸張及び培養をするために、１平方センチメートル当たりの表面積に０．１５６ｍｇの組織消化の密度にて、間質培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ’ｓ、１０％ウシ胎仔血清（ユタ州ローガンに所在のハイクロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）社）、１００Ｕペニシリン／１００μｇストレプトマイシン／０．２５μｇフンギゾン）中のＴ２２５フラスコ中にて播種した。初代培養細胞のこの初代の継代は「継代０（Ｐ０）」と称される。３７℃、５％のＣＯ２にて最初に４８時間インキュベートした後、培養物をＰＢＳを用いて洗浄し、７５−９０％のコンフルエントに達するまで（おおよそ６日の培養）間質培地中にて維持した。細胞をトリプシン（０．０５％）消化にて継代培養し、５０００細胞／ｃｍ２の密度にて播種した（「継代１」）。継代時の細胞の生存率及び数は、トリパンブルー排除及び血球計による細胞数カウントにより決定した。７５−９０％の密度（おおよそ６日の培養）に達した後も、細胞は、継代２まで繰り返し継代培養した。
【００４０】
（脂質生成）
初代脂質由来幹細胞のコンフルエントな培養物（継代２）は、脂質生成のために、米国特許第６１５３４３２号明細書に記載されている方法と類似の方法、即ち、間質培地を、３％ＦＢＳ、３３μＭのビオチン、１７μＭのパントテン酸塩、１μＭのウシインシュリン、１μＭのデキサメタゾン、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５μＭのロシグリタゾン及び１００Ｕペニシリン／１００μｇストレプトマイシン／０．２５μｇフンギゾンとＤＭＥＭ／Ｆ−１２とから構成された脂質細胞誘導培地、に置き換えることにより誘導された。３日後、培地は、ＩＢＭＸ及びロシグリタゾンの両方が含まれていないことを除いては誘導培地と同じである脂質細胞維持培地に変更した。細胞は、維持培地の９０％を３日毎に取り替えた場合に培養物中にて９日まで維持された。
【００４１】
（概日誘導）
６ウェルプレート中にある未分化の、又は脂質細胞で分化したヒトＡＳＣのコンフルエントな培養物から培地を除去し、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２培地及び１００Ｕペニシリン／１００μｇストレプトマイシン／０．２５μｇフンギゾンのみ、或いは、３０％ＦＢＳ、１μＭのデキサメタゾン又は５μＭのロシグリタゾン、のうちの一つが補充されたものと置換された。ＡＳＣは誘導剤に２時間さらされた。誘導の１時間後、各条件下にある一つのプレートを全ＲＮＡのために採取した。２時間後、残りのプレート中の培地は、無血清ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２培地及び１００Ｕペニシリン／１００μｇストレプトマイシン／０．２５μｇフンギゾンのみと、置き換えた。最初の誘導から４時間毎に４８時間まで、個々のプレートから全ＲＮＡが採取された。
【００４２】
（ヒトＡＳＣに対する定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））
マウス組織に対して、上記したようにＡＳＣからＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（モレキュラーリサーチセンター）を製造業者の仕様書に従って使用し、全ＲＮＡを精製した。おおよそ２μｇの全ＲＮＡを、２０μＬの反応物中にて、４２℃にて１時間、Ｏｌｉｇｏ ｄＴと共にＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ；プロメガ社）を使用して逆転写した。興味のある遺伝子のプライマー（表２に列挙）はプライマーエキスプレスソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社）を使用して確認した。全てのプライマーは対応するヒトｍＲＮＡの配列に基づいており、少なくとも一つのエクソン／イントロン接合部を超えて振幅するように指定されていた。ｑＲＴ−ＰＣＲは７９００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、汎用される周期条件（９５℃にて１０分間；９５℃の４０サイクルにて１５秒間；そして６０℃にて１分間）の下に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）とともに希釈したｃＤＮＡサンプル上にて実施した。全ての結果は、サイクロフィリンＢ発現対照に対して補正した。
【００４３】
【表３】
（周期分析）
ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られた概日データの周期は、Ｔｉｍｅ Ｓｅｒｉｅｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｓｉｎｏｒ ｖ．６．０ソフトウェア（エキスパート ソフト テクノロジー社製）を使用して試験した。各データセットは、一般的な余弦式モデル、Ａｃｏｓ（２ｐ ｔ／Ｔ）＋Ｂｓｉｎ（２ｐ ｔ／Ｔ）＋Ｍ（ここで、Ａは振幅であり、Ｔは期間（２４時間）であり、かつＭはＭＥＳＯＲ（リズム補正平均値）（Ｃ．Ｂｉｎｇｈａｍら（１９８２年））である）に適合し、周期的な様式を示すデータ時点の百分率、及びモデル曲線に設定されたデータの適合性に対するｒ２値を提供した。モデルは、０．９５０確率水準にて有効であるものとして設定した（ＡＮＯＶＡ）。各データセットの適合度はＫ−Ｓ検定（コルモゴロフースミルノフ検定）、ｋ２検定、平均及びＱ検定（ユングボックスＱ統計適合度仮説）を用いて検定し、報告された個々のデータセットはこれらの試験の各々に対する基準に適合した。
【実施例２】
【００４４】
（脂肪組織は概日振動機構遺伝子を発現する）
脂肪組織中の活性末梢概日時計の存在を研究し、かつ特徴づけるために、ｑＲＴ−ＰＣＲのアプローチを、８週齢のＡＫＲ／Ｊマウスの肝臓、褐色脂肪組織、鼠径部脂肪組織及び精巣上体脂肪組織（それぞれ、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴ）における概日遺伝子の発現パターンを調べるために使用した。組織は、３匹の雄の８週齢ＡＫＲ／Ｊマウスから、４時間毎に４８時間にわたり採取した（１３の時点、各時点においてｎ＝３）。全ＲＮＡは回収された組織から抽出され、実施例１に記載したように、遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＴ解析のために使用した。全ての結果は、対応するサイクロフィリンＢ発現レベルで補正した。図１において、全ての値は平均値±ＳＤにて報告されている。図１に示されるように、試験された概日振動遺伝子の大部分において、顕著な周期的発現が認められた。Ｎｐａｓ２及びＢｍａｌ１は同調性にて周期化され、同調因子（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ）（概日）時間（ＺＴ）０（０、２４及び４８時間、または１２時間の暗期の最後）付近にてその頂点（最も高いレベル）に到達し、ＺＴ１２（１２及び３６時間、または１２時間の明期の最後）付近にてその最低点（もっとも低いレベル）に到達した。それらの発現パターンはＢＡＴ、ｉＷＡＴ、ｅＷＡＴ及び肝臓の間で一致したが、振幅においては若干の相違があった。これに対し、Ｃｌｏｃｋの発現はこれらの組織のいずれにおいても一貫した概日パターンには従わなかった（図１）。Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２及びＰｅｒ３の発現は、同調した２４時間の振動を示し、ＺＴ１２（１２時間及び３６時間）付近にて頂点に達し、かつＺＴ０（０、２４及び４８時間）付近にて最低点に達した（図１）。Ｃｒｙ２の発現において幾らかの矛盾が観察されたが、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２の全体の遺伝子発現は、ＺＴ２０（２０及び４４時間）付近が頂点であり、かつＺＴ８（８及び３２時間）付近が最低点である概日プロファイルに従った（図１）。これらの見解を確認するために、数ヶ月後に同じ試験を繰り返し、図１に示したものに非常に類似する結果を示した（データは図示しない）。観察された遺伝子発現パターンの周期性を有する性質は、発現データが、周期的な振動パターンの数学的なモデルとしての余弦曲線に一致することにより示された（データは図示しない）。
【００４５】
これらの結果は、褐色脂肪組織、鼠径部脂肪組織及び精巣上体脂肪組織における活性末梢概日時計の存在を明らかに示すものである。試験された概日振動遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ１−３及びＣｒｙ１−２）の顕著な周期的発現は、振幅において若干の相違はあるものの、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴにおいて一致した。興味深いことに、発現パターンは肝臓においても反映され、その概日時計は独立して特徴づけられた（Ｓ．Ｐａｎｄａら（２００２年ｂ）；Ｋ．Ａ．Ｓｔｏｋｋａｎら（２００１年））。しかしながら、Ｃｌｏｃｋの発現は肝臓も含むこれらの組織のいずれにおいても一致した概日パターンに従わなかった。少なくともＳＣＮにおけるＣｌｏｃｋの発現は、周期的というよりもむしろ構成的であるものと思われることを他の研究者が示した。また、その他の末梢組織及び前脳において、ＣＬＯＣＫ蛋白質の作用は、ＮＰＡＳ２のようなオルソログによって実施されることが示された（Ｍ．Ｒｅｉｃｈら（２００１年））。Ｃｌｏｃｋにおいて振動発現プロファイルが欠如しているという事実は、脂肪組織の概日振動体の成分としてこの遺伝子を排除するものではない。Ｎｐａｓ２の振動パターンは、それが脂肪組織におけるコア振動体の主要な成分であることを示していない。
【００４６】
ＣｒｙとＰｅｒの発現位相の間に観察された僅かな時間のずれは、ＳＣＮ及び特定の末梢組織において既に報告されている（Ｎ．Ｒ．Ｇｌｏｓｓｏｐら（２００２年））。試験された全てのＰｅｒ及びＣｒｙ遺伝子の日内振動は、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴ並びに肝臓において、同調的な様式にて起こった。もっとも重要なことは、試験された全ての組織において、Ｎｐａｓ２及びＢｍａｌ１の振動は、Ｐｅｒ及びＣｒｙの振動とは逆の位相にて起こり、その他の哺乳動物組織において示されるように、活性概日時計の自動調節機構を反復するものである（Ｒ．Ａｌｌａｄａら（２００１年））。
【００４７】
この結果は、余弦曲線に適合する解析結果を更に支持するものであり、遺伝子発現が余弦曲線と一致する傾向及び概日時計内の逆位相振動に従うことを明らかに示す。総合すると、これらの知見は、脂肪組織における活性概日時計機構の存在を例示するのみならず、その一致した様式及び再生可能な様式にある周期的な性質を確認するものである。
【実施例３】
【００４８】
（脂肪組織において概日制御された出力遺伝子振動）
ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴにおける活性概日時計の存在は、その他の組織において概日制御されていることが知られている複数の遺伝子の発現レベルを調べることにより更に追求した。実施例２に記載のマウスの末梢組織は、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した更なる遺伝子の発現パターンを調べるために使用した。図２に示されるように、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβの発現はＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴにおいてＰｅｒ遺伝子に備えられた位相にて振動し、肝臓にて観察されたパターンに反映した。Ｄｂｐの発現は、Ｐｅｒ及びＲｅｖ−ｅｒｂ遺伝子に類似する振動パターンを示す一方、Ｅ４ｂｐ４の発現はＮｐａｓ２及びＢｍａｌ１に対する位相における概日プロファイルにほぼ従い、かつＤｂｐの位相とはかけ離れていた（図２）。脂肪組織、特にｉＷＡＴにおけるＳｔｒａ１３の発現は、強い振動傾向を示したが、特定の概日パターンには従わなかった。Ａｒｎｔ遺伝子の発現は有意に変動せず、Ｉｄ２発現の概日パターンは肝臓を含む試験した全ての組織にて観察された（図２）。
【００４９】
末梢概日時計の活性は、複数の概日制御出力遺伝子の発現パターンにおける効果によりもっとも明らかとなった。ＲＥＶ−ＥＲＢα及びＲＥＶ−ＥＲＢβはオーファン核ホルモン受容体であり、遺伝子プロモータ中においてＲＯＲ特異的応答要素（ＲＯＲＥ）を結合することによる負の転写調節因子として作用し、正の転写調節因子ＲＯＲαの結合を阻止する。それらは、この機構により、Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ及びＣｒｙ１の発現を直接調節することが示されている（Ｎ．Ｐｒｅｉｔｎｅｒら（２００２年））。Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβの発現は、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１により正に調節され、ＰＥＲ：ＣＲＹ二量体により負に調節され、従って、本研究にて観察された発現プロファイルに一致する。Ｒｅｖ−ｅｒｂαの発現は脂質生成との相関関係が示されており（Ａ．Ｃｈａｗｌａら（１９９３年））、かつその異所性発現はインビトロ及びインビボにおける脂肪細胞の分化を促進する（Ｓ．Ｌａｉｔｉｎｅｎら（２００５年））。従って、これらの遺伝子の概日調節された発現は、脂肪細胞分化プログラムに重要な役割を担うであろう。
【００５０】
ＤＢＰ（アルブミンＤ−要素結合蛋白質）は、ＰＡＲドメイン転写因子であり、その発現は直接的な概日制御下にある（Ｌ．Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｌｉｎａら、（１９９７年））。この研究にて観察されたＤｂｐの発現は、Ｄｂｐ転写がＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１によって推進され、ＰＥＲ：ＣＲＹ二量体によって抑制されるという知見と一致している（Ｊ．Ａ．Ｒｉｐｐｅｒｇｅｒら（２０００年））。更に、ＤＢＰ欠損マウスにおける研究は、これらの動物が変更された活性期間を示し、概日振動機構の制御におけるＤｂｐの役割を提案していることを明らかにした（Ｌ．Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｌｉｎａら（１９９７年））。ＤＢＰはまた、Ｐｅｒ１転写とシミュレーションすることが示されているので、概日振動機構における調節効果をも有し得る（Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（２０００年））。
【００５１】
Ｅ４ＢＰ４蛋白質はＤＢＰに非常に関係している。そのプロモータはＲＯＲＥ要素を含み、ＲＥＶ−ＥＲＢ’ｓによる転写抑制に影響を受けやすくなっている（Ｈ．Ｒ．Ｕｄｅｒａら（２００２年））。従って、Ｅ４ｂｐ４発現は振動パターンに従っているが、その位相は、Ｄｂｐの位相に相対向するものであった（Ｓ．Ｍｉｔｓｕｉら（２００１年）もまた、参照されたい）。
【００５２】
Ｓｔｒａ１３（Ｄｅｃ１）は、複数の下流概日出力遺伝子を含む複数の遺伝子の概日制御転写抑制因子／調節因子をコードする（Ａ．Ｇｒｅｃｈｅｚ−Ｃａｓｓｉａｕら（２００４年））。Ｓｔｒａ１３転写はＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１により活性化される一方、ＳＴＲＡ１３蛋白質はＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１活性の抑制因子として作用する（Ｓ．Ｈｏｎｍａら（２００２年））。肝臓におけるＳｔｒａ１３ｍＲＮＡの最大レベルは、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１の転写活性のピークに一致することが報告されている（Ｓ．Ｐａｎｄａら（２００２年ｂ））。概日振動は肝臓において観察されたが、Ｓｔｒａ１３の概日発現は脂肪組織においては観察されなかった。この不一致は、これらの組織におけるＳｔｒａ１３の発現が比較的低いことによるものであろう。
【００５３】
ＡＲＮＴは、ｂＨＬＨ−ＰＡＳドメイン蛋白質であり、ＰＥＲ蛋白質（２）に構造的に類似する。ＡＲＮＴのレベルは肝臓、肺及び胸腺においては概日振動の傾向に従ったが、脾臓においては従わないことが示されている（Ｖ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（１９９８年））。しかしながら、現在の研究において、Ａｒｎｔ遺伝子発現の有意な変動は、いかなる脂肪組織においても、又は肝臓においても認められていない。これは、転写制御機構よりもむしろ翻訳後による蛋白質レベルにおける日内変化を示すものであろう。
【００５４】
Ｉｄ２遺伝子はＤＮＡ結合ドメインを欠いたＨＬＨ蛋白質をコードする。ＩＤ２蛋白質はその他のｂＨＬＨ蛋白質と二量体化し、そのＤＮＡ結合活性を阻害する（Ｋ．Ｎｅｕｍａｎら（１９９５年））。そのプロモータはＥ−ｂｏｘ配列を含み、概日ｂＨＬＨ−ＰＡＳ転写因子による転写調節の標的の可能性となる。ＳＣＮ及び肝臓の最近のマイクロアレイ解析において、Ｉｄ２は大規模クラスタの概日調節された遺伝子のプロトタイプを提供した（Ｈ．Ｒ．Ｕｅｄａら（２００２年））。これらの知見と一致して、Ｉｄ２発現においては強い振動パターンが認められ、その位相は、試験されたその他のＣＬＯＣＫ−調節された遺伝子に類似し、それは、Ｉｄ２発現には正の概日調節因子が含まれていることを意味する。
【実施例４】
【００５５】
（概日リズムの血清測定）
二つの独立した試験にて、８週齢ＡＫＲ／Ｊ雄マウスから、４時間毎に４８時間にわたり血液サンプルを採取した（１３時点）。遠心分離後、各時点からの血清をプールし、実施例１に記載したように、ラジオイムノアッセイ（コルチコステロン）又はＥＬＩＳＡ（メラトニン及びレプチン）による血清蛋白質の検出に使用した。全ての試験は、（単一の時点内の）プールしたサンプルにて実施した。平均±ＳＤの値を図３に示した。血清コルチコステロンレベルは全身制御として供され、かつＰｅｒ及びＣｒｙ遺伝子と類似した、１２時間の明期の最後に頂点が存在する概日プロファイルを示した（図３）。しかしながら、メラトニン及びレプチンの血清レベルの測定は有意な振動プロファイルを生じなかった。
【００５６】
コルチコステロンレベルは、特徴的な概日リズムを示すことが知られており（Ｃ．Ａｌｌｅｎら（１９６７年））、対照として使用した。しかしながら、１群５匹の動物におけるメラトニン及びレプチンの血清レベルの測定は、振動プロファイルの傾向を示しはしたが、有意性は達成していない。有意性は、より大きな母集団ベースを使用すれば達成できるかもしれない。
【実施例５】
【００５７】
（マイクロアレイ解析は脂肪組織中の多数の周期的発現遺伝子を示す）
脂肪組織における概日遺伝子発現の程度を調べるために、実施例１及び２に記載したように、ｑＲＴ−ＰＣＲにより既に試験された組織からの全ＲＮＡサンプルについてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ遺伝子発現解析を実施した。補正後、遺伝子発現の周期性は離散フーリエ変換により検出され、かつ概日期間の有意性は、実施例１に記載したように、Ｆｉｓｈｅｒのｇ検定により確認した。多くの遺伝子は、ｉＷＡＴ（４３９８遺伝子）、ＢＡＴ（５０６１遺伝子）及び肝臓（５３８６遺伝子）において振動発現パターンを示した。図４に示されるように、これらの遺伝子のうちの６５０個はＢＡＴ、ｉＷＡＴ及び肝臓において保存された概日発現パターンを示し、組織特異的振動トランスクリプトームのそれぞれ１４．８％、１２．８％及び１２％であった（図５）。この遺伝子群は、基礎代謝及び「ハウスキーピング」機能に関与するものから主として構成されており、概日時計振動体遺伝子Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１（Ａｒｎｔ１）、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３及びＣｒｙ１並びに出力遺伝子Ｄｂｐを含み、我々のｑＲＴ−ＰＣＲの結果に一致し（図１及び２）、かつコサイン−フィット解析により確認した（データは図示しない）。更に、脂肪機能に関与する複数の遺伝子（Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐγ、Ｌｐ１、Ｐｐａｒα、Ｐｇｃ１β及びＳｔａｔ５Ａ）の発現は、これら３つの組織において周期化していることが示された。
【００５８】
概日トランスクリプトームの別の特徴は、振動遺伝子が特定の一時的な群において周期化することであった。遺伝子の大部分は、ＺＴ０、４、８又は１６のいずれかにおけるその振動位相の頂点に基づいて分類され、このパターンがＢＡＴ、ｉＷＡＴ及び肝臓における共通の振動体遺伝子のうちから検出可能であることを示す（データ図示しない）。
【００５９】
ｑＲＴ−ＰＣＲにより既に検査されたサンプルにおけるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ遺伝子発現解析の結果は、ｉＷＡＴ、ＢＡＴ及び肝臓において振動体発現パターンを有する多数の遺伝子を示してきた。５３００を超える遺伝子の検出は、肝臓においてこれまでに報告されている値（Ｒ．Ａ．Ａｋｈｔａｒら（２００２年）；Ｋ．Ｏｉｓｈｉら（２００３年））を超えている。実施例１において記載されているように、周期的に発現する全ての遺伝子を、その振幅及び「ノイズ」レベルに関わらず、確実に決定するために周波数変換アプローチを使用した。
