化合物をカプセル化するためのナノ粒子、その調製およびその使用
本発明は、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含んでなる化合物をカプセル化するためのナノ粒子、その調製および使用に関する。前記ナノ粒子は、水溶性または脂溶性の生物活性化合物をカプセル化することができる。本発明は、食品、医薬品、および化粧品部門、ならびにナノテクノロジー部門における応用が可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食品、医薬品、および化粧品部門、ならびにナノテクノロジー部門に含まれ、コーティング剤としてカゼインを用いた生物活性化合物のカプセル化物からなる。
【背景技術】
【０００２】
消費者の新たな要求に応えるため、食品産業には技術的発展が必要とされている。ナノテクノロジーは、生物活性化合物［ＢＡＣ］、例えば香味料、ビタミン、ミネラル、精油、酸化防止剤、プレバイオティクスなどをカプセル化可する技術を通して食品産業に大きな変革をもたらす可能性を提示し、その結果、例えば製品の品質保存期間を延長する；使用するＢＡＣの量を低減させる；その放出性を制御する；そのバイオアベイラビリティを増大させる；望ましくない香りをマスクするなど多くの利点を得ることができる。
【０００３】
ＢＡＣのカプセル化に適した担体の設計に際しては、コーティング剤またはマトリックスとして使用される物質を正しく選択することが非常に重要であり、そのためには、特に剤形、その毒性、製剤が組み込まれる製品（食品、化粧品、医薬品など）などの要素を考慮しなければならない。食品ナノテクノロジーの分野では、毒性が問題となり得る合成ポリマーの使用は推奨されない。天然ポリマーはこれらの弱点をもたないが、これらの使用はより複雑な粒子製造法の開発を示唆するのみではなく、ほとんどの場合、得られる粒径（多くの場合において１００μｍを超える）は制御が困難であることから、このようなナノ粒子は消費者にその存在が気付かれ、対象食品の官能特性を変化させことがある。
【０００４】
幾つかの物質の中でも、タンパク質はＢＡＣコーティング剤として以前から用いられている。その食品への応用のために、疎水性ＢＡＣをカプセル化するための担体としてのカゼインの使用が記載されている（カナダ特許第２６４９７８８号および欧州特許第２０１１４７２号）。
【０００５】
葉酸塩群に含まれるＢ型水溶性ビタミンである葉酸（プテロイルモノグルタミン酸またはビタミンＢ９）は、ＤＮＡ合成のような重要な生化学過程において必須である。葉酸の欠乏は、巨赤芽球性貧血、アルツハイマー病、ダウン症候群、体液障害、ある種の癌（大腸癌、子宮頸癌、白血病、膵臓癌）、胎児育成期の神経管欠損、妊娠期の合併症、および男性不妊の存在に関連する。しかしながら、葉酸は生命体では合成できないため、様々な栄養補助食品または食事を通して供給されなければならない。
【０００６】
葉酸塩は、基本的にポリグルタミン酸塩の形で食品（例えば果実および野菜）中に天然に存在するが、それらのバイオアベイラビリティは、典型的には５０％以下であり、不完全である。従って、葉酸で強化された食品の摂取は、葉酸塩の摂取量が推奨されるそれよりも低い場合に、このビタミンの摂取量を増すための補完的な選択肢となり得る。それにもかかわらず、食品に添加された葉酸のバイオアベイラビリティは、マトリックス効果（葉酸が食品成分と結合し得ることで、その吸収が妨げられる）のため、または、葉酸のバイオアベイラビリティを低減させる任意成分が食品中に存在するため、完全ではない。さらに、葉酸は腸内で可溶化されない場合には十分に吸収されない。カプセル剤や錠剤などの手段で投与された葉酸を含む栄養補助食品または強化食品は、葉酸が胃酸により胃で分解された後沈殿して溶けにくい形態へと変換されることによって、供給された葉酸の一部のみしか腸へ到達しないという弱点をもつ。
【０００７】
加えて、葉酸塩または葉酸による食品の強化は、葉酸塩およびそれらの誘導体ならびに葉酸の両方が、特に温度、光、およびｐＨの変化といった因子に感受性であることから複雑な過程であり、そのためこれらの安定性は食品加工条件によって損なわれ、消費者に利用可能なビタミンの生物活性量は大きく減少し得る。従って、前記ビタミンによって食品を強化する場合には、食品の保管および調製の間に大きな減少が起こり得るとして、これらの側面を考慮することが必要となる。
【０００８】
葉酸含有食品、基本的には乳製品およびシリアル製品の強化については知られている。ソーセージ肉（スペイン特許第２３０２５７１号）、乳製品（欧州特許第１９４１８０４号）、乳幼児用食品（米国特許第４７５３９２６号）、または鶏肉、豚肉、もしくは牛肉を基にした缶詰食品（ロシア特許第２２２３６７２号およびロシア特許第２２１３４９３号）のような、栄養補助食品（欧州特許第２００２８３９号）または葉酸もしくは葉酸塩で強化された食品についても記載されている。しかしながら、記載された事例では、ビタミンと食品マトリックスとの可能な相互作用についても、またそのバイオアベイラビリティについても意図されていない。
【０００９】
葉酸を含有するアルギン酸塩およびペクチンのマイクロカプセルを得る方法であって、胃の状態のような、該マイクロカプセルの分解をもたらす環境因子からそれを保護し、その腸への放出を達成する方法についても記載されている。しかしながら、得られたマイクロカプセルは過度に大きく、対象食品の官能特性に影響を及ぼす。コポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフェア内に葉酸をカプセル化して、その持続放出を達成する方法についても記載されている。結果は肯定的であったが、このポリマーの使用は医学および薬学領域に限定されていることから、食品における応用には十分でないる。
【００１０】
従って、ＢＡＣカプセル化系、好ましくは水溶性、さらに好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、例えば前述の弱点を全体的または部分的に克服する葉酸の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
今般、驚くべきことに、カゼインにより形成され、塩基性アミノ酸（例えばアルギニンまたはリジン）および食品に適した金属（例えばカルシウム）をさらに含むナノ粒子が、食品、化粧品、および薬品へのその応用において、新規なカプセル化を形成し、かつ生物活性化合物（ＢＡＣ）の系を安定化させること、そしてＢＡＣは水溶性および脂溶性両方、好ましくは水溶性、さらに好ましくは酸性水溶性であることを見出した。
【００１２】
従って、一つの態様によれば、本発明はカゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される食品用の金属を含むナノ粒子に関する。前記ナノ粒子は技術的助剤として用いることができる；これらはさらにＢＡＣ、好ましくは水溶性のＢＡＣ、さらに好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、例えば葉酸、パントテン酸およびアスコルビン酸のようなＢもしくはＣ型ビタミン、またはその他の親水性の化合物をカプセル化する能力を有するが、これらは脂溶性のＢＡＣを組み込むこともできる。
【００１３】
前記ナノ粒子は、製品加工（例えば食品、医薬品、または化粧品）の間および保管の間双方において安定であり、かつ外部因子、例えば光、ｐＨの変化、酸化などによる分解からＢＡＣを保護でき、さらに、これらを食品に応用した際に、これらはＢＡＣを胃の酸性状態から保護し、胃管に沿ったＢＡＣの放出を妨げ、それによってＢＡＣの沈殿を回避し、その結果バイオアベイラビリティの低下を回避する。さらに、前記ナノ粒子は、ＢＡＣの正確な吸収のために腸内でのＢＡＣの完全な放出を促進する（模擬）腸液中に溶解可能であること、さらに任意の種類の毒性問題を回避可能であることを見出した。有利なことに、前記ナノ粒子はそれらが導入される食品中では不活性であるため、ＢＡＣがマトリックスの様々な成分と反応し、そのバイオアベイラビリティが減少することを回避する。
【００１４】
加えて、本発明により提供されるナノ粒子の最も重要な特徴の一つは、カゼインそれ自体にＢＡＣそのものの有益な効果を補う栄養特性が示されていることから、環境状態および胃の状態の双方からＢＡＣを保護し、腸におけるその放出を促進して、そのバイオアベイラビリティを改善するための天然の担体としてカゼインを使用することにある。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は前記ナノ粒子を製造する方法に関する。前記方法は簡便で、工業的規模で応用が可能である。有利なことに、前記方法は食品添加剤として承認されていない合成または反応性ポリマーを含まず、界面活性剤または乳化剤の含有が最小限に抑えられており、そして制御可能な粒径を有するナノメートル尺度のナノ粒子を得ることが可能である。
【００１６】
特定の実施形態によれば、前記方法はさらに、ＢＡＣを長期間安定に保つ粉末の形態で製剤を得るために、前記ナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥する工程を含み、この型の粉末製剤は固形食品での使用に特に適している。有利なことに、前記乾燥処理はナノ粒子保護剤の存在下で実行される。このようにして得られるＢＡＣを含有するナノ粒子は、溶液中でＢＡＣを分解から保護する水性溶媒中に容易に懸濁することができる。得られた最終産物は安定であり、長期に亘る保管の間ずっとＢＡＣを保護し、さらに液体（例えば飲料など）および固体双方、様々な種類の食品に応用可能である。
【００１７】
別の態様によれば、本発明は、食品、医薬品、または化粧品部門における使用のための前記ナノ粒子を含む組成物に関する。実際、前記ナノ粒子は、この分野での使用に適した安定な化粧品製剤を得るため、クリーム、ゲルおよびヒドロゲル中に組み込むことができる。前記ナノ粒子はまた、局所経路による前記ナノ粒子の投与に適した賦形剤と共に製剤化することもできる。
【００１８】
別の態様によれば、本発明は、本発明により提供されるカゼインナノ粒子に基づく前記組成物を含む食品材料に関する。特定の実施形態によれば、前記食品材料は液体、半固体、または固体の形態である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、葉酸を含有するカゼインナノ粒子を得るために適用される本発明の方法の特定の実施形態について、概略図を示す。
【図２】図２は、空のカゼインナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。画像の左下周縁に位置する黒棒は１００ｎｍの基準に相当する。
【図３】図３は、葉酸を含有するカゼインナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。画像の左下周縁に位置する黒棒は１００ｎｍの基準に相当する。
【図４】図４は、カプセル化された葉酸の量と、各葉酸のｍｇに対して製剤へ添加されたカゼインの量との比を示す。全ての製剤において、葉酸溶液添加前のリジンとタンパク質との重量比は１：１２である。
【図５】図５は、製剤中に葉酸をリジンと共に含有するカゼインナノ粒子の、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。高圧処理なし（ＡおよびＢ）、１００ＭＰａで５分間処理（Ｃ）、４００ＭＰａで５分間処理（Ｄ）、および８００ＭＰａで５分間処理（Ｅ）。
【図６】図６は、４００ＭＰａで５分間処理した、製剤中に葉酸をアルギニンと共に含有するカゼインナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。
【図７】図７は、模擬胃液（ＳＧＦ）（最初の２時間：０〜２時間）、そして模擬腸液（ＳＩＦ）（２ないし２４時間）中で、３７±１℃でインキュベーション後、高圧処理しなかった、カゼインナノ粒子からの葉酸の放出を示す。データは平均±標準偏差（ｎ＝６）を示す。
【図８】図８は、模擬胃液（ＳＧＦ）（最初の２時間：０〜２時間）、そして模擬腸液（ＳＩＦ）（２ないし８時間）中で、３７±１℃でインキュベーション後、（Ａ）１５０ＭＰａで５分間、およびＢ）４００ＭＰａで５分間高圧処理した、カゼインナノ粒子からの葉酸の放出を示す。データは平均±標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【図９】図９は、実験動物に様々なビタミン製剤を投与した後の血清葉酸濃度（ｎｇ／ｍＬ）を時間関数として示す。結果は平均±標準偏差（ｎ＝５）を示す。 Ａ）静脈内経路、用量１ｍｇ／ｋｇ。 Ｂ）経口経路、用量１ｍｇ／ｋｇ：水に溶解したカプセル化されていない葉酸（黒塗りの丸）；水に分散したカゼインナノ粒子内のカプセル化された葉酸（黒塗りの四角）；水に分散した高圧処理されたカゼインナノ粒子内のカプセル化された葉酸（黒塗りの三角）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明はカゼインナノ粒子、および生物活性化合物（ＢＡＣ）をカプセル化する方法を提供し、その結果、ＢＡＣを光、ｐＨの変化、酸化などのような外部因子による分解から保護する。
【００２１】
定義
本発明の理解を容易にすることを目的とした、本発明に関して用いられる幾つかの用語および表現の意味は以下のとおりである。
【００２２】
本明細書において、「塩基性アミノ酸」は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンを含む。
【００２３】
本明細書において、「カゼイン」は、乳タンパク質全体の約８０％を形成する複合タンパク質を指す。カゼインはグロブリンの定義に含まれるリン酸化タンパク質型のタンパク質であり；可溶性であり；高い保水力を有し、２０℃、約４．６のｐＨにおいて沈殿する。カゼインは４つの基本的な画分（αｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン、およびκ−カゼイン）から成り、それらのアミノ酸組成、それらの電荷分布、およびそれらのカルシウム存在下で凝集する傾向によって互いに区別される。乳中で、カゼインは「カゼインミセル」と称される直径５０ないし６００ｎｍ（平均で約１５０ｎｍ）の大きなコロイド粒子を形成する。これらの粒子は疎水性相互作用によって、かつカゼイン構造内に存在するホスホセリンラジカルによるリン酸カルシウム複合によって形成される。前記ミセルは乳中で非常に安定なコロイド系を形成し、これがその色調、熱安定性、およびレンニンによる凝固の主な原因の一つである。
【００２４】
本明細書において、「生物活性化合物」または「ＢＡＣ」は、栄養、治療的、および／または美容的作用を有する任意の脂溶性および水溶性の化合物を指す。本発明によるＢＡＣの、これらには限定されない例には、アミノ酸、抗菌剤、着香剤、防腐剤、甘味料、ステロイド、薬物、ホルモン、脂質、ペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、香味料、ビタミンなどが含まれる。
【００２５】
本明細書において、「水溶性の生物活性化合物」または「水溶性のＢＡＣ」は、栄養、治療的、および／または美容的作用を有し、かつスペイン薬局方によって定義される下記基準に従い、水溶液中で可溶性である（極めて溶けやすい、溶けやすい、やや溶けやすい、やや溶けにくい、または溶けにくい）化合物を指す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
水溶性のＢＡＣの、これらに限定されない例には、ビタミン、例えばＢまたはＣファミリー由来のビタミンおよびそれらの誘導体、塩またはエステル；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チオクト酸、それらの塩またはエステルなどが含まれる。特定の実施形態によれば、前記水溶性のＢＡＣは、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体：葉酸結合型のポリグルタミン酸塩；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸（アルファリポ酸）、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステル、または塩、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００２８】
本明細書において、「脂溶性の生物活性化合物」または「脂溶性のＢＡＣ」は、栄養、治療的、および／または美容的作用を有し、かつスペイン薬局方によって定義される基準に従い、脂および油中で可溶性である（極めて溶けやすい、溶けやすい、やや溶けやすい、やや溶けにくい、または溶けにくい）化合物を指す。脂溶性のＢＡＣの、これらに限定されない例には、ビタミン、例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリー由来のビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロテノイド（カロチン、リコピン、ルテイン、カプサイシン、ゼアキサンチンなど）、オメガ−３脂肪酸（ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）など）、フィトスタノールおよびフィトステロール（シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（ケルセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）、およびそれらの誘導体が含まれる。
【００２９】
ヒトまたは動物用の食品におけるその使用が、国または機関、例えば国連食糧農業機関（ＦＡＯ）もしくは世界保健機関（ＷＨＯ）の国際食品規格に従って安全である際、製品は「食品用」と称され、結果的に「食品用」製品は「食品におけるその使用に適する」無毒性の製品であることから、両表現は同義語であり、本明細書では区別なく用いられる。
【００３０】
本明細書において、「二価金属」には、その原子価が２である任意の金属元素、例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛などのアルカリ土類金属、または幾つかの原子価を有する場合にはそのうちの一つが２であるもの、例えば鉄などが、医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品での使用に適するという条件下で、含まれる。
【００３１】
本明細書において、「三価金属」には、その原子価が３である任意の金属元素、または幾つかの原子価を有する場合にはそのうちの一つが３であるもの、例えば鉄などが、医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品での使用に適するという条件下で、含まれる。
【００３２】
本明細書において、「ナノ粒子」は、１マイクロメートル（μｍ）未満、好ましくは約１０ないし９００ナノメートル（ｎｍ）の径を有する球状または類似の形状のコロイド系を指す。
【００３３】
本明細書において、「平均径」は、水性溶媒中で共に移動するナノ粒子集団の平均直径を指す。これらの系の平均径は当業者に公知の標準的方法によって測定でき、これは例えば実施例において記載される（後記参照）。本発明のナノ粒子は、１μｍ未満、典型的には１ないし９９９ｎｍ、好ましくは１０ないし９００ｎｍ、さらに好ましくは５０ないし５００ｎｍ、さらに一層好ましくは１００ないし２００ｎｍに含まれる平均粒径を有することを特徴とする。特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、５０ないし２００ｎｍに含まれ、好ましくは約１４０ｎｍの平均粒径を有する。
【００３４】
ナノ粒子
一つの態様によれば、本発明はカゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子（以下「本発明のナノ粒子」という。）に関する。
【００３５】
特定の実施形態によれば、前記塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである。
【００３６】
別の特定の実施形態によれば、前記金属は、好ましくはカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄（それらの二価型で）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される食品用の二価金属である。
【００３７】
別の特定の実施形態によれば、前記金属は、例えば三価型の鉄のような、食品用の三価金属である。
【００３８】
本発明のナノ粒子は、技術的助剤、例えば脂の代替物などとして用いることができる。本発明のナノ粒子はさらに、生物活性化合物（ＢＡＣ）をカプセル化する能力を有する。
【００３９】
従って、別の特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、さらに生物活性化合物（ＢＡＣ）を含む。前記ＢＡＣは水溶性のＢＡＣまたは脂溶性のＢＡＣであってよく；この場合、本発明のナノ粒子は、本明細書中で「本発明の装填ナノ粒子」として特定されることがある。
【００４０】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性水溶性のＢＡＣである。より特定の実施形態によれば、前記水溶性のＢＡＣは下記：
ａ）ＢまたはＣファミリー由来のビタミン；
ｂ）ａ）のビタミン誘導体；
ｃ）ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびチオクト酸から選択される化合物；
ｄ）前述の化合物ａ）〜ｃ）のいずれかの塩またはエステル；並びに
ｅ）それらの組み合わせ
からなる群から選択されるものである。
【００４１】
特定の実施形態によれば、前記水溶性のＢＡＣは、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシンすなわちビタミンＢ３、パントテン酸すなわちビタミンＢ５、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体：葉酸結合型のポリグルタミン酸塩；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸すなわちアルファリポ酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４２】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは葉酸、パントテン酸、アスコルビン酸などの酸性水溶性のＢＡＣである。
【００４３】
何らの理論によって拘束されることを望むものではないが、二価金属(例えばカルシウム)のような金属の存在下で、αおよびβカゼインは、それらの構造内に存在するホスホセリンラジカルが陽イオン成分と結合する際、それらの親水性および表面電荷が失われることによって凝集すると考えられる。水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性のもの（例えば葉酸）は前記金属と静電気的に相互作用もすることから、これらの型のカゼインにより生成される疎水性マトリックス内に捕捉され得る。次に、κカゼインは金属（例えばカルシウム）とは反応しないことから、その疎水性部分によって粒子に結合し、その水溶性画分は外部の水性溶媒と接触する。前記水溶性画分は、高比率のカルボニル基（グルタミン酸またはアスパラギン酸のようなアミノ酸の酸性基）に加え、三糖および四糖に結合したセリルおよびスレオニル残基に対応する極性基を有する。従って、ナノ粒子の形成後、溶液中に存在する塩基性アミノ酸（例えばリジン）は、ナノ粒子と前記画分のカルボキシル基との静電気的な相互作用によってナノ粒子の表面に付着し得ることが考えられる［例えば、スプレー乾燥機を通した加熱後（適切な場合には）、これらは共有結合し得る］。図１に、カゼインマトリックス、リジン（塩基性アミノ酸）、およびカルシウム（二価金属）を含む、本発明の装填ナノ粒子の概略図を示す。
【００４４】
別の特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣであり、もっともこの場合は、好ましくは水性溶媒中でＢＡＣの均質な懸濁液を形成すること、またはさらに好ましくは、有機溶液中にＢＡＣを溶解するため、前記水性懸濁液または前記有機溶液を、カゼイン源（例えばカゼイン塩）を含有する溶液へゆっくりと加え、該混合液をインキュベートすることが必要であろう。
【００４５】