【００６０】
これらの知見は、これらの異なる組織の代謝活性間における全体的な一致を示唆している。この知見は、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及び肝臓中の振動遺伝子において明らかなように、特定の一時的な群において振動遺伝子が周期化するという観察結果により更に支持されている。
【実施例６】
【００６１】
（一時的な制限給餌療法が脂肪蓄積部における概日発現プロファイルを変える）
ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴにおける遺伝子発現の振動パターンが実験的に位相シフトされるか否かを決定するために、実験動物群では給餌を１２時間の明期に行うように一時的に制限し（制限給餌）、一方、対照動物群は随意に食物を摂取させた。実施例１に更に記載されているように、４２匹の８週齢の雄ＡＫＲ／Ｊマウスを、給餌制限群（実線）及び対照群（点線）の２つの実験群に分けて、屠殺する前に７日間一つのハウジングにて維持した。肝臓、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴを各群３匹の動物から、４時間毎に２４時間にわたり採取した（７時点、各時点当たり２つの群、各時点当たり各群ｎ＝３）。肝臓、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴからの概日遺伝子の発現パターンを実施例２に記載したように決定し報告した。複数の遺伝子の結果を図５及び６に示す。図５において、Ｎ／Ｄ平均値は決定していない。図５及び６に示されるように、この２４時間の試験において、対照動物（点線）は、図１及び２に示されるものに匹敵する発現遺伝子の概日パターンを示した。しかしながら、食物へのアクセスが一時的に制限されている動物（実線）は遺伝子発現の位相が対照動物に対してシフトしていた。
【００６２】
付随的な対照として、血清コルチゾン、体重及び食物消費量を、７日間の一時的な制限給餌試験期間中にモニタリングした。血液サンプルは、実施例５において上記したように動物から回収した。遠心分離後、所定の時点内の各群からの血清をプールし、ラジオイムノアッセイによる血清コルチコステロンの一回の検出に使用した。個々の動物の食物摂取量及び体重を屠殺時まで毎日測定し、平均±ＳＤの値を図７に示した。図７に示されるように、一時的な制限給餌療法は、コルチコステロン血清レベルの概日パターンにおいて位相をシフトするとともに振幅を減衰した。最初の調整期間を過ぎて、対照動物と給餌制限動物との間における食物摂取量には有意な差はなかった。両群の間に、体重に関しても有意な差はなかった。とはいえ、体重増加に向かう傾向が給餌制限群では観察された。
【００６３】
給餌制限が、肝臓、骨格筋、心臓及び腎臓の末梢組織における概日リズムを調節することはこれまでに示されてきた（Ｋ．Ａ．Ｓｔｏｋｋａｎら（２００１年）；Ｎ．Ｒ．Ｇｌｏｓｓｏｐら（２００２年）；Ｋ．Ｏｉｓｈｉら（２００４年）；Ｆ．Ｄａｍｉｏｌａら（２０００年）；Ｎ．Ｌｅ Ｍｉｎｈら（２００１年）及びＳ．Ｙａｍａｚａｋｉら（２０００年））。この最近の研究において、個々の遺伝子は、肝臓、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴの間にて一貫した位相のシフトを示した。しかしながら、観察された位相シフトは個々の組織内の遺伝子の全ての間にて均一ではなかった。個々の概日時計成分は独自の調節機構を有しているので、給餌制限は各遺伝子の位相を異なって調節するのであろう。同様の観察結果が肝臓においても見られた（Ｆ．Ｄａｍｉｏｌａら（２０００年）；Ｎ．Ｌｅ Ｍｉｎｈら（２００１年））。
【００６４】
概日振動体遺伝子間の逆位相の関係は、一時的な給餌制限療法において影響を与えなかった。代わりに、この関係は個々の遺伝子の位相シフト自体を調節し、これらの末梢時計が刺激に同調するように構成された機構を有し、かつ時計自体の振動動作を相殺することなく生理学的な要求を変更することを意味する。同様に、一時的な給餌制限は、その発現を調節する振動体遺伝子と同様の様式にて出力遺伝子の位相をシフトし、それによって振動体機能と出力遺伝子発現との間の関連を繰り返す。
【００６５】
現在のデータは、給餌制限が、既に報告されたように血清コルチコステロン濃度の振動位相を変化させることを示す。
【実施例７】
【００６６】
（未分化ヒトＡＳＣの概日遺伝子発現におけるデキサメタゾンの効果）
デキサメタゾンに一時的にさらされた未分化ヒトＡＳＣの応答を調べるために本研究を実施した。継代２のヒトＡＳＣを、上記したように形成手術を受けた健常な女性ドナーから得られる脂肪吸引物から単離した。ドナーの年齢は３２歳〜５９歳の範囲であり、そのＢＭＩは２０．９〜３０．１の範囲であった（データ図示しない）。コロニー形成単位アッセイにおけるドナーの４人からのＡＳＣの解析により、分化カクテルに応答した脂質生成及び骨生成の両方を受ける能力を確認した（Ｊ．Ｂ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（２００６年）に既に記載されているように）。初期の研究は、これら４人のドナーから得られたコンフルエントかつ休止した未分化の継代２のＡＳＣを用いて実施した。ＡＳＣを、２時間の間、新鮮な無血清培地のみにさらすか、又はデキサメタゾン（１μＭ）を補充した培地にさらし、その後無血清培地のみに変換して４８時間までさらした。誘導後一時間の全ＲＮＡ及び最初にさらした後、４時間間隔での全ＲＮＡ用にサンプルを採取した。全ＲＮＡは、Ｂｍａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβの遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析に対して使用され、対応するサイクロフィリンＢ発現レベルに対して補正した。
【００６７】
図８Ａは新鮮な血清培地のみにさらしたヒトＡＳＣの結果を示す。各線は、個々のドナーからの細胞の結果を示す。図８Ｂはデキサメタゾンに２時間さらした後に無血清培地にて平坦化させたヒトＡＳＣの結果を示す。グルコース及びその他の栄養物を含む新鮮な培地のみにさらした場合、全ての被検者においてＰｅｒ３及びＲｅｖ−ｅｒｂαの顕著な周期的発現が誘導され、ピークのレベルは、それぞれ、２８時間、又は２０及び４４時間であった。遺伝子Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｎｐａｓ２、及びＰｅｒ１の発現は、振動プロファイルに向かう傾向を示したが、ドナー間においてバラツキがあった。
【００６８】
デキサメタゾンの誘導後、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ３、及びＲｅｖ−ｅｒｂαの遺伝子発現は、図８Ｂに示されるように、４人のドナーからの未分化ＡＳＣにおいて振動プロファイルを示した。概日転写装置の「負」の調節アームに属する遺伝子であるＰｅｒ１、Ｐｅｒ３及びＣｒｙ２は、１乃至４時間後のｍＲＮＡの前初期誘導、誘導後２８乃至３２時間の間のピーク、及び４８時間における上昇が見られた。これに対して、概日転写装置の「正」の調節アームに属する遺伝子であるＢｍａｌ１は前初期誘導が見られず、誘導後、１６乃至２０時間及び４０時間にピークレベルを示した。これは、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ３及びＣｒｙ２に対して約８乃至１２時間位相がシフトしたことに反映する。ＣＬＯＣＫ同族体及びＢＭＡＬ１蛋白質ヘテロ二量体性のパートナーであるＮＰＡＳ２をコードする遺伝子は４人のドナー間において一貫した振動プロファイルを示さなかった。Ｒｅｖ−ｅｒｂαのデキサメタゾン誘導発現プロファイルは４人のドナー間において厳密に調節されており、誘導後２４時間のピークレベル、４８時間に上昇が認められた。
【実施例８】
【００６９】
（未分化ヒトＡＳＣ及び脂肪細胞分化ヒトＡＳＣにおけるデキサメタゾン、チアゾリジンジオン又は３０％血清を用いた概日遺伝子発現の誘導）
脂質生成はＰＰＡＲγ２の増大したレベルに伴うものであるので、脂質細胞分化ヒトＡＳＣが、ＰＰＡＲγ２又はグルココルチコイド受容体リガンドに異なって応答するかどうかを決定するために更なる研究を実施した。げっ歯類の繊維芽細胞（６）における概日遺伝子発現を誘導することが知られている血清ショック（３０％ウシ胎仔血清）を対照として使用した。３人の別々のドナーから得られた継代２のヒトＡＳＣを、実施例１及び７に記載したように、コンフルエントかつ休止するまで培養した。概日遺伝子の発現は、未分化の状態のＡＳＣ、或いはデキサメタゾン又はチアゾリジンジオンを含んだ誘導カクテルにさらし、その後、９日間の脂肪細胞の分化の後のＡＳＣを使用して決定した。未分化細胞及び脂肪細胞分化細胞から培地を除去し、３０％ウシ胎仔血清（図９）、デキサメタゾン（１μＭ）（図１０）又はロシグリタゾン（５μＭ）（図１１）のいずれかを補充した無血清培地と交換した。サイクロフィリンＢに対して補正されたＢｍａｌ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβの一時的な発現プロファイルを試験した。個々の線は３人の異なるドナーからの値を示す。試験は３回実施し、示された値は平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【００７０】
個々のドナーは、３種類の異なる薬剤で誘導された遺伝子発現の振幅に変動を示した。未分化ＡＳＣ及び脂肪細胞で分化したＡＳＣにおいて、各刺激はＢｍａｌ１の発現を誘導した。最も迅速な誘導は、３０％血清処置にて達成され、遺伝子発現の上昇及びピークレベル（頂点）はデキサメタゾン及びトリアゾリジンジオンにて誘導された場合（８乃至１２時間）に対して約４時間早く（４乃至８時間）起こった。連続するピーク間の長さは、約２４乃至２８時間であった。個々の刺激に対するＰｅｒ３の応答は変化した。図８Ｂに明記されているように、未分化ＡＳＣにおいて、デキサメタゾンは、前初期応答を誘導し、続いて２４乃至２８時間にピークが認められた。前初期応答の程度は、引き続くピークが２０乃至２４時間に起こる脂肪細胞分化ＡＳＣにおいては緩やかであった。３０％血清もトリアゾリジンジオンも前初期応答を開始しなかったが、ピーク発現は未分化ＡＳＣでは２４乃至２８時間、脂肪細胞分化ＡＳＣではその約４時間前に起こった。未分化ＡＳＣにおいてデキサメタゾン又はトリアゾリジンジオンにて誘導された後のＲｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ発現の開始は類似しており、２４時間にて頂点に到達し、４８時間にて上昇を示した。これに対し、未分化ＡＳＣにおける３０％血清にて処置した後の未分化ＡＳＣのＲｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ誘導はより迅速であり、１２乃至２０時間にて頂点に到達した。脂肪細胞分化ＡＳＣにおいて、全ての刺激は、１６乃至２０時間にてＲｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβのピーク誘導を誘発し、４０乃至４４時間に第二のピークが観察され、それは、デキサメタゾン及びトリアゾリジンジオンによる誘導では、未分化ＡＳＣ場合よりも約８時間位相が前進していることに対応する。
【００７１】
データの周期性は、コサイナー（Ｃｏｓｉｎｏｒ）解析を使用してより厳密に評価した（データは図示しない）。コサイナー「リズム」はリズム様式に振舞うデータ時点の百分率を決定する。未分化ＡＳＣ及び脂肪細胞分化ＡＳＣのいずれに対しても、データの５０％以上が統計学的に有意な振動リズムを示した。Ｂｍａｌ１、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβデータセットの３分の２が、９５％のＡＮＯＶＡ確率限界に適合した。
【実施例９】
【００７２】
（ヒトＡＳＣの概日遺伝子発現プロファイルにおけるＧＳＫ３Ｂ阻害剤ＳＢ４１５２８６の効果）
ヒト脂肪由来幹細胞のデキサメタゾンでの処置は、上記したようにインビトロにおける概日リズムの誘導を示し、かつこの誘導がグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤の添加によって遮断されるかどうかを調べるための実験を実施した。
【００７３】
ヒトＡＳＣのコンフルエントな培養物は、１μモルのデキサメタゾンに２時間さらすことにより誘導した。培地を、無血清培地（ＳＦ）又は３０μＭＳＢ４１５２８６（ＳＢ４１５、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤）を含んだ無血清培地に変更した。個々の培養物は表示した時間において全ＲＮＡを採取し、Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３及びＲｅｖ−ｅｒｂαの遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析に使用し、対応するサイクロフィリンＢのレベルに対して補正した。試験は３回実施し、示された値は平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【００７４】
図１２に示されるように、細胞をＳＢ４１５とともに培養した場合、概日周期がシフトし、かつ長くなった。ＳＢ４１５２８６が存在しない場合、デキサメタゾンで誘導された細胞は、概日転写因子遺伝子ＢＭＡＬ１及びＰｅｒ３並びに下流標的であるＲｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβのｍＲＮＡレベルの発現において、時間依存性の増加を示した（ｅｖ−ｅｒｂβのデータは図示しない）。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤の存在において、ｍＲＮＡ誘導プロファイルは遅延し、かつ６乃至９時間シフトし、概日周期（タウ）の延長と一致した。これらの結果は、脂肪細胞における遺伝子発現の概日周期は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤を使用することによりシフトし得ることを示す。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータのその他公知の阻害剤は、ＳＢ−２１６７６３、リチウム、インスリン及びフェニレフリンを含む（Ｍ．Ｐ．Ｃｏｇｈｌａｎ他（２０００年）；Ｄ．Ａ．Ｃｒｏｓｓら（２００１年）；Ｋ．ＭａｃＡｕｌａｙら（２００３年）；及びＬ．Ｍ．Ｂａｌｌｏｕら（２００１年））。
【実施例１０】
【００７５】
（ＳＢ４１５２８６による概日期間の延長による体重増加の誘導）
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤（ＳＢ４１５２８６）でのマウスの処置は、平均概日期間（タウ）の延長により肥満を誘導する。実験はＡＫＲ／Ｊマウスにて実施する。動物群は、通常の給餌状態に置かれ、一定した１２時間の明期と１２時間の暗期の条件（ＬＤ）又は恒暗条件（ＤＤ）下に維持される。動物は、４乃至８週間の間、チューブによる強制的な投与により、毎日、プラセボ又はＧＳＫ３ベータ阻害剤（ＳＢ４１５２８６）で処置される。動物の体重は毎日監視される。活性及び概日リズムに対する代替的なマーカとして回し車での運動が連続的に観察される。ＧＳＫ３ベータ阻害剤での処置は、対照と比較して、恒暗条件（ＤＤ）で一日の概日周期を一日当たり３乃至１０％増大させる。動物の体重における統計学的に有意な増大は、ＤＤ条件で、対照群とＧＳＫ３ベータ阻害剤の群との間では、８週間の最後までに起こる。
【００７６】
第二の実験において、マウスを、同マウスが高脂肪食（脂肪から４５％のカロリー）を摂取することを除いては同一の条件下に配置する。ＧＳＫ３ベータ阻害剤での処置は、プラセボ対照群に対して、８週間の最後までに体重の有意な上昇を引き起こす。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。ＧＳＫ３ベータ阻害剤の添加は、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。
【実施例１１】
【００７７】
（概日期間が塩化リチウムにて延長されることによる体重増加の誘導）
別のグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤（塩化リチウム）でのマウスの処置により肥満が誘導され、平均概日期間（概日周期）（タウ）が延長する。研究は、ＡＫＲ／Ｊマウスで実施される。動物群は、通常の給餌状態に置かれ、一定した１２時間の明期と１２時間の暗期（ＬＤ）又は恒暗条件（ＤＤ）下に維持される。動物は、４乃至８週間の間、通常の飲料水（対照）を受けるか、又は塩化リチウムを含む飲料水（濃縮）を受ける。動物の体重は毎日監視される。活性及び概日リズムに対する代替的なマーカとして回し車での運動が連続的に観察される。塩化リチウムでの処置は、対照と比較して、恒暗条件（ＤＤ）で一日の概日周期を一日当たり３乃至１０％増大させる。動物の体重における統計学的に有意な増大は、ＤＤ条件で、対照群と塩化リチウム群との間では、８週間の最後までに起こる。塩化リチウムでの処置は、８週間の最後までに、プラセボ対照群に対して体重を有意に上昇させる。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。塩化リチウムの添加は、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。
【実施例１２】
【００７８】
（双極性障害の治療に使用される薬剤であるバルプロ酸にて概日期間が延長されることによる体重増加の誘導）
双極性障害の治療に使用される薬剤でのマウスの処置により肥満が誘導され、平均概日期間（概日周期）（タウ）が延長する。研究は、ＡＫＲ／Ｊマウスで実施される。動物群は、通常の給餌状態に置かれ、一定した１２時間の明期と１２時間の暗期（ＬＤ）又は恒暗条件（ＤＤ）下に維持される。動物は、４乃至８週間の間、チューブによる強制的な投与により、毎日、プラセボ又はバルプロ酸（濃縮）を受ける。動物の体重は毎日監視される。活性及び概日リズムに対する代替的なマーカとして回し車での運動が連続的に観察される。バルプロ酸又はその他の抗双極性障害薬での処置は、対照と比較して、恒暗条件（ＤＤ）で一日の概日周期を一日当たり３乃至１０％増大させる。動物の体重における統計学的に有意な増大は、ＤＤ条件で、対照群とバルプロ酸群との間では、８週間の最後までに起こる。双極性障害治療用化合物での処置は、プラセボ対照群と比較して、体重増加における有意な増大が８週間の最後までに起こる。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。バルプロ酸の添加は、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。
【００７９】
第二の実験において、マウスを、同マウスが高脂肪食（脂肪から４５％のカロリー）を摂取することを除いては同一の条件下に配置する。ＧＳＫ３ベータ阻害剤での処置は、プラセボ対照群に対して、８週間の最後までに体重の有意な上昇を引き起こす。これは、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。
【実施例１３】
【００８０】
（概日期間がＧＳＫ３ベータ活性化剤にて短縮されることによる体重減少の誘導））
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ活性化剤での処置は、肥満を低減し、かつ平均概日期間（タウ）を短縮する。研究は、ＡＫＲ／Ｊマウスで実施される。動物群は、通常の給餌状態に置かれ、一定した１２時間の明期と１２時間の暗期（ＬＤ）又は恒暗条件（ＤＤ）下に維持される。動物は、４乃至８週間の間、チューブによる強制的な経口投与により、毎日、プラセボ（対照）又はＧＳＫ３ベータ活性化剤（濃縮）で処置される。動物の体重は毎日監視される。活性及び概日リズムに対する代替的なマーカとして回し車での運動が連続的に観察される。ＧＳＫ３ベータ活性化剤での処置は、対照と比較して、恒暗条件（ＤＤ）で一日の概日周期を一日当たり３乃至１０％低減させる。動物の体重における統計学的に有意な減少は、ＤＤ条件で、対照群とＧＳＫ３ベータ活性化剤の群との間では、８週間の最後までに起こる。ＧＳＫ３ベータ活性化剤での処置は、プラセボ対照群と比較して、体重増加における有意な増大が８週間の最後までに起こる。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。また、ＧＳＫ３ベータ活性化剤の添加は、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。周知のＧＳＫ３ベータ活性化剤の例は、オクトレオチド（ソマトスタチン類似体）、ソマトスタチン、エンザスタウリン及びアスピリンを含む（Ｍ．Ｔｈｅｏｄｏｒｏｐｏｕｌｏｕら（２００６年）；Ｊ．Ｒ．Ｇｒａｆｆら（２００５年）；Ａ．ｄｉ Ｐａｌｍａら（２００６年））。
【００８１】
第二の実験において、マウスを、同マウスが高脂肪食（脂肪から４５％のカロリー）を摂取することを除いては同一の条件下に配置する。ＧＳＫ３ベータ活性化剤での処置は、プラセボ対照群に対して、８週間の最後までに体重の有意な減少を引き起こす。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。ここでも、ＧＳＫ３ベータ活性化剤の添加は、対照に対して実験群におおいて、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの位相シフトと関連する。