捕捉の機構は水溶性のＢＡＣのそれとは異なり得るが、その理由は、脂溶性のＢＡＣおよびナノ粒子内部の疎水性分画が（二価または三価の）金属と相互作用する能力を有するか否かに関わらず、脂溶性のＢＡＣは両画分間の親和性によって、ナノ粒子内部の疎水性画分に捕捉されるからであろう。
【００４６】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは、ビタミン、例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリー由来のビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロテノイド（カロチン、リコピン、ルテイン、カプサイシン、ゼアキサンチンなど）、オメガ−３脂肪酸（例えばＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸（例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリン）、フィトスタノールおよびフィトステロール（例えばシトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（例えばケルセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）およびそれらの誘導体から選択される脂溶性のＢＡＣである。
【００４７】
本発明の装填ナノ粒子におけるＢＡＣ：カゼインの重量比は広範囲に変動してよく、これらに限定されるものではないがその例では、本発明の装填ナノ粒子におけるＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：２００、好ましくは１：１０ないし１：８０、さらに好ましくは１：１５ないし１：３５程度に含まれてよい。特定の実施形態によれば、ＢＡＣは水溶性のＢＡＣであり、本発明の装填ナノ粒子における（水溶性の）ＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：５０、好ましくは１：１０ないし１：３０、さらに好ましくは１：１５ないし１：２０程度に含まれてよい。別の特定の実施形態によれば、ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣであり、本発明の装填ナノ粒子における（脂溶性の）ＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：２００、好ましくは１：１０ないし１：８０、さらに好ましくは１：２０ないし１：３５程度に含まれてよい。
【００４８】
加えて、所望の場合は、本発明のナノ粒子は、ＢＡＣを装填したものおよびしていないもの双方、温度および酸化に関して安定性を高めるという目的で、それらの製剤中に酸化防止剤、例えばアスコルビン酸（ビタミンＣ）などを組み込んでもよい。特定の実施形態によれば、ＢＡＣは葉酸であり、酸化防止剤は、葉酸を紫外線照射、ｐＨの変化、熱、酸素などによる分解から保護することによって作用すると考えられ、さらにアスコルビン酸による栄養補給を提供する、アスコルビン酸である。前記酸化防止剤は、ＢＡＣと共にカプセル化されてもよいし、または本発明のナノ粒子のコーティング中に導入されてもよい。
【００４９】
ナノ粒子を得る方法
別の態様によれば、本発明は、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子（本発明のナノ粒子）を製造する方法（以下「本発明の方法［１］」という。）に関し、該方法は下記：
ａ）カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液を調製する工程；および
ｂ）工程ａ）の溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含む。
【００５０】
別の態様によれば、本発明は、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびに生物活性化合物を含むナノ粒子（本発明の装填ナノ粒子）を製造する方法（以下「本発明の方法［２］」という。）にも関し、該方法は下記：
ａ）（ｉ）カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する水溶液を、（ｉｉ）生物活性化合物を含有する溶液と混合する工程；および
ｂ）工程ａ）で得られた混合液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含む。
【００５１】
本発明の方法［１］の工程ａ）において、カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液は、当業者に公知である従来の方法、例えば前記カゼイン源および塩基性アミノ酸を水性溶媒へ添加することによって調製される。
【００５２】
本発明の方法［２］の工程ａ）において、カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する水溶液（ｉ）はＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）と混合される。ＢＡＣを含有する前記溶液（ｉｉ）の性質および組成は、ＢＡＣの種類および性質に依存して変動し得る。従って、特定の実施形態によれば、ＢＡＣが水溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）は水溶液であり；別の特定の実施形態によれば、ＢＡＣが酸性水溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）は、第２の塩基性アミノ酸をさらに含む水溶液であり；そして別の特定の実施形態によれば、ＢＡＣが脂溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）は、水性溶媒、または好ましくは有機溶液、さらに好ましくはアルコール、例えばエタノールのような水混和性溶媒の有機溶液中のＢＡＣの懸濁液である。
【００５３】
両方法［本発明の方法［１］および［２］］を実施するために使用できるカゼインは、実際には、例えば乳、豆など任意のカゼイン源に由来してよい。カゼインは前記溶液中で酸カゼインまたはカゼイン塩の形態で見出され得る。特定の実施形態によれば、前記カゼイン源は、カゼイン塩、好ましくはカゼインナトリウムの形態であるカゼインを含む。カゼインカルシウムおよびホスホカルシウムを使用することもできるが、これらは実施にはあまり有利ではない。その理由は、カルシウムは、カゼイン塩を活性成分と混合した後にナノ粒子を形成するために用いられるので、カゼイン塩溶液が溶媒中に既にカルシウムを有している場合、前記方法の実施が著しく損なわれる可能性があるからである。
【００５４】
本発明の方法［１］の工程ａ）で形成される水溶液中、および本発明の方法［２］の工程ａ）で用いられる水溶液（ｉ）［カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する］中に含有されてよいカゼインの量は広範囲に変動し得るが；特定の実施形態によれば、前記水溶液中に含有されるカゼインの量は、０．１％ないし１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％ないし５％、さらに好ましくは１％ないし３％に含まれる。
【００５５】
塩基性アミノ酸は、カゼインの溶解に寄与し、さらに適切な場合にはＢＡＣ、特に酸性水溶性のＢＡＣの溶解に寄与し、ＢＡＣの装填された本発明のナノ粒子および装填されていないものの製造において、非常に重要な役割を果たす。事実、溶液のｐＨの上昇に伴って、塩基性アミノ酸は無機塩の使用を必要とすることなくカゼイン塩の溶解を可能にし、さらに陰イオン型のカゼインであるカッパ（κ）画分の親水性末端を維持するための塩基として作用することで、懸濁液中に負の表面電荷を有する粒子が維持され、静電気的な反発による凝集が起こらないと考えられる。
【００５６】
両方法［本発明の方法［１］および［２］］を実施するために使用できる塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群、好ましくは、アルギニン、リジン、およびそれらの混合物から選択される。本発明のナノ粒子の内側または外側にあってよい塩基性アミノ酸は、ナノ粒子の形成に先立って成分の溶解を促進し、さらにナノ粒子の両側（内側および外側）にそれらを得た後に適切なｐＨを維持するため、基本的な技術的役割を果たす。実例によると、葉酸は水中では溶けにくいが、わずかにアルカリ性の水溶液中では溶けやすいため、塩基性アミノ酸の存在は葉酸の溶解を補助する。
【００５７】
本発明の方法［２］の特定の実施形態によれば、ＢＡＣが酸性水溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）は、第２の塩基性アミノ酸をさらに含む（ＢＡＣの沈殿を防止するため）水溶液である。この場合には、２つの異なる塩基性アミノ酸を使用する可能性が意図されているが、特定の実施形態によれば、カゼイン源を含有する水溶液の調製に用いられる塩基性アミノ酸（第１の塩基性アミノ酸）、およびＢＡＣを含有する水溶液の調製に用いられるもの（第２の塩基性アミノ酸）は同一であり、アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびそれらの混合物からなる群、好ましくは、アルギニン、リジンおよびそれらの混合物から選択される。
【００５８】
本発明の方法［１］の工程ａ）で形成される溶液中、および本発明の方法［２］の工程ａ）の溶液（ｉ）中に含有されてよい塩基性アミノ酸の量は広範囲に変動してよく、一般には用いる塩基性アミノ酸に依存する。従って、塩基性アミノ酸：カゼインの重量比は大きく変動し得るが、特定の実施形態によれば、本発明の方法［１］の工程ａ）で形成される溶液中、または本発明の方法［２］の溶液（ｉ）中の塩基性アミノ酸：カゼインの重量比は、１：１ないし１：５０、好ましくは１：１０ないし１：４０に含まれ、さらに好ましくは、用いる塩基性アミノ酸がリジンの場合には、１：１２程度であり、または用いる塩基性アミノ酸がアルギニンの場合には、１：２５程度である。
【００５９】
ＢＡＣが酸性水溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する本発明の方法［２］の工程ａ）の溶液（ｉｉ）は、第２の塩基性アミノ酸をさらに含むが、これは既に言及したように前記第１の塩基性アミノ酸と同じであってもまたは異なっていてもよく、この場合本発明の方法［２］における、すなわち前記方法の工程ａ）の溶液（ｉ）および（ｉｉ）を混合した後の、塩基性アミノ酸：カゼインの比は、１：１ないし１：５０、好ましくは１：５ないし１：２０に含まれ、さらに好ましくは、用いる塩基性アミノ酸がリジンの場合には、１：６程度であり、または用いる塩基性アミノ酸がアルギニンの場合には、１：９程度である。
【００６０】
本発明の方法［１］および本発明の方法［２］双方は、工程ａ）の溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程［工程ｂ）］を含む。何らの理論によって拘束されることを望むものではないが、二価金属（例えばカルシウム）のような前記金属は、特にＢＡＣが水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、または前記金属（例えばカルシウム）と相互作用することができる水溶性のＢＡＣ、例えば葉酸、パントテン酸、またはＢもしくはＣ群のビタミン、またはそれらの誘導体である場合に、ＢＡＣの安定化を助けるブリッジを本発明の装填ナノ粒子の内側に作り出すことが可能であると考えられ；この場合、前記金属、例えば前記二価金属（例えばカルシウム）は、カゼイン（カゼイン塩の形である）とＢＡＣ、好ましくは水溶性のＢＡＣ、さらに好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、または前記金属と相互作用することができる水溶性のＢＡＣとの間のブリッジとして作用し、本発明の装填ナノ粒子の疎水性画分中に前記ＢＡＣが捕捉された状態にすると考えられる。
【００６１】
特定の実施形態によれば、前記金属はカルシウム、マグネシウム、亜鉛、二価型の鉄、およびそれらの組み合わせから選択される二価金属、好ましくはカルシウムである。別の特定の実施形態によれば、前記金属は三価型の鉄のような三価金属である。
【００６２】
前記本発明の方法［１］および［２］を実施するために、実際には任意のカルシウム水溶液、有利には食品用溶液［食品のマイクロカプセル化に用いられるカルシウム塩の比については、「Ｃｏｄｅｘ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ」ＧＳＦＡオンラインを参照されたい。］が用いられてよいが、特定の実施形態によれば、前記カルシウム塩の水溶液は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、硫酸カルシウム、およびそれらの混合物からなる群より選択され、好ましくは塩化カルシウムである。実際、炭酸カルシウムまたはアルギン酸カルシウムは、これらが水中で不溶性であるか、または極めて溶けにくい塩であるために推奨されない。同様に、前記本発明の方法［１］および［２］を実施するために、食品用マグネシウム、亜鉛、または二価型もしくは三価型の鉄の任意の水溶液が用いられてよい。
【００６３】
「金属」が二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される前記金属を指す場合の金属：カゼインの重量比は広範囲に変動し得るが、特定の実施形態によれば、金属：カゼインの重量比は１：５ないし１：１５、好ましくは１：７ないし１：１０、さらに好ましくは１：８．５程度に含まれる。特定の実施形態によれば、前記金属は二価金属である。
【００６４】
本発明の方法［２］は本発明の装填ナノ粒子を得ることを導くが、そのために工程ａ）は、（ｉ）カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する水溶液を、（ｉｉ）ＢＡＣを含有する溶液と混合することを含む。前記ＢＡＣの特性は既に言及したとおりである。特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、例えば葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシンすなわちビタミンＢ３、パントテン酸すなわちビタミンＢ５、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体：葉酸結合型のポリグルタミン酸塩；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物である。別の特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣ、例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリーのビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロテノイド（例えばカロチン、リコピン、ルテイン、カプサイシン、ゼアキサンチンなど）、オメガ−３脂肪酸（例えばＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸（例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリン）、フィトスタノールまたはフィトステロール（例えばシトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（ケルセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）またはそれらの誘導体である。
【００６５】
本発明の装填ナノ粒子におけるＢＡＣ：カゼインの重量比は広範囲に変動してよく、これらに限定されない例では、本発明の装填ナノ粒子におけるＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：２００、好ましくは１：１０ないし１：８０、さらに好ましくはおおよそ１：１５ないし１：３５に含まれてよい。特定の実施形態によれば、ＢＡＣは水溶性のＢＡＣであり、本発明の装填ナノ粒子における（水溶性の）ＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：５０、好ましくは１：１０ないし１：３０、さらに好ましくは１：１５ないし１：２０程度に含まれてよい。別の特定の実施形態によれば、ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣであり、本発明の装填ナノ粒子における（脂溶性の）ＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：２００、好ましくは１：１０ないし１：８０、さらに好ましくは１：２０ないし１：３５程度に含まれてよい。
【００６６】
同様に、塩基性アミノ酸：ＢＡＣの重量比（本発明の方法［２］の工程ａ）で用いられる、酸性水溶性のＢＡＣおよび第２の塩基性アミノ酸を含有する水溶液（ｉｉ）に相当する）は広範囲に変動してよく、特定の実施形態によれば、前記溶液（ｉｉ）における塩基性アミノ酸：（酸性水溶性の）ＢＡＣの重量比は１：０．１ないし１：３、好ましくは１：０．５ないし１：１に含まれ、さらに好ましくは１：０．７５程度である。
【００６７】
既に述べたように、本発明のナノ粒子、ＢＡＣを装填しているものおよびしていないもの双方は、温度および酸化に関して安定性を高めるという目的で、それらの製剤中に酸化防止剤、例えばアスコルビン酸（ビタミンＣ）などを組み込んでもよい。この場合、前記酸化防止剤は、（適切な場合には）ＢＡＣと共にカプセル化されてもよいし、または本発明のナノ粒子のコーティング中にあってもよく、そのために前記本発明の方法［１］および［２］は、例えば前記ＢＡＣおよび塩基性アミノ酸を含有する水溶液に酸化防止剤を添加することによって、ナノ粒子の製剤化中に酸化防止剤を組み込むため適切に調整され得る。
【００６８】
特定の実施形態によれば、ＢＡＣは葉酸であり、酸化防止剤は、葉酸を紫外線照射、ｐＨ変化、熱、酸素などによる分解から保護することによって作用すると考えられ、さらにアスコルビン酸による栄養補給を提供する、アスコルビン酸である。前記酸化防止剤は、ＢＡＣと共にカプセル化されてもよいし、または本発明のナノ粒子のコーティング中に導入されてもよい。
【００６９】
加えて、所望の場合は、本発明の方法［１］および本発明の方法［２］双方は、様々な処理を用いることによって、得られたナノ粒子を安定化させるために、１以上の付加工程を含んでもよい。
【００７０】
特定の実施形態によれば、前記安定化処理は、ＢＡＣを装填しているものおよびしていないもの双方として形成された本発明のナノ粒子を含有する懸濁液を、例えば１００ないし８００ＭＰａ、典型的には３５０ないし６００ＭＰａに含まれる圧力で、高圧処理に付すことを含む。特定の実施形態によれば、前記処理は、ナノ粒子の懸濁液を１００ＭＰａないし８００ＭＰａ、典型的には３５０ないし６００ＭＰａの圧力で、３ないし５分間のサイクルに付すことを含み、実際には４００ＭＰａの圧力が良好な結果を提供する。
【００７１】
別の特定の実施形態によれば、前記安定化処理は、ＢＡＣを装填しているものおよびしていないもの双方として形成された本発明のナノ粒子を含有する懸濁液を、ＵＨＴ（超高温）処理、例えば１３０℃ないし１４０℃に含まれる温度に２ないし５秒間付し、続いて急冷することを含む。
【００７２】
同様に、所望の場合は、本発明の方法［１］および本発明の方法［２］双方は、粉末の形でＢＡＣを装填しているものおよびしていないもの双方の本発明のナノ粒子を得るために、形成されたナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥させるための乾燥工程を含み得る。前記ナノ粒子がこの形態で存在すると、それらの安定性に寄与し、そしてさらに、小麦粉、パン、菓子製品、シリアル、粉末乳のような固形食品、並びに化粧品および／または医薬品へのそれらの最終的応用に対し特に有用である。
【００７３】
実際には、この乾燥工程を行うために、ナノ粒子を含有する懸濁液の乾燥に適した任意の従来の技術または方法を用いてよいが、特定の実施形態によれば、ナノ粒子を含有する懸濁液の乾燥は、スプレー乾燥によるか、または凍結乾燥によって行われる。この処理は一般に、糖類、例えばラクトース、トレハロース、マンニトール、スクロース、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトール、マルトースなど、およびそれらの混合物のような前記ナノ粒子の適切な保護剤を、ナノ粒子の懸濁液に添加することによって行われる。前記保護剤は、乾燥過程の間に、本発明のナノ粒子を熱分解および酸化から保護する。
【００７４】
カゼイン：糖類の重量比は広範囲に変動し得るが、特定の実施形態によれば、カゼイン：糖類の重量比は１：１ないし１：４に含まれ、好ましくは約１：２である。
【００７５】
同様に、特定の実施形態によれば、糖類を含有する溶液は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などのような酸化防止剤をさらに含有してよく、この場合、カゼイン：糖類：酸化防止剤（例えばビタミンＣ）の重量比は、１：０．７５〜２．５：０．０１〜１．５、好ましくは１：２．０：０．１０であってよい。
【００７６】
本発明の方法［１］によって得られた本発明のナノ粒子、すなわち、ａ）カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液を調製する工程；およびｂ）工程ａ）の溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含む方法によって製造される、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００７７】
同様に、本発明の方法［２］によって得られた本発明の装填ナノ粒子、すなわち、ａ）（ｉ）カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液を、（ｉｉ）ＢＡＣを含有する溶液と混合する工程；およびｂ）工程ａ）で得られた溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含む方法によって製造される、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびにＢＡＣを含むナノ粒子は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００７８】
応用
本発明のナノ粒子は、技術的助剤、例えば脂代用物などとして用いることができる。これらは、ＢＡＣ、例えば水溶性のＢＡＣまたは脂溶性のＢＡＣをカプセル化する能力も有する。
【００７９】
特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、ＢＡＣ、好ましくは水溶性のＢＡＣ、さらに好ましくは酸性水溶性のＢＡＣのカプセル化を可能にし、さらにその調製において、そして最終産物（ナノ粒子）中に、天然ポリマーではないもの（合成ポリマーに関連する毒性を防止する）、食品用でもないもの、その他の成分は使用せずに、医薬品、化粧品、および食品組成物との組み合わせも可能にする。前記ナノ粒子は、外部因子（光、ｐＨ変化、酸化など）による分解からＢＡＣを保護する。
【００８０】
有利なことに、本発明のナノ粒子は、官能特性（舌の上の食感）の変化を防ぐため、１μｍ未満、好ましくは５０ないし２００ｎｍに含まれ、さらに好ましくは約１４０ｎｍの平均径を有する。
【００８１】
同様に、本発明のナノ粒子は、胃の消化性酸性状態から前記ＢＡＣを保護しながら、腸におけるＢＡＣのバイオアベイラビリティを改善し、腸におけるそれらの溶解および放出を促進する。
【００８２】
本発明のナノ粒子は、溶解時にＢＡＣを分解から保護する水性溶媒に再懸濁できる。これらはさらに、ＢＡＣを安定な状態に保ち、その長期間の保管を可能にする（特に、固形食品の調製におけるその組み込みに対して）、乾燥粉末の形態で存在できる。
【００８３】
加えて、本発明のナノ粒子は、局所使用の化粧品および医薬組成物の調製にも適している。
【００８４】