【実施例１４】
【００８２】
（高脂肪食は脂肪組織における周期的な概日時計遺伝子装置を変更する）
研究は、高脂肪食での処置が複数の蓄積部からの脂肪組織における「時計」遺伝子ファミリーの概日発現プロファイルを変化させることを確認するために実施される。雄ＡＲＫ／Ｊマウス（６乃至８週齢）をジャクソン ラボラトリーズ社から購入し、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて、２週間の間、１２時間明期／１２時間暗期の周期を厳格に維持しながら、収容される。３２乃至４０匹の動物群を２週間の間、好きなだけ給餌できる通常の状態、又は高脂肪食の状態に、置く。各群から３乃至４匹の動物群を、３乃至４時間間隔にて３６乃至４８時間まで、頸椎脱臼にて安楽死させる。以下の組織を採取した：血清、脂肪組織（皮下、精巣上体、大網、肩甲骨間、後腹膜）、心臓、肝臓、骨格筋、骨／軟骨）。組織サンプルは、急速冷凍され、続いて全ＲＮＡ及び蛋白質用に採取される。血清サンプルは、ＥＬＩＳＡアッセイによりアディポネクチン、レプチン及び／又はアグーチ関連蛋白質の発現が解析される。サンプルは、ウェスタンイムノブロットにより蛋白質が、リアルタイムＰＣＲによりＲＮＡが、及び／又はノーザンブロット解析により「時計」遺伝子の発現が解析されるが、同「時計」遺伝子は、以下の遺伝子Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｌｏｃｋ、ＢＭＡＬ１、ＮＰＡＳ２、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、Ｒｅｖ−Ｅｒｂα、Ｒｅｖ−Ｅｒｂβ；の幾らか又は全てを含むが、それらに限定されるものではない。適切な対照（アクチン、サイクロフィリン及び／又はＧＡＰＤＨ）が平行して実施される。加えて、アディポネクチン、レプチン、リポ蛋白質リパーゼ、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαの脂肪細胞発現も決定される。対照試験は、肝臓組織における同一遺伝子産物の発現プロファイルを調べる。その他の組織は、更なる分析用に保存される。遺伝子産物の誘導プロファイルの証拠が特定され、上記したような振動パターンの証拠が数学的に解析される。
【実施例１５】
【００８３】
（ヒト被験者はインビボで脂肪組織内に末梢概日時計を有する）
ヒト被験者が、インビボにて、皮下脂肪組織において概日時計装置を発現するかどうかを確認するための試験が実施される。肥満の被験者（ＢＭＩ＞３０）を試験に採用する（１０＜ｎ＜２０）。被験者は７日間の間、厳格な１２時間明期／１２時間暗期である周期と随意の食事の条件にて維持される。最後の３６時間の後に、患者は、適切な静脈のアクセス部位に留置カテーテルが配置される。血液サンプルは、２０乃至３０分間隔にて血清から採取される。３時間間隔にて、患者は、ランダムな採取パターン及び予めプログラムされた採取パターンにて、大腿部、上腕部、腹部及び臀部の皮下脂肪蓄積部にて針生検が実施される。組織サンプルは急速冷凍され、続いて全ＲＮＡ用に採取される。血清サンプルは、ＥＬＩＳＡアッセイによりアディポネクチン、レプチン及び／又はアグーチ関連蛋白質の発現が解析される。組織サンプルは、「時計」遺伝子の発現を解析するために、リアルタイムＰＣＲによりＲＮＡが解析され、同「時計」遺伝子は、以下の遺伝子Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｌｏｃｋ、ＢＭＡＬ１、ＮＰＡＳ２、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、Ｒｅｖ−Ｅｒｂα、Ｒｅｖ−Ｅｒｂβ；の幾らか又は全てを含むが、それらに限定されるものではない。適切な対照（アクチン、サイクロフィリン及び／又はＧＡＰＤＨ）が平行して実施される。加えて、アディポネクチン、レプチン、リポ蛋白質リパーゼ、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαの脂肪細胞発現も決定される。遺伝子産物の発現プロファイルが特定され、振動パターンの証拠が数学的に解析される。
【実施例１６】
【００８４】
（ヒト被検者の脂肪組織における末梢概日時計遺伝子装置は同調され得る）
肥満の被験者（ＢＭＩ＞３０）を試験に採用する（２０＜ｎ＜４０）。被験者は１４日間の間、厳格な１２時間明期／１２時間暗期である周期にて維持される。この期間中、被検者の半分は、１２時間の明期周期時に通常の間隔にてこの間に通常の随意の食事を受ける。年齢及び性別が一致した群は、１２時間の暗期周期時に同一の間隔にて同様の食事を受ける。最後の３６時間の後に、患者は、適切な静脈のアクセス部位に留置カテーテルが配置される。血液サンプルは、２０乃至３０分間隔にて血清から採取される。３時間間隔にて、患者は、ランダムな採取パターン及び予めプログラムされた採取パターンにて、大腿部、上腕部、腹部及び臀部の皮下脂肪蓄積部にて針生検が実施される。組織サンプルは、急速冷凍され、続いて全ＲＮＡ用に採取される。血清サンプルは、ＲＩＡによりグルココルチコイドの発現が、ＥＬＩＳＡアッセイによりアディポネクチン、レプチン及び／又はアグーチ関連蛋白質の発現が解析される。組織サンプルは、「時計」遺伝子の発現を解析するために、リアルタイムＰＣＲによりＲＮＡが解析され、同「時計」遺伝子は、以下の遺伝子Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｌｏｃｋ、ＢＭＡＬ１、ＮＰＡＳ２、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、Ｒｅｖ−Ｅｒｂα、Ｒｅｖ−Ｅｒｂβ；の幾らか又は全てを含むが、それらに限定されるものではない。適切な対照（アクチン、サイクロフィリン及び／又はＧＡＰＤＨ）が平行して実施される。加えて、アディポネクチン、レプチン、リポ蛋白質リパーゼ、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαの脂肪細胞発現も決定される。遺伝子産物の発現プロファイルが特定され、振動パターンの証拠が数学的に解析される。二つの群は、概日リズムに対して、時計遺伝子の発現プロファイル及びその他の脂肪組織産物に関して比較される。
【００８５】
本発明の発明者は、脂肪組織蓄積部中での活性末梢概日時計の存在を示してきたが、それは脂肪組織機能を調節する一時的な成分の存在を示唆する。肥満及びメタポリック症候群と概日機能不全とを関連付ける新たな根拠もこの概念を支持する。ヒトＡＳＣが、皮下脂肪組織の一時的な分子解析の強力なインビトロモデルを提供することも示した。ＡＳＣを血清ショック又は核ホルモン受容体リガンドに一時的にさらすことにより、コア概日転写装置（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ、Ｃｒｙ）及びそれらの直接のエフェクタ（Ｒｅｖ−ｅｒｂα＆β）に関与する遺伝子の発現を誘導した。一般に、血清ショックは、核ホルモン受容体リガンドに同様にさらした場合と比較して約４時間早く周期的な遺伝子発現を誘導する。更に、脂肪細胞分化ＡＳＣによる核ホルモン受容体リガンドに対する応答は、未分化のＡＳＣよりも約４乃至８時間先行する。しかしながら、デキサメタゾン及びロシグリタゾンがＡＳＣにおいて脂質生成を開始するために使用されていたので、分化細胞は核ホルモン受容体リガンドに感作され得るであろう。加えて、チオアゾリジンジオン受容体、ＰＰＡＲγ２のレベルは、ＡＳＣ脂肪細胞分化時に増大することが知られている（Ｙ．Ｄ．Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら（２００１年））。これらの事実の一方又は両方は、未分化ＡＳＣと比較した脂肪細胞分化ＡＳＣの迅速な核ホルモン受容体リガンド応答を説明するであろう。
【００８６】
これらの結果はさらに、概日機構が個々のドナーから単離された細胞間でも変動することを確認する。本発明の発明者は、脂肪組織蓄積部におけるコア概日転写装置の振動を最初に実証した。食餌へのアクセスを一時的に制限するというような外因性の刺激によりこの発現プロファイルの位相がシフトすることを見出した。また、本発明者は、ＧＳＫ３β阻害剤が概日発現プロファイルを延長するために使用され、かつ悪液質に罹患する患者の体重増加を誘導するために使用できることを見出した。また、単離したＡＳＣは、ヒト脂肪組織の概日機構の解析における代替的なインビトロモデルに使用できる可能性も示した。ヒトＡＳＣにおける概日遺伝子誘導の一時的な動力学はその分化状態の関数として変化した。従って、成熟した脂肪細胞は、核ホルモン受容体リガンドに対するインビボでの応答に関して、それらが、コルチコステロンのような外因性のホルモン又は経口抗糖尿病薬のような外因性の投薬であるか否かに関して、未成熟な脂肪細胞とは異なる。時間生物学的なモデルと一致して、チアゾリジンジオンが糖尿病患者に投与される日内時間は、脂肪組織における概日時計によりその治療効果に重要な影響を与えるであろう。
【００８７】
（その他）
本明細書にて使用される用語「治療上有効な量」は、脂肪組織中に見出されるある時計遺伝子の遺伝子発現の概日パターンを統計学上有意な程度（ｐ＜０．０５）に延長又は短縮する化合物の量を参照する。従って、用語「治療上有効な量」は、例えば、悪液質又は神経性無食欲症に罹患した患者のような体重増加の必要な患者の体重を増加させるのに有効な遺伝子発現パターンを延長するのに有効な量を含む。化合物の投与量の範囲は、所望の効果が得られる範囲である。一般的に、用量は送達の形態に応じて変更されるであろう。本明細書の示唆が与えられた当業者は、適切な用量範囲を容易に決定できるであろう。用量は禁忌の場合には個々の医師によって調整される。いずれにしても、治療の効果は、概日パターンの変化の程度、及び当業者に周知の方法による体重の変化の程度をモニタリングすることにより決定される。本化合物の適用は、経口投与、注射、又は局所投与であり得るが、同化合物は、同化合物又はその担体を脂溶性とすることにより脂肪組織に標的化される。特に、化合物は、脂溶性クリーム又は徐放性の皮下インプラントの形態にて、皮下脂肪組織に直接経皮的に送達され得る。代替的に、同化合物は、皮下脂肪組織に直接注射され得る。
【００８８】
（参考文献）
【００８９】
【表４】
本明細書中にて引用された全ての参考文献の完全な開示は、本明細書において参照により援用される。また、参照により援用されたものは、以下の文献の完全な開示であり、それらはいずれも本明細書における従来技術ではない：Ｓ．Ｚｖｏｎｉｃら「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋｓ ｉｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第５５巻、９６２−９７０頁（２００６年）。Ａ．Ａ．Ｐｔｉｔｓｙｎら、「Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋｓ ａｒｅ ｒｅｓｏｕｎｄｉｎｇ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ」、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｅ１６、１−１０頁（２００６年）及びＸ．Ｗｕら、「Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、ｓｅｒｕｍ、ａｎｄ ｔｈａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｎｄ ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｓｔａｔｅｓ」、２００６年５月３１日に「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」提出された原稿。しかしながら、そうでなければ一致しない点がある場合、本明細書は調整するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】マウスから単離された４つ末梢組織（肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）及び精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ））からの、４時間毎に４８時間にわたり実施されたＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された８つの遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図２】マウスから単離された４つ末梢組織（肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）及び精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ））からの、４時間毎に４８時間にわたり実施された定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された７つの遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ａｒｎｔ、Ｓｔｒａ１３、Ｄｂｐ、Ｅ４ｂｐ４及びＩｄ２）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図３】プールされたマウス血清から４時間毎に４８時間にわたり測定された血清バイオマーカ（コルチコステロン、メラトニン及びレプチン）の概日振動を示す。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図４】離散フーリエ変換により検出された周期性を用いた、マイクロアレイ分析により解析された、肝臓、ＢＡＴ及びｉＷＡＴにおける周期的に発現した遺伝子の重複する数を示す。
【図５】２群のマウスから単離された４つ末梢組織（肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）及び精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ））から４時間毎に２４時間にわたり実施されたＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された８つの遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。対照群（点線）は給餌が制限されておらず、制限給餌群（実線）は夜のみ給餌した。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図６】２群のマウスから単離された４つ末梢組織（肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）及び精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ））から４時間毎に２４時間にわたり実施されたＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された５つの遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ｄｂｐ、Ｅ４ｂｐ４及びＩｄ２）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。対照群（点線）は給餌が制限されておらず、制限給餌群（実線）は夜のみ給餌した。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図７】血清コルチコステロン（回収された血清中にて４時間毎に２４時間にわたり測定した）の一日の振動パターン、７日間にわたり測定された食物の一日摂取量及び体重における制限給餌の影響を示す。対照群（点線）は給餌が制限されておらず、制限給餌群（実線）は夜のみ給餌した。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図８Ａ】新鮮な血清培地のみにさらされた未分化のヒト脂肪幹細胞からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された８つの遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｎｐａｓ２、Ｐｅｒ３、及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。各グラフは個々のヒトドナーを示す。
【図８Ｂ】デキサメタゾン（１回に１μＭ）に２時間さらされ、その後無血清培地中のみにて維持された未分化のヒト脂肪幹細胞からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された８つの遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｎｐａｓ２、Ｐｅｒ３、及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。各グラフは個々のヒトドナーを示す。
【図９】３人のドナーからの未分化のヒト脂肪幹細胞及び分化したヒト脂肪幹細胞（各ラインは個々のドナーである）からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された４つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。ここで、細胞は３０％ウシ胎仔血清アルブミンを含んだ培地に２時間さらされた後に４８時間無血清培地中のみにて維持されている。同細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図１０】３人のドナーからの未分化のヒト脂肪幹細胞及び分化したヒト脂肪幹細胞（各ラインは個々のドナーである）からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された４つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。ここで、細胞はデキサメタゾン（１μＭ）を含んだ培地に２時間さらされた後に４８時間無血清培地中のみにて維持されている。同細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図１１】３人のドナーからの未分化のヒト脂肪幹細胞及び分化したヒト脂肪幹細胞（各ラインは個々のドナーである）からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された４つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。ここで、細胞はロシグリタゾン（５μＭ）を含んだ培地に２時間さらされた後に４８時間無血清培地中のみにて維持されている。同細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図１２】１μＭのデキサメタゾンが補充された無血清培地に２時間さらされ、その後無血清培地（ＳＦ）又は３０μＭのＳＢ４１５２８６（ＳＢ４１５；グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）の阻害剤）を含む無血清培地に変換された脂肪細胞で分化されたヒト脂肪細胞幹細胞からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された３つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３及びＲｅｖ−ｅｒｂα）の概日振動遺伝子発現パターンを図面に示した時間に対して示す。定量は３回実施して、示された値は平均±Ｓ．Ｄ．である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体重の増減に関連した疾病、例えば、肥満、糖尿病、免疫機能異常疾患、癌及びＡＩＤＳに関連した悪液質、並びに神経性無食欲症、双極性障害及びプラダーウィリー症候群のような代謝障害、を治療するために、脂肪組織の末梢時計を同調するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
２００５年６月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／６８９３１５号の出願日の利益は、米国特許法§１１９（ｅ）に基づいて請求される。
アメリカ合衆国において、肥満は多発する症状であり、成人の５０％超が、身長と体重に基づく体格指数（ＢＭＩ）の推奨される値を超えている。肥満におけるこの上昇に関連して、小児及び成人人口の両方において糖尿病の頻度が増加している。同様に、夜間過食症、神経性無食欲症及び双極性障害のような摂食及び睡眠に関連した疾患を有する多くの患者が毎年存在している。また、癌又はＡＩＤＳ患者も、多くの場合、過度の体重減少、筋肉疲労及び脂肪組織蓄積の損失を併発している。これらの疾患の全てに代謝機能の調節不能が関わっている。
【０００３】
エネルギー代謝及び脂肪組織機能は日内変化する昼／夜の周期に関連した顕著な特徴を示し、概日リズムに影響する。例としては、一日のうちで律動的に変化する中核体温や、限定されるものではないが、レプチン、アディポネクチン、ＰＡＩ−１、アンジオテンシノーゲン及びリポ蛋白質リパーゼを含む蛋白質の脂肪組織及びその他の器官からの分泌と、があり、それらは心臓血管機能及び心臓血管性疾患危険因子の調節に重要な役割を担っている。加えて、限定されるものではないが、例えばＳＲＥＢＰ／ＡＤＤ１及びＰＰＡＲαを含む主要な含脂肪細胞機能を制御するための転写因子は、肝臓、心臓及びその他の組織において概日パターンの発現を示す。視交叉上核（ＳＣＮ）に配置されている脳の中枢時計がこれらの事象を調節する上で主要な役割を担っていることは既に周知ではあるが、別の組織内に配置されている末梢時計もまた機能していることが明らかになりつつある。
【０００４】
遺伝子発現における概日リズムは、外的環境の生化学的プロセスに同調し、一定に変化する生理学的課題に応答して生物が効果的に機能することを可能にする（Ｒ．Ａｌｌａｄａらによる特許文献１（２００１年））。Ｃｌｏｃｋ（又はそのパラログＮｐａｓ２）、Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒｉｏｄ（Ｐｅｒ）及びＣｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ（Ｃｒｙ）遺伝子によりコードされる、塩基性ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ／Ｐｅｒ−Ａｒｎｔ−Ｓｉｍｐｌｅｍｉｎｄｅｄ（ｂＨＬＨ−ＰＡＳ）ドメインファミリーに属する遺伝子はこのプロセスにおいて中心的な役割を果たす（Ｒ．Ａｌｌａｄａら（２００１年））。ＣＬＯＣＫ及びＢＭＡＬ１のヘテロ二量体は、Ｐｅｒ及びＣｒｙの転写を推進する（Ｎ．Ｇｅｋａｋｉｓら（１９９８年）、Ｔ．Ｋ．Ｄａｒｌｉｎｇｔｏｎら（１９９８年）、特許文献２）。細胞質における翻訳後、ＰＥＲ及びＣＲＹ蛋白質は、ヘテロ二量体化し、核に転座し、かつＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１の活性を調節し、転写／翻訳フィードバックループを完成する（Ｊ．Ａ．Ｒｉｐｐｅｒｇｅｒら（２０００年）及びＥ．Ａ．Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｊｒ．ら（１９９９年））。その結果として、これら二組の遺伝子の発現レベルは互いに逆位相振動プロファイルを呈する。加えて、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１ヘテロ二量体は、複数の生理学的機能に関連している転写因子ＤＢＰ（アルブミンＤ結合蛋白質）及びＲＥＶ−ＥＲＢαをコードするものを含む概日エフェクタ遺伝子の転写を調節する（Ｊ．Ａ．Ｒｉｐｐｅｒｇｅｒら（２０００年）及びＡ．Ｂａｌｓａｌｏｂｒｅら（１９９８年））。
【０００５】
マウスにおいてｍＰｅｒ２プロモータ：ルシフェラーゼレセプターを使用した最近の研究では、生体外で２０日超の期間において持続した振動性のルシフェラーゼプロファイルを示し、それらは、視交叉上核（ＳＣＮ）におけるコア概日振動体のみならず、肝臓及び筋肉の組織片においても示した（Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏら（２００４年））。これらの末梢振動体は、ＳＣＮを外科的に切除してしまった動物においてさえも作用し続け、抹消組織内において独立した概日振動体が作用することを示す。繊維芽細胞系における複数のインビトロ試験は更にこの知見を支持するものである。これらの細胞における概日時計遺伝子Ｃｌｏｃｋ、Ｐｅｒ、Ｄｂｐ及びＢｍａｌ１の発現は、デキサメタゾン、高血清濃度又はグルコースにさらすことにより誘導され得る（Ｅ．Ｎａｇｏｓｈｉら、（２００４年））。加えて、コルチコトロピン放出因子アンタゴニストにて治療することにより患者の概日リズムを変更する方法が提唱されている（特許文献３）。また、近年の研究では、これらの分析がヒトの皮膚繊維芽まで展開されている。Ｂｍａｌ１プロモータ／ルシフェラーゼレポーター構築物で形質導入され、かつデキサメタゾンで誘導された場合、ヒト繊維芽細胞におけるルシフェラーゼ活性は約２４．５時間の概日リズムを示した（Ｓ．Ａ．Ｂｒｏｗｎら、（２００５年））。大部分のドナーの概日周期は２４〜２５時間の間に分布しているが、１９人のドナーでは、その範囲は２２．７５時間〜２６．２５時間まで広がった。
【０００６】
ヒト疾患の多くの状態では、概日リズムの変化は、脂肪組織機能の変化に関連している。例えば、双極性障害の患者が塩化リチウムのような薬物療法を受けると、急速に体重が増加し、肥満になる（Ａ．Ｆａｇｉｏｌｉｎｉら、（２００２年）、（２００３年））。双極性疾患の臨床上の顕著な特徴に、異常な睡眠パターンと無秩序な概日機能がある。最近の知見では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３における塩化リチウムの阻害効果とＲｅｖ−ｅｒｂαの調節とが関係付けられた（Ｌ．Ｙｉｎら、（２００６年））。同様に、ＴＮＦα、ＩＬ−６、アディポネクチン、レプチン及びＰＡＩ−１のような多くのアディポカインの血清レベルは強力な概日パターンを示す（Ａ．Ｇａｖｒｉｌａら（２００３年ａ、２００３年ｂ）；Ｓ．Ｅ．ｌａ Ｆｌｅｕｒら（２００１年）；Ｊ．Ｇ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｏｍら（２００３年）；Ａ．Ｎ．Ｖｇｏｎｔｚａｓら（１９９９年）；Ａ．Ｎ．Ｖｇｏｎｔｚａｓら（２００２年）及びＡ．Ｎ．Ｖｇｏｎｔｚａｓら（２００４年ａ，２００４年ｂ））。疫学的な研究により、ＰＡＩ−１の循環レベルの早朝のピークと、一般的な患者人口における心筋梗塞、突然死及び心臓麻痺の発生とが相関付けられた（Ａ．Ｊ．Ｓｔｕｎｋａｒｄら（２００４年）；Ｇ．Ｓ．Ｂｉｒｋｅｔｖｅｄｔら（１９９９年））。これと一致して、ＰＡＩ−１プロモータがＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１二量体により認識されたＤＮＡ応答要素を含むことが観察された（Ｊ．Ｇ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｏｍら（２００３年））。興味深いことに、肥満及び２型糖尿病と診断された患者は、心筋梗塞の発生とともに概日リズムの変化を呈さなくなった（Ｊ．Ｓ．Ｒａｎａら（２００３年））。これら同一の患者では慢性的にＰＡＩ−１のレベルが上昇し、概日変動の減衰をその発現において生じた（Ｊ．Ｇ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｏｍら（２００３年））。同様に、疫学的研究では、活動期間が昼夜期間に対して逆になる夜間労働者ではメタボリックシンドロームの発生が増大した（Ｕ．Ｈｏｌｍｂａｃｋら、（２００３年））。
【０００７】
関節炎疾患の症状は、概日パターンを呈することが示されてきた（Ｎ．Ｇ．Ａｒｖｉｄｓｏｎら（１９９７年）；Ｍ．Ｃｕｔｏｌｏら（２００３年））。グルココルチコイドを用いた治療のタイミングは、関節リウマチに罹患した患者における朝のこわばりの重症度に有意な効果を有することを示した（Ｎ．Ｇ．Ａｒｖｉｄｓｏｎら（１９９７年））。また、ヒトにおいてプロラクチンリズムを変更するために薬剤を投与するタイミングは、関節リウマチの治療として提唱されてきた（特許文献４）。
【０００８】
中枢神経系の視交叉上核及びその他の部位は、概日リズムの制御において主要な役割を呈し、標的となる器官の交感神経支配により直接的に作用し、かつグルココルチコイドの放出及びその他の循環する全身性要因により間接的に作用する（Ｐ．Ｌ．Ｌｏｗｒｅｙら（２００４））。それにも関わらず、最近の結果からは、末梢組織がある程度の概日リズムの自立性を有していることが示唆されている（Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏら（２００４年）；Ｌ．Ｄ．Ｗｉｌｓｂａｃｈｅｒら（２００２年））。単離されたラットの心筋細胞は、グルコースではなく、血清ショック又はノルエピネフリンにさらされた後に活性化される固有の概日装置を示した。（Ｄ．Ｊ．Ｄｕｒｇａｎら、（２００５年））。マイクロアレイ及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析では、肝臓、心臓及びその他の組織は、概日転写装置をコードする遺伝子を発現することが示された（Ｓ．Ｐａｎｄａら（２００２年ｂ）；Ｋ．Ｆ．Ｓｔｏｒｃｈら（２００２年）；Ｈ．Ｒ．Ｕｅｄａら（２００２年）；Ｍ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇ（２００６年）；Ｍ．Ｅ．Ｙｏｕｎｇら（２００２年））。これらの遺伝子の相対的なレベルは日内変動し、一時的に平行な発現プロファイルにおいて、１０％までのトランスクリプトームがそれらとともにクラスタする（Ｓ．Ｐａｎｄａら（２００２年ｂ）；Ｋ．Ｆ．Ｓｔｏｒｃｈら（２００２年）；Ｈ．Ｒ．Ｕｅｄａら（２００２年））。その上、Ｐｅｒ２プロモータ／ルシフェラーゼレポーター構築物遺伝子導入マウスから単離された肝臓、心臓及び筋肉は、レポーター遺伝子の独立した振動発現を示し、ＳＣＮインプットが不在である場合でも２０日まで概日リズムを維持した（Ｓ．Ｈ．Ｙｏｏら（２００４年））。
【０００９】
脂肪代謝を調節する概日転写調節装置に関する文献の数は増大している。インビトロにおけるトランスフェクションの研究では、ＰＡＳドメインファミリーメンバーであるＢＭＡＬ１及びＥＰＡＳ２は脂質生成転写調節因子であることが明らかとなった（Ｓ．Ｓｈｉｍｂａら（２００５年）；Ｓ．Ｓｈｉｍｂａら（２００４年））。同様に、Ｒｅｖ−ｅｒｂαは、転写標的でもあり、同様に脂質生成調節因子でもある。最近の研究では、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β−媒介機構がＲｅｖ−ｅｒｂαを制御することを示している（Ｌ．Ｙｉｎら（２００６年））。インビボの研究では、ＢＭＡＬ１及びＣＬＯＣＫ機能の損失は、マウスモデルにおいてグルコース及びトリグリセリドの循環レベルの日周期性の損失に関係していることが示されている（Ｒ．Ｄ．Ｒｕｄｉｃら（２００４年））。更に、コア概日調節因子Ｃｌｏｃｋが突然変異したマウスでは、これらが過食、肥満になり、かつメタボリック症候群に関連した病的状態となるので、日周的な摂食行動を失う（Ｆ．Ｗ．Ｔｕｒｅｋら（２００５年））。
【００１０】
多くの全身的な特徴が、生物の日内周期及び概日リズムに影響を及ぼす（Ｃｚｅｉｓｌｅｒら（１９９９年））。ヒトにおいて特徴付けられる最良のものの幾らかは、体温、メラトニンレベル及びグルココルチコイドレベルであり、２４時間の間に顕著な頂点（ピーク）と最低点とを示し、これは個人において十分に保持される。日周変動に一致する発現プロファイルを呈することが示されている更なる蛋白質が存在する。それらの幾らかを以下の表に要約する。
【００１１】
【表１】
中枢概日時計とこれらの末梢系との関係は十分に定義されるに留めた。末梢組織は、中枢時計とのバランスにて幾らか作用しており、中枢時計とバランスをとる及び／又は相殺するように作用するという事実が存在する。これは、睡眠の損失とは無関係な、遠距離旅行においてしばしば経験される不快感（時差ぼけ）の原因となる。末梢時計は、身体の概日リズムをリセットするために、中枢時計と協力して作用する。
【００１２】
概日機能の損失及び疾患の発症に何らかの関連があることは明らかではあるが、抹消時計の存在及び脂肪組織の生理学における概日遺伝子の役割は、本発明の出願時には明記されなかった、２００５年６月１０日の優先日後に公開されて、本願より前に出願された文献において、ある種の時計遺伝子の遺伝子発現が、マウスの歯周脂肪組織において概日パターンを示したことが報告されている（Ｈ．Ａｎｄｏら（２００５年））。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００２／０１５１５９０号
【特許文献２】米国特許出願公開第２００３／００５９８４８号
【特許文献３】米国特許第６４３２９８９号
【特許文献４】米国特許第５９０５０８３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上記した懸案を鑑みてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の発明者は、コア概日振動体（ＢＭＡＬ、Ｃｌｏｃｋ、ＮＰＡＳ、Ｐｅｒ）及びその調節すべき標的（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂ）を制御する転写因子をコードする遺伝子が脂肪組織中に認められることを発見した。これらの遺伝子の概日パターンは制限給餌を使用することにより同調される。概日遺伝子の発現プロファイルは、核ホルモン受容体リガンド（デキサメタゾン又はチアゾリジンジオン）又は３０％のウシ胎仔血清にさらした後、マウスと、未分化ヒトＡＳＣ及び脂肪細胞分化ヒトＡＳＣと、において解析した。三種類の薬剤の全てが、代表的な概日遺伝子の周期的発現プロファイルの開始を誘導した。ウシ胎仔血清の応答は、核ホルモン受容体リガンドの応答より約４時間前進した。同様に、誘導薬剤に対する脂肪細胞分化細胞の応答は、それらのドナーの一致した未分化の対照と比較して加速されていた。全般的に見れば、試験した概日遺伝子は、２４−２８時間の位相の間に存在する頂点と最低点とにより特徴付けられる振動発現プロファイルを示した。更に、個々のドナーは、概日遺伝子発現の位相の長さに変化を示した。従って、核ホルモン受容体リガンドはヒト脂肪組織内において概日転写装置に影響を与え、かつこれらの化合物に対する応答は、細胞分化の関数として変化し得ることを実証した。概日パターンはまた、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータの阻害剤を使用することにより長くなった。概日パターンを長くしたり、短くしたりするという調節は、体重の増加又は減少にそれぞれ影響を与えるために使用できる。
【００１５】
本発明は、代謝障害の治療における標的として脂肪組織における概日リズムに関連した「時計」遺伝子を使用する方法を提供する。概日転写装置をコード化する遺伝子がマウスの褐色脂肪組織並びに皮下及び内臓の白色脂肪組織において振動発現プロファイルを示した。餌へのアクセスを一時的に制限するような環境からの刺激により、マウス組織においてこれらの遺伝子の発現の位相を８時間までシフトすることが示された。加えて、マウスの脂肪組織トランスクリプトームの少なくとも２０乃至２５％が振動発現プロファイルを呈した。また、単離されたヒト脂肪幹細胞を、ヒト脂肪組織における概日機構の解析のための代理のインビトロモデルとして提供することができる可能性も示された。ヒトＡＳＣにおける概日遺伝子誘導の一時的な動力学は、それらの分化状態の関数として変化する。マウスの脂肪細胞は、コルチコステロンのような核ホルモン受容体リガンド又は経口抗糖尿病薬のような外因性の薬剤への応答に対して、前脂肪細胞から分化する。チアゾリジンジオンを糖尿病患者に投与する一日のうちの時間は、その治療効果に有意に影響を与えるであろう。脂肪組織における末梢時計の概日パターンを知ることによって、ある種の薬剤を投与するのに最も効果的な時間を容易に決定することができるであろう。本発明の一態様において、肥満又はその他の体重増加を治療及び予防する上の標的として「時計」遺伝子を使用する方法が提供された。本発明の別の態様において、真性糖尿病を治療する方法における標的又はインジケータとして「時計」遺伝子を使用する方法が提供された。本発明の別の態様において、非限定的ではあるが、神経性無食欲症及び夜間過食症を含む摂食障害の治療において、標的として「時計」遺伝子を使用する方法が提供された。本発明の更に別の態様において、非限定的ではあるが、癌性悪液質及び後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に罹患した患者の消耗性症候群を含む栄養欠乏状態の治療において、標的として「時計」遺伝子を使用する方法が提供された。本発明のその他の目的及び特徴は、以下の開示及び添付された特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。
【００１６】
本発明の一実施形態において、「時計」遺伝子は、脂肪組織蓄積部において概日時計の様式にて発現されることが示された。本発明の別の実施形態において、脂肪組織末梢「時計」遺伝子は、非限定的ではあるが、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤、グルココルチコイド及びチアゾリジンジオンを含む外因性薬剤の投与により同調される。本発明の別の実施形態において、脂肪組織末梢「時計」遺伝子は、給餌予定を変更することにより同調される。本発明の更に別の実施形態において、非限定的ではあるが、グルココルチコイド、チアゾリジンジオン、甲状腺ホルモン及びその他の核ホルモン受容体リガンドを含む外因性薬剤を使用して脂肪組織末梢「時計」遺伝子を操作することにより、肥満が阻止されるか、又は緩和される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（定義）
「概日リズム」は、生物体により示される事象及び生化学的現象の日内変化するリズムを参照する。これらの事象は、一日の明期／暗期の周期によって調節され、かつ哺乳動物においては、視交叉上核によって中枢的に調節されている。
【００１８】
「ＰＡＳファミリー」は、周期的な／ＡＲＮＴ（アリル炭化水素核トランスポーター）／Ｓｉｍ蛋白質において見出されるドメインと相同する蛋白質のファミリーを参照する。ＰＡＳドメインは、概日リズムの調節に関与する時計遺伝子と関係している。
【００１９】
「ＨＬＨファミリー」は、蛋白質の塩基性ヘリックスループヘリックスファミリーを参照する。ｂＨＬＨは転写調節蛋白質間のヘテロ二量体化を促進するべく機能する。
「ＣＬＯＣＫ」は、視交叉上核（ＳＣＮ）の概日時計の正の調節を行う転写複合体を形成するためにＢＭＡＬ１とヘテロ二量体化するＰＡＳドメイン／ｂＨＬＨ蛋白質を参照する。
【００２０】
「ＢＭＡＬ−１」は、視交叉上核（ＳＣＮ）の概日時計の正の調節を行い、かつ脳及び末梢組織のその他の領域にてＮＰＡＳ２及びその他の蛋白質と二量体化する転写複合体を形成するためにＣＬＯＣＫとヘテロ二量体化するＰＡＳドメイン／ｂＨＬＨ蛋白質を参照する。
【００２１】
「ＮＰＡＳ２」は、脳及びその他の組織にて概日時計の正の調節を行う転写複合体を形成するためにＢＭＡＬ−１と二量体化するＰＡＳドメイン／ｂＨＬＨ蛋白質を参照する。
「ＰＥＲ」は、ＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体により調節される周期的な蛋白質を参照する。ＰＥＲ蛋白質は、ＣＬＯＣＫ及びＮＰＡＳ２での発現にて振動する負の転写調節複合体を形成するためにＣＲＹとともに作用する。ＰＥＲ蛋白質は中枢時計組織及び末梢時計組織の両方において発現される。
【００２２】
「ＣＲＹ」はＢＭＡＬ１／ＣＬＯＣＫ複合体により調節されるクリプトクロム蛋白質を参照する。ＣＲＹ蛋白質は、ＣＬＯＣＫ及びＮＰＡＳ２での発現にて振動する負の転写調節複合体を形成するためにＰＥＲとともに作用する。ＣＲＹ蛋白質は中枢時計組織及び末梢時計組織の両方において発現される。
【００２３】
「ＤＥＣ」は、ＳＴＲＡ１３及びＳＨＡＲＰとしても知られているＤｅｌｅｔｅｄ ｉｎ Ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ Ｃａｎｃｅｒ（ＤＥＣ）蛋白質を参照し、ｂＨＬＨファミリーのメンバーであり、概日時計の様式にて調節され、かつ低酸素症に応答する。
【００２４】
「核ホルモン受容体」は、非限定的ではあるが、グルココルチコイド、トリアゾリジンジオン、ビタミンＤ３、甲状腺ホルモン、エストロジェン及びアンドロゲンを含む周知の及び未知のリガンドにより活性化される転写調節蛋白質のファミリーを参照する。核ホルモン受容体は複数の代謝機能において主要な役割を呈し、同ファミリーのメンバーは末梢時計組織において概日の発現パターンの徴候を示す。
【００２５】
「脂肪組織」は、非限定的ではあるが、皮下部位、網嚢部位、生殖腺部位、肩甲骨部位、骨髄、乳房部位及び機械的部位を含む幼若な生物及び成熟した生物の身体中に配置される脂肪蓄積部を参照する。
【００２６】
「成人幹細胞」は分化した胎児後組織に見出される任意の未分化細胞を参照し、それ自体が再生可能であり、かつ（ある種の制限を伴って）分化して、それから始まりかつ広範囲のその他のタイプの細胞になる組織の特定の型の細胞を生成する。
【００２７】
「ＡＤＣ」なる用語は、脂肪由来成人幹細胞を参照し、哺乳動物又はその他の脊椎動物由来の任意の脂肪蓄積部からのコラゲナーゼ消化及び分画遠心法により単離される。
【実施例１】
【００２８】
（材料及び方法）
全ての材料は、特に明記されていない限り、シグマ／アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）社（ミズーリ州セントルイス所在）又はフィッシャー サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社（ペンシルバニア州ピッツバーグ所在）より入手した。
【００２９】
（インビボの概日試験）
試験は、ジャクソン ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社（メーン州バーハーバー所在）から入手した８−１０週齢の雄ＡＫＲ／Ｊマウスを使用して行った。動物は、２週間の間、１２時間は明期：１２時間は暗期の厳密な条件にて、標準的な随時の給餌（Ｐｕｒｉｎａ５０１５）にて順応させた。この間、全ての動物は、人間との接触により誘導されるストレスを低減するために、スタッフによって頻繁に取り扱われた。順応期間の後、４時間毎に４８時間にわたって、１群が３又は５匹の動物が屠殺された。一時的な給餌制限試験の動物は、随時食餌にアクセスできる対照群と、１２時間の明所期間のみ食餌にアクセスできる制限給餌（ＲＦ）群とに分けた。７日間の制限給餌期間の間、各動物について、個々の体重及び食物摂取量を毎日モニタリングし、動物を２４時間にわたり、４時間毎に１群３匹ずつ屠殺した。動物は、ＣＯ２による窒息及び頸椎脱臼により屠殺され、血清、鼠径部白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）、精巣上体ＷＡＴ（ｅＷＡＴ）、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）及び肝臓を採取した。