従って、別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明のナノ粒子を含む組成物（以下「本発明の組成物」という。）に関し；特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子であり；別の特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、本発明の装填ナノ粒子、すなわちカゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびに栄養性があり、治療的および／または美容的作用を有するＢＡＣ、さらに医薬的もしくは美容的に許容される担体または食品に適した担体を含むナノ粒子である。
【００８５】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは、アミノ酸、抗菌剤、着香剤、防腐剤、甘味料、ステロイド、薬物、ホルモン、脂質、ペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、香味料、ビタミン、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００８６】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性水溶性のＢＡＣである。水溶性のＢＡＣの、これらに限定されない例には、ビタミン、例えばＢまたはＣファミリーのビタミンおよびそれらの誘導体、塩またはエステル；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チオクト酸、それらの塩またはエステルなどが含まれる。特定の実施形態によれば、前記水溶性のＢＡＣは、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体、すなわち葉酸結合型のポリグルタミン酸塩；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００８７】
別の特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣである。脂溶性のＢＡＣの、これらに限定されない例には、例えばＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリーのビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロテノイド（カロチン、リコピン、ルテイン、カプサイシン、ゼアキサンチンなど）、オメガ−３脂肪酸（例えばＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸（例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリン）、フィトスタノールおよびフィトステロール（例えばシトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（例えばケルセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）、およびそれらの誘導体が含まれる。
【００８８】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、局所経路によるその投与に適した医薬組成物であり、そのために前記組成物は、局所経路による投与に適した１つ以上の賦形剤を含む医薬的に許容される担体を、例えばゲル、軟膏、クリームなどの形態で含む。局所経路による投与を意図した医薬組成物の製剤化に適した賦形剤についての、および前記医薬組成物の製造についての情報は、Ｃ．Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３，Ｌｕｚａｎ ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓによる、書籍「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」に見出すことができる。投与される本発明のナノ粒子の用量は広範囲に変動する可能性があり、例えば、本発明のナノ粒子の０．１％ないし３０％、好ましくは０．５％ないし５％を含有する本発明の組成物の約０．５（ｇ／ｃｍ２処置される領域）ないし約２（ｇ／ｃｍ２処置される領域）である。
【００８９】
別の特定の実施形態によれば、本発明の組成物は局所経路による投与に適した化粧品組成物であり、そのために前記組成物は、局所経路による投与に適した１つ以上の賦形剤を含む美容的に許容される担体を、例えばゲル、クリーム、シャンプー、ローションなどの形態で含む。局所経路による投与を意図した化粧品組成物の製剤化に適した賦形剤についての、および前記医薬組成物の製造についての情報は、Ｏｃｔａｖｉｏ Ｄｉｅｚ Ｓａｌｅｓ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８，Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｖｉｄｅｏｃｉｎｃｏ，Ｓ．Ａ．による、書籍「Ｍａｎｕａｌ ｄｅ Ｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｉａ」に見出すことができる。
【００９０】
別の特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、固体、液体、または半固体の食品調製物のような食品組成物である。
【００９１】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物は：
１０重量％ないし５０重量％のカゼイン；
０．９％重量％ないし２．５重量％の葉酸；
１重量％ないし６重量％のカルシウム；および
１重量％ないし７重量％の塩基性アミノ酸；および
３０重量％ないし８０重量％の糖類を含み、
ここで、全ての比率は、組成物の総重量に対する重量による。
【００９２】
別の特定の実施形態によれば、本発明の組成物は：
１０重量％ないし５０重量％のカゼイン；
０．９％重量％ないし２．５重量％の葉酸；
１重量％ないし６重量％のカルシウム；および
１重量％ないし７重量％の塩基性アミノ酸；
２０重量％ないし５５重量％の糖類；および
１重量％ないし２５重量％のアスコルビン酸を含み、
ここで、全ての比率は、組成物の総重量に対する重量による。
【００９３】
また、本発明の組成物は食料品に組み込むことができ、それゆえ別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物を含む食料品に関する。前記食料品は、液体、半固体、または固体の形態において見出される。有利なことに、本発明のナノ粒子の全体的または部分的な溶解を防止または最小化するために、そしてそれゆえそれらの安定性に寄与するために、前記食料品は、酸性ｐＨ、すなわち７未満、好ましくは６以下、さらに好ましくは５以下を有する。本発明の組成物で補強または強化され得る食料品の例には、乳およびその誘導体（ヨーグルト、チーズ、カードなど）、ジュース、ジャム、パンおよび菓子製品、発酵肉、ソースなどが含まれる。同様に、本発明の組成物は、動物用の食品、例えば飼料中に組み込まれてもよい。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例は、それらの内部に生物活性化合物、特に葉酸を組み込むことが可能なカゼイン粒子の製造を説明する。これらは、既に述べた複数の因子が原因で食品中で起こり得る分解から、当該化合物を保護する。これら例は、葉酸を、その摂取の後、胃における状態から保護し、そして葉酸を腸液中に放出する、これらナノ粒子の能力をも示す。
【００９５】
空のカゼインナノ粒子を製造するための一般的方法
カゼインナノ粒子を製造する方法は、水性溶媒中にカゼインナトリウム（ＡＮＶＩＳＡ、マドリッド、スペイン）を規定量の塩基性アミノ酸と共に溶解し、続いてマグネチックスターラーによる連続流の下に、規定量のカルシウム溶液を添加して、乳白色の懸濁液の見掛けを有するナノ粒子を形成させることを含む。
【００９６】
ナノ粒子の物理化学的性質の決定
ナノ粒子の物理化学的性質の完全な決定を達成するために必要な様々な試験について以下に記載する。
【００９７】
ナノ粒子の径および表面電荷は物理化学的試験から決定し、後者はゼータ電位の測定を通して決定した。第１のパラメータはＺｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ Ｚ−Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｏｐｔｉｌａｓ、スペイン）を用いて光子相関分光法によって得て、一方、ゼータ電位はＺｅｔａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク、米国）を用いて測定した。
【００９８】
ナノ粒子を形成する方法の収率は、製剤を遠心分離（１７，０００×ｇ、２０分）して得た上清から回収したナノ粒子を得た後に残った遊離カゼインの定量化を通して算出した。従って、製剤中で粒子を形成するカゼインの量は、最初に添加した量と、精製工程の間に回収した上清中に定量された量との間の差異として概算した。前記定量化は、２８２ｎｍにおける紫外（ＵＶ）分光法（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３、ＵＶ−可視分光光度システム）によって行った。収率は下記のとおり概算した：
収率（％）＝［（総カゼイン塩のｍｇ−上清中のカゼイン塩のｍｇ）／総カゼイン塩のｍｇ］×１００［方程式１］
【００９９】
様々な計算を行うため、１５０ないし１，５００μｇ／ｍＬの検量曲線（Ｒ２＝０．９９９２；ＬＤ＝３６μｇ／ｍＬ；ＬＱ＝１１９μｇ／ｍＬ）を用いた。
【０１００】
加えて、総カゼイン塩と上清中に含有されるカゼイン塩との間の差異によって得られた結果を確認するために、遠心分離後に得られたペレットを定量する試験を行った。この場合、粒子の破壊のために、０．０５Ｍ ＮａＯＨを用い、これは検量曲線の用意に用いた媒体と同じであった。従って、この場合に収率は、下記のとおり概算した：
収率（％）＝［（ペレット中のカゼイン塩のｍｇ）／総カゼイン塩のｍｇ］×１００［方程式２］
【０１０１】
前記媒体中で調製したカゼイン塩として見られた最大吸光度は３００ｎｍであった。検量線作成のために用いた濃度もまた、１５０ないし１，５００μｇ／ｍＬの範囲であった（Ｒ２＝０．９９９６；ＬＤ＝２６μｇ／ｍＬ；ＬＱ＝８５μｇ／ｍＬ）。
【０１０２】
ナノ粒子の形態は、走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＤＳＭ ９４０Ａ、独国）によって観察した。そのために、凍結乾燥ナノ粒子を９ｎｍの金分子層（Ｅｍｉｔｅｃｈ Ｋ５５０ Ｔｅａｍ、Ｓｐｕｔｔｅｒ−Ｃｏａｔｅｒ、英国）によってコーティングし、Ｚｅｉｓｓ ＤＭＳ ９４０Ａ顕微鏡（米国）によって写真撮影した。
【０１０３】
葉酸を含有するカゼインナノ粒子を製造するための一般的方法
葉酸を含有するカゼインナノ粒子を製造する方法は、水性溶媒中にカゼインナトリウムを規定量の塩基性アミノ酸と共に溶解し、続いてマグネチックスターラーの下に、水性溶媒中に予め調製した規定量の葉酸溶液を規定量の塩基性アミノ酸と共に添加することを含む。混合液を数分間インキュベートした後、最終工程は、カルシウム塩を添加して、乳白色−黄色がかった懸濁液の見掛けを有するナノ粒子を形成させることからなる。
【０１０４】
場合により、形成されたナノ粒子は、それらを安定化させるため、１００ないし８００ＭＰａ下で１ないし５分間のサイクルで高圧静水圧処理（Ｓｔａｎｓｔｅｄ Ｆｌｕｉｄ Ｐｏｗｅｒ、ＩＳＯＬＡＢモデルＦＰＧ１１５００Ｂ１１０；シリーズ番号：７８４４）に付してよい。
【０１０５】
続いて、撹拌による３分間の均質化の後、撹拌を停止することなく、規定量の糖類溶液（ラクトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、ソルビトール、マルトデキストリン、またはマルトース）を添加する。最終的に、懸濁液は凍結乾燥するか、またはスプレー乾燥機（Ｂｕｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ Ｂ−１９１、Ｂｕｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、スイス）内で以下の条件においてスプレーする：
−空気注入口温度：６０〜１００℃
−空気排出口温度：３０〜９０℃
−空気圧：２〜１０ｂａｒｓ［２〜１０×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：２〜９ｍＬ／分
−吸引：３０〜１００％
−空気流：２００〜９００Ｌ／ｈ。
【０１０６】
場合により、製剤は糖類を添加した後、スプレー乾燥の代わりに凍結乾燥によって乾燥させることができる。
【０１０７】
カゼイン粒子に結合する葉酸量の決定
ナノ粒子に結合する葉酸の量を、Ｆａｙｅ［Ｆａｙｅ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｖｉｔａｍｉｎｓ．Ｉｎ Ｆｏｏｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＨＰＬＣ，Ｎｏｌｌｅｔ，Ｌ．Ｍ．Ｌ．（Ｅｄ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０（２０００）ｐｐ．４４４−４４５］によって記載された方法に従って、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。分析は、ダイオードアレイＵＶ検出システムと組み合わせた、モデル１１００ ＬＣシリーズクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ワルドブロン、独国）において行った。データは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄコンピュータにおいて、Ｃｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ Ｇ２１７１ソフトウェアにより分析した。葉酸の分離のため、４０℃に加熱したＡｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８ Ａｌｌｔｉｍａ（商標）カラム（５μｍ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）を、適合するＧｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｃ１８ ＡＪＯ−７５９６カラムと共に用いた。移動相は、リン酸（３３ｍＭ、ｐＨ２．３）／アセトニトリル混合液から勾配（第１表）をつけて作られ、０．２５ｍＬ／分の流速でポンプ注入した。検出は２９０ｎｍで行った。サンプル注入量は１０μＬであった。葉酸の保持時間は２２．６±０．５分である。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
サンプルの定量化の前に、溶液中のカゼインおよび／またはアミノ酸の存在が葉酸の正しい定量化を妨げ得ないことが確認され、９５％超の正確かつ的確な結果が得られる、２ないし４００μｇ／ｍＬの濃度の異なる検量線を準備した。
【０１１０】
製造直後のサンプルの分析のため（それらの乾燥前）、製剤の規定量を濾過した後に得られた上清を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）３００，０００ ＭＷＣＯ透析チューブ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国）を通して定量した。次に、ペレットを０．０５Ｍ ＮａＯＨに溶解して粒子を破壊し、そして溶液中のカゼインおよび葉酸およびアミノ酸を維持し、そしてその結果それらの定量化を進めた。両画分（上清およびペレット）に見出された葉酸含有量の和は、最初に添加した総量と常に一致した。さらに、１ｍＬの製剤を１ｍＬの０．０５Ｍ ＮａＯＨに溶解することによって、葉酸の総量を定量することも可能であった。この試験により、添加した葉酸の量と、記載したクロマトグラフィー法を通した定量化によって得られた葉酸の量との間の差異が、全ての試験例で１０％を超えることが確認された。
【０１１１】
加えて、粉末サンプルの定量化のために１０ｍｇのナノ粒子を用い、これらを２ｍＬの水に再懸濁し、遠心分離して、その後製造直後のサンプルと同様の方法によって進めた。
【０１１２】
模擬胃腸液中のナノ粒子からの葉酸の放出に対する放出動態試験
ナノ粒子からの葉酸の放出に対する放出動態は、その約１０ｍｇを、２ｍＬの模擬胃液中に３７±１℃で分散させることによって決定した（０ないし２時間）（ＵＳＰ ＸＸＩＩＩ）。規定時間に、ナノ粒子懸濁液を遠心分離して（１７，０００×ｇ、２０分）、上清中の葉酸の量を前述のＨＰＬＣ法によって定量した。胃液から上清を除いた後、３７±１℃で模擬腸液を加え（２ないし２４時間）（ＵＳＰ ＸＸＩＩＩ）、その後上記の試験例と同じ方法によって進めた。
【０１１３】
各試験で用いた製剤中に存在するビタミンの総含有量を考慮して、全時間に放出された葉酸のパーセンテージを算出した。
【０１１４】
薬物動態試験。カゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸のバイオアベイラビリティ
薬物動態試験は、施設内の治験倫理委員会の規則および実験動物に関する欧州の法律（８６／６０９／ＥＵ）に従って行った。そのために、平均体重２５ｇの雄ウィスターラット２５匹を通常の明−暗（１２時間−１２時間）状態に付し、試験前の一週間に、要求に応じて葉酸欠乏性の飼料（Ｆｏｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｉｅｔ．ＴＤ．９５２４７．Ｈａｒｌａｎ、米国）および水を摂取させた。製剤投与の１２時間前に、ラットを、飼料は摂取できないが水は自由に摂取できるメタボリックケージへ隔離した。
【０１１５】
動物を５つの処置群（１群あたり５匹のラット）に分けた。第１群には１ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）のみを経口投与した。続く３群は、以下の製剤：（ｉ）遊離葉酸（カプセル化されていない）（Ａｄｉｔｉｏ、Ｐａｎｒｅａｃ Ｑｕｉｍｉｃａ、バルセロナ、スペイン）、（ｉｉ）葉酸をカプセル化しているカゼインナノ粒子、（ｉｉｉ）高圧処理により、葉酸をカプセル化しているカゼインナノ粒子のいずれかに組み込まれた葉酸の１ｍｇ／ｋｇ（２００μｇ／ラット）のみの経口用量で処置した。水中に分散した異なる製剤の各１ｍＬを、胃−食道カニューレを通して投与した。最後に、生理食塩水血清（０．５ｍＬ）に溶解した同用量の遊離葉酸（１ｍｇ／ｋｇ）を、第５群の伏在静内へ静脈内経路により投与した。
【０１１６】
製剤の投与に先立ち、各ラットの基本的なビタミン濃度を調べるため、尾の伏在静脈から血液を採取した。投与後、血清分離管（ＳＡＲＳＴＥＤＴ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ １．１ｍＬ Ｚ−Ｇｅｌ）を用いて、異なる時間に約５００μＬ量の血液を採取した。全ての試験例で、ラットが疼痛を感じることを防止するため、吸入麻酔（イソフルラン：酸素）を用いて動物を眠らせた後に血液を採取し、常時これらの定数を調べた。
【０１１７】
続いて、血液量を、予め動物の体温に温めた５００μＬの生理食塩水血清を腹腔内投与することによって置換した。この間に動物の状態を試験したが（移動性、積極性、アレルギー性反応、及び体温）、有意な変化は観察されなかった。
【０１１８】
血清サンプルの葉酸の前処置および定量
血液を入れたチューブを遠心分離（６，０００ｒｐｍ、２０分、２０℃）した後に得られた血清サンプル中の葉酸の定量化を、酵素免疫アッセイ法によって行った。そのために、食品中の葉酸の定量のためにＦＤＡによって承認されたＥｌｉｓａキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，ＩＮＣ．カラバサス、カリフォルニア州、米国）を用いた。血清サンプルは、前処理なしで製造業者の説明書に従って定量した。
【０１１９】
該キットは食品における使用のために設計されているため、一連の予備試験を、血清サンプル中のビタミンを定量するその能力を確認するために行った。前記試験は、以下の前準備過程：１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸ナトリウム中に調製した５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム溶液中に溶解した葉酸の可変量（０〜３００μＬ）を５０μＬの血清に添加する過程によって、該キットを用いて得られた結果と、前項に記載した高速液体クロマトグラフィー法によって得られた結果との徹底的な比較を行うことからなる。得られた溶液を、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム溶液で最終量３５０μＬ（血清希釈１：７）とした。各混合液を３０分間煮沸し、続いて２℃に冷却して、前記温度で一晩保持した。
【０１２０】
得られたサンプルを２０，０００ｒｐｍで、２０分間遠心分離し、次に２０μｍのフィルターを通して濾過した後、既に記載した高速液体クロマトグラフィー法を用いることによってそれらの葉酸含有量を定量した。この場合、血清のビタミン濃度が低いため、定量化における誤差を最小限に抑えるため、かついかなるマトリックスによる干渉を除くため、標準添加法を用いた。
【０１２１】
試験を行った全ての例において、両方法による血清葉酸濃度の差異は１０％未満であった。従って、分析に必要とされる血清量が少なく、そしてより簡便で迅速な方法であり、その検出限界（２ｎｇ／ｍＬ）はクロマトグラフィー技術のそれよりもかなり低いため、サンプル全体の定量のために、酵素免疫アッセイ法が選択された。
【０１２２】
脂溶性活性物質：ケルセチンを含有するカゼインナノ粒子を製造するための一般的方法
ケルセチンを含有するカゼインナノ粒子を製造する方法は、水性溶媒中にカゼインナトリウムを規定量の塩基性アミノ酸と共に溶解し、続いてマグネチックスターラーの下に、水性溶媒中に規定量のアスコルビン酸溶液、そして続いて予めエタノールに溶解したケルセチンを添加することを含む。混合液を数分間インキュベートした後、最終工程は、カルシウム塩を添加し、乳白色−黄色がかった懸濁液の見掛けを有するナノ粒子を形成させることからなる。
【０１２３】
場合により、形成されたナノ粒子は、それらを安定化させるため、１００ないし８００ＭＰａ下で１ないし５分間のサイクルで高圧静水圧処理（Ｓｔａｎｓｔｅｄ Ｆｌｕｉｄ Ｐｏｗｅｒ、ＩＳＯＬＡＢモデルＦＰＧ１１５００Ｂ１１０；シリーズ番号：７８４４）に付してよい。
【０１２４】
続いて、撹拌による３分間の均質化の後、撹拌を停止することなく、規定量の糖類溶液（ラクトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、ソルビトール、マルトデキストリン、またはマルトース）を添加する。最終的に、懸濁液は凍結乾燥するか、またはスプレー乾燥機（Ｂｕｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ Ｂ−１９１、Ｂｕｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、スイス）内で以下の条件においてスプレーする：
−空気注入口温度：６０〜１００℃
−空気排出口温度：３０〜９０℃
−空気圧：２〜１０ｂａｒｓ［２〜１０×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：２〜９ｍＬ／分
−吸引：３０〜１００％
−空気流：２００〜９００Ｌ／ｈ。
【０１２５】
場合により、糖類を添加した後、製剤はスプレー乾燥の代わりに凍結乾燥によって乾燥させることができる。
【０１２６】
カゼイン粒子に結合するケルセチン量の決定
ナノ粒子に結合するケルセチンの量を、Ｌａｃｏｐｉｎｉ（Ｌａｃｏｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｆｏｏｄ Ｃｏｍｐ Ａｎａｌ ２００８；２１：５８９−５９８）によって記載された方法に幾つかの変更を加え、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。分析は、ダイオードアレイＵＶ検出システムと組み合わせた、モデル１１００ ＬＣシリーズクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ワルドブロン、独国）において行った。データは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄコンピュータにおいて、Ｃｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ Ｇ２１７１ソフトウェアにより分析した。葉酸の分離のため、４０℃に加熱したＡｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８ Ａｌｌｔｉｍａ（商標）カラム（５μｍ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）を、適合するＧｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｃ１８ ＡＪＯ−７５９６カラムと共に用い、勾配（第２表を参照）を有する水／メタノール／氷酢酸混合液を移動相として、０．２５ｍＬ／分の流速でポンプ注入した。検出は２６０ｎｍで行い、サンプル注入量は１０μＬで、ケルセチンの保持時間は２４．２±０．２分であった。
【０１２７】
【表３】
【０１２８】
サンプルの定量化の前に、９５％超の正確かつ的確な結果が得られる、含水アルコール溶媒（７５％エタノール）中の１ないし１００μｇ／ｍＬの濃度の異なる検量線を準備した。
【０１２９】
製造直後のサンプルの分析のため（それらの乾燥前）、濾過（１７０００ｒｐｍ、２０分）によりナノ粒子の精製過程後に得られた上清を、５０％（ｗ／ｖ）エタノール含有量の含水アルコール溶液が得られるまで希釈した。
【０１３０】
最後に、ナノ粒子に結合したケルセチン量［カプセル化効率（Ｅ．Ｅ．）］を、最初に添加したケルセチン量（Ｑ）と上清中に定量されたケルセチン量との間の差異として、以下の方程式に従って算出した。
【数１】
【０１３１】
実施例１
空のカゼインナノ粒子の調製および性質決定、それらを得るための方法の収率、用いるアミノ酸の型の、ナノ粒子の安定性および物理化学的特性に対する影響
１ｇのカゼインナトリウムを、９０ｍｇのリジンと共に７５ｍＬの水に溶解した。続いて、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この溶液に４０ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。この方法は３回行った。
【０１３２】
図２（ＡおよびＢ）に、透過型電子顕微鏡によって得た、この方法によって得られたカゼイン粒子の写真を示す。
【０１３３】
加えて、粒子の物理化学的特性に対するアミノ酸の型の影響を理解するために、同試験をアミノ酸の非存在下で、またはリジンの代わりに５０ｍｇのアルギニンを用いて行った。
【０１３４】
第３表に、得られたナノ粒子の主な物理化学的パラメータを要約する。
【０１３５】
【表４】
【０１３６】
実施した統計学的試験（ノンパラメトリック独立標本検定：クラスカル・ウォリス）により、製剤の物理化学的パラメータの間に差異があるということが認められる、統計学的に有意な証拠は存在しないことが示された。従って、アミノ酸の型は空のナノ粒子の前記特性に干渉しないと結論することができる。
【０１３７】
製剤に加えるアミノ酸の比を変化させて同じ試験を行っても、同様の結論、すなわちアミノ酸の比および型は空のナノ粒子の最終的な特性に干渉しないという結論に達した。
【０１３８】
製剤の安定性について理解するため、３つの型のナノ粒子の物理化学的パラメータを長時間に亘って測定した。得られた結果を第４表に収載する。
【０１３９】
【表５】
【０１４０】
それらを得た時点で、３つの型のナノ粒子は同一オーダーの径および比較的低い多分散度を有していた（ＰＤＩ値が０．３未満で、粒径分布が均一であることから考えられる）。これらの径および分散値は、アミノ酸と共に製剤化したナノ粒子の例における試験の全体を通して有意な変動を示さない。しかしながら、それらを得てから２時間後、アミノ酸と共に製剤化しなかったナノ粒子は、それらの平均径およびそれらの多分散度の双方が著しく増加し（０．３を超える多分散値に対しては粒径値は表現されず、直径における不均一性が大きいという指針のみである）、試験後には非常に高い多分散値に達した。前記増加は、粒子間の凝集現象の存在を示している。３つの製剤を経時的に観察したとき、アミノ酸なしのナノ粒子の沈殿物が乳白色の層を生じるのに対し、アミノ酸と共に製剤化したナノ粒子は均質な懸濁液を形成することが確認されたため、これらの現象は巨視的規模においてさえも確認された。これらの結果に鑑みると、経時的に安定な粒子を得るためにアミノ酸の存在は必須であると考えられる。
【０１４１】
加えて、再び３つの型の製剤を調製し、スプレー乾燥技術により乾燥させた後、それらの物理化学的特性について試験した。該方法の条件は下記の通りであった：
−空気注入口温度：９０℃
−空気排出口温度：４９℃
−空気圧：６ｂａｒ［６×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
−吸引：１００％
−空気流：６００Ｌ／ｈ。
【０１４２】
この試験は、ナノ粒子を得た時点でそれらを乾燥させたときのアミノ酸の影響を理解する目的で行ったが、その理由は、その時にいずれの製剤も凝集現象を示さなかったためである。得られた結果を第５表に収載する。
【０１４３】
【表６】
【０１４４】
粉末状に乾燥させたアミノ酸を有するナノ粒子を水性溶媒に再懸濁させることにより、径分布は単分散のままであり、それらの径は、スプレー乾燥による乾燥前のそれらの同族体の径よりもわずかに大きいことが観察された。しかしながら、アミノ酸なしで製剤化されたナノ粒子は、より大きな径と多分散値を有しており、このことは乾燥中に凝集現象を受けた可能性を示す。従って、アミノ酸の存在は、粒子をスプレー乾燥によって乾燥させるときにも必要である。
【０１４５】
このことに鑑みると、アミノ酸を有するナノ粒子の物理化学的特性は、アミノ酸を有さないナノ粒子のそれとは異なっており；それらは凝集傾向が少ないことから、生物活性化合物をカプセル化するために選択される製剤であると結論付けられる。
【０１４６】
実施例２
葉酸を含有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定、カプセル化効率に対するリジンおよび葉酸含有量の影響
全てが最終量７．５ｍＬの水に１００ｍｇのカゼインナトリウムおよび可変量のリジン（０〜８．５ｍｇ）を含有する異なる溶液を調製した。
【０１４７】
加えて、５０ｍＬの水に、３００ｍｇの葉酸を４００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０１４８】
続いて、カゼイン塩溶液に１ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に４ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。この方法は、それぞれの型の製剤について３回に行った。
【０１４９】
図３に、透過型電子顕微鏡によって得た、この方法によって得られた葉酸をカプセル化したカゼイン粒子の画像を示す。
【０１５０】
各例において得られた物理化学的特性を第６表に収載する。
【０１５１】
【表７】
【０１５２】
実施した統計学的検定（ノンパラメトリック独立標本検定：クラスカル・ウォリス）により、表に収載されている最後の３つの製剤（リジン含有量が３．９、４．５、および８．５ｍｇである）の物理化学的特性に差異があると考えられる、統計学的に有意な証拠は存在しないことが示された。第１の例では、葉酸溶液はリジンを含んでいるが、最初のカゼイン塩溶液中にアミノ酸が存在しないために葉酸がカルシウムと共に部分的に沈殿しやすくなり、遠心分離後のペレット中の葉酸の全てがカプセル化されたものではないことから、ビタミンの定量化における誤差の原因となることが確認された。
【０１５３】
さらなる試験により、ビタミン溶液がアミノ酸を含有するが、カゼイン塩溶液がアミノ酸を含有しない場合、沈殿することなく製剤中に組み込むことのできる葉酸の最大量は４ｍｇであることが確認され、得られた結果は第６表のものと同様であった（２５．５±１μｇＦＡ／ｍｇＮＰ、およびカプセル化効率：６８．７±０．５）。従って、アミノ酸の存在はカプセル化されるビタミンの量には影響しないことが確認された。しかしながら、アミノ酸なしで製剤化されたナノ粒子の安定性は低く、さらに凝集傾向が高いため（実施例１を参照）、製剤化はこのようなアミノ酸の存在下で行った。
【０１５４】
粒子の物理化学的特性に対する、製剤に添加した葉酸量の影響を理解するために、全ての例において、最初のカゼイン溶液中のアミノ酸量を一定：８．５ｍｇとし、添加する葉酸溶液の量のみを変化させることによって同様の試験を行った。
【０１５５】
図４に、カプセル化された葉酸量と製剤に添加したビタミン量との間の比を関数として示す。
【０１５６】
試験を行った製剤に見られた径は１３２ないし１４０ｎｍの範囲であり、全ての例で多分散度は０．２未満であった。この例では、各製剤に添加した葉酸量が異なるため、カプセル化効率値は同等ではない。重量比１３．５：１のカゼイン：葉酸に対する最大値は７３．１±７．５であった。
【０１５７】
この試験の結果として、製剤中のカゼインのｍｇ／ＦＡのｍｇの比が減少するため（すなわち、製剤に最初に添加した葉酸量が増加するため）、ナノ粒子内部でカプセル化された葉酸量の増加が得られると結論することができる。しかしながら、製剤中に存在するカゼイン量（ｍｇで）が、葉酸の各ｍｇに対して経験値よりも少ない場合には、リジンの非存在下で起こるような沈殿および不安定な製剤が観察される。
【０１５８】
実施例３
スプレー乾燥によって乾燥させた、葉酸を含有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定、最終製剤に対する乾燥過程の影響
最終量７５ｍＬの水に、双方とも１，０００ｍｇのカゼインナトリウムおよび９０ｍｇのリジンを含有する、２つの溶液を調製した。
【０１５９】
加えて、１００ｍＬの水に、６００ｍｇの葉酸を８００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０１６０】
続いて、各カゼイン塩溶液に７．５ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に４０ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０１６１】
最後に、製剤の１つを、上清およびペレット中の葉酸の定量化のために遠心分離を行い、一方もう１つには、スプレー乾燥機を用いた乾燥の前に１，９００ｍｇのラクトースを加えた。該方法の条件は下記の通りであった：
−空気注入口温度：９０℃
−空気排出口温度：４５℃
−空気圧：６ｂａｒ［６×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
−吸引：９５％
−空気流：６００Ｌ／ｈ。
【０１６２】
双方の例において観察された物理化学的特性を第７表に収載する。
【０１６３】
【表８】
【０１６４】
実施した統計学的検定（ノンパラメトリック独立標本検定：クラスカル・ウォリス）により、両製剤に対して得られたカプセル化効率の間には統計学的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が存在することが示された。この差異は、既にカプセル化された葉酸の一部を放出させる、カゼインナノ粒子の部分的な分解の原因となる、意図した温度でのスプレー乾燥による製剤の乾燥過程に起因する可能性がある。
【０１６５】
これらの結果は、方法を粒子の架橋に応用する必要を示しており、そうすることによって粒子の安定性を改善することができ、そして製剤を遠心分離または乾燥させる過程における前述のカプセル化効率の低下を防止することができる。
【０１６６】
実施例４
高圧で安定化させ、スプレー乾燥技術によって乾燥させた、葉酸を含有し、リジンを有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定、ナノ粒子の物理化学的特性に対する処理の影響
全てが最終量７５ｍＬの水に１，０００ｍｇのカゼインナトリウムおよび９０ｍｇのリジンを含有する、異なる溶液を調製した。
【０１６７】
加えて、１００ｍＬの水に、６００ｍｇの葉酸を８００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０１６８】
続いて、カゼイン塩溶液に７．５ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラによる連続流の下に、この混合液に４０ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０１６９】
粒子が一旦形成されたら、製剤を密閉したプラスチックバッグへ移し、高圧静水圧処理に付した（０ＭＰａ；１００ＭＰａ、５分；２００ＭＰａ、５分；４００ＭＰａ、５分；６００ＭＰａ、５分、または８００ＭＰａ、５分）。
【０１７０】
過程が一旦終了したら、水に溶解した１，９００ｍｇのラクトースを各製剤に加え、以下の条件下でスプレー乾燥技術を用いてそれらを乾燥させた：
−空気注入口温度：８５℃
−空気排出口温度：４５℃
−空気圧：６ｂａｒ［６×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
−吸引：９５％
−空気流：６００Ｌ／ｈ。
【０１７１】
第８表に、得られたナノ粒子の主な物理化学的特性を要約する。
【０１７２】
【表９】
【０１７３】
第８表に見られるように、製剤に適用される処理の型にかかわらず、ナノ粒子は同様の表面電荷を有している。しかしながら、データは、処理に適用する圧力が増加するにつれて、得られる粒径がより小さくなり、最大７％までの減少に達することを検出した。しかしながら、適用する圧力が高くなるにつれて、カプセル化されたビタミンの量（そしてその結果としてのカプセル化効率）の値はより大きくなり、処理なしの製剤に対して６５％増加した（８００ＭＰａで処理したサンプルの場合）。
【０１７４】
加えて、図５は、高圧処理なし、ならびに１００、４００、および８００ＭＰａで処理した製剤の、走査型電子顕微鏡によって得られた顕微鏡写真を示す。これらは、高圧静水圧処理なしのナノ粒子が、それらが得られた後に付される様々な過程（スプレー乾燥による乾燥、遠心分離、高温に達する過程での顕微鏡観察）によってどのように部分的に変化するかを確認したことを示すが、様々な高圧処理に供されたナノ粒子の方がより安定であった。
【０１７５】
これらの結果は、適用した高圧静水処理はナノ粒子を架橋し、それらをより安定させ、遠心分離、乾燥、および写真撮影後にそれらが分解するのを防止することを示す。乾燥または遠心分離を行うこれらの過程の幾つかにおけるナノ粒子の部分的な分解は、葉酸の放出を伴い、その結果得られるカプセル化効率をより低下させる可能性があるため、これは全て、処理されたサンプルにおいてより高いカプセル化効率が得られることを説明している。
【０１７６】
実施例５
高圧を用い、スプレー乾燥によって乾燥させた、葉酸を含有し、アルギニンを有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定、最終結果において用いたアミノ酸の影響
最終量２１０ｍＬの、３，０６５ｍｇのカゼインナトリウムおよび１２３ｍｇのアルギニンの水溶液を調製した。
【０１７７】
加えて、１００ｍＬの水に、６０５ｍｇの葉酸を８００ｍｇのアルギニンと共に溶解した。
【０１７８】
続いて、カゼイン塩溶液に２７ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に１２０ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０１７９】
粒子が一旦形成されたら、製剤を密閉したプラスチックバッグへ移し、４００ＭＰａで５分のサイクルからなる高圧静水圧処理に付した。
【０１８０】
過程が一旦終了したら、水に溶解した５，８８０ｍｇのマンニトールを高圧処理された３００ｍＬの製剤に加え、以下の条件下でスプレー乾燥技術を用いてその乾燥を行った：
−空気注入口温度：８５℃
−空気排出口温度：４５℃
−空気圧：６ｂａｒ［６×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
−吸引：９５％
−空気流：６００Ｌ／ｈ。
【０１８１】
得られた製剤の主な物理化学的特性を第９表に要約する。
【０１８２】
【表１０】
【０１８３】
図６は、４００ＭＰａ、５分間の処理で製剤中に葉酸をアルギニンと共に含有するカゼインナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。
【０１８４】
観察されるように、得られた製剤は、アルギニンの代わりにリジンを用いて得たナノ粒子と同様の特性を有している。
【０１８５】
実施例６
模擬胃腸液中でのナノ粒子からの葉酸の放出に対する放出動態試験、放出動態における高圧処理の影響
放出試験を行うために、実施例４に記載した粉末製剤（高圧処理なし、１００ＭＰａおよび４００ＭＰａで処理）を用いた。
【０１８６】
図７は、高圧処理なしのサンプルの例に対して得られた放出動態を示す。これにおいて、胃液中での２時間のインキュベーション後に、最大の葉酸放出値である４％に達したことが観察される。しかしながら、腸の状態では、カゼイン粒子は増大したパーセンテージのビタミンを放出して（試験２４時間目で９０％に達する）、溶解した。さらに、この媒体中では、インキュベーション後に遠心分離したサンプルには、それらの溶解、そしてそれゆえのビタミンの放出の証拠となるカゼインペレットがほとんど存在しなかった。従って、設計された製剤は、胃の管の至る所で葉酸をカプセル化し、胃の状態がバイオアベイラビリティを減少させるのを防止すると考えられる。さらに、ナノ粒子が腸内で溶解することで、ビタミンの放出を助け、ナノ粒子の存在によって起こり得る任意の毒性問題を排除する。
【０１８７】
高圧処理したサンプルの場合について、図８（ＡおよびＢ）にそれらの放出動態を示す。それらにおいては、高圧処理なしのサンプルに見出されるものと非常に類似したプロファイルが見られ、模擬腸液中での６時間後の最大放出パーセンテージ（７０％）は、同今回の処理なしのサンプルに見出されるもの（８０％）よりもわずかに低い。
【０１８８】
従って、カゼインナノ粒子の架橋のためにそれらへ高静水圧を適用することによって、それらからの成分放出のプロファイルは有意に変化しないが、放出されたビタミンの総量は６時間後に１０％低下する。
【０１８９】
実施例７
カゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸の薬物動態学的試験
第１０表に、薬物動態学的試験において試験したナノ粒子の主な物理化学的特性を要約する。実施例５に記載した方法に従って、双方の型のナノ粒子（高圧処理あり及びなし）を得た。
【０１９０】
【表１１】
【０１９１】
薬物動態学的試験を３段階に分けた。第１段階は、リン酸緩衝液に溶解した１ｍｇ／ｋｇの葉酸を静脈内投与することからなり；第２段階は、５匹の雄ウィスターラット群（このラット群では、経時的な基礎ビタミン濃度について試験した）のラットに１ｍＬのリン酸緩衝液を経口投与することからなる。最後に、第３段階は、１ｍｇ／ｋｇの（ｉ）水に溶解した葉酸、（ｉｉ）カゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸、および（ｉｉｉ）高圧処理した、カゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸を、５匹の動物から構成されるラット群へ経口投与することからなる。
【０１９２】
投与後、約５００μＬ量の血液を異なる時間に採取して（０、１、２、３、８、および２４時間）、血清分離管に回収し、続いて動物の血液量を同等の生理食塩水血清で腹腔内経路によって戻した。葉酸の投与後に得られたデータの薬物動態学的分析を、ＷｉＮＮｏｎｌｉｎ １．５薬物動態調整プログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マウンテンビュー、米国）の、ノンコンパートメント調整の方法を用いて行った。
【０１９３】
得られた結果（基礎濃度を差し引いた後）を図９に収載する。観察されるように、葉酸の静脈内投与（図９Ａ）は、最初のサンプル摂取による血清薬物濃度のピークに続いて、血清薬物濃度の大幅な減少を示している。ビタミンを経口投与した際に得られるプロファイル（図９Ｂ）は、最大濃度が有意に低いために異なっており、これはより長時間現れ、よりゆっくりと減少する。しかしながら、遊離型（カプセル化されていない）またはカゼインナノ粒子内にカプセル化された（高圧処理あり又はなし）葉酸の経口投与後に見られるビタミン濃度を比較すると、濃度プロファイルは同様の時間において見られたが、最大値はカプセル化されたビタミンを投与した時の方がより大きかった。
【０１９４】
本試験の実験データのノンコンパートメント解析を行った後に得られた薬物動態学的なパラメータの値を第１１表に収載する。
【０１９５】
【表１２】
【０１９６】
観察されるように、用いた製剤の型に依存してＡＵＣ値は有意に変動する。ビタミンがカゼインナノ粒子内にカプセル化されている場合、ＡＵＣ値は遊離型の葉酸を投与した後のものよりも有意に高く、これらはさらに投与後２４時間までにわたって維持される。２つのナノ粒子製剤において血漿中の葉酸の平均滞留時間（ＭＲＴ）は同様であり、遊離型と比較した場合にはそれよりも長いことが観察された（経口および静脈内）。
【０１９７】
これらの結果により、葉酸をカプセル化したカゼインナノ粒子の経口によるバイオアベイラビリティは双方の製剤で５２％であり、経口経路による遊離葉酸の経口投与後に得られた値よりも４５％高いと計算された。
【０１９８】
実施例８
葉酸をカプセル化したカゼインナノ粒子を有する化粧品製剤［１］
最終量１５ｍＬの水に、２００ｍｇのカゼインナトリウムおよび１８ｍｇのリジンを含有する溶液を調製した。
【０１９９】
加えて、１００ｍＬの水に、６００ｍｇの葉酸を８００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０２００】
続いて、カゼイン塩溶液に１．５ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に８ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０２０１】
最後に、製剤を１７，０００×ｇで、２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを２５ｍＬの水に再懸濁した。
【０２０２】
加えて、４２ｍＬの水に、７ｇのグリセリンおよび０．２ｇのニパギンナトリウムを含有する溶液を調製した。該溶液を水浴中で５０℃まで加熱し、続いて葉酸を含有するカゼインナノ粒子の水溶液を加えて、それにより化粧品製剤を調製し得る最終水溶液を得た。
【０２０３】
加えて、２５ｇのＮｅｏ ＰＣＬ Ｏ／Ｗをも、７０℃で加熱してそれを完全に融解した。この脂肪層が一旦融解したら、経時的に正確で安定なＯ／Ｗエマルションが得られるまで、持続的に撹拌しながら前述の水溶液を加えた。得られたクリームの官能評価は、均質な見掛けを有し、かつ塊が見られないことから肯定できるものであった。
【０２０４】
この同試験を、実施例４に記載される、高圧処理（４００ＭＰａ、５分）して、かつスプレー乾燥機によって乾燥させたナノ粒子の製剤を用いても行った。６００ｍｇの製剤を２５ｍＬの水に再懸濁後、既に上記した同じ方法を行った。得られたクリームもまた均質な見掛けを有し、かつ塊が見られなかった。
【０２０５】
実施例９
葉酸をカプセル化したカゼインナノ粒子を有する化粧品製剤［２］
最終量１５ｍＬの水に、２００ｍｇのカゼインナトリウムおよび１８ｍｇのリジンを含有する溶液を調製した。
【０２０６】
加えて、１００ｍＬの水に、６００ｍｇの葉酸を８００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０２０７】
続いて、各カゼイン塩溶液に１．５ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に８ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０２０８】
最後に、製剤を１７，０００×ｇで、２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを２５ｍＬの水に再懸濁した。
【０２０９】
加えて、０．５ｇのカーボポールＵｌｔｒｅｚ １０を７５ｍＬの水に溶解した。該溶液にナノ粒子の懸濁液を加えた。混合液が一旦均質になったら、ｐＨ１０になるまで十分な量のトリメチルアミンを加えた。均質かつ安定で、わずかに黄色がかったカーボポールゲルが得られるまで混合液を均質化した。