【００３０】
（マウス組織における定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））
全ＲＮＡは、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（モレキュラーリサーチセンター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ））を製造業者の仕様書に従って使用し、回収した組織から精製した。全ＲＮＡの約２μｇをＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ；プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社）を使用して、２０μＬの反応物中にて４２℃でＯｌｉｇｏ ｄＴを用いて１時間、逆転写した。興味のある遺伝子のプライマーはプライマーエキスプレス（Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ）ソフトウェア（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社）を使用して確認した。これらの試験にて使用したプライマーの全リストを表１に列挙した。ｑＲＴ−ＰＣＲは７９００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、汎用される周期条件（９５℃にて１０分間；９５℃の４０サイクルにて１５秒間；そして６０℃にて１分間）の下に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、希釈したｃＤＮＡサンプル上にて実施した。全ての結果は、サイクロフィリンＢ発現対照に対して補正した。
【００３１】
【表２】
（血清分析）
メラトニン及びレプチン用の市販のＥＬＩＺＡキット（メラトニンはニュージャージー州フランダーズ所在のリサーチ ダイアゴノスティクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）社製；カタログ番号ＲＥ５４０２１、レプチンはミズーリ州セントルイス所在のリンコ リサーチ（Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社製；カタログ番号ＥＺＭＬ−８２Ｋ）及びコルチコステロン用のラジオイムノアッセイ用キット（ニューヨーク州オレンジバーグ所在のエムピー バイオメディカルズ（Ｍｐ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社製；カタログ番号＃０７−１２０１０２）を、製造業者の仕様書に従って使用した。定量は、１群ｎ＝３−５匹の動物から個々の時点にて採取され、プールされた血清サンプルについて実施した。コルチコステロンの定量は、プールしたサンプルにて３回実施した。
【００３２】
（周期分析）
ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られた概日データの周期は、Ｔｉｍｅ Ｓｅｒｉｅｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｓｉｎｏｒ ｖ．６．０ソフトウェア（エキスパート ソフト テクノロジー（Ｅｘｐｅｒｔ Ｓｏｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）社製）を使用して試験した。各データセットは、一般的な以下の余弦式モデルに適合した。
【００３３】
【数１】
上式において、Ａは振幅であり、Ｔは期間（２４時間）であり、かつＭはＭＥＳＯＲ（リズム補正平均値）（Ｃ．Ｂｉｎｇｈａｍら（１９８２年）；Ｗ．Ｎｅｌｓｏｎら（１９７９年））である。モデル（ＡＮＯＶＡ）は、０．９５０確率水準にて有効であるものとして設定した。各データセットの適合度はＫ−Ｓ検定（コルモゴロフースミルノフ検定）、ｋ２検定、平均及びＱ検定（ユングボックスＱ統計適合度仮説）を用いて検定し、報告された個々のデータセットはこれらの試験の各々に対する基準に適合した。
【００３４】
（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘオリゴヌクレオチドマイクロアレイ遺伝子発現解析）
ＲＮＡ強度は、Ａｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（カリフォルニア州パロアルトに所在のアジレント テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社製）における電気泳動により評価した。二本鎖ｃＤＮＡは、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（カリフォルニア州カールズバッド所在のインビトロージェン社製）を使用して、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーと組み合わせて、約９μｇの全ＲＮＡから合成した。ビオチン付加ｃＲＮＡは、ＧｅｎｅＣｈｉｐ ＩＶＴ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（カリフォルニア州サンタクララ所在のアフィメトリックス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）社製）を使用してインビトロにて転写され、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓａｍｐｌｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｍｏｄｕｌｅを使用して精製された。１０μｇの精製したｃＲＮＡは９４℃にて３５分間フラグメンテーションバッファー（２００ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸塩、ｐＨ８．１、５００ｍＭの酢酸カリウム、１５０ｍＭの酢酸マグネシウム）中にてインキュベートすることにより断片化し、氷上にて冷却した。６．５μｇの断片化したビオチン標識ｃＲＮＡは、１４０００を超える実証されたマウス遺伝子と照合できるＭｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４３０Ａ ２．０Ａｒｒａｙ（アフィメトリックス社製）とハイブリダイズした。アレイは、一定した回転数（６０ｒｐｍ）にて４５℃にて１６時間インキュベートし、洗浄し、その後、１０μｇ／ｍＬのストレプタビジン−Ｒフィコエリトリン（カリフォルニア州バーリンガムに所在のベクトル ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社製）を用いて２５℃にて１０分間、次に３μｇ／ｍＬのビオチン付加ヤギ抗ストレプタビジン抗体（ベクトル ラボラトリーズ社製）にて２５℃にて１０分間染色した。次にアレイを、ストレプタビジン−Ｒフィコエリトリンを用いて２５℃にて１０分間再び染色した。洗浄及び染色後、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ ３０００を使用してアレイをスキャニングした。画素強度を測定し、発現シグナルを解析し、特徴を市販のソフトウェアパッケージである、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．１．２（アフィメトリックス社製）を使用して抽出した。データマイニング及び統計学的解析は、Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ Ｔｏｏｌ ｖ．３．０（アフィメトリックス社製）アルゴリズムを使用して実施した。個々の試験を比較するために、アレイは、２５００の標的強度値まで全体にスケール化した。各サンプル中における各遺伝子発現のＡｂｓｏｌｕｔｅ ｃａｌｌ（発現がある（ｐｒｅｓｅｎｔ）、境界の（ｍａｒｇｉｎａｌ）、発現がない（ａｂｓｅｎｔ））、変化の方向、及びサンプル間の遺伝子発現の倍率変化は、上述のソフトウェアを使用して特定した。
【００３５】
（マイクロアレイデータのスペクトル解析）
遺伝子ｘのＮ個のサンプル（ｘ０，ｘ１，ｘ２，・・・ｘＮ−１）の一連のマイクロアレイ発現値は、離散フーリエ変換（ＤＦＴ）アルゴリズムを使用して、時間ドメインから周波数ドメインへと変換した。
【００３６】
【数２】
周波数：
【００３７】
【数３】
を有する有意な正弦成分を有する時系列は、そのピリオドグラムが平坦な線に近づく純粋なランダム系列と異なり、その周波数にて、高い確率にてピーク（ピリオドグラム）を示した（Ｍ．Ｂ．Ｐｒｅｓｔｌｅｙ（１９８１年））。観察された周期性の有意性は、近年推奨されているＦｉｓｈｅｒのｇ−統計量により評価した（Ｓ．Ｗｉｃｈｅｒｔら（２００４年））。複数のテストを行うという問題を解決するために、誤検出率（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｒａｔｅ（ＦＤＲ））法を、複数の比較において使用した（Ｙ．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら（２００１年））。この方法は実際のデータに適応でき、ＦＤＲを制御するために示された（Ｓ．Ｗｉｃｋｅｒｔら（２００４年）；Ｙ．Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら（２００１年））。
【００３８】
（概日遺伝子の特定及び注釈）
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ解析により検出された概日発現遺伝子は、プローブセット番号をＤＡＶＩＤデータベース中の遺伝子情報と一致させることにより、特定及び注釈した。
【００３９】
（ヒト脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）の単離及び伸張）
全てのプロトコルは、試験前に、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ、ルイジアナ州バトンルージュ所在）にて検討され、かつ承認された。皮下脂肪組織部位からの脂肪吸引による吸引物は地方の形成外科病院によって美容手術を受けた女性被験者から得た。組織は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて３−４回洗浄し、予め３７℃に加温した１％のウシ血清及び０．１％のコラゲナーゼタイプＩ（ニュージャージー州レイクウッド所在のワーシントン バイオケミカル コーポレイション（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社）を加えた当量のＰＢＳに懸濁させた。次に組織を３７℃の振盪水浴中に置いて、６０分間連続攪拌し、室温にて、３００−５００Ｘｇにて５分間遠心分離した。成熟した脂肪細胞を含む上澄み液を吸引した。ペレットは、間質血管成分（ＳＶＦ）として特定した。ＳＶＦの一部は、低温保存培地（１０％ジメチルスルホキシド、１０％のＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ’ｓ、８０％ウシ胎仔血清）に再懸濁させ、エタノール−ジャケット型閉鎖容器中にて−８０℃にて凍結させ、液体窒素中にて保存した。ＳＶＦの一部は、コロニー形成単位試験（以下に記載）に使用した。ＳＶＦの残りの細胞は懸濁させ、直後に、伸張及び培養をするために、１平方センチメートル当たりの表面積に０．１５６ｍｇの組織消化の密度にて、間質培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ’ｓ、１０％ウシ胎仔血清（ユタ州ローガンに所在のハイクロン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）社）、１００Ｕペニシリン／１００μｇストレプトマイシン／０．２５μｇフンギゾン）中のＴ２２５フラスコ中にて播種した。初代培養細胞のこの初代の継代は「継代０（Ｐ０）」と称される。３７℃、５％のＣＯ２にて最初に４８時間インキュベートした後、培養物をＰＢＳを用いて洗浄し、７５−９０％のコンフルエントに達するまで（おおよそ６日の培養）間質培地中にて維持した。細胞をトリプシン（０．０５％）消化にて継代培養し、５０００細胞／ｃｍ２の密度にて播種した（「継代１」）。継代時の細胞の生存率及び数は、トリパンブルー排除及び血球計による細胞数カウントにより決定した。７５−９０％の密度（おおよそ６日の培養）に達した後も、細胞は、継代２まで繰り返し継代培養した。
【００４０】
（脂質生成）
初代脂質由来幹細胞のコンフルエントな培養物（継代２）は、脂質生成のために、米国特許第６１５３４３２号明細書に記載されている方法と類似の方法、即ち、間質培地を、３％ＦＢＳ、３３μＭのビオチン、１７μＭのパントテン酸塩、１μＭのウシインシュリン、１μＭのデキサメタゾン、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）、５μＭのロシグリタゾン及び１００Ｕペニシリン／１００μｇストレプトマイシン／０．２５μｇフンギゾンとＤＭＥＭ／Ｆ−１２とから構成された脂質細胞誘導培地、に置き換えることにより誘導された。３日後、培地は、ＩＢＭＸ及びロシグリタゾンの両方が含まれていないことを除いては誘導培地と同じである脂質細胞維持培地に変更した。細胞は、維持培地の９０％を３日毎に取り替えた場合に培養物中にて９日まで維持された。
【００４１】
（概日誘導）
６ウェルプレート中にある未分化の、又は脂質細胞で分化したヒトＡＳＣのコンフルエントな培養物から培地を除去し、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２培地及び１００Ｕペニシリン／１００μｇストレプトマイシン／０．２５μｇフンギゾンのみ、或いは、３０％ＦＢＳ、１μＭのデキサメタゾン又は５μＭのロシグリタゾン、のうちの一つが補充されたものと置換された。ＡＳＣは誘導剤に２時間さらされた。誘導の１時間後、各条件下にある一つのプレートを全ＲＮＡのために採取した。２時間後、残りのプレート中の培地は、無血清ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２培地及び１００Ｕペニシリン／１００μｇストレプトマイシン／０．２５μｇフンギゾンのみと、置き換えた。最初の誘導から４時間毎に４８時間まで、個々のプレートから全ＲＮＡが採取された。
【００４２】
（ヒトＡＳＣに対する定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））
マウス組織に対して、上記したようにＡＳＣからＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（モレキュラーリサーチセンター）を製造業者の仕様書に従って使用し、全ＲＮＡを精製した。おおよそ２μｇの全ＲＮＡを、２０μＬの反応物中にて、４２℃にて１時間、Ｏｌｉｇｏ ｄＴと共にＭｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウィルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ；プロメガ社）を使用して逆転写した。興味のある遺伝子のプライマー（表２に列挙）はプライマーエキスプレスソフトウェア（アプライドバイオシステムズ社）を使用して確認した。全てのプライマーは対応するヒトｍＲＮＡの配列に基づいており、少なくとも一つのエクソン／イントロン接合部を超えて振幅するように指定されていた。ｑＲＴ−ＰＣＲは７９００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して、汎用される周期条件（９５℃にて１０分間；９５℃の４０サイクルにて１５秒間；そして６０℃にて１分間）の下に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）とともに希釈したｃＤＮＡサンプル上にて実施した。全ての結果は、サイクロフィリンＢ発現対照に対して補正した。
【００４３】
【表３】
（周期分析）
ｑＲＴ−ＰＣＲにより得られた概日データの周期は、Ｔｉｍｅ Ｓｅｒｉｅｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ−Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｏｓｉｎｏｒ ｖ．６．０ソフトウェア（エキスパート ソフト テクノロジー社製）を使用して試験した。各データセットは、一般的な余弦式モデル、Ａｃｏｓ（２ｐ ｔ／Ｔ）＋Ｂｓｉｎ（２ｐ ｔ／Ｔ）＋Ｍ（ここで、Ａは振幅であり、Ｔは期間（２４時間）であり、かつＭはＭＥＳＯＲ（リズム補正平均値）（Ｃ．Ｂｉｎｇｈａｍら（１９８２年））である）に適合し、周期的な様式を示すデータ時点の百分率、及びモデル曲線に設定されたデータの適合性に対するｒ２値を提供した。モデルは、０．９５０確率水準にて有効であるものとして設定した（ＡＮＯＶＡ）。各データセットの適合度はＫ−Ｓ検定（コルモゴロフースミルノフ検定）、ｋ２検定、平均及びＱ検定（ユングボックスＱ統計適合度仮説）を用いて検定し、報告された個々のデータセットはこれらの試験の各々に対する基準に適合した。
【実施例２】
【００４４】
（脂肪組織は概日振動機構遺伝子を発現する）
脂肪組織中の活性末梢概日時計の存在を研究し、かつ特徴づけるために、ｑＲＴ−ＰＣＲのアプローチを、８週齢のＡＫＲ／Ｊマウスの肝臓、褐色脂肪組織、鼠径部脂肪組織及び精巣上体脂肪組織（それぞれ、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴ）における概日遺伝子の発現パターンを調べるために使用した。組織は、３匹の雄の８週齢ＡＫＲ／Ｊマウスから、４時間毎に４８時間にわたり採取した（１３の時点、各時点においてｎ＝３）。全ＲＮＡは回収された組織から抽出され、実施例１に記載したように、遺伝子発現の定量ＲＴ−ＰＣＴ解析のために使用した。全ての結果は、対応するサイクロフィリンＢ発現レベルで補正した。図１において、全ての値は平均値±ＳＤにて報告されている。図１に示されるように、試験された概日振動遺伝子の大部分において、顕著な周期的発現が認められた。Ｎｐａｓ２及びＢｍａｌ１は同調性にて周期化され、同調因子（Ｚｅｉｔｇｅｂｅｒ）（概日）時間（ＺＴ）０（０、２４及び４８時間、または１２時間の暗期の最後）付近にてその頂点（最も高いレベル）に到達し、ＺＴ１２（１２及び３６時間、または１２時間の明期の最後）付近にてその最低点（もっとも低いレベル）に到達した。それらの発現パターンはＢＡＴ、ｉＷＡＴ、ｅＷＡＴ及び肝臓の間で一致したが、振幅においては若干の相違があった。これに対し、Ｃｌｏｃｋの発現はこれらの組織のいずれにおいても一貫した概日パターンには従わなかった（図１）。Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２及びＰｅｒ３の発現は、同調した２４時間の振動を示し、ＺＴ１２（１２時間及び３６時間）付近にて頂点に達し、かつＺＴ０（０、２４及び４８時間）付近にて最低点に達した（図１）。Ｃｒｙ２の発現において幾らかの矛盾が観察されたが、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２の全体の遺伝子発現は、ＺＴ２０（２０及び４４時間）付近が頂点であり、かつＺＴ８（８及び３２時間）付近が最低点である概日プロファイルに従った（図１）。これらの見解を確認するために、数ヶ月後に同じ試験を繰り返し、図１に示したものに非常に類似する結果を示した（データは図示しない）。観察された遺伝子発現パターンの周期性を有する性質は、発現データが、周期的な振動パターンの数学的なモデルとしての余弦曲線に一致することにより示された（データは図示しない）。
【００４５】
これらの結果は、褐色脂肪組織、鼠径部脂肪組織及び精巣上体脂肪組織における活性末梢概日時計の存在を明らかに示すものである。試験された概日振動遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ１−３及びＣｒｙ１−２）の顕著な周期的発現は、振幅において若干の相違はあるものの、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴにおいて一致した。興味深いことに、発現パターンは肝臓においても反映され、その概日時計は独立して特徴づけられた（Ｓ．Ｐａｎｄａら（２００２年ｂ）；Ｋ．Ａ．Ｓｔｏｋｋａｎら（２００１年））。しかしながら、Ｃｌｏｃｋの発現は肝臓も含むこれらの組織のいずれにおいても一致した概日パターンに従わなかった。少なくともＳＣＮにおけるＣｌｏｃｋの発現は、周期的というよりもむしろ構成的であるものと思われることを他の研究者が示した。また、その他の末梢組織及び前脳において、ＣＬＯＣＫ蛋白質の作用は、ＮＰＡＳ２のようなオルソログによって実施されることが示された（Ｍ．Ｒｅｉｃｈら（２００１年））。Ｃｌｏｃｋにおいて振動発現プロファイルが欠如しているという事実は、脂肪組織の概日振動体の成分としてこの遺伝子を排除するものではない。Ｎｐａｓ２の振動パターンは、それが脂肪組織におけるコア振動体の主要な成分であることを示していない。