【０２１０】
この同じ試験を、実施例４に記載される、高圧処理（４００ＭＰａ、５分）して、かつスプレー乾燥機によって乾燥させたナノ粒子の製剤を用いても行った。６００ｍｇの製剤を２５ｍＬの水に再懸濁後、既に上記した同じ方法を行った。得られたゲルもまたわずかに黄色がかった色であり、均質かつ安定な見掛けであった。
【０２１１】
実施例１０
葉酸をカプセル化したカゼインナノ粒子を有する化粧品製剤［３］
３ｇのモノステアリン酸グリセリンを、５ｇのミリスチン酸イソプロピルおよび２ｇのセチルアルコールと混合した。この混合液を水浴中で７０℃で加熱した。
【０２１２】
加えて、実施例８に記載した、葉酸を有するカゼインナノ粒子を含有する８７ｇのカーボポールゲルを、３ｇのソルビトール液と共に水浴中で５０℃まで加熱した。この溶液を前者に加え、均質なエマルションが得られるまで穏やかに撹拌した。
【０２１３】
実施例１１
ケルセチンを含有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定
７．５ｍＬの水に、１００ｍｇのカゼインナトリウムおよび８．５ｍｇのリジン（または５．５ｍｇのアルギニン）を含有する溶液を調製した。
【０２１４】
加えて、濃度１２ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を調製し、その０．５ｍＬをカゼイン塩およびリジンの混合物に加えた。アスコルビン酸ナトリウムを用いる理由は、ナノ粒子を得る過程の間に、ケルセチンの酸化を防止するためであった。
【０２１５】
加えて、５０ｍｇのケルセチンを５ｍＬのエタノールに溶解した。
【０２１６】
続いて、カゼイン塩溶液に０．１５ｍＬのケルセチン溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に４ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。この方法は、それぞれの型の製剤について３回行った。
【０２１７】
各例において得られた物理化学的特性を第１２表に収載する。
【０２１８】
【表１３】
【０２１９】
得られた結果により、本発明のナノ粒子は、脂溶性の特性を有する生物活性化合物のカプセル化にも適し、そして高いカプセル化効率パーセンテージを得られることが示された。
【０２２０】
加えて、この結果により、一つまたは別のアミノ酸の存在は、得られたナノ粒子の物理化学的特性に影響しないことが確認される。
【０２２１】
カプセル化されたケルセチンの量を増大させるため、アミノ酸としてリジンおよび可変量のケルセチン（０．０５ないし０．５０ｍＬのケルセチンエタノール溶液）を用いて試験を反復した。得られた結果を第１３表に収載する。
【０２２２】
【表１４】
【０２２３】
得られた結果により、製剤中のケルセチン量の増加に伴って、カプセル化されたケルセチンの量も同比率で増加するが、カプセル化効率は一定のままであることが示される。
【０２２４】
さらに、先に記載した方法に従って試験を行ったが、カゼイン塩溶液へのケルセチン添加に先立ち、ケルセチンを（それをエタノール中に溶解する代わりに）水中に分散させた。得られた結果により、ケルセチンの一部はカゼインナノ粒子内にカプセル化されたが、カゼイン塩溶液へのケルセチン添加に先立ちケルセチンをエタノールに溶解した先の例よりもカプセル化効率は低いことが示された。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は食品、医薬品、および化粧品部門、ならびにナノテクノロジー部門に含まれ、コーティング剤としてカゼインを用いた生物活性化合物のカプセル化物からなる。
【背景技術】
【０００２】
消費者の新たな要求に応えるため、食品産業には技術的発展が必要とされている。ナノテクノロジーは、生物活性化合物［ＢＡＣ］、例えば香味料、ビタミン、ミネラル、精油、酸化防止剤、プレバイオティクスなどをカプセル化可する技術を通して食品産業に大きな変革をもたらす可能性を提示し、その結果、例えば製品の品質保存期間を延長する；使用するＢＡＣの量を低減させる；その放出性を制御する；そのバイオアベイラビリティを増大させる；望ましくない香りをマスクするなど多くの利点を得ることができる。
【０００３】
ＢＡＣのカプセル化に適した担体の設計に際しては、コーティング剤またはマトリックスとして使用される物質を正しく選択することが非常に重要であり、そのためには、特に剤形、その毒性、製剤が組み込まれる製品（食品、化粧品、医薬品など）などの要素を考慮しなければならない。食品ナノテクノロジーの分野では、毒性が問題となり得る合成ポリマーの使用は推奨されない。天然ポリマーはこれらの弱点をもたないが、これらの使用はより複雑な粒子製造法の開発を示唆するのみではなく、ほとんどの場合、得られる粒径（多くの場合において１００μｍを超える）は制御が困難であることから、このようなナノ粒子は消費者にその存在が気付かれ、対象食品の官能特性を変化させことがある。
【０００４】
幾つかの物質の中でも、タンパク質はＢＡＣコーティング剤として以前から用いられている。その食品への応用のために、疎水性ＢＡＣをカプセル化するための担体としてのカゼインの使用が記載されている（カナダ特許第２６４９７８８号および欧州特許第２０１１４７２号）。
【０００５】
葉酸塩群に含まれるＢ型水溶性ビタミンである葉酸（プテロイルモノグルタミン酸またはビタミンＢ９）は、ＤＮＡ合成のような重要な生化学過程において必須である。葉酸の欠乏は、巨赤芽球性貧血、アルツハイマー病、ダウン症候群、体液障害、ある種の癌（大腸癌、子宮頸癌、白血病、膵臓癌）、胎児育成期の神経管欠損、妊娠期の合併症、および男性不妊の存在に関連する。しかしながら、葉酸は生命体では合成できないため、様々な栄養補助食品または食事を通して供給されなければならない。
【０００６】
葉酸塩は、基本的にポリグルタミン酸塩の形で食品（例えば果実および野菜）中に天然に存在するが、それらのバイオアベイラビリティは、典型的には５０％以下であり、不完全である。従って、葉酸で強化された食品の摂取は、葉酸塩の摂取量が推奨されるそれよりも低い場合に、このビタミンの摂取量を増すための補完的な選択肢となり得る。それにもかかわらず、食品に添加された葉酸のバイオアベイラビリティは、マトリックス効果（葉酸が食品成分と結合し得ることで、その吸収が妨げられる）のため、または、葉酸のバイオアベイラビリティを低減させる任意成分が食品中に存在するため、完全ではない。さらに、葉酸は腸内で可溶化されない場合には十分に吸収されない。カプセル剤や錠剤などの手段で投与された葉酸を含む栄養補助食品または強化食品は、葉酸が胃酸により胃で分解された後沈殿して溶けにくい形態へと変換されることによって、供給された葉酸の一部のみしか腸へ到達しないという弱点をもつ。
【０００７】
加えて、葉酸塩または葉酸による食品の強化は、葉酸塩およびそれらの誘導体ならびに葉酸の両方が、特に温度、光、およびｐＨの変化といった因子に感受性であることから複雑な過程であり、そのためこれらの安定性は食品加工条件によって損なわれ、消費者に利用可能なビタミンの生物活性量は大きく減少し得る。従って、前記ビタミンによって食品を強化する場合には、食品の保管および調製の間に大きな減少が起こり得るとして、これらの側面を考慮することが必要となる。
【０００８】
葉酸含有食品、基本的には乳製品およびシリアル製品の強化については知られている。ソーセージ肉（スペイン特許第２３０２５７１号）、乳製品（欧州特許第１９４１８０４号）、乳幼児用食品（米国特許第４７５３９２６号）、または鶏肉、豚肉、もしくは牛肉を基にした缶詰食品（ロシア特許第２２２３６７２号およびロシア特許第２２１３４９３号）のような、栄養補助食品（欧州特許第２００２８３９号）または葉酸もしくは葉酸塩で強化された食品についても記載されている。しかしながら、記載された事例では、ビタミンと食品マトリックスとの可能な相互作用についても、またそのバイオアベイラビリティについても意図されていない。
【０００９】
葉酸を含有するアルギン酸塩およびペクチンのマイクロカプセルを得る方法であって、胃の状態のような、該マイクロカプセルの分解をもたらす環境因子からそれを保護し、その腸への放出を達成する方法についても記載されている。しかしながら、得られたマイクロカプセルは過度に大きく、対象食品の官能特性に影響を及ぼす。コポリ（乳酸−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）ナノスフェア内に葉酸をカプセル化して、その持続放出を達成する方法についても記載されている。結果は肯定的であったが、このポリマーの使用は医学および薬学領域に限定されていることから、食品における応用には十分でないる。
【００１０】
従って、ＢＡＣカプセル化系、好ましくは水溶性、さらに好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、例えば前述の弱点を全体的または部分的に克服する葉酸の開発が必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
今般、驚くべきことに、カゼインにより形成され、塩基性アミノ酸（例えばアルギニンまたはリジン）および食品に適した金属（例えばカルシウム）をさらに含むナノ粒子が、食品、化粧品、および薬品へのその応用において、新規なカプセル化を形成し、かつ生物活性化合物（ＢＡＣ）の系を安定化させること、そしてＢＡＣは水溶性および脂溶性両方、好ましくは水溶性、さらに好ましくは酸性水溶性であることを見出した。
【００１２】
従って、一つの態様によれば、本発明はカゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される食品用の金属を含むナノ粒子に関する。前記ナノ粒子は技術的助剤として用いることができる；これらはさらにＢＡＣ、好ましくは水溶性のＢＡＣ、さらに好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、例えば葉酸、パントテン酸およびアスコルビン酸のようなＢもしくはＣ型ビタミン、またはその他の親水性の化合物をカプセル化する能力を有するが、これらは脂溶性のＢＡＣを組み込むこともできる。
【００１３】
前記ナノ粒子は、製品加工（例えば食品、医薬品、または化粧品）の間および保管の間双方において安定であり、かつ外部因子、例えば光、ｐＨの変化、酸化などによる分解からＢＡＣを保護でき、さらに、これらを食品に応用した際に、これらはＢＡＣを胃の酸性状態から保護し、胃管に沿ったＢＡＣの放出を妨げ、それによってＢＡＣの沈殿を回避し、その結果バイオアベイラビリティの低下を回避する。さらに、前記ナノ粒子は、ＢＡＣの正確な吸収のために腸内でのＢＡＣの完全な放出を促進する（模擬）腸液中に溶解可能であること、さらに任意の種類の毒性問題を回避可能であることを見出した。有利なことに、前記ナノ粒子はそれらが導入される食品中では不活性であるため、ＢＡＣがマトリックスの様々な成分と反応し、そのバイオアベイラビリティが減少することを回避する。
【００１４】
加えて、本発明により提供されるナノ粒子の最も重要な特徴の一つは、カゼインそれ自体にＢＡＣそのものの有益な効果を補う栄養特性が示されていることから、環境状態および胃の状態の双方からＢＡＣを保護し、腸におけるその放出を促進して、そのバイオアベイラビリティを改善するための天然の担体としてカゼインを使用することにある。
【００１５】
別の態様によれば、本発明は前記ナノ粒子を製造する方法に関する。前記方法は簡便で、工業的規模で応用が可能である。有利なことに、前記方法は食品添加剤として承認されていない合成または反応性ポリマーを含まず、界面活性剤または乳化剤の含有が最小限に抑えられており、そして制御可能な粒径を有するナノメートル尺度のナノ粒子を得ることが可能である。
【００１６】
特定の実施形態によれば、前記方法はさらに、ＢＡＣを長期間安定に保つ粉末の形態で製剤を得るために、前記ナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥する工程を含み、この型の粉末製剤は固形食品での使用に特に適している。有利なことに、前記乾燥処理はナノ粒子保護剤の存在下で実行される。このようにして得られるＢＡＣを含有するナノ粒子は、溶液中でＢＡＣを分解から保護する水性溶媒中に容易に懸濁することができる。得られた最終産物は安定であり、長期に亘る保管の間ずっとＢＡＣを保護し、さらに液体（例えば飲料など）および固体双方、様々な種類の食品に応用可能である。
【００１７】
別の態様によれば、本発明は、食品、医薬品、または化粧品部門における使用のための前記ナノ粒子を含む組成物に関する。実際、前記ナノ粒子は、この分野での使用に適した安定な化粧品製剤を得るため、クリーム、ゲルおよびヒドロゲル中に組み込むことができる。前記ナノ粒子はまた、局所経路による前記ナノ粒子の投与に適した賦形剤と共に製剤化することもできる。
【００１８】
別の態様によれば、本発明は、本発明により提供されるカゼインナノ粒子に基づく前記組成物を含む食品材料に関する。特定の実施形態によれば、前記食品材料は液体、半固体、または固体の形態である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、葉酸を含有するカゼインナノ粒子を得るために適用される本発明の方法の特定の実施形態について、概略図を示す。
【図２】図２は、空のカゼインナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。画像の左下周縁に位置する黒棒は１００ｎｍの基準に相当する。
【図３】図３は、葉酸を含有するカゼインナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す。画像の左下周縁に位置する黒棒は１００ｎｍの基準に相当する。
【図４】図４は、カプセル化された葉酸の量と、各葉酸のｍｇに対して製剤へ添加されたカゼインの量との比を示す。全ての製剤において、葉酸溶液添加前のリジンとタンパク質との重量比は１：１２である。
【図５】図５は、製剤中に葉酸をリジンと共に含有するカゼインナノ粒子の、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。高圧処理なし（ＡおよびＢ）、１００ＭＰａで５分間処理（Ｃ）、４００ＭＰａで５分間処理（Ｄ）、および８００ＭＰａで５分間処理（Ｅ）。
【図６】図６は、４００ＭＰａで５分間処理した、製剤中に葉酸をアルギニンと共に含有するカゼインナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。
【図７】図７は、模擬胃液（ＳＧＦ）（最初の２時間：０〜２時間）、そして模擬腸液（ＳＩＦ）（２ないし２４時間）中で、３７±１℃でインキュベーション後、高圧処理しなかった、カゼインナノ粒子からの葉酸の放出を示す。データは平均±標準偏差（ｎ＝６）を示す。
【図８】図８は、模擬胃液（ＳＧＦ）（最初の２時間：０〜２時間）、そして模擬腸液（ＳＩＦ）（２ないし８時間）中で、３７±１℃でインキュベーション後、（Ａ）１５０ＭＰａで５分間、およびＢ）４００ＭＰａで５分間高圧処理した、カゼインナノ粒子からの葉酸の放出を示す。データは平均±標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【図９】図９は、実験動物に様々なビタミン製剤を投与した後の血清葉酸濃度（ｎｇ／ｍＬ）を時間関数として示す。結果は平均±標準偏差（ｎ＝５）を示す。 Ａ）静脈内経路、用量１ｍｇ／ｋｇ。 Ｂ）経口経路、用量１ｍｇ／ｋｇ：水に溶解したカプセル化されていない葉酸（黒塗りの丸）；水に分散したカゼインナノ粒子内のカプセル化された葉酸（黒塗りの四角）；水に分散した高圧処理されたカゼインナノ粒子内のカプセル化された葉酸（黒塗りの三角）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明はカゼインナノ粒子、および生物活性化合物（ＢＡＣ）をカプセル化する方法を提供し、その結果、ＢＡＣを光、ｐＨの変化、酸化などのような外部因子による分解から保護する。
【００２１】
定義
本発明の理解を容易にすることを目的とした、本発明に関して用いられる幾つかの用語および表現の意味は以下のとおりである。
【００２２】
本明細書において、「塩基性アミノ酸」は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンを含む。
【００２３】
本明細書において、「カゼイン」は、乳タンパク質全体の約８０％を形成する複合タンパク質を指す。カゼインはグロブリンの定義に含まれるリン酸化タンパク質型のタンパク質であり；可溶性であり；高い保水力を有し、２０℃、約４．６のｐＨにおいて沈殿する。カゼインは４つの基本的な画分（αｓ１−カゼイン、αｓ２−カゼイン、β−カゼイン、およびκ−カゼイン）から成り、それらのアミノ酸組成、それらの電荷分布、およびそれらのカルシウム存在下で凝集する傾向によって互いに区別される。乳中で、カゼインは「カゼインミセル」と称される直径５０ないし６００ｎｍ（平均で約１５０ｎｍ）の大きなコロイド粒子を形成する。これらの粒子は疎水性相互作用によって、かつカゼイン構造内に存在するホスホセリンラジカルによるリン酸カルシウム複合によって形成される。前記ミセルは乳中で非常に安定なコロイド系を形成し、これがその色調、熱安定性、およびレンニンによる凝固の主な原因の一つである。
【００２４】
本明細書において、「生物活性化合物」または「ＢＡＣ」は、栄養、治療的、および／または美容的作用を有する任意の脂溶性および水溶性の化合物を指す。本発明によるＢＡＣの、これらには限定されない例には、アミノ酸、抗菌剤、着香剤、防腐剤、甘味料、ステロイド、薬物、ホルモン、脂質、ペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、香味料、ビタミンなどが含まれる。
【００２５】
本明細書において、「水溶性の生物活性化合物」または「水溶性のＢＡＣ」は、栄養、治療的、および／または美容的作用を有し、かつスペイン薬局方によって定義される下記基準に従い、水溶液中で可溶性である（極めて溶けやすい、溶けやすい、やや溶けやすい、やや溶けにくい、または溶けにくい）化合物を指す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
水溶性のＢＡＣの、これらに限定されない例には、ビタミン、例えばＢまたはＣファミリー由来のビタミンおよびそれらの誘導体、塩またはエステル；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チオクト酸、それらの塩またはエステルなどが含まれる。特定の実施形態によれば、前記水溶性のＢＡＣは、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体：葉酸結合型のポリグルタミン酸塩；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸（アルファリポ酸）、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステル、または塩、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００２８】
本明細書において、「脂溶性の生物活性化合物」または「脂溶性のＢＡＣ」は、栄養、治療的、および／または美容的作用を有し、かつスペイン薬局方によって定義される基準に従い、脂および油中で可溶性である（極めて溶けやすい、溶けやすい、やや溶けやすい、やや溶けにくい、または溶けにくい）化合物を指す。脂溶性のＢＡＣの、これらに限定されない例には、ビタミン、例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリー由来のビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロテノイド（カロチン、リコピン、ルテイン、カプサイシン、ゼアキサンチンなど）、オメガ−３脂肪酸（ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）など）、フィトスタノールおよびフィトステロール（シトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（ケルセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）、およびそれらの誘導体が含まれる。
【００２９】
ヒトまたは動物用の食品におけるその使用が、国または機関、例えば国連食糧農業機関（ＦＡＯ）もしくは世界保健機関（ＷＨＯ）の国際食品規格に従って安全である際、製品は「食品用」と称され、結果的に「食品用」製品は「食品におけるその使用に適する」無毒性の製品であることから、両表現は同義語であり、本明細書では区別なく用いられる。
【００３０】
本明細書において、「二価金属」には、その原子価が２である任意の金属元素、例えばカルシウム、マグネシウム、亜鉛などのアルカリ土類金属、または幾つかの原子価を有する場合にはそのうちの一つが２であるもの、例えば鉄などが、医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品での使用に適するという条件下で、含まれる。
【００３１】
本明細書において、「三価金属」には、その原子価が３である任意の金属元素、または幾つかの原子価を有する場合にはそのうちの一つが３であるもの、例えば鉄などが、医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品での使用に適するという条件下で、含まれる。
【００３２】
本明細書において、「ナノ粒子」は、１マイクロメートル（μｍ）未満、好ましくは約１０ないし９００ナノメートル（ｎｍ）の径を有する球状または類似の形状のコロイド系を指す。
【００３３】
本明細書において、「平均径」は、水性溶媒中で共に移動するナノ粒子集団の平均直径を指す。これらの系の平均径は当業者に公知の標準的方法によって測定でき、これは例えば実施例において記載される（後記参照）。本発明のナノ粒子は、１μｍ未満、典型的には１ないし９９９ｎｍ、好ましくは１０ないし９００ｎｍ、さらに好ましくは５０ないし５００ｎｍ、さらに一層好ましくは１００ないし２００ｎｍに含まれる平均粒径を有することを特徴とする。特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、５０ないし２００ｎｍに含まれ、好ましくは約１４０ｎｍの平均粒径を有する。
【００３４】
ナノ粒子
一つの態様によれば、本発明はカゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子（以下「本発明のナノ粒子」という。）に関する。
【００３５】
特定の実施形態によれば、前記塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである。
【００３６】
別の特定の実施形態によれば、前記金属は、好ましくはカルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄（それらの二価型で）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される食品用の二価金属である。
【００３７】
別の特定の実施形態によれば、前記金属は、例えば三価型の鉄のような、食品用の三価金属である。
【００３８】
本発明のナノ粒子は、技術的助剤、例えば脂の代替物などとして用いることができる。本発明のナノ粒子はさらに、生物活性化合物（ＢＡＣ）をカプセル化する能力を有する。
【００３９】
従って、別の特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、さらに生物活性化合物（ＢＡＣ）を含む。前記ＢＡＣは水溶性のＢＡＣまたは脂溶性のＢＡＣであってよく；この場合、本発明のナノ粒子は、本明細書中で「本発明の装填ナノ粒子」として特定されることがある。
【００４０】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性水溶性のＢＡＣである。より特定の実施形態によれば、前記水溶性のＢＡＣは下記：
ａ）ＢまたはＣファミリー由来のビタミン；
ｂ）ａ）のビタミン誘導体；
ｃ）ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびチオクト酸から選択される化合物；
ｄ）前述の化合物ａ）〜ｃ）のいずれかの塩またはエステル；並びに
ｅ）それらの組み合わせ
からなる群から選択されるものである。
【００４１】