【００４６】
ＣｒｙとＰｅｒの発現位相の間に観察された僅かな時間のずれは、ＳＣＮ及び特定の末梢組織において既に報告されている（Ｎ．Ｒ．Ｇｌｏｓｓｏｐら（２００２年））。試験された全てのＰｅｒ及びＣｒｙ遺伝子の日内振動は、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴ並びに肝臓において、同調的な様式にて起こった。もっとも重要なことは、試験された全ての組織において、Ｎｐａｓ２及びＢｍａｌ１の振動は、Ｐｅｒ及びＣｒｙの振動とは逆の位相にて起こり、その他の哺乳動物組織において示されるように、活性概日時計の自動調節機構を反復するものである（Ｒ．Ａｌｌａｄａら（２００１年））。
【００４７】
この結果は、余弦曲線に適合する解析結果を更に支持するものであり、遺伝子発現が余弦曲線と一致する傾向及び概日時計内の逆位相振動に従うことを明らかに示す。総合すると、これらの知見は、脂肪組織における活性概日時計機構の存在を例示するのみならず、その一致した様式及び再生可能な様式にある周期的な性質を確認するものである。
【実施例３】
【００４８】
（脂肪組織において概日制御された出力遺伝子振動）
ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴにおける活性概日時計の存在は、その他の組織において概日制御されていることが知られている複数の遺伝子の発現レベルを調べることにより更に追求した。実施例２に記載のマウスの末梢組織は、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した更なる遺伝子の発現パターンを調べるために使用した。図２に示されるように、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβの発現はＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴにおいてＰｅｒ遺伝子に備えられた位相にて振動し、肝臓にて観察されたパターンに反映した。Ｄｂｐの発現は、Ｐｅｒ及びＲｅｖ−ｅｒｂ遺伝子に類似する振動パターンを示す一方、Ｅ４ｂｐ４の発現はＮｐａｓ２及びＢｍａｌ１に対する位相における概日プロファイルにほぼ従い、かつＤｂｐの位相とはかけ離れていた（図２）。脂肪組織、特にｉＷＡＴにおけるＳｔｒａ１３の発現は、強い振動傾向を示したが、特定の概日パターンには従わなかった。Ａｒｎｔ遺伝子の発現は有意に変動せず、Ｉｄ２発現の概日パターンは肝臓を含む試験した全ての組織にて観察された（図２）。
【００４９】
末梢概日時計の活性は、複数の概日制御出力遺伝子の発現パターンにおける効果によりもっとも明らかとなった。ＲＥＶ−ＥＲＢα及びＲＥＶ−ＥＲＢβはオーファン核ホルモン受容体であり、遺伝子プロモータ中においてＲＯＲ特異的応答要素（ＲＯＲＥ）を結合することによる負の転写調節因子として作用し、正の転写調節因子ＲＯＲαの結合を阻止する。それらは、この機構により、Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ及びＣｒｙ１の発現を直接調節することが示されている（Ｎ．Ｐｒｅｉｔｎｅｒら（２００２年））。Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβの発現は、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１により正に調節され、ＰＥＲ：ＣＲＹ二量体により負に調節され、従って、本研究にて観察された発現プロファイルに一致する。Ｒｅｖ−ｅｒｂαの発現は脂質生成との相関関係が示されており（Ａ．Ｃｈａｗｌａら（１９９３年））、かつその異所性発現はインビトロ及びインビボにおける脂肪細胞の分化を促進する（Ｓ．Ｌａｉｔｉｎｅｎら（２００５年））。従って、これらの遺伝子の概日調節された発現は、脂肪細胞分化プログラムに重要な役割を担うであろう。
【００５０】
ＤＢＰ（アルブミンＤ−要素結合蛋白質）は、ＰＡＲドメイン転写因子であり、その発現は直接的な概日制御下にある（Ｌ．Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｌｉｎａら、（１９９７年））。この研究にて観察されたＤｂｐの発現は、Ｄｂｐ転写がＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１によって推進され、ＰＥＲ：ＣＲＹ二量体によって抑制されるという知見と一致している（Ｊ．Ａ．Ｒｉｐｐｅｒｇｅｒら（２０００年））。更に、ＤＢＰ欠損マウスにおける研究は、これらの動物が変更された活性期間を示し、概日振動機構の制御におけるＤｂｐの役割を提案していることを明らかにした（Ｌ．Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｌｉｎａら（１９９７年））。ＤＢＰはまた、Ｐｅｒ１転写とシミュレーションすることが示されているので、概日振動機構における調節効果をも有し得る（Ｓ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉら（２０００年））。
【００５１】
Ｅ４ＢＰ４蛋白質はＤＢＰに非常に関係している。そのプロモータはＲＯＲＥ要素を含み、ＲＥＶ−ＥＲＢ’ｓによる転写抑制に影響を受けやすくなっている（Ｈ．Ｒ．Ｕｄｅｒａら（２００２年））。従って、Ｅ４ｂｐ４発現は振動パターンに従っているが、その位相は、Ｄｂｐの位相に相対向するものであった（Ｓ．Ｍｉｔｓｕｉら（２００１年）もまた、参照されたい）。
【００５２】
Ｓｔｒａ１３（Ｄｅｃ１）は、複数の下流概日出力遺伝子を含む複数の遺伝子の概日制御転写抑制因子／調節因子をコードする（Ａ．Ｇｒｅｃｈｅｚ−Ｃａｓｓｉａｕら（２００４年））。Ｓｔｒａ１３転写はＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１により活性化される一方、ＳＴＲＡ１３蛋白質はＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１活性の抑制因子として作用する（Ｓ．Ｈｏｎｍａら（２００２年））。肝臓におけるＳｔｒａ１３ｍＲＮＡの最大レベルは、ＣＬＯＣＫ：ＢＭＡＬ１の転写活性のピークに一致することが報告されている（Ｓ．Ｐａｎｄａら（２００２年ｂ））。概日振動は肝臓において観察されたが、Ｓｔｒａ１３の概日発現は脂肪組織においては観察されなかった。この不一致は、これらの組織におけるＳｔｒａ１３の発現が比較的低いことによるものであろう。
【００５３】
ＡＲＮＴは、ｂＨＬＨ−ＰＡＳドメイン蛋白質であり、ＰＥＲ蛋白質（２）に構造的に類似する。ＡＲＮＴのレベルは肝臓、肺及び胸腺においては概日振動の傾向に従ったが、脾臓においては従わないことが示されている（Ｖ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら（１９９８年））。しかしながら、現在の研究において、Ａｒｎｔ遺伝子発現の有意な変動は、いかなる脂肪組織においても、又は肝臓においても認められていない。これは、転写制御機構よりもむしろ翻訳後による蛋白質レベルにおける日内変化を示すものであろう。
【００５４】
Ｉｄ２遺伝子はＤＮＡ結合ドメインを欠いたＨＬＨ蛋白質をコードする。ＩＤ２蛋白質はその他のｂＨＬＨ蛋白質と二量体化し、そのＤＮＡ結合活性を阻害する（Ｋ．Ｎｅｕｍａｎら（１９９５年））。そのプロモータはＥ−ｂｏｘ配列を含み、概日ｂＨＬＨ−ＰＡＳ転写因子による転写調節の標的の可能性となる。ＳＣＮ及び肝臓の最近のマイクロアレイ解析において、Ｉｄ２は大規模クラスタの概日調節された遺伝子のプロトタイプを提供した（Ｈ．Ｒ．Ｕｅｄａら（２００２年））。これらの知見と一致して、Ｉｄ２発現においては強い振動パターンが認められ、その位相は、試験されたその他のＣＬＯＣＫ−調節された遺伝子に類似し、それは、Ｉｄ２発現には正の概日調節因子が含まれていることを意味する。
【実施例４】
【００５５】
（概日リズムの血清測定）
二つの独立した試験にて、８週齢ＡＫＲ／Ｊ雄マウスから、４時間毎に４８時間にわたり血液サンプルを採取した（１３時点）。遠心分離後、各時点からの血清をプールし、実施例１に記載したように、ラジオイムノアッセイ（コルチコステロン）又はＥＬＩＳＡ（メラトニン及びレプチン）による血清蛋白質の検出に使用した。全ての試験は、（単一の時点内の）プールしたサンプルにて実施した。平均±ＳＤの値を図３に示した。血清コルチコステロンレベルは全身制御として供され、かつＰｅｒ及びＣｒｙ遺伝子と類似した、１２時間の明期の最後に頂点が存在する概日プロファイルを示した（図３）。しかしながら、メラトニン及びレプチンの血清レベルの測定は有意な振動プロファイルを生じなかった。
【００５６】
コルチコステロンレベルは、特徴的な概日リズムを示すことが知られており（Ｃ．Ａｌｌｅｎら（１９６７年））、対照として使用した。しかしながら、１群５匹の動物におけるメラトニン及びレプチンの血清レベルの測定は、振動プロファイルの傾向を示しはしたが、有意性は達成していない。有意性は、より大きな母集団ベースを使用すれば達成できるかもしれない。
【実施例５】
【００５７】
（マイクロアレイ解析は脂肪組織中の多数の周期的発現遺伝子を示す）
脂肪組織における概日遺伝子発現の程度を調べるために、実施例１及び２に記載したように、ｑＲＴ−ＰＣＲにより既に試験された組織からの全ＲＮＡサンプルについてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ遺伝子発現解析を実施した。補正後、遺伝子発現の周期性は離散フーリエ変換により検出され、かつ概日期間の有意性は、実施例１に記載したように、Ｆｉｓｈｅｒのｇ検定により確認した。多くの遺伝子は、ｉＷＡＴ（４３９８遺伝子）、ＢＡＴ（５０６１遺伝子）及び肝臓（５３８６遺伝子）において振動発現パターンを示した。図４に示されるように、これらの遺伝子のうちの６５０個はＢＡＴ、ｉＷＡＴ及び肝臓において保存された概日発現パターンを示し、組織特異的振動トランスクリプトームのそれぞれ１４．８％、１２．８％及び１２％であった（図５）。この遺伝子群は、基礎代謝及び「ハウスキーピング」機能に関与するものから主として構成されており、概日時計振動体遺伝子Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１（Ａｒｎｔ１）、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３及びＣｒｙ１並びに出力遺伝子Ｄｂｐを含み、我々のｑＲＴ−ＰＣＲの結果に一致し（図１及び２）、かつコサイン−フィット解析により確認した（データは図示しない）。更に、脂肪機能に関与する複数の遺伝子（Ｃｅｂｐα、Ｃｅｂｐγ、Ｌｐ１、Ｐｐａｒα、Ｐｇｃ１β及びＳｔａｔ５Ａ）の発現は、これら３つの組織において周期化していることが示された。
【００５８】
概日トランスクリプトームの別の特徴は、振動遺伝子が特定の一時的な群において周期化することであった。遺伝子の大部分は、ＺＴ０、４、８又は１６のいずれかにおけるその振動位相の頂点に基づいて分類され、このパターンがＢＡＴ、ｉＷＡＴ及び肝臓における共通の振動体遺伝子のうちから検出可能であることを示す（データ図示しない）。
【００５９】
ｑＲＴ−ＰＣＲにより既に検査されたサンプルにおけるＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ遺伝子発現解析の結果は、ｉＷＡＴ、ＢＡＴ及び肝臓において振動体発現パターンを有する多数の遺伝子を示してきた。５３００を超える遺伝子の検出は、肝臓においてこれまでに報告されている値（Ｒ．Ａ．Ａｋｈｔａｒら（２００２年）；Ｋ．Ｏｉｓｈｉら（２００３年））を超えている。実施例１において記載されているように、周期的に発現する全ての遺伝子を、その振幅及び「ノイズ」レベルに関わらず、確実に決定するために周波数変換アプローチを使用した。
【００６０】
これらの知見は、これらの異なる組織の代謝活性間における全体的な一致を示唆している。この知見は、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及び肝臓中の振動遺伝子において明らかなように、特定の一時的な群において振動遺伝子が周期化するという観察結果により更に支持されている。
【実施例６】
【００６１】
（一時的な制限給餌療法が脂肪蓄積部における概日発現プロファイルを変える）
ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴにおける遺伝子発現の振動パターンが実験的に位相シフトされるか否かを決定するために、実験動物群では給餌を１２時間の明期に行うように一時的に制限し（制限給餌）、一方、対照動物群は随意に食物を摂取させた。実施例１に更に記載されているように、４２匹の８週齢の雄ＡＫＲ／Ｊマウスを、給餌制限群（実線）及び対照群（点線）の２つの実験群に分けて、屠殺する前に７日間一つのハウジングにて維持した。肝臓、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴを各群３匹の動物から、４時間毎に２４時間にわたり採取した（７時点、各時点当たり２つの群、各時点当たり各群ｎ＝３）。肝臓、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴからの概日遺伝子の発現パターンを実施例２に記載したように決定し報告した。複数の遺伝子の結果を図５及び６に示す。図５において、Ｎ／Ｄ平均値は決定していない。図５及び６に示されるように、この２４時間の試験において、対照動物（点線）は、図１及び２に示されるものに匹敵する発現遺伝子の概日パターンを示した。しかしながら、食物へのアクセスが一時的に制限されている動物（実線）は遺伝子発現の位相が対照動物に対してシフトしていた。
【００６２】
付随的な対照として、血清コルチゾン、体重及び食物消費量を、７日間の一時的な制限給餌試験期間中にモニタリングした。血液サンプルは、実施例５において上記したように動物から回収した。遠心分離後、所定の時点内の各群からの血清をプールし、ラジオイムノアッセイによる血清コルチコステロンの一回の検出に使用した。個々の動物の食物摂取量及び体重を屠殺時まで毎日測定し、平均±ＳＤの値を図７に示した。図７に示されるように、一時的な制限給餌療法は、コルチコステロン血清レベルの概日パターンにおいて位相をシフトするとともに振幅を減衰した。最初の調整期間を過ぎて、対照動物と給餌制限動物との間における食物摂取量には有意な差はなかった。両群の間に、体重に関しても有意な差はなかった。とはいえ、体重増加に向かう傾向が給餌制限群では観察された。
【００６３】
給餌制限が、肝臓、骨格筋、心臓及び腎臓の末梢組織における概日リズムを調節することはこれまでに示されてきた（Ｋ．Ａ．Ｓｔｏｋｋａｎら（２００１年）；Ｎ．Ｒ．Ｇｌｏｓｓｏｐら（２００２年）；Ｋ．Ｏｉｓｈｉら（２００４年）；Ｆ．Ｄａｍｉｏｌａら（２０００年）；Ｎ．Ｌｅ Ｍｉｎｈら（２００１年）及びＳ．Ｙａｍａｚａｋｉら（２０００年））。この最近の研究において、個々の遺伝子は、肝臓、ＢＡＴ、ｉＷＡＴ及びｅＷＡＴの間にて一貫した位相のシフトを示した。しかしながら、観察された位相シフトは個々の組織内の遺伝子の全ての間にて均一ではなかった。個々の概日時計成分は独自の調節機構を有しているので、給餌制限は各遺伝子の位相を異なって調節するのであろう。同様の観察結果が肝臓においても見られた（Ｆ．Ｄａｍｉｏｌａら（２０００年）；Ｎ．Ｌｅ Ｍｉｎｈら（２００１年））。
【００６４】
概日振動体遺伝子間の逆位相の関係は、一時的な給餌制限療法において影響を与えなかった。代わりに、この関係は個々の遺伝子の位相シフト自体を調節し、これらの末梢時計が刺激に同調するように構成された機構を有し、かつ時計自体の振動動作を相殺することなく生理学的な要求を変更することを意味する。同様に、一時的な給餌制限は、その発現を調節する振動体遺伝子と同様の様式にて出力遺伝子の位相をシフトし、それによって振動体機能と出力遺伝子発現との間の関連を繰り返す。
【００６５】
現在のデータは、給餌制限が、既に報告されたように血清コルチコステロン濃度の振動位相を変化させることを示す。
【実施例７】
【００６６】
（未分化ヒトＡＳＣの概日遺伝子発現におけるデキサメタゾンの効果）
デキサメタゾンに一時的にさらされた未分化ヒトＡＳＣの応答を調べるために本研究を実施した。継代２のヒトＡＳＣを、上記したように形成手術を受けた健常な女性ドナーから得られる脂肪吸引物から単離した。ドナーの年齢は３２歳〜５９歳の範囲であり、そのＢＭＩは２０．９〜３０．１の範囲であった（データ図示しない）。コロニー形成単位アッセイにおけるドナーの４人からのＡＳＣの解析により、分化カクテルに応答した脂質生成及び骨生成の両方を受ける能力を確認した（Ｊ．Ｂ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌら（２００６年）に既に記載されているように）。初期の研究は、これら４人のドナーから得られたコンフルエントかつ休止した未分化の継代２のＡＳＣを用いて実施した。ＡＳＣを、２時間の間、新鮮な無血清培地のみにさらすか、又はデキサメタゾン（１μＭ）を補充した培地にさらし、その後無血清培地のみに変換して４８時間までさらした。誘導後一時間の全ＲＮＡ及び最初にさらした後、４時間間隔での全ＲＮＡ用にサンプルを採取した。全ＲＮＡは、Ｂｍａｌ１、Ｎｐａｓ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβの遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析に対して使用され、対応するサイクロフィリンＢ発現レベルに対して補正した。
【００６７】
図８Ａは新鮮な血清培地のみにさらしたヒトＡＳＣの結果を示す。各線は、個々のドナーからの細胞の結果を示す。図８Ｂはデキサメタゾンに２時間さらした後に無血清培地にて平坦化させたヒトＡＳＣの結果を示す。グルコース及びその他の栄養物を含む新鮮な培地のみにさらした場合、全ての被検者においてＰｅｒ３及びＲｅｖ−ｅｒｂαの顕著な周期的発現が誘導され、ピークのレベルは、それぞれ、２８時間、又は２０及び４４時間であった。遺伝子Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｎｐａｓ２、及びＰｅｒ１の発現は、振動プロファイルに向かう傾向を示したが、ドナー間においてバラツキがあった。
【００６８】
デキサメタゾンの誘導後、Ｂｍａｌ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ３、及びＲｅｖ−ｅｒｂαの遺伝子発現は、図８Ｂに示されるように、４人のドナーからの未分化ＡＳＣにおいて振動プロファイルを示した。概日転写装置の「負」の調節アームに属する遺伝子であるＰｅｒ１、Ｐｅｒ３及びＣｒｙ２は、１乃至４時間後のｍＲＮＡの前初期誘導、誘導後２８乃至３２時間の間のピーク、及び４８時間における上昇が見られた。これに対して、概日転写装置の「正」の調節アームに属する遺伝子であるＢｍａｌ１は前初期誘導が見られず、誘導後、１６乃至２０時間及び４０時間にピークレベルを示した。これは、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ３及びＣｒｙ２に対して約８乃至１２時間位相がシフトしたことに反映する。ＣＬＯＣＫ同族体及びＢＭＡＬ１蛋白質ヘテロ二量体性のパートナーであるＮＰＡＳ２をコードする遺伝子は４人のドナー間において一貫した振動プロファイルを示さなかった。Ｒｅｖ−ｅｒｂαのデキサメタゾン誘導発現プロファイルは４人のドナー間において厳密に調節されており、誘導後２４時間のピークレベル、４８時間に上昇が認められた。
【実施例８】
【００６９】
（未分化ヒトＡＳＣ及び脂肪細胞分化ヒトＡＳＣにおけるデキサメタゾン、チアゾリジンジオン又は３０％血清を用いた概日遺伝子発現の誘導）
脂質生成はＰＰＡＲγ２の増大したレベルに伴うものであるので、脂質細胞分化ヒトＡＳＣが、ＰＰＡＲγ２又はグルココルチコイド受容体リガンドに異なって応答するかどうかを決定するために更なる研究を実施した。げっ歯類の繊維芽細胞（６）における概日遺伝子発現を誘導することが知られている血清ショック（３０％ウシ胎仔血清）を対照として使用した。３人の別々のドナーから得られた継代２のヒトＡＳＣを、実施例１及び７に記載したように、コンフルエントかつ休止するまで培養した。概日遺伝子の発現は、未分化の状態のＡＳＣ、或いはデキサメタゾン又はチアゾリジンジオンを含んだ誘導カクテルにさらし、その後、９日間の脂肪細胞の分化の後のＡＳＣを使用して決定した。未分化細胞及び脂肪細胞分化細胞から培地を除去し、３０％ウシ胎仔血清（図９）、デキサメタゾン（１μＭ）（図１０）又はロシグリタゾン（５μＭ）（図１１）のいずれかを補充した無血清培地と交換した。サイクロフィリンＢに対して補正されたＢｍａｌ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβの一時的な発現プロファイルを試験した。個々の線は３人の異なるドナーからの値を示す。試験は３回実施し、示された値は平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【００７０】