特定の実施形態によれば、前記水溶性のＢＡＣは、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシンすなわちビタミンＢ３、パントテン酸すなわちビタミンＢ５、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体：葉酸結合型のポリグルタミン酸塩；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸すなわちアルファリポ酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４２】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは葉酸、パントテン酸、アスコルビン酸などの酸性水溶性のＢＡＣである。
【００４３】
何らの理論によって拘束されることを望むものではないが、二価金属(例えばカルシウム)のような金属の存在下で、αおよびβカゼインは、それらの構造内に存在するホスホセリンラジカルが陽イオン成分と結合する際、それらの親水性および表面電荷が失われることによって凝集すると考えられる。水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性のもの（例えば葉酸）は前記金属と静電気的に相互作用もすることから、これらの型のカゼインにより生成される疎水性マトリックス内に捕捉され得る。次に、κカゼインは金属（例えばカルシウム）とは反応しないことから、その疎水性部分によって粒子に結合し、その水溶性画分は外部の水性溶媒と接触する。前記水溶性画分は、高比率のカルボニル基（グルタミン酸またはアスパラギン酸のようなアミノ酸の酸性基）に加え、三糖および四糖に結合したセリルおよびスレオニル残基に対応する極性基を有する。従って、ナノ粒子の形成後、溶液中に存在する塩基性アミノ酸（例えばリジン）は、ナノ粒子と前記画分のカルボキシル基との静電気的な相互作用によってナノ粒子の表面に付着し得ることが考えられる［例えば、スプレー乾燥機を通した加熱後（適切な場合には）、これらは共有結合し得る］。図１に、カゼインマトリックス、リジン（塩基性アミノ酸）、およびカルシウム（二価金属）を含む、本発明の装填ナノ粒子の概略図を示す。
【００４４】
別の特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣであり、もっともこの場合は、好ましくは水性溶媒中でＢＡＣの均質な懸濁液を形成すること、またはさらに好ましくは、有機溶液中にＢＡＣを溶解するため、前記水性懸濁液または前記有機溶液を、カゼイン源（例えばカゼイン塩）を含有する溶液へゆっくりと加え、該混合液をインキュベートすることが必要であろう。
【００４５】
捕捉の機構は水溶性のＢＡＣのそれとは異なり得るが、その理由は、脂溶性のＢＡＣおよびナノ粒子内部の疎水性分画が（二価または三価の）金属と相互作用する能力を有するか否かに関わらず、脂溶性のＢＡＣは両画分間の親和性によって、ナノ粒子内部の疎水性画分に捕捉されるからであろう。
【００４６】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは、ビタミン、例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリー由来のビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロテノイド（カロチン、リコピン、ルテイン、カプサイシン、ゼアキサンチンなど）、オメガ−３脂肪酸（例えばＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸（例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリン）、フィトスタノールおよびフィトステロール（例えばシトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（例えばケルセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）およびそれらの誘導体から選択される脂溶性のＢＡＣである。
【００４７】
本発明の装填ナノ粒子におけるＢＡＣ：カゼインの重量比は広範囲に変動してよく、これらに限定されるものではないがその例では、本発明の装填ナノ粒子におけるＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：２００、好ましくは１：１０ないし１：８０、さらに好ましくは１：１５ないし１：３５程度に含まれてよい。特定の実施形態によれば、ＢＡＣは水溶性のＢＡＣであり、本発明の装填ナノ粒子における（水溶性の）ＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：５０、好ましくは１：１０ないし１：３０、さらに好ましくは１：１５ないし１：２０程度に含まれてよい。別の特定の実施形態によれば、ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣであり、本発明の装填ナノ粒子における（脂溶性の）ＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：２００、好ましくは１：１０ないし１：８０、さらに好ましくは１：２０ないし１：３５程度に含まれてよい。
【００４８】
加えて、所望の場合は、本発明のナノ粒子は、ＢＡＣを装填したものおよびしていないもの双方、温度および酸化に関して安定性を高めるという目的で、それらの製剤中に酸化防止剤、例えばアスコルビン酸（ビタミンＣ）などを組み込んでもよい。特定の実施形態によれば、ＢＡＣは葉酸であり、酸化防止剤は、葉酸を紫外線照射、ｐＨの変化、熱、酸素などによる分解から保護することによって作用すると考えられ、さらにアスコルビン酸による栄養補給を提供する、アスコルビン酸である。前記酸化防止剤は、ＢＡＣと共にカプセル化されてもよいし、または本発明のナノ粒子のコーティング中に導入されてもよい。
【００４９】
ナノ粒子を得る方法
別の態様によれば、本発明は、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子（本発明のナノ粒子）を製造する方法（以下「本発明の方法［１］」という。）に関し、該方法は下記：
ａ）カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液を調製する工程；および
ｂ）工程ａ）の溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含む。
【００５０】
別の態様によれば、本発明は、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびに生物活性化合物を含むナノ粒子（本発明の装填ナノ粒子）を製造する方法（以下「本発明の方法［２］」という。）にも関し、該方法は下記：
ａ）（ｉ）カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する水溶液を、（ｉｉ）生物活性化合物を含有する溶液と混合する工程；および
ｂ）工程ａ）で得られた混合液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含む。
【００５１】
本発明の方法［１］の工程ａ）において、カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液は、当業者に公知である従来の方法、例えば前記カゼイン源および塩基性アミノ酸を水性溶媒へ添加することによって調製される。
【００５２】
本発明の方法［２］の工程ａ）において、カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する水溶液（ｉ）はＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）と混合される。ＢＡＣを含有する前記溶液（ｉｉ）の性質および組成は、ＢＡＣの種類および性質に依存して変動し得る。従って、特定の実施形態によれば、ＢＡＣが水溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）は水溶液であり；別の特定の実施形態によれば、ＢＡＣが酸性水溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）は、第２の塩基性アミノ酸をさらに含む水溶液であり；そして別の特定の実施形態によれば、ＢＡＣが脂溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）は、水性溶媒、または好ましくは有機溶液、さらに好ましくはアルコール、例えばエタノールのような水混和性溶媒の有機溶液中のＢＡＣの懸濁液である。
【００５３】
両方法［本発明の方法［１］および［２］］を実施するために使用できるカゼインは、実際には、例えば乳、豆など任意のカゼイン源に由来してよい。カゼインは前記溶液中で酸カゼインまたはカゼイン塩の形態で見出され得る。特定の実施形態によれば、前記カゼイン源は、カゼイン塩、好ましくはカゼインナトリウムの形態であるカゼインを含む。カゼインカルシウムおよびホスホカルシウムを使用することもできるが、これらは実施にはあまり有利ではない。その理由は、カルシウムは、カゼイン塩を活性成分と混合した後にナノ粒子を形成するために用いられるので、カゼイン塩溶液が溶媒中に既にカルシウムを有している場合、前記方法の実施が著しく損なわれる可能性があるからである。
【００５４】
本発明の方法［１］の工程ａ）で形成される水溶液中、および本発明の方法［２］の工程ａ）で用いられる水溶液（ｉ）［カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する］中に含有されてよいカゼインの量は広範囲に変動し得るが；特定の実施形態によれば、前記水溶液中に含有されるカゼインの量は、０．１％ないし１０％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５％ないし５％、さらに好ましくは１％ないし３％に含まれる。
【００５５】
塩基性アミノ酸は、カゼインの溶解に寄与し、さらに適切な場合にはＢＡＣ、特に酸性水溶性のＢＡＣの溶解に寄与し、ＢＡＣの装填された本発明のナノ粒子および装填されていないものの製造において、非常に重要な役割を果たす。事実、溶液のｐＨの上昇に伴って、塩基性アミノ酸は無機塩の使用を必要とすることなくカゼイン塩の溶解を可能にし、さらに陰イオン型のカゼインであるカッパ（κ）画分の親水性末端を維持するための塩基として作用することで、懸濁液中に負の表面電荷を有する粒子が維持され、静電気的な反発による凝集が起こらないと考えられる。
【００５６】
両方法［本発明の方法［１］および［２］］を実施するために使用できる塩基性アミノ酸は、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群、好ましくは、アルギニン、リジン、およびそれらの混合物から選択される。本発明のナノ粒子の内側または外側にあってよい塩基性アミノ酸は、ナノ粒子の形成に先立って成分の溶解を促進し、さらにナノ粒子の両側（内側および外側）にそれらを得た後に適切なｐＨを維持するため、基本的な技術的役割を果たす。実例によると、葉酸は水中では溶けにくいが、わずかにアルカリ性の水溶液中では溶けやすいため、塩基性アミノ酸の存在は葉酸の溶解を補助する。
【００５７】
本発明の方法［２］の特定の実施形態によれば、ＢＡＣが酸性水溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する溶液（ｉｉ）は、第２の塩基性アミノ酸をさらに含む（ＢＡＣの沈殿を防止するため）水溶液である。この場合には、２つの異なる塩基性アミノ酸を使用する可能性が意図されているが、特定の実施形態によれば、カゼイン源を含有する水溶液の調製に用いられる塩基性アミノ酸（第１の塩基性アミノ酸）、およびＢＡＣを含有する水溶液の調製に用いられるもの（第２の塩基性アミノ酸）は同一であり、アルギニン、リジン、ヒスチジンおよびそれらの混合物からなる群、好ましくは、アルギニン、リジンおよびそれらの混合物から選択される。
【００５８】
本発明の方法［１］の工程ａ）で形成される溶液中、および本発明の方法［２］の工程ａ）の溶液（ｉ）中に含有されてよい塩基性アミノ酸の量は広範囲に変動してよく、一般には用いる塩基性アミノ酸に依存する。従って、塩基性アミノ酸：カゼインの重量比は大きく変動し得るが、特定の実施形態によれば、本発明の方法［１］の工程ａ）で形成される溶液中、または本発明の方法［２］の溶液（ｉ）中の塩基性アミノ酸：カゼインの重量比は、１：１ないし１：５０、好ましくは１：１０ないし１：４０に含まれ、さらに好ましくは、用いる塩基性アミノ酸がリジンの場合には、１：１２程度であり、または用いる塩基性アミノ酸がアルギニンの場合には、１：２５程度である。
【００５９】
ＢＡＣが酸性水溶性のＢＡＣである場合、前記ＢＡＣを含有する本発明の方法［２］の工程ａ）の溶液（ｉｉ）は、第２の塩基性アミノ酸をさらに含むが、これは既に言及したように前記第１の塩基性アミノ酸と同じであってもまたは異なっていてもよく、この場合本発明の方法［２］における、すなわち前記方法の工程ａ）の溶液（ｉ）および（ｉｉ）を混合した後の、塩基性アミノ酸：カゼインの比は、１：１ないし１：５０、好ましくは１：５ないし１：２０に含まれ、さらに好ましくは、用いる塩基性アミノ酸がリジンの場合には、１：６程度であり、または用いる塩基性アミノ酸がアルギニンの場合には、１：９程度である。
【００６０】
本発明の方法［１］および本発明の方法［２］双方は、工程ａ）の溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程［工程ｂ）］を含む。何らの理論によって拘束されることを望むものではないが、二価金属（例えばカルシウム）のような前記金属は、特にＢＡＣが水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、または前記金属（例えばカルシウム）と相互作用することができる水溶性のＢＡＣ、例えば葉酸、パントテン酸、またはＢもしくはＣ群のビタミン、またはそれらの誘導体である場合に、ＢＡＣの安定化を助けるブリッジを本発明の装填ナノ粒子の内側に作り出すことが可能であると考えられ；この場合、前記金属、例えば前記二価金属（例えばカルシウム）は、カゼイン（カゼイン塩の形である）とＢＡＣ、好ましくは水溶性のＢＡＣ、さらに好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、または前記金属と相互作用することができる水溶性のＢＡＣとの間のブリッジとして作用し、本発明の装填ナノ粒子の疎水性画分中に前記ＢＡＣが捕捉された状態にすると考えられる。
【００６１】
特定の実施形態によれば、前記金属はカルシウム、マグネシウム、亜鉛、二価型の鉄、およびそれらの組み合わせから選択される二価金属、好ましくはカルシウムである。別の特定の実施形態によれば、前記金属は三価型の鉄のような三価金属である。
【００６２】
前記本発明の方法［１］および［２］を実施するために、実際には任意のカルシウム水溶液、有利には食品用溶液［食品のマイクロカプセル化に用いられるカルシウム塩の比については、「Ｃｏｄｅｘ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ」ＧＳＦＡオンラインを参照されたい。］が用いられてよいが、特定の実施形態によれば、前記カルシウム塩の水溶液は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、硫酸カルシウム、およびそれらの混合物からなる群より選択され、好ましくは塩化カルシウムである。実際、炭酸カルシウムまたはアルギン酸カルシウムは、これらが水中で不溶性であるか、または極めて溶けにくい塩であるために推奨されない。同様に、前記本発明の方法［１］および［２］を実施するために、食品用マグネシウム、亜鉛、または二価型もしくは三価型の鉄の任意の水溶液が用いられてよい。
【００６３】
「金属」が二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される前記金属を指す場合の金属：カゼインの重量比は広範囲に変動し得るが、特定の実施形態によれば、金属：カゼインの重量比は１：５ないし１：１５、好ましくは１：７ないし１：１０、さらに好ましくは１：８．５程度に含まれる。特定の実施形態によれば、前記金属は二価金属である。
【００６４】
本発明の方法［２］は本発明の装填ナノ粒子を得ることを導くが、そのために工程ａ）は、（ｉ）カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する水溶液を、（ｉｉ）ＢＡＣを含有する溶液と混合することを含む。前記ＢＡＣの特性は既に言及したとおりである。特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性水溶性のＢＡＣ、例えば葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシンすなわちビタミンＢ３、パントテン酸すなわちビタミンＢ５、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体：葉酸結合型のポリグルタミン酸塩；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物である。別の特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣ、例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリーのビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロテノイド（例えばカロチン、リコピン、ルテイン、カプサイシン、ゼアキサンチンなど）、オメガ−３脂肪酸（例えばＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸（例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリン）、フィトスタノールまたはフィトステロール（例えばシトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（ケルセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）またはそれらの誘導体である。
【００６５】
本発明の装填ナノ粒子におけるＢＡＣ：カゼインの重量比は広範囲に変動してよく、これらに限定されない例では、本発明の装填ナノ粒子におけるＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：２００、好ましくは１：１０ないし１：８０、さらに好ましくはおおよそ１：１５ないし１：３５に含まれてよい。特定の実施形態によれば、ＢＡＣは水溶性のＢＡＣであり、本発明の装填ナノ粒子における（水溶性の）ＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：５０、好ましくは１：１０ないし１：３０、さらに好ましくは１：１５ないし１：２０程度に含まれてよい。別の特定の実施形態によれば、ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣであり、本発明の装填ナノ粒子における（脂溶性の）ＢＡＣ：カゼインの重量比は、１：１ないし１：２００、好ましくは１：１０ないし１：８０、さらに好ましくは１：２０ないし１：３５程度に含まれてよい。
【００６６】
同様に、塩基性アミノ酸：ＢＡＣの重量比（本発明の方法［２］の工程ａ）で用いられる、酸性水溶性のＢＡＣおよび第２の塩基性アミノ酸を含有する水溶液（ｉｉ）に相当する）は広範囲に変動してよく、特定の実施形態によれば、前記溶液（ｉｉ）における塩基性アミノ酸：（酸性水溶性の）ＢＡＣの重量比は１：０．１ないし１：３、好ましくは１：０．５ないし１：１に含まれ、さらに好ましくは１：０．７５程度である。
【００６７】
既に述べたように、本発明のナノ粒子、ＢＡＣを装填しているものおよびしていないもの双方は、温度および酸化に関して安定性を高めるという目的で、それらの製剤中に酸化防止剤、例えばアスコルビン酸（ビタミンＣ）などを組み込んでもよい。この場合、前記酸化防止剤は、（適切な場合には）ＢＡＣと共にカプセル化されてもよいし、または本発明のナノ粒子のコーティング中にあってもよく、そのために前記本発明の方法［１］および［２］は、例えば前記ＢＡＣおよび塩基性アミノ酸を含有する水溶液に酸化防止剤を添加することによって、ナノ粒子の製剤化中に酸化防止剤を組み込むため適切に調整され得る。
【００６８】
特定の実施形態によれば、ＢＡＣは葉酸であり、酸化防止剤は、葉酸を紫外線照射、ｐＨ変化、熱、酸素などによる分解から保護することによって作用すると考えられ、さらにアスコルビン酸による栄養補給を提供する、アスコルビン酸である。前記酸化防止剤は、ＢＡＣと共にカプセル化されてもよいし、または本発明のナノ粒子のコーティング中に導入されてもよい。
【００６９】
加えて、所望の場合は、本発明の方法［１］および本発明の方法［２］双方は、様々な処理を用いることによって、得られたナノ粒子を安定化させるために、１以上の付加工程を含んでもよい。
【００７０】
特定の実施形態によれば、前記安定化処理は、ＢＡＣを装填しているものおよびしていないもの双方として形成された本発明のナノ粒子を含有する懸濁液を、例えば１００ないし８００ＭＰａ、典型的には３５０ないし６００ＭＰａに含まれる圧力で、高圧処理に付すことを含む。特定の実施形態によれば、前記処理は、ナノ粒子の懸濁液を１００ＭＰａないし８００ＭＰａ、典型的には３５０ないし６００ＭＰａの圧力で、３ないし５分間のサイクルに付すことを含み、実際には４００ＭＰａの圧力が良好な結果を提供する。
【００７１】
別の特定の実施形態によれば、前記安定化処理は、ＢＡＣを装填しているものおよびしていないもの双方として形成された本発明のナノ粒子を含有する懸濁液を、ＵＨＴ（超高温）処理、例えば１３０℃ないし１４０℃に含まれる温度に２ないし５秒間付し、続いて急冷することを含む。
【００７２】
同様に、所望の場合は、本発明の方法［１］および本発明の方法［２］双方は、粉末の形でＢＡＣを装填しているものおよびしていないもの双方の本発明のナノ粒子を得るために、形成されたナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥させるための乾燥工程を含み得る。前記ナノ粒子がこの形態で存在すると、それらの安定性に寄与し、そしてさらに、小麦粉、パン、菓子製品、シリアル、粉末乳のような固形食品、並びに化粧品および／または医薬品へのそれらの最終的応用に対し特に有用である。
【００７３】
実際には、この乾燥工程を行うために、ナノ粒子を含有する懸濁液の乾燥に適した任意の従来の技術または方法を用いてよいが、特定の実施形態によれば、ナノ粒子を含有する懸濁液の乾燥は、スプレー乾燥によるか、または凍結乾燥によって行われる。この処理は一般に、糖類、例えばラクトース、トレハロース、マンニトール、スクロース、マルトデキストリン、グルコース、ソルビトール、マルトースなど、およびそれらの混合物のような前記ナノ粒子の適切な保護剤を、ナノ粒子の懸濁液に添加することによって行われる。前記保護剤は、乾燥過程の間に、本発明のナノ粒子を熱分解および酸化から保護する。
【００７４】
カゼイン：糖類の重量比は広範囲に変動し得るが、特定の実施形態によれば、カゼイン：糖類の重量比は１：１ないし１：４に含まれ、好ましくは約１：２である。
【００７５】
同様に、特定の実施形態によれば、糖類を含有する溶液は、アスコルビン酸（ビタミンＣ）などのような酸化防止剤をさらに含有してよく、この場合、カゼイン：糖類：酸化防止剤（例えばビタミンＣ）の重量比は、１：０．７５〜２．５：０．０１〜１．５、好ましくは１：２．０：０．１０であってよい。
【００７６】
本発明の方法［１］によって得られた本発明のナノ粒子、すなわち、ａ）カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液を調製する工程；およびｂ）工程ａ）の溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含む方法によって製造される、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００７７】