個々のドナーは、３種類の異なる薬剤で誘導された遺伝子発現の振幅に変動を示した。未分化ＡＳＣ及び脂肪細胞で分化したＡＳＣにおいて、各刺激はＢｍａｌ１の発現を誘導した。最も迅速な誘導は、３０％血清処置にて達成され、遺伝子発現の上昇及びピークレベル（頂点）はデキサメタゾン及びトリアゾリジンジオンにて誘導された場合（８乃至１２時間）に対して約４時間早く（４乃至８時間）起こった。連続するピーク間の長さは、約２４乃至２８時間であった。個々の刺激に対するＰｅｒ３の応答は変化した。図８Ｂに明記されているように、未分化ＡＳＣにおいて、デキサメタゾンは、前初期応答を誘導し、続いて２４乃至２８時間にピークが認められた。前初期応答の程度は、引き続くピークが２０乃至２４時間に起こる脂肪細胞分化ＡＳＣにおいては緩やかであった。３０％血清もトリアゾリジンジオンも前初期応答を開始しなかったが、ピーク発現は未分化ＡＳＣでは２４乃至２８時間、脂肪細胞分化ＡＳＣではその約４時間前に起こった。未分化ＡＳＣにおいてデキサメタゾン又はトリアゾリジンジオンにて誘導された後のＲｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ発現の開始は類似しており、２４時間にて頂点に到達し、４８時間にて上昇を示した。これに対し、未分化ＡＳＣにおける３０％血清にて処置した後の未分化ＡＳＣのＲｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ誘導はより迅速であり、１２乃至２０時間にて頂点に到達した。脂肪細胞分化ＡＳＣにおいて、全ての刺激は、１６乃至２０時間にてＲｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβのピーク誘導を誘発し、４０乃至４４時間に第二のピークが観察され、それは、デキサメタゾン及びトリアゾリジンジオンによる誘導では、未分化ＡＳＣ場合よりも約８時間位相が前進していることに対応する。
【００７１】
データの周期性は、コサイナー（Ｃｏｓｉｎｏｒ）解析を使用してより厳密に評価した（データは図示しない）。コサイナー「リズム」はリズム様式に振舞うデータ時点の百分率を決定する。未分化ＡＳＣ及び脂肪細胞分化ＡＳＣのいずれに対しても、データの５０％以上が統計学的に有意な振動リズムを示した。Ｂｍａｌ１、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβデータセットの３分の２が、９５％のＡＮＯＶＡ確率限界に適合した。
【実施例９】
【００７２】
（ヒトＡＳＣの概日遺伝子発現プロファイルにおけるＧＳＫ３Ｂ阻害剤ＳＢ４１５２８６の効果）
ヒト脂肪由来幹細胞のデキサメタゾンでの処置は、上記したようにインビトロにおける概日リズムの誘導を示し、かつこの誘導がグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤の添加によって遮断されるかどうかを調べるための実験を実施した。
【００７３】
ヒトＡＳＣのコンフルエントな培養物は、１μモルのデキサメタゾンに２時間さらすことにより誘導した。培地を、無血清培地（ＳＦ）又は３０μＭＳＢ４１５２８６（ＳＢ４１５、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤）を含んだ無血清培地に変更した。個々の培養物は表示した時間において全ＲＮＡを採取し、Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３及びＲｅｖ−ｅｒｂαの遺伝子発現のｑＲＴ−ＰＣＲ解析に使用し、対応するサイクロフィリンＢのレベルに対して補正した。試験は３回実施し、示された値は平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【００７４】
図１２に示されるように、細胞をＳＢ４１５とともに培養した場合、概日周期がシフトし、かつ長くなった。ＳＢ４１５２８６が存在しない場合、デキサメタゾンで誘導された細胞は、概日転写因子遺伝子ＢＭＡＬ１及びＰｅｒ３並びに下流標的であるＲｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβのｍＲＮＡレベルの発現において、時間依存性の増加を示した（ｅｖ−ｅｒｂβのデータは図示しない）。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤の存在において、ｍＲＮＡ誘導プロファイルは遅延し、かつ６乃至９時間シフトし、概日周期（タウ）の延長と一致した。これらの結果は、脂肪細胞における遺伝子発現の概日周期は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤を使用することによりシフトし得ることを示す。グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータのその他公知の阻害剤は、ＳＢ−２１６７６３、リチウム、インスリン及びフェニレフリンを含む（Ｍ．Ｐ．Ｃｏｇｈｌａｎ他（２０００年）；Ｄ．Ａ．Ｃｒｏｓｓら（２００１年）；Ｋ．ＭａｃＡｕｌａｙら（２００３年）；及びＬ．Ｍ．Ｂａｌｌｏｕら（２００１年））。
【実施例１０】
【００７５】
（ＳＢ４１５２８６による概日期間の延長による体重増加の誘導）
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤（ＳＢ４１５２８６）でのマウスの処置は、平均概日期間（タウ）の延長により肥満を誘導する。実験はＡＫＲ／Ｊマウスにて実施する。動物群は、通常の給餌状態に置かれ、一定した１２時間の明期と１２時間の暗期の条件（ＬＤ）又は恒暗条件（ＤＤ）下に維持される。動物は、４乃至８週間の間、チューブによる強制的な投与により、毎日、プラセボ又はＧＳＫ３ベータ阻害剤（ＳＢ４１５２８６）で処置される。動物の体重は毎日監視される。活性及び概日リズムに対する代替的なマーカとして回し車での運動が連続的に観察される。ＧＳＫ３ベータ阻害剤での処置は、対照と比較して、恒暗条件（ＤＤ）で一日の概日周期を一日当たり３乃至１０％増大させる。動物の体重における統計学的に有意な増大は、ＤＤ条件で、対照群とＧＳＫ３ベータ阻害剤の群との間では、８週間の最後までに起こる。
【００７６】
第二の実験において、マウスを、同マウスが高脂肪食（脂肪から４５％のカロリー）を摂取することを除いては同一の条件下に配置する。ＧＳＫ３ベータ阻害剤での処置は、プラセボ対照群に対して、８週間の最後までに体重の有意な上昇を引き起こす。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。ＧＳＫ３ベータ阻害剤の添加は、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。
【実施例１１】
【００７７】
（概日期間が塩化リチウムにて延長されることによる体重増加の誘導）
別のグリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ阻害剤（塩化リチウム）でのマウスの処置により肥満が誘導され、平均概日期間（概日周期）（タウ）が延長する。研究は、ＡＫＲ／Ｊマウスで実施される。動物群は、通常の給餌状態に置かれ、一定した１２時間の明期と１２時間の暗期（ＬＤ）又は恒暗条件（ＤＤ）下に維持される。動物は、４乃至８週間の間、通常の飲料水（対照）を受けるか、又は塩化リチウムを含む飲料水（濃縮）を受ける。動物の体重は毎日監視される。活性及び概日リズムに対する代替的なマーカとして回し車での運動が連続的に観察される。塩化リチウムでの処置は、対照と比較して、恒暗条件（ＤＤ）で一日の概日周期を一日当たり３乃至１０％増大させる。動物の体重における統計学的に有意な増大は、ＤＤ条件で、対照群と塩化リチウム群との間では、８週間の最後までに起こる。塩化リチウムでの処置は、８週間の最後までに、プラセボ対照群に対して体重を有意に上昇させる。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。塩化リチウムの添加は、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。
【実施例１２】
【００７８】
（双極性障害の治療に使用される薬剤であるバルプロ酸にて概日期間が延長されることによる体重増加の誘導）
双極性障害の治療に使用される薬剤でのマウスの処置により肥満が誘導され、平均概日期間（概日周期）（タウ）が延長する。研究は、ＡＫＲ／Ｊマウスで実施される。動物群は、通常の給餌状態に置かれ、一定した１２時間の明期と１２時間の暗期（ＬＤ）又は恒暗条件（ＤＤ）下に維持される。動物は、４乃至８週間の間、チューブによる強制的な投与により、毎日、プラセボ又はバルプロ酸（濃縮）を受ける。動物の体重は毎日監視される。活性及び概日リズムに対する代替的なマーカとして回し車での運動が連続的に観察される。バルプロ酸又はその他の抗双極性障害薬での処置は、対照と比較して、恒暗条件（ＤＤ）で一日の概日周期を一日当たり３乃至１０％増大させる。動物の体重における統計学的に有意な増大は、ＤＤ条件で、対照群とバルプロ酸群との間では、８週間の最後までに起こる。双極性障害治療用化合物での処置は、プラセボ対照群と比較して、体重増加における有意な増大が８週間の最後までに起こる。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。バルプロ酸の添加は、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。
【００７９】
第二の実験において、マウスを、同マウスが高脂肪食（脂肪から４５％のカロリー）を摂取することを除いては同一の条件下に配置する。ＧＳＫ３ベータ阻害剤での処置は、プラセボ対照群に対して、８週間の最後までに体重の有意な上昇を引き起こす。これは、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。
【実施例１３】
【００８０】
（概日期間がＧＳＫ３ベータ活性化剤にて短縮されることによる体重減少の誘導））
グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ活性化剤での処置は、肥満を低減し、かつ平均概日期間（タウ）を短縮する。研究は、ＡＫＲ／Ｊマウスで実施される。動物群は、通常の給餌状態に置かれ、一定した１２時間の明期と１２時間の暗期（ＬＤ）又は恒暗条件（ＤＤ）下に維持される。動物は、４乃至８週間の間、チューブによる強制的な経口投与により、毎日、プラセボ（対照）又はＧＳＫ３ベータ活性化剤（濃縮）で処置される。動物の体重は毎日監視される。活性及び概日リズムに対する代替的なマーカとして回し車での運動が連続的に観察される。ＧＳＫ３ベータ活性化剤での処置は、対照と比較して、恒暗条件（ＤＤ）で一日の概日周期を一日当たり３乃至１０％低減させる。動物の体重における統計学的に有意な減少は、ＤＤ条件で、対照群とＧＳＫ３ベータ活性化剤の群との間では、８週間の最後までに起こる。ＧＳＫ３ベータ活性化剤での処置は、プラセボ対照群と比較して、体重増加における有意な増大が８週間の最後までに起こる。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。また、ＧＳＫ３ベータ活性化剤の添加は、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの対照に対する実験群の位相シフトと関連する。周知のＧＳＫ３ベータ活性化剤の例は、オクトレオチド（ソマトスタチン類似体）、ソマトスタチン、エンザスタウリン及びアスピリンを含む（Ｍ．Ｔｈｅｏｄｏｒｏｐｏｕｌｏｕら（２００６年）；Ｊ．Ｒ．Ｇｒａｆｆら（２００５年）；Ａ．ｄｉ Ｐａｌｍａら（２００６年））。
【００８１】
第二の実験において、マウスを、同マウスが高脂肪食（脂肪から４５％のカロリー）を摂取することを除いては同一の条件下に配置する。ＧＳＫ３ベータ活性化剤での処置は、プラセボ対照群に対して、８週間の最後までに体重の有意な減少を引き起こす。脂肪組織からのＲＮＡを得て、かつ時間の関数として抹消時計遺伝子の遺伝子発現を調べるために、動物を周期的に屠殺する。ここでも、ＧＳＫ３ベータ活性化剤の添加は、対照に対して実験群におおいて、脂肪細胞蓄積部及び肝臓での概日コア転写装置ｍＲＮＡ発現プロファイルの位相シフトと関連する。
【実施例１４】
【００８２】
（高脂肪食は脂肪組織における周期的な概日時計遺伝子装置を変更する）
研究は、高脂肪食での処置が複数の蓄積部からの脂肪組織における「時計」遺伝子ファミリーの概日発現プロファイルを変化させることを確認するために実施される。雄ＡＲＫ／Ｊマウス（６乃至８週齢）をジャクソン ラボラトリーズ社から購入し、Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて、２週間の間、１２時間明期／１２時間暗期の周期を厳格に維持しながら、収容される。３２乃至４０匹の動物群を２週間の間、好きなだけ給餌できる通常の状態、又は高脂肪食の状態に、置く。各群から３乃至４匹の動物群を、３乃至４時間間隔にて３６乃至４８時間まで、頸椎脱臼にて安楽死させる。以下の組織を採取した：血清、脂肪組織（皮下、精巣上体、大網、肩甲骨間、後腹膜）、心臓、肝臓、骨格筋、骨／軟骨）。組織サンプルは、急速冷凍され、続いて全ＲＮＡ及び蛋白質用に採取される。血清サンプルは、ＥＬＩＳＡアッセイによりアディポネクチン、レプチン及び／又はアグーチ関連蛋白質の発現が解析される。サンプルは、ウェスタンイムノブロットにより蛋白質が、リアルタイムＰＣＲによりＲＮＡが、及び／又はノーザンブロット解析により「時計」遺伝子の発現が解析されるが、同「時計」遺伝子は、以下の遺伝子Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｌｏｃｋ、ＢＭＡＬ１、ＮＰＡＳ２、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、Ｒｅｖ−Ｅｒｂα、Ｒｅｖ−Ｅｒｂβ；の幾らか又は全てを含むが、それらに限定されるものではない。適切な対照（アクチン、サイクロフィリン及び／又はＧＡＰＤＨ）が平行して実施される。加えて、アディポネクチン、レプチン、リポ蛋白質リパーゼ、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαの脂肪細胞発現も決定される。対照試験は、肝臓組織における同一遺伝子産物の発現プロファイルを調べる。その他の組織は、更なる分析用に保存される。遺伝子産物の誘導プロファイルの証拠が特定され、上記したような振動パターンの証拠が数学的に解析される。
【実施例１５】
【００８３】
（ヒト被験者はインビボで脂肪組織内に末梢概日時計を有する）
ヒト被験者が、インビボにて、皮下脂肪組織において概日時計装置を発現するかどうかを確認するための試験が実施される。肥満の被験者（ＢＭＩ＞３０）を試験に採用する（１０＜ｎ＜２０）。被験者は７日間の間、厳格な１２時間明期／１２時間暗期である周期と随意の食事の条件にて維持される。最後の３６時間の後に、患者は、適切な静脈のアクセス部位に留置カテーテルが配置される。血液サンプルは、２０乃至３０分間隔にて血清から採取される。３時間間隔にて、患者は、ランダムな採取パターン及び予めプログラムされた採取パターンにて、大腿部、上腕部、腹部及び臀部の皮下脂肪蓄積部にて針生検が実施される。組織サンプルは急速冷凍され、続いて全ＲＮＡ用に採取される。血清サンプルは、ＥＬＩＳＡアッセイによりアディポネクチン、レプチン及び／又はアグーチ関連蛋白質の発現が解析される。組織サンプルは、「時計」遺伝子の発現を解析するために、リアルタイムＰＣＲによりＲＮＡが解析され、同「時計」遺伝子は、以下の遺伝子Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｌｏｃｋ、ＢＭＡＬ１、ＮＰＡＳ２、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、Ｒｅｖ−Ｅｒｂα、Ｒｅｖ−Ｅｒｂβ；の幾らか又は全てを含むが、それらに限定されるものではない。適切な対照（アクチン、サイクロフィリン及び／又はＧＡＰＤＨ）が平行して実施される。加えて、アディポネクチン、レプチン、リポ蛋白質リパーゼ、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαの脂肪細胞発現も決定される。遺伝子産物の発現プロファイルが特定され、振動パターンの証拠が数学的に解析される。
【実施例１６】
【００８４】
（ヒト被検者の脂肪組織における末梢概日時計遺伝子装置は同調され得る）
肥満の被験者（ＢＭＩ＞３０）を試験に採用する（２０＜ｎ＜４０）。被験者は１４日間の間、厳格な１２時間明期／１２時間暗期である周期にて維持される。この期間中、被検者の半分は、１２時間の明期周期時に通常の間隔にてこの間に通常の随意の食事を受ける。年齢及び性別が一致した群は、１２時間の暗期周期時に同一の間隔にて同様の食事を受ける。最後の３６時間の後に、患者は、適切な静脈のアクセス部位に留置カテーテルが配置される。血液サンプルは、２０乃至３０分間隔にて血清から採取される。３時間間隔にて、患者は、ランダムな採取パターン及び予めプログラムされた採取パターンにて、大腿部、上腕部、腹部及び臀部の皮下脂肪蓄積部にて針生検が実施される。組織サンプルは、急速冷凍され、続いて全ＲＮＡ用に採取される。血清サンプルは、ＲＩＡによりグルココルチコイドの発現が、ＥＬＩＳＡアッセイによりアディポネクチン、レプチン及び／又はアグーチ関連蛋白質の発現が解析される。組織サンプルは、「時計」遺伝子の発現を解析するために、リアルタイムＰＣＲによりＲＮＡが解析され、同「時計」遺伝子は、以下の遺伝子Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｌｏｃｋ、ＢＭＡＬ１、ＮＰＡＳ２、ＤＥＣ１、ＤＥＣ２、Ｒｅｖ−Ｅｒｂα、Ｒｅｖ−Ｅｒｂβ；の幾らか又は全てを含むが、それらに限定されるものではない。適切な対照（アクチン、サイクロフィリン及び／又はＧＡＰＤＨ）が平行して実施される。加えて、アディポネクチン、レプチン、リポ蛋白質リパーゼ、ＰＰＡＲγ及びＰＰＡＲαの脂肪細胞発現も決定される。遺伝子産物の発現プロファイルが特定され、振動パターンの証拠が数学的に解析される。二つの群は、概日リズムに対して、時計遺伝子の発現プロファイル及びその他の脂肪組織産物に関して比較される。
【００８５】
本発明の発明者は、脂肪組織蓄積部中での活性末梢概日時計の存在を示してきたが、それは脂肪組織機能を調節する一時的な成分の存在を示唆する。肥満及びメタポリック症候群と概日機能不全とを関連付ける新たな根拠もこの概念を支持する。ヒトＡＳＣが、皮下脂肪組織の一時的な分子解析の強力なインビトロモデルを提供することも示した。ＡＳＣを血清ショック又は核ホルモン受容体リガンドに一時的にさらすことにより、コア概日転写装置（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ、Ｃｒｙ）及びそれらの直接のエフェクタ（Ｒｅｖ−ｅｒｂα＆β）に関与する遺伝子の発現を誘導した。一般に、血清ショックは、核ホルモン受容体リガンドに同様にさらした場合と比較して約４時間早く周期的な遺伝子発現を誘導する。更に、脂肪細胞分化ＡＳＣによる核ホルモン受容体リガンドに対する応答は、未分化のＡＳＣよりも約４乃至８時間先行する。しかしながら、デキサメタゾン及びロシグリタゾンがＡＳＣにおいて脂質生成を開始するために使用されていたので、分化細胞は核ホルモン受容体リガンドに感作され得るであろう。加えて、チオアゾリジンジオン受容体、ＰＰＡＲγ２のレベルは、ＡＳＣ脂肪細胞分化時に増大することが知られている（Ｙ．Ｄ．Ｈａｌｖｏｒｓｅｎら（２００１年））。これらの事実の一方又は両方は、未分化ＡＳＣと比較した脂肪細胞分化ＡＳＣの迅速な核ホルモン受容体リガンド応答を説明するであろう。
【００８６】
これらの結果はさらに、概日機構が個々のドナーから単離された細胞間でも変動することを確認する。本発明の発明者は、脂肪組織蓄積部におけるコア概日転写装置の振動を最初に実証した。食餌へのアクセスを一時的に制限するというような外因性の刺激によりこの発現プロファイルの位相がシフトすることを見出した。また、本発明者は、ＧＳＫ３β阻害剤が概日発現プロファイルを延長するために使用され、かつ悪液質に罹患する患者の体重増加を誘導するために使用できることを見出した。また、単離したＡＳＣは、ヒト脂肪組織の概日機構の解析における代替的なインビトロモデルに使用できる可能性も示した。ヒトＡＳＣにおける概日遺伝子誘導の一時的な動力学はその分化状態の関数として変化した。従って、成熟した脂肪細胞は、核ホルモン受容体リガンドに対するインビボでの応答に関して、それらが、コルチコステロンのような外因性のホルモン又は経口抗糖尿病薬のような外因性の投薬であるか否かに関して、未成熟な脂肪細胞とは異なる。時間生物学的なモデルと一致して、チアゾリジンジオンが糖尿病患者に投与される日内時間は、脂肪組織における概日時計によりその治療効果に重要な影響を与えるであろう。
【００８７】
（その他）
本明細書にて使用される用語「治療上有効な量」は、脂肪組織中に見出されるある時計遺伝子の遺伝子発現の概日パターンを統計学上有意な程度（ｐ＜０．０５）に延長又は短縮する化合物の量を参照する。従って、用語「治療上有効な量」は、例えば、悪液質又は神経性無食欲症に罹患した患者のような体重増加の必要な患者の体重を増加させるのに有効な遺伝子発現パターンを延長するのに有効な量を含む。化合物の投与量の範囲は、所望の効果が得られる範囲である。一般的に、用量は送達の形態に応じて変更されるであろう。本明細書の示唆が与えられた当業者は、適切な用量範囲を容易に決定できるであろう。用量は禁忌の場合には個々の医師によって調整される。いずれにしても、治療の効果は、概日パターンの変化の程度、及び当業者に周知の方法による体重の変化の程度をモニタリングすることにより決定される。本化合物の適用は、経口投与、注射、又は局所投与であり得るが、同化合物は、同化合物又はその担体を脂溶性とすることにより脂肪組織に標的化される。特に、化合物は、脂溶性クリーム又は徐放性の皮下インプラントの形態にて、皮下脂肪組織に直接経皮的に送達され得る。代替的に、同化合物は、皮下脂肪組織に直接注射され得る。
【００８８】
（参考文献）
【００８９】
【表４】