同様に、本発明の方法［２］によって得られた本発明の装填ナノ粒子、すなわち、ａ）（ｉ）カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液を、（ｉｉ）ＢＡＣを含有する溶液と混合する工程；およびｂ）工程ａ）で得られた溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含む方法によって製造される、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびにＢＡＣを含むナノ粒子は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００７８】
応用
本発明のナノ粒子は、技術的助剤、例えば脂代用物などとして用いることができる。これらは、ＢＡＣ、例えば水溶性のＢＡＣまたは脂溶性のＢＡＣをカプセル化する能力も有する。
【００７９】
特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、ＢＡＣ、好ましくは水溶性のＢＡＣ、さらに好ましくは酸性水溶性のＢＡＣのカプセル化を可能にし、さらにその調製において、そして最終産物（ナノ粒子）中に、天然ポリマーではないもの（合成ポリマーに関連する毒性を防止する）、食品用でもないもの、その他の成分は使用せずに、医薬品、化粧品、および食品組成物との組み合わせも可能にする。前記ナノ粒子は、外部因子（光、ｐＨ変化、酸化など）による分解からＢＡＣを保護する。
【００８０】
有利なことに、本発明のナノ粒子は、官能特性（舌の上の食感）の変化を防ぐため、１μｍ未満、好ましくは５０ないし２００ｎｍに含まれ、さらに好ましくは約１４０ｎｍの平均径を有する。
【００８１】
同様に、本発明のナノ粒子は、胃の消化性酸性状態から前記ＢＡＣを保護しながら、腸におけるＢＡＣのバイオアベイラビリティを改善し、腸におけるそれらの溶解および放出を促進する。
【００８２】
本発明のナノ粒子は、溶解時にＢＡＣを分解から保護する水性溶媒に再懸濁できる。これらはさらに、ＢＡＣを安定な状態に保ち、その長期間の保管を可能にする（特に、固形食品の調製におけるその組み込みに対して）、乾燥粉末の形態で存在できる。
【００８３】
加えて、本発明のナノ粒子は、局所使用の化粧品および医薬組成物の調製にも適している。
【００８４】
従って、別の態様によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明のナノ粒子を含む組成物（以下「本発明の組成物」という。）に関し；特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含むナノ粒子であり；別の特定の実施形態によれば、本発明のナノ粒子は、本発明の装填ナノ粒子、すなわちカゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびに栄養性があり、治療的および／または美容的作用を有するＢＡＣ、さらに医薬的もしくは美容的に許容される担体または食品に適した担体を含むナノ粒子である。
【００８５】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは、アミノ酸、抗菌剤、着香剤、防腐剤、甘味料、ステロイド、薬物、ホルモン、脂質、ペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類、タンパク質、プロテオグリカン、香味料、ビタミン、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００８６】
特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは水溶性のＢＡＣ、好ましくは酸性水溶性のＢＡＣである。水溶性のＢＡＣの、これらに限定されない例には、ビタミン、例えばＢまたはＣファミリーのビタミンおよびそれらの誘導体、塩またはエステル；ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、チオクト酸、それらの塩またはエステルなどが含まれる。特定の実施形態によれば、前記水溶性のＢＡＣは、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸（葉酸誘導体、すなわち葉酸結合型のポリグルタミン酸塩；ポリグルタミン酸結合型の葉酸塩）、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【００８７】
別の特定の実施形態によれば、前記ＢＡＣは脂溶性のＢＡＣである。脂溶性のＢＡＣの、これらに限定されない例には、例えばＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋファミリーのビタミンおよびそれらの誘導体、リン脂質、カロテノイド（カロチン、リコピン、ルテイン、カプサイシン、ゼアキサンチンなど）、オメガ−３脂肪酸（例えばＤＨＡ、ＥＰＡなど）、アミノ酸（例えばイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリン）、フィトスタノールおよびフィトステロール（例えばシトステロール、カンペステロール、スチグマステロールなど）、ポリフェノール（例えばケルセチン、ルチン、レスベラトロール、ケンフェロール、ミリセチン、イソラムネチンなど）、およびそれらの誘導体が含まれる。
【００８８】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、局所経路によるその投与に適した医薬組成物であり、そのために前記組成物は、局所経路による投与に適した１つ以上の賦形剤を含む医薬的に許容される担体を、例えばゲル、軟膏、クリームなどの形態で含む。局所経路による投与を意図した医薬組成物の製剤化に適した賦形剤についての、および前記医薬組成物の製造についての情報は、Ｃ．Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３，Ｌｕｚａｎ ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓによる、書籍「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」に見出すことができる。投与される本発明のナノ粒子の用量は広範囲に変動する可能性があり、例えば、本発明のナノ粒子の０．１％ないし３０％、好ましくは０．５％ないし５％を含有する本発明の組成物の約０．５（ｇ／ｃｍ２処置される領域）ないし約２（ｇ／ｃｍ２処置される領域）である。
【００８９】
別の特定の実施形態によれば、本発明の組成物は局所経路による投与に適した化粧品組成物であり、そのために前記組成物は、局所経路による投与に適した１つ以上の賦形剤を含む美容的に許容される担体を、例えばゲル、クリーム、シャンプー、ローションなどの形態で含む。局所経路による投与を意図した化粧品組成物の製剤化に適した賦形剤についての、および前記医薬組成物の製造についての情報は、Ｏｃｔａｖｉｏ Ｄｉｅｚ Ｓａｌｅｓ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９８，Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｖｉｄｅｏｃｉｎｃｏ，Ｓ．Ａ．による、書籍「Ｍａｎｕａｌ ｄｅ Ｃｏｓｍｅｔｏｌｏｇｉａ」に見出すことができる。
【００９０】
別の特定の実施形態によれば、本発明の組成物は、固体、液体、または半固体の食品調製物のような食品組成物である。
【００９１】
特定の実施形態によれば、本発明の組成物は：
１０重量％ないし５０重量％のカゼイン；
０．９％重量％ないし２．５重量％の葉酸；
１重量％ないし６重量％のカルシウム；および
１重量％ないし７重量％の塩基性アミノ酸；および
３０重量％ないし８０重量％の糖類を含み、
ここで、全ての比率は、組成物の総重量に対する重量による。
【００９２】
別の特定の実施形態によれば、本発明の組成物は：
１０重量％ないし５０重量％のカゼイン；
０．９％重量％ないし２．５重量％の葉酸；
１重量％ないし６重量％のカルシウム；および
１重量％ないし７重量％の塩基性アミノ酸；
２０重量％ないし５５重量％の糖類；および
１重量％ないし２５重量％のアスコルビン酸を含み、
ここで、全ての比率は、組成物の総重量に対する重量による。
【００９３】
また、本発明の組成物は食料品に組み込むことができ、それゆえ別の態様によれば、本発明は、本発明の組成物を含む食料品に関する。前記食料品は、液体、半固体、または固体の形態において見出される。有利なことに、本発明のナノ粒子の全体的または部分的な溶解を防止または最小化するために、そしてそれゆえそれらの安定性に寄与するために、前記食料品は、酸性ｐＨ、すなわち７未満、好ましくは６以下、さらに好ましくは５以下を有する。本発明の組成物で補強または強化され得る食料品の例には、乳およびその誘導体（ヨーグルト、チーズ、カードなど）、ジュース、ジャム、パンおよび菓子製品、発酵肉、ソースなどが含まれる。同様に、本発明の組成物は、動物用の食品、例えば飼料中に組み込まれてもよい。
【実施例】
【００９４】
以下の実施例は、それらの内部に生物活性化合物、特に葉酸を組み込むことが可能なカゼイン粒子の製造を説明する。これらは、既に述べた複数の因子が原因で食品中で起こり得る分解から、当該化合物を保護する。これら例は、葉酸を、その摂取の後、胃における状態から保護し、そして葉酸を腸液中に放出する、これらナノ粒子の能力をも示す。
【００９５】
空のカゼインナノ粒子を製造するための一般的方法
カゼインナノ粒子を製造する方法は、水性溶媒中にカゼインナトリウム（ＡＮＶＩＳＡ、マドリッド、スペイン）を規定量の塩基性アミノ酸と共に溶解し、続いてマグネチックスターラーによる連続流の下に、規定量のカルシウム溶液を添加して、乳白色の懸濁液の見掛けを有するナノ粒子を形成させることを含む。
【００９６】
ナノ粒子の物理化学的性質の決定
ナノ粒子の物理化学的性質の完全な決定を達成するために必要な様々な試験について以下に記載する。
【００９７】
ナノ粒子の径および表面電荷は物理化学的試験から決定し、後者はゼータ電位の測定を通して決定した。第１のパラメータはＺｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ Ｚ−Ｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ／Ｏｐｔｉｌａｓ、スペイン）を用いて光子相関分光法によって得て、一方、ゼータ電位はＺｅｔａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク、米国）を用いて測定した。
【００９８】
ナノ粒子を形成する方法の収率は、製剤を遠心分離（１７，０００×ｇ、２０分）して得た上清から回収したナノ粒子を得た後に残った遊離カゼインの定量化を通して算出した。従って、製剤中で粒子を形成するカゼインの量は、最初に添加した量と、精製工程の間に回収した上清中に定量された量との間の差異として概算した。前記定量化は、２８２ｎｍにおける紫外（ＵＶ）分光法（Ａｇｉｌｅｎｔ ８４５３、ＵＶ−可視分光光度システム）によって行った。収率は下記のとおり概算した：
収率（％）＝［（総カゼイン塩のｍｇ−上清中のカゼイン塩のｍｇ）／総カゼイン塩のｍｇ］×１００［方程式１］
【００９９】
様々な計算を行うため、１５０ないし１，５００μｇ／ｍＬの検量曲線（Ｒ２＝０．９９９２；ＬＤ＝３６μｇ／ｍＬ；ＬＱ＝１１９μｇ／ｍＬ）を用いた。
【０１００】
加えて、総カゼイン塩と上清中に含有されるカゼイン塩との間の差異によって得られた結果を確認するために、遠心分離後に得られたペレットを定量する試験を行った。この場合、粒子の破壊のために、０．０５Ｍ ＮａＯＨを用い、これは検量曲線の用意に用いた媒体と同じであった。従って、この場合に収率は、下記のとおり概算した：
収率（％）＝［（ペレット中のカゼイン塩のｍｇ）／総カゼイン塩のｍｇ］×１００［方程式２］
【０１０１】
前記媒体中で調製したカゼイン塩として見られた最大吸光度は３００ｎｍであった。検量線作成のために用いた濃度もまた、１５０ないし１，５００μｇ／ｍＬの範囲であった（Ｒ２＝０．９９９６；ＬＤ＝２６μｇ／ｍＬ；ＬＱ＝８５μｇ／ｍＬ）。
【０１０２】
ナノ粒子の形態は、走査型電子顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ＤＳＭ ９４０Ａ、独国）によって観察した。そのために、凍結乾燥ナノ粒子を９ｎｍの金分子層（Ｅｍｉｔｅｃｈ Ｋ５５０ Ｔｅａｍ、Ｓｐｕｔｔｅｒ−Ｃｏａｔｅｒ、英国）によってコーティングし、Ｚｅｉｓｓ ＤＭＳ ９４０Ａ顕微鏡（米国）によって写真撮影した。
【０１０３】
葉酸を含有するカゼインナノ粒子を製造するための一般的方法
葉酸を含有するカゼインナノ粒子を製造する方法は、水性溶媒中にカゼインナトリウムを規定量の塩基性アミノ酸と共に溶解し、続いてマグネチックスターラーの下に、水性溶媒中に予め調製した規定量の葉酸溶液を規定量の塩基性アミノ酸と共に添加することを含む。混合液を数分間インキュベートした後、最終工程は、カルシウム塩を添加して、乳白色−黄色がかった懸濁液の見掛けを有するナノ粒子を形成させることからなる。
【０１０４】
場合により、形成されたナノ粒子は、それらを安定化させるため、１００ないし８００ＭＰａ下で１ないし５分間のサイクルで高圧静水圧処理（Ｓｔａｎｓｔｅｄ Ｆｌｕｉｄ Ｐｏｗｅｒ、ＩＳＯＬＡＢモデルＦＰＧ１１５００Ｂ１１０；シリーズ番号：７８４４）に付してよい。
【０１０５】
続いて、撹拌による３分間の均質化の後、撹拌を停止することなく、規定量の糖類溶液（ラクトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、ソルビトール、マルトデキストリン、またはマルトース）を添加する。最終的に、懸濁液は凍結乾燥するか、またはスプレー乾燥機（Ｂｕｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ Ｂ−１９１、Ｂｕｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、スイス）内で以下の条件においてスプレーする：
−空気注入口温度：６０〜１００℃
−空気排出口温度：３０〜９０℃
−空気圧：２〜１０ｂａｒｓ［２〜１０×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：２〜９ｍＬ／分
−吸引：３０〜１００％
−空気流：２００〜９００Ｌ／ｈ。
【０１０６】
場合により、製剤は糖類を添加した後、スプレー乾燥の代わりに凍結乾燥によって乾燥させることができる。
【０１０７】
カゼイン粒子に結合する葉酸量の決定
ナノ粒子に結合する葉酸の量を、Ｆａｙｅ［Ｆａｙｅ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｖｉｔａｍｉｎｓ．Ｉｎ Ｆｏｏｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ＨＰＬＣ，Ｎｏｌｌｅｔ，Ｌ．Ｍ．Ｌ．（Ｅｄ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０（２０００）ｐｐ．４４４−４４５］によって記載された方法に従って、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。分析は、ダイオードアレイＵＶ検出システムと組み合わせた、モデル１１００ ＬＣシリーズクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ワルドブロン、独国）において行った。データは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄコンピュータにおいて、Ｃｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ Ｇ２１７１ソフトウェアにより分析した。葉酸の分離のため、４０℃に加熱したＡｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８ Ａｌｌｔｉｍａ（商標）カラム（５μｍ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）を、適合するＧｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｃ１８ ＡＪＯ−７５９６カラムと共に用いた。移動相は、リン酸（３３ｍＭ、ｐＨ２．３）／アセトニトリル混合液から勾配（第１表）をつけて作られ、０．２５ｍＬ／分の流速でポンプ注入した。検出は２９０ｎｍで行った。サンプル注入量は１０μＬであった。葉酸の保持時間は２２．６±０．５分である。
【０１０８】
【表２】
【０１０９】
サンプルの定量化の前に、溶液中のカゼインおよび／またはアミノ酸の存在が葉酸の正しい定量化を妨げ得ないことが確認され、９５％超の正確かつ的確な結果が得られる、２ないし４００μｇ／ｍＬの濃度の異なる検量線を準備した。
【０１１０】
製造直後のサンプルの分析のため（それらの乾燥前）、製剤の規定量を濾過した後に得られた上清を、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）３００，０００ ＭＷＣＯ透析チューブ（ＶＩＶＡＳＰＩＮ ２、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、独国）を通して定量した。次に、ペレットを０．０５Ｍ ＮａＯＨに溶解して粒子を破壊し、そして溶液中のカゼインおよび葉酸およびアミノ酸を維持し、そしてその結果それらの定量化を進めた。両画分（上清およびペレット）に見出された葉酸含有量の和は、最初に添加した総量と常に一致した。さらに、１ｍＬの製剤を１ｍＬの０．０５Ｍ ＮａＯＨに溶解することによって、葉酸の総量を定量することも可能であった。この試験により、添加した葉酸の量と、記載したクロマトグラフィー法を通した定量化によって得られた葉酸の量との間の差異が、全ての試験例で１０％を超えることが確認された。
【０１１１】
加えて、粉末サンプルの定量化のために１０ｍｇのナノ粒子を用い、これらを２ｍＬの水に再懸濁し、遠心分離して、その後製造直後のサンプルと同様の方法によって進めた。
【０１１２】
模擬胃腸液中のナノ粒子からの葉酸の放出に対する放出動態試験
ナノ粒子からの葉酸の放出に対する放出動態は、その約１０ｍｇを、２ｍＬの模擬胃液中に３７±１℃で分散させることによって決定した（０ないし２時間）（ＵＳＰ ＸＸＩＩＩ）。規定時間に、ナノ粒子懸濁液を遠心分離して（１７，０００×ｇ、２０分）、上清中の葉酸の量を前述のＨＰＬＣ法によって定量した。胃液から上清を除いた後、３７±１℃で模擬腸液を加え（２ないし２４時間）（ＵＳＰ ＸＸＩＩＩ）、その後上記の試験例と同じ方法によって進めた。
【０１１３】
各試験で用いた製剤中に存在するビタミンの総含有量を考慮して、全時間に放出された葉酸のパーセンテージを算出した。
【０１１４】
薬物動態試験。カゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸のバイオアベイラビリティ
薬物動態試験は、施設内の治験倫理委員会の規則および実験動物に関する欧州の法律（８６／６０９／ＥＵ）に従って行った。そのために、平均体重２５ｇの雄ウィスターラット２５匹を通常の明−暗（１２時間−１２時間）状態に付し、試験前の一週間に、要求に応じて葉酸欠乏性の飼料（Ｆｏｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｄｉｅｔ．ＴＤ．９５２４７．Ｈａｒｌａｎ、米国）および水を摂取させた。製剤投与の１２時間前に、ラットを、飼料は摂取できないが水は自由に摂取できるメタボリックケージへ隔離した。
【０１１５】
動物を５つの処置群（１群あたり５匹のラット）に分けた。第１群には１ｍＬのＰＢＳ（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４）のみを経口投与した。続く３群は、以下の製剤：（ｉ）遊離葉酸（カプセル化されていない）（Ａｄｉｔｉｏ、Ｐａｎｒｅａｃ Ｑｕｉｍｉｃａ、バルセロナ、スペイン）、（ｉｉ）葉酸をカプセル化しているカゼインナノ粒子、（ｉｉｉ）高圧処理により、葉酸をカプセル化しているカゼインナノ粒子のいずれかに組み込まれた葉酸の１ｍｇ／ｋｇ（２００μｇ／ラット）のみの経口用量で処置した。水中に分散した異なる製剤の各１ｍＬを、胃−食道カニューレを通して投与した。最後に、生理食塩水血清（０．５ｍＬ）に溶解した同用量の遊離葉酸（１ｍｇ／ｋｇ）を、第５群の伏在静内へ静脈内経路により投与した。
【０１１６】
製剤の投与に先立ち、各ラットの基本的なビタミン濃度を調べるため、尾の伏在静脈から血液を採取した。投与後、血清分離管（ＳＡＲＳＴＥＤＴ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅ １．１ｍＬ Ｚ−Ｇｅｌ）を用いて、異なる時間に約５００μＬ量の血液を採取した。全ての試験例で、ラットが疼痛を感じることを防止するため、吸入麻酔（イソフルラン：酸素）を用いて動物を眠らせた後に血液を採取し、常時これらの定数を調べた。
【０１１７】
続いて、血液量を、予め動物の体温に温めた５００μＬの生理食塩水血清を腹腔内投与することによって置換した。この間に動物の状態を試験したが（移動性、積極性、アレルギー性反応、及び体温）、有意な変化は観察されなかった。
【０１１８】
血清サンプルの葉酸の前処置および定量
血液を入れたチューブを遠心分離（６，０００ｒｐｍ、２０分、２０℃）した後に得られた血清サンプル中の葉酸の定量化を、酵素免疫アッセイ法によって行った。そのために、食品中の葉酸の定量のためにＦＤＡによって承認されたＥｌｉｓａキット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ，ＩＮＣ．カラバサス、カリフォルニア州、米国）を用いた。血清サンプルは、前処理なしで製造業者の説明書に従って定量した。
【０１１９】
該キットは食品における使用のために設計されているため、一連の予備試験を、血清サンプル中のビタミンを定量するその能力を確認するために行った。前記試験は、以下の前準備過程：１％（ｗ／ｖ）アスコルビン酸ナトリウム中に調製した５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム溶液中に溶解した葉酸の可変量（０〜３００μＬ）を５０μＬの血清に添加する過程によって、該キットを用いて得られた結果と、前項に記載した高速液体クロマトグラフィー法によって得られた結果との徹底的な比較を行うことからなる。得られた溶液を、５０ｍＭの四ホウ酸ナトリウム溶液で最終量３５０μＬ（血清希釈１：７）とした。各混合液を３０分間煮沸し、続いて２℃に冷却して、前記温度で一晩保持した。
【０１２０】
得られたサンプルを２０，０００ｒｐｍで、２０分間遠心分離し、次に２０μｍのフィルターを通して濾過した後、既に記載した高速液体クロマトグラフィー法を用いることによってそれらの葉酸含有量を定量した。この場合、血清のビタミン濃度が低いため、定量化における誤差を最小限に抑えるため、かついかなるマトリックスによる干渉を除くため、標準添加法を用いた。
【０１２１】
試験を行った全ての例において、両方法による血清葉酸濃度の差異は１０％未満であった。従って、分析に必要とされる血清量が少なく、そしてより簡便で迅速な方法であり、その検出限界（２ｎｇ／ｍＬ）はクロマトグラフィー技術のそれよりもかなり低いため、サンプル全体の定量のために、酵素免疫アッセイ法が選択された。
【０１２２】
脂溶性活性物質：ケルセチンを含有するカゼインナノ粒子を製造するための一般的方法
ケルセチンを含有するカゼインナノ粒子を製造する方法は、水性溶媒中にカゼインナトリウムを規定量の塩基性アミノ酸と共に溶解し、続いてマグネチックスターラーの下に、水性溶媒中に規定量のアスコルビン酸溶液、そして続いて予めエタノールに溶解したケルセチンを添加することを含む。混合液を数分間インキュベートした後、最終工程は、カルシウム塩を添加し、乳白色−黄色がかった懸濁液の見掛けを有するナノ粒子を形成させることからなる。
【０１２３】
場合により、形成されたナノ粒子は、それらを安定化させるため、１００ないし８００ＭＰａ下で１ないし５分間のサイクルで高圧静水圧処理（Ｓｔａｎｓｔｅｄ Ｆｌｕｉｄ Ｐｏｗｅｒ、ＩＳＯＬＡＢモデルＦＰＧ１１５００Ｂ１１０；シリーズ番号：７８４４）に付してよい。
【０１２４】
続いて、撹拌による３分間の均質化の後、撹拌を停止することなく、規定量の糖類溶液（ラクトース、トレハロース、マンニトール、グルコース、ソルビトール、マルトデキストリン、またはマルトース）を添加する。最終的に、懸濁液は凍結乾燥するか、またはスプレー乾燥機（Ｂｕｃｈｉ Ｍｉｎｉ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ Ｂ−１９１、Ｂｕｃｈｉ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ ＡＧ、スイス）内で以下の条件においてスプレーする：