本明細書中にて引用された全ての参考文献の完全な開示は、本明細書において参照により援用される。また、参照により援用されたものは、以下の文献の完全な開示であり、それらはいずれも本明細書における従来技術ではない：Ｓ．Ｚｖｏｎｉｃら「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋｓ ｉｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅｓ」、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、第５５巻、９６２−９７０頁（２００６年）。Ａ．Ａ．Ｐｔｉｔｓｙｎら、「Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｃｌｏｃｋｓ ａｒｅ ｒｅｓｏｕｎｄｉｎｇ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｉｓｓｕｅｓ」、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２巻、ｅ１６、１−１０頁（２００６年）及びＸ．Ｗｕら、「Ｃｉｒｃａｄｉａｎ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、ｓｅｒｕｍ、ａｎｄ ｔｈａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ａｎｄ ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ ｓｔａｔｅｓ」、２００６年５月３１日に「Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ」提出された原稿。しかしながら、そうでなければ一致しない点がある場合、本明細書は調整するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】マウスから単離された４つ末梢組織（肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）及び精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ））からの、４時間毎に４８時間にわたり実施されたＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された８つの遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図２】マウスから単離された４つ末梢組織（肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）及び精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ））からの、４時間毎に４８時間にわたり実施された定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された７つの遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ａｒｎｔ、Ｓｔｒａ１３、Ｄｂｐ、Ｅ４ｂｐ４及びＩｄ２）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図３】プールされたマウス血清から４時間毎に４８時間にわたり測定された血清バイオマーカ（コルチコステロン、メラトニン及びレプチン）の概日振動を示す。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図４】離散フーリエ変換により検出された周期性を用いた、マイクロアレイ分析により解析された、肝臓、ＢＡＴ及びｉＷＡＴにおける周期的に発現した遺伝子の重複する数を示す。
【図５】２群のマウスから単離された４つ末梢組織（肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）及び精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ））から４時間毎に２４時間にわたり実施されたＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された８つの遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｂｍａｌ１、Ｃｌｏｃｋ、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｐｅｒ３、Ｃｒｙ１及びＣｒｙ２）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。対照群（点線）は給餌が制限されておらず、制限給餌群（実線）は夜のみ給餌した。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図６】２群のマウスから単離された４つ末梢組織（肝臓、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）、鼠径部脂肪組織（ｉＷＡＴ）及び精巣上体脂肪組織（ｅＷＡＴ））から４時間毎に２４時間にわたり実施されたＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された５つの遺伝子（Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ、Ｄｂｐ、Ｅ４ｂｐ４及びＩｄ２）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。対照群（点線）は給餌が制限されておらず、制限給餌群（実線）は夜のみ給餌した。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図７】血清コルチコステロン（回収された血清中にて４時間毎に２４時間にわたり測定した）の一日の振動パターン、７日間にわたり測定された食物の一日摂取量及び体重における制限給餌の影響を示す。対照群（点線）は給餌が制限されておらず、制限給餌群（実線）は夜のみ給餌した。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図８Ａ】新鮮な血清培地のみにさらされた未分化のヒト脂肪幹細胞からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された８つの遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｎｐａｓ２、Ｐｅｒ３、及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。各グラフは個々のヒトドナーを示す。
【図８Ｂ】デキサメタゾン（１回に１μＭ）に２時間さらされ、その後無血清培地中のみにて維持された未分化のヒト脂肪幹細胞からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された８つの遺伝子（Ｎｐａｓ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｎｐａｓ２、Ｐｅｒ３、及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。各グラフは個々のヒトドナーを示す。
【図９】３人のドナーからの未分化のヒト脂肪幹細胞及び分化したヒト脂肪幹細胞（各ラインは個々のドナーである）からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された４つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。ここで、細胞は３０％ウシ胎仔血清アルブミンを含んだ培地に２時間さらされた後に４８時間無血清培地中のみにて維持されている。同細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図１０】３人のドナーからの未分化のヒト脂肪幹細胞及び分化したヒト脂肪幹細胞（各ラインは個々のドナーである）からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された４つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。ここで、細胞はデキサメタゾン（１μＭ）を含んだ培地に２時間さらされた後に４８時間無血清培地中のみにて維持されている。同細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図１１】３人のドナーからの未分化のヒト脂肪幹細胞及び分化したヒト脂肪幹細胞（各ラインは個々のドナーである）からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された４つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３、Ｒｅｖ−ｅｒｂα及びＲｅｖ−ｅｒｂβ）の概日振動遺伝子発現パターンを示す。ここで、細胞はロシグリタゾン（５μＭ）を含んだ培地に２時間さらされた後に４８時間無血清培地中のみにて維持されている。同細胞は、４時間毎に４８時間にわたり採取された。全ての値は、平均値±Ｓ．Ｄ．にて報告されている。
【図１２】１μＭのデキサメタゾンが補充された無血清培地に２時間さらされ、その後無血清培地（ＳＦ）又は３０μＭのＳＢ４１５２８６（ＳＢ４１５；グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ（ＧＳＫ３β）の阻害剤）を含む無血清培地に変換された脂肪細胞で分化されたヒト脂肪細胞幹細胞からのＲＮＡにおける定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により解析された３つの遺伝子（Ｂｍａｌ１、Ｐｅｒ３及びＲｅｖ−ｅｒｂα）の概日振動遺伝子発現パターンを図面に示した時間に対して示す。定量は３回実施して、示された値は平均±Ｓ．Ｄ．である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体重増加を必要とする哺乳動物において体重増加を増大させるための方法において、前記方法は、脂肪組織中の一つ以上の末梢時計遺伝子の概日遺伝子発現を延長する化合物を治療上有効な量にて前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記末梢時計遺伝子は、ＢＭＡＬ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ及びＰｅｒ３からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータを阻害することが知られている化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物は、塩化リチウム、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、塩化リチウム、インスリン、フェニレフリン、バルプロ酸及びヒスタミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物は、糖尿病、免疫不全疾患、悪液質、神経性無食欲症、双極性疾患及びプラダーウィリー症候群に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、皮下脂肪組織に経皮的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物は、脂肪組織に直接注射される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物は、薬理学的に許容される担体と組み合わせられ、組み合わせられたものは脂溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
体重減少を必要とする哺乳動物において体重減少を増大させるための方法において、前記方法は、脂肪組織の末梢時計遺伝子の概日遺伝子発現を短縮する化合物を治療上有効な量にて前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記末梢時計遺伝子は、ＢＭＡＬ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ及びＰｅｒ３からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータを活性化することが知られている化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物は、ソマトスタチン、オクトレオチド、ソマトスタチン類似体、アスピリン及びエンザスタウリンからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物は、糖尿病、体重疾患、又はメタボリック症候群である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物は、皮下脂肪組織に経皮的に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物は、脂肪組織に直接注射される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物は、薬理学的に許容される担体と組み合わせられ、組み合わせられたものは脂溶性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
脂肪細胞中にある末梢時計遺伝子の遺伝子発現の概日パターンを調節するのに有効な化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は、
脂肪由来の成人幹細胞を得る工程と、
前記細胞を、活性を試験されるべき化合物にさらす工程と、
前記細胞から、複数の時点においてＲＮＡを得る工程と、
遺伝子発現レベルのパターンを時間の関数として測定する工程と、
前記遺伝子発現のパターンを、化合物にさらされていない脂肪由来の成人幹細胞からの遺伝子発現のパターンと比較する工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記遺伝子発現は、ＢＭＡＬ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ及びＰｅｒ３からなる群より選択される遺伝子から測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１】
体重増加を必要とする哺乳動物において体重増加を増大させるための方法において、前記方法は、脂肪組織中の一つ以上の末梢時計遺伝子の概日遺伝子発現を延長する化合物を治療上有効な量にて前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記末梢時計遺伝子は、ＢＭＡＬ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ及びＰｅｒ３からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータを阻害することが知られている化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物は、塩化リチウム、ＳＢ２１６７６３、ＳＢ４１５２８６、塩化リチウム、インスリン、フェニレフリン、バルプロ酸及びヒスタミンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物は、糖尿病、免疫不全疾患、悪液質、神経性無食欲症、双極性疾患及びプラダーウィリー症候群に罹患している、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物は、皮下脂肪組織に経皮的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物は、脂肪組織に直接注射される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記化合物は、薬理学的に許容される担体と組み合わせられ、組み合わせられたものは脂溶性である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
体重減少を必要とする哺乳動物において体重減少を増大させるための方法において、前記方法は、脂肪組織の末梢時計遺伝子の概日遺伝子発現を短縮する化合物を治療上有効な量にて前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記末梢時計遺伝子は、ＢＭＡＬ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ及びＰｅｒ３からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータを活性化することが知られている化合物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物は、ソマトスタチン、オクトレオチド、ソマトスタチン類似体、アスピリン及びエンザスタウリンからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物は、糖尿病、体重疾患、又はメタボリック症候群である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物は、皮下脂肪組織に経皮的に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記化合物は、脂肪組織に直接注射される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物は、薬理学的に許容される担体と組み合わせられ、組み合わせられたものは脂溶性である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
脂肪細胞中にある末梢時計遺伝子の遺伝子発現の概日パターンを調節するのに有効な化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は、
脂肪由来の成人幹細胞を得る工程と、
前記細胞を、活性を試験されるべき化合物にさらす工程と、
前記細胞から、複数の時点においてＲＮＡを得る工程と、
遺伝子発現レベルのパターンを時間の関数として測定する工程と、
前記遺伝子発現のパターンを、化合物にさらされていない脂肪由来の成人幹細胞からの遺伝子発現のパターンと比較する工程と、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記遺伝子発現は、ＢＭＡＬ１、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ２、Ｐｅｒ１、Ｐｅｒ２、Ｒｅｖ−ｅｒｂα、Ｒｅｖ−ｅｒｂβ及びＰｅｒ３からなる群より選択される遺伝子から測定される、請求項９に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００８−５４５７９９（Ｐ２００８−５４５７９９Ａ）
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５１５９６３（Ｐ２００８−５１５９６３）
【出願日】平成１８年６月９日（２００６．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３５７３３
【国際公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【出願人】（５０７４０５２１２）ボード オブ スーパーバイザーズ オブ ルイジアナ ステイト ユニバーシティー アンド アグリカルチュラル アンド メカニカル カレッジ (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＳＵＰＥＲＶＩＳＯＲＳ ＯＦ ＬＯＵＩＳＩＡＮＡ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＡＮＤ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＡＮＤ ＭＥＣＨＡＮＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月９日（２００６．６．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２４５４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１３５７３３
【国際公開日】平成１８年１２月２１日（２００６．１２．２１）
【出願人】（５０７４０５２１２）ボード オブ スーパーバイザーズ オブ ルイジアナ ステイト ユニバーシティー アンド アグリカルチュラル アンド メカニカル カレッジ (3)
【氏名又は名称原語表記】ＢＯＡＲＤ ＯＦ ＳＵＰＥＲＶＩＳＯＲＳ ＯＦ ＬＯＵＩＳＩＡＮＡ ＳＴＡＴＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＡＮＤ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ ＡＮＤ ＭＥＣＨＡＮＩＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
【Ｆターム（参考）】
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