−空気注入口温度：６０〜１００℃
−空気排出口温度：３０〜９０℃
−空気圧：２〜１０ｂａｒｓ［２〜１０×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：２〜９ｍＬ／分
−吸引：３０〜１００％
−空気流：２００〜９００Ｌ／ｈ。
【０１２５】
場合により、糖類を添加した後、製剤はスプレー乾燥の代わりに凍結乾燥によって乾燥させることができる。
【０１２６】
カゼイン粒子に結合するケルセチン量の決定
ナノ粒子に結合するケルセチンの量を、Ｌａｃｏｐｉｎｉ（Ｌａｃｏｐｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｆｏｏｄ Ｃｏｍｐ Ａｎａｌ ２００８；２１：５８９−５９８）によって記載された方法に幾つかの変更を加え、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により定量した。分析は、ダイオードアレイＵＶ検出システムと組み合わせた、モデル１１００ ＬＣシリーズクロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ワルドブロン、独国）において行った。データは、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄコンピュータにおいて、Ｃｈｅｍ−Ｓｔａｔｉｏｎ Ｇ２１７１ソフトウェアにより分析した。葉酸の分離のため、４０℃に加熱したＡｌｌｔｅｃｈ Ｃ１８ Ａｌｌｔｉｍａ（商標）カラム（５μｍ、１５０ｍｍ×２．１ｍｍ）を、適合するＧｅｍｉｎｉ（登録商標）Ｃ１８ ＡＪＯ−７５９６カラムと共に用い、勾配（第２表を参照）を有する水／メタノール／氷酢酸混合液を移動相として、０．２５ｍＬ／分の流速でポンプ注入した。検出は２６０ｎｍで行い、サンプル注入量は１０μＬで、ケルセチンの保持時間は２４．２±０．２分であった。
【０１２７】
【表３】
【０１２８】
サンプルの定量化の前に、９５％超の正確かつ的確な結果が得られる、含水アルコール溶媒（７５％エタノール）中の１ないし１００μｇ／ｍＬの濃度の異なる検量線を準備した。
【０１２９】
製造直後のサンプルの分析のため（それらの乾燥前）、濾過（１７０００ｒｐｍ、２０分）によりナノ粒子の精製過程後に得られた上清を、５０％（ｗ／ｖ）エタノール含有量の含水アルコール溶液が得られるまで希釈した。
【０１３０】
最後に、ナノ粒子に結合したケルセチン量［カプセル化効率（Ｅ．Ｅ．）］を、最初に添加したケルセチン量（Ｑ）と上清中に定量されたケルセチン量との間の差異として、以下の方程式に従って算出した。
【数１】
【０１３１】
実施例１
空のカゼインナノ粒子の調製および性質決定、それらを得るための方法の収率、用いるアミノ酸の型の、ナノ粒子の安定性および物理化学的特性に対する影響
１ｇのカゼインナトリウムを、９０ｍｇのリジンと共に７５ｍＬの水に溶解した。続いて、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この溶液に４０ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。この方法は３回行った。
【０１３２】
図２（ＡおよびＢ）に、透過型電子顕微鏡によって得た、この方法によって得られたカゼイン粒子の写真を示す。
【０１３３】
加えて、粒子の物理化学的特性に対するアミノ酸の型の影響を理解するために、同試験をアミノ酸の非存在下で、またはリジンの代わりに５０ｍｇのアルギニンを用いて行った。
【０１３４】
第３表に、得られたナノ粒子の主な物理化学的パラメータを要約する。
【０１３５】
【表４】
【０１３６】
実施した統計学的試験（ノンパラメトリック独立標本検定：クラスカル・ウォリス）により、製剤の物理化学的パラメータの間に差異があるということが認められる、統計学的に有意な証拠は存在しないことが示された。従って、アミノ酸の型は空のナノ粒子の前記特性に干渉しないと結論することができる。
【０１３７】
製剤に加えるアミノ酸の比を変化させて同じ試験を行っても、同様の結論、すなわちアミノ酸の比および型は空のナノ粒子の最終的な特性に干渉しないという結論に達した。
【０１３８】
製剤の安定性について理解するため、３つの型のナノ粒子の物理化学的パラメータを長時間に亘って測定した。得られた結果を第４表に収載する。
【０１３９】
【表５】
【０１４０】
それらを得た時点で、３つの型のナノ粒子は同一オーダーの径および比較的低い多分散度を有していた（ＰＤＩ値が０．３未満で、粒径分布が均一であることから考えられる）。これらの径および分散値は、アミノ酸と共に製剤化したナノ粒子の例における試験の全体を通して有意な変動を示さない。しかしながら、それらを得てから２時間後、アミノ酸と共に製剤化しなかったナノ粒子は、それらの平均径およびそれらの多分散度の双方が著しく増加し（０．３を超える多分散値に対しては粒径値は表現されず、直径における不均一性が大きいという指針のみである）、試験後には非常に高い多分散値に達した。前記増加は、粒子間の凝集現象の存在を示している。３つの製剤を経時的に観察したとき、アミノ酸なしのナノ粒子の沈殿物が乳白色の層を生じるのに対し、アミノ酸と共に製剤化したナノ粒子は均質な懸濁液を形成することが確認されたため、これらの現象は巨視的規模においてさえも確認された。これらの結果に鑑みると、経時的に安定な粒子を得るためにアミノ酸の存在は必須であると考えられる。
【０１４１】
加えて、再び３つの型の製剤を調製し、スプレー乾燥技術により乾燥させた後、それらの物理化学的特性について試験した。該方法の条件は下記の通りであった：
−空気注入口温度：９０℃
−空気排出口温度：４９℃
−空気圧：６ｂａｒ［６×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
−吸引：１００％
−空気流：６００Ｌ／ｈ。
【０１４２】
この試験は、ナノ粒子を得た時点でそれらを乾燥させたときのアミノ酸の影響を理解する目的で行ったが、その理由は、その時にいずれの製剤も凝集現象を示さなかったためである。得られた結果を第５表に収載する。
【０１４３】
【表６】
【０１４４】
粉末状に乾燥させたアミノ酸を有するナノ粒子を水性溶媒に再懸濁させることにより、径分布は単分散のままであり、それらの径は、スプレー乾燥による乾燥前のそれらの同族体の径よりもわずかに大きいことが観察された。しかしながら、アミノ酸なしで製剤化されたナノ粒子は、より大きな径と多分散値を有しており、このことは乾燥中に凝集現象を受けた可能性を示す。従って、アミノ酸の存在は、粒子をスプレー乾燥によって乾燥させるときにも必要である。
【０１４５】
このことに鑑みると、アミノ酸を有するナノ粒子の物理化学的特性は、アミノ酸を有さないナノ粒子のそれとは異なっており；それらは凝集傾向が少ないことから、生物活性化合物をカプセル化するために選択される製剤であると結論付けられる。
【０１４６】
実施例２
葉酸を含有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定、カプセル化効率に対するリジンおよび葉酸含有量の影響
全てが最終量７．５ｍＬの水に１００ｍｇのカゼインナトリウムおよび可変量のリジン（０〜８．５ｍｇ）を含有する異なる溶液を調製した。
【０１４７】
加えて、５０ｍＬの水に、３００ｍｇの葉酸を４００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０１４８】
続いて、カゼイン塩溶液に１ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に４ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。この方法は、それぞれの型の製剤について３回に行った。
【０１４９】
図３に、透過型電子顕微鏡によって得た、この方法によって得られた葉酸をカプセル化したカゼイン粒子の画像を示す。
【０１５０】
各例において得られた物理化学的特性を第６表に収載する。
【０１５１】
【表７】
【０１５２】
実施した統計学的検定（ノンパラメトリック独立標本検定：クラスカル・ウォリス）により、表に収載されている最後の３つの製剤（リジン含有量が３．９、４．５、および８．５ｍｇである）の物理化学的特性に差異があると考えられる、統計学的に有意な証拠は存在しないことが示された。第１の例では、葉酸溶液はリジンを含んでいるが、最初のカゼイン塩溶液中にアミノ酸が存在しないために葉酸がカルシウムと共に部分的に沈殿しやすくなり、遠心分離後のペレット中の葉酸の全てがカプセル化されたものではないことから、ビタミンの定量化における誤差の原因となることが確認された。
【０１５３】
さらなる試験により、ビタミン溶液がアミノ酸を含有するが、カゼイン塩溶液がアミノ酸を含有しない場合、沈殿することなく製剤中に組み込むことのできる葉酸の最大量は４ｍｇであることが確認され、得られた結果は第６表のものと同様であった（２５．５±１μｇＦＡ／ｍｇＮＰ、およびカプセル化効率：６８．７±０．５）。従って、アミノ酸の存在はカプセル化されるビタミンの量には影響しないことが確認された。しかしながら、アミノ酸なしで製剤化されたナノ粒子の安定性は低く、さらに凝集傾向が高いため（実施例１を参照）、製剤化はこのようなアミノ酸の存在下で行った。
【０１５４】
粒子の物理化学的特性に対する、製剤に添加した葉酸量の影響を理解するために、全ての例において、最初のカゼイン溶液中のアミノ酸量を一定：８．５ｍｇとし、添加する葉酸溶液の量のみを変化させることによって同様の試験を行った。
【０１５５】
図４に、カプセル化された葉酸量と製剤に添加したビタミン量との間の比を関数として示す。
【０１５６】
試験を行った製剤に見られた径は１３２ないし１４０ｎｍの範囲であり、全ての例で多分散度は０．２未満であった。この例では、各製剤に添加した葉酸量が異なるため、カプセル化効率値は同等ではない。重量比１３．５：１のカゼイン：葉酸に対する最大値は７３．１±７．５であった。
【０１５７】
この試験の結果として、製剤中のカゼインのｍｇ／ＦＡのｍｇの比が減少するため（すなわち、製剤に最初に添加した葉酸量が増加するため）、ナノ粒子内部でカプセル化された葉酸量の増加が得られると結論することができる。しかしながら、製剤中に存在するカゼイン量（ｍｇで）が、葉酸の各ｍｇに対して経験値よりも少ない場合には、リジンの非存在下で起こるような沈殿および不安定な製剤が観察される。
【０１５８】
実施例３
スプレー乾燥によって乾燥させた、葉酸を含有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定、最終製剤に対する乾燥過程の影響
最終量７５ｍＬの水に、双方とも１，０００ｍｇのカゼインナトリウムおよび９０ｍｇのリジンを含有する、２つの溶液を調製した。
【０１５９】
加えて、１００ｍＬの水に、６００ｍｇの葉酸を８００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０１６０】
続いて、各カゼイン塩溶液に７．５ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に４０ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０１６１】
最後に、製剤の１つを、上清およびペレット中の葉酸の定量化のために遠心分離を行い、一方もう１つには、スプレー乾燥機を用いた乾燥の前に１，９００ｍｇのラクトースを加えた。該方法の条件は下記の通りであった：
−空気注入口温度：９０℃
−空気排出口温度：４５℃
−空気圧：６ｂａｒ［６×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
−吸引：９５％
−空気流：６００Ｌ／ｈ。
【０１６２】
双方の例において観察された物理化学的特性を第７表に収載する。
【０１６３】
【表８】
【０１６４】
実施した統計学的検定（ノンパラメトリック独立標本検定：クラスカル・ウォリス）により、両製剤に対して得られたカプセル化効率の間には統計学的に有意な差異（ｐ＜０．０５）が存在することが示された。この差異は、既にカプセル化された葉酸の一部を放出させる、カゼインナノ粒子の部分的な分解の原因となる、意図した温度でのスプレー乾燥による製剤の乾燥過程に起因する可能性がある。
【０１６５】
これらの結果は、方法を粒子の架橋に応用する必要を示しており、そうすることによって粒子の安定性を改善することができ、そして製剤を遠心分離または乾燥させる過程における前述のカプセル化効率の低下を防止することができる。
【０１６６】
実施例４
高圧で安定化させ、スプレー乾燥技術によって乾燥させた、葉酸を含有し、リジンを有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定、ナノ粒子の物理化学的特性に対する処理の影響
全てが最終量７５ｍＬの水に１，０００ｍｇのカゼインナトリウムおよび９０ｍｇのリジンを含有する、異なる溶液を調製した。
【０１６７】
加えて、１００ｍＬの水に、６００ｍｇの葉酸を８００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０１６８】
続いて、カゼイン塩溶液に７．５ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラによる連続流の下に、この混合液に４０ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０１６９】
粒子が一旦形成されたら、製剤を密閉したプラスチックバッグへ移し、高圧静水圧処理に付した（０ＭＰａ；１００ＭＰａ、５分；２００ＭＰａ、５分；４００ＭＰａ、５分；６００ＭＰａ、５分、または８００ＭＰａ、５分）。
【０１７０】
過程が一旦終了したら、水に溶解した１，９００ｍｇのラクトースを各製剤に加え、以下の条件下でスプレー乾燥技術を用いてそれらを乾燥させた：
−空気注入口温度：８５℃
−空気排出口温度：４５℃
−空気圧：６ｂａｒ［６×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
−吸引：９５％
−空気流：６００Ｌ／ｈ。
【０１７１】
第８表に、得られたナノ粒子の主な物理化学的特性を要約する。
【０１７２】
【表９】
【０１７３】
第８表に見られるように、製剤に適用される処理の型にかかわらず、ナノ粒子は同様の表面電荷を有している。しかしながら、データは、処理に適用する圧力が増加するにつれて、得られる粒径がより小さくなり、最大７％までの減少に達することを検出した。しかしながら、適用する圧力が高くなるにつれて、カプセル化されたビタミンの量（そしてその結果としてのカプセル化効率）の値はより大きくなり、処理なしの製剤に対して６５％増加した（８００ＭＰａで処理したサンプルの場合）。
【０１７４】
加えて、図５は、高圧処理なし、ならびに１００、４００、および８００ＭＰａで処理した製剤の、走査型電子顕微鏡によって得られた顕微鏡写真を示す。これらは、高圧静水圧処理なしのナノ粒子が、それらが得られた後に付される様々な過程（スプレー乾燥による乾燥、遠心分離、高温に達する過程での顕微鏡観察）によってどのように部分的に変化するかを確認したことを示すが、様々な高圧処理に供されたナノ粒子の方がより安定であった。
【０１７５】
これらの結果は、適用した高圧静水処理はナノ粒子を架橋し、それらをより安定させ、遠心分離、乾燥、および写真撮影後にそれらが分解するのを防止することを示す。乾燥または遠心分離を行うこれらの過程の幾つかにおけるナノ粒子の部分的な分解は、葉酸の放出を伴い、その結果得られるカプセル化効率をより低下させる可能性があるため、これは全て、処理されたサンプルにおいてより高いカプセル化効率が得られることを説明している。
【０１７６】
実施例５
高圧を用い、スプレー乾燥によって乾燥させた、葉酸を含有し、アルギニンを有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定、最終結果において用いたアミノ酸の影響
最終量２１０ｍＬの、３，０６５ｍｇのカゼインナトリウムおよび１２３ｍｇのアルギニンの水溶液を調製した。
【０１７７】
加えて、１００ｍＬの水に、６０５ｍｇの葉酸を８００ｍｇのアルギニンと共に溶解した。
【０１７８】
続いて、カゼイン塩溶液に２７ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に１２０ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０１７９】
粒子が一旦形成されたら、製剤を密閉したプラスチックバッグへ移し、４００ＭＰａで５分のサイクルからなる高圧静水圧処理に付した。
【０１８０】
過程が一旦終了したら、水に溶解した５，８８０ｍｇのマンニトールを高圧処理された３００ｍＬの製剤に加え、以下の条件下でスプレー乾燥技術を用いてその乾燥を行った：
−空気注入口温度：８５℃
−空気排出口温度：４５℃
−空気圧：６ｂａｒ［６×１０５Ｐａ］
−サンプルポンプ流量：４．５ｍＬ／分
−吸引：９５％
−空気流：６００Ｌ／ｈ。
【０１８１】
得られた製剤の主な物理化学的特性を第９表に要約する。
【０１８２】
【表１０】
【０１８３】
図６は、４００ＭＰａ、５分間の処理で製剤中に葉酸をアルギニンと共に含有するカゼインナノ粒子の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真を示す。
【０１８４】
観察されるように、得られた製剤は、アルギニンの代わりにリジンを用いて得たナノ粒子と同様の特性を有している。
【０１８５】
実施例６
模擬胃腸液中でのナノ粒子からの葉酸の放出に対する放出動態試験、放出動態における高圧処理の影響
放出試験を行うために、実施例４に記載した粉末製剤（高圧処理なし、１００ＭＰａおよび４００ＭＰａで処理）を用いた。
【０１８６】
図７は、高圧処理なしのサンプルの例に対して得られた放出動態を示す。これにおいて、胃液中での２時間のインキュベーション後に、最大の葉酸放出値である４％に達したことが観察される。しかしながら、腸の状態では、カゼイン粒子は増大したパーセンテージのビタミンを放出して（試験２４時間目で９０％に達する）、溶解した。さらに、この媒体中では、インキュベーション後に遠心分離したサンプルには、それらの溶解、そしてそれゆえのビタミンの放出の証拠となるカゼインペレットがほとんど存在しなかった。従って、設計された製剤は、胃の管の至る所で葉酸をカプセル化し、胃の状態がバイオアベイラビリティを減少させるのを防止すると考えられる。さらに、ナノ粒子が腸内で溶解することで、ビタミンの放出を助け、ナノ粒子の存在によって起こり得る任意の毒性問題を排除する。
【０１８７】
高圧処理したサンプルの場合について、図８（ＡおよびＢ）にそれらの放出動態を示す。それらにおいては、高圧処理なしのサンプルに見出されるものと非常に類似したプロファイルが見られ、模擬腸液中での６時間後の最大放出パーセンテージ（７０％）は、同今回の処理なしのサンプルに見出されるもの（８０％）よりもわずかに低い。
【０１８８】
従って、カゼインナノ粒子の架橋のためにそれらへ高静水圧を適用することによって、それらからの成分放出のプロファイルは有意に変化しないが、放出されたビタミンの総量は６時間後に１０％低下する。
【０１８９】
実施例７
カゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸の薬物動態学的試験
第１０表に、薬物動態学的試験において試験したナノ粒子の主な物理化学的特性を要約する。実施例５に記載した方法に従って、双方の型のナノ粒子（高圧処理あり及びなし）を得た。
【０１９０】
【表１１】
【０１９１】
薬物動態学的試験を３段階に分けた。第１段階は、リン酸緩衝液に溶解した１ｍｇ／ｋｇの葉酸を静脈内投与することからなり；第２段階は、５匹の雄ウィスターラット群（このラット群では、経時的な基礎ビタミン濃度について試験した）のラットに１ｍＬのリン酸緩衝液を経口投与することからなる。最後に、第３段階は、１ｍｇ／ｋｇの（ｉ）水に溶解した葉酸、（ｉｉ）カゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸、および（ｉｉｉ）高圧処理した、カゼインナノ粒子内にカプセル化された葉酸を、５匹の動物から構成されるラット群へ経口投与することからなる。
【０１９２】
投与後、約５００μＬ量の血液を異なる時間に採取して（０、１、２、３、８、および２４時間）、血清分離管に回収し、続いて動物の血液量を同等の生理食塩水血清で腹腔内経路によって戻した。葉酸の投与後に得られたデータの薬物動態学的分析を、ＷｉＮＮｏｎｌｉｎ １．５薬物動態調整プログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マウンテンビュー、米国）の、ノンコンパートメント調整の方法を用いて行った。
【０１９３】
得られた結果（基礎濃度を差し引いた後）を図９に収載する。観察されるように、葉酸の静脈内投与（図９Ａ）は、最初のサンプル摂取による血清薬物濃度のピークに続いて、血清薬物濃度の大幅な減少を示している。ビタミンを経口投与した際に得られるプロファイル（図９Ｂ）は、最大濃度が有意に低いために異なっており、これはより長時間現れ、よりゆっくりと減少する。しかしながら、遊離型（カプセル化されていない）またはカゼインナノ粒子内にカプセル化された（高圧処理あり又はなし）葉酸の経口投与後に見られるビタミン濃度を比較すると、濃度プロファイルは同様の時間において見られたが、最大値はカプセル化されたビタミンを投与した時の方がより大きかった。
【０１９４】
本試験の実験データのノンコンパートメント解析を行った後に得られた薬物動態学的なパラメータの値を第１１表に収載する。
【０１９５】
【表１２】
【０１９６】
観察されるように、用いた製剤の型に依存してＡＵＣ値は有意に変動する。ビタミンがカゼインナノ粒子内にカプセル化されている場合、ＡＵＣ値は遊離型の葉酸を投与した後のものよりも有意に高く、これらはさらに投与後２４時間までにわたって維持される。２つのナノ粒子製剤において血漿中の葉酸の平均滞留時間（ＭＲＴ）は同様であり、遊離型と比較した場合にはそれよりも長いことが観察された（経口および静脈内）。
【０１９７】
これらの結果により、葉酸をカプセル化したカゼインナノ粒子の経口によるバイオアベイラビリティは双方の製剤で５２％であり、経口経路による遊離葉酸の経口投与後に得られた値よりも４５％高いと計算された。
【０１９８】
実施例８
葉酸をカプセル化したカゼインナノ粒子を有する化粧品製剤［１］
最終量１５ｍＬの水に、２００ｍｇのカゼインナトリウムおよび１８ｍｇのリジンを含有する溶液を調製した。
【０１９９】
加えて、１００ｍＬの水に、６００ｍｇの葉酸を８００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０２００】
続いて、カゼイン塩溶液に１．５ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に８ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０２０１】
最後に、製剤を１７，０００×ｇで、２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを２５ｍＬの水に再懸濁した。
【０２０２】
加えて、４２ｍＬの水に、７ｇのグリセリンおよび０．２ｇのニパギンナトリウムを含有する溶液を調製した。該溶液を水浴中で５０℃まで加熱し、続いて葉酸を含有するカゼインナノ粒子の水溶液を加えて、それにより化粧品製剤を調製し得る最終水溶液を得た。
【０２０３】
加えて、２５ｇのＮｅｏ ＰＣＬ Ｏ／Ｗをも、７０℃で加熱してそれを完全に融解した。この脂肪層が一旦融解したら、経時的に正確で安定なＯ／Ｗエマルションが得られるまで、持続的に撹拌しながら前述の水溶液を加えた。得られたクリームの官能評価は、均質な見掛けを有し、かつ塊が見られないことから肯定できるものであった。
【０２０４】
この同試験を、実施例４に記載される、高圧処理（４００ＭＰａ、５分）して、かつスプレー乾燥機によって乾燥させたナノ粒子の製剤を用いても行った。６００ｍｇの製剤を２５ｍＬの水に再懸濁後、既に上記した同じ方法を行った。得られたクリームもまた均質な見掛けを有し、かつ塊が見られなかった。
【０２０５】
実施例９
葉酸をカプセル化したカゼインナノ粒子を有する化粧品製剤［２］
最終量１５ｍＬの水に、２００ｍｇのカゼインナトリウムおよび１８ｍｇのリジンを含有する溶液を調製した。
【０２０６】
加えて、１００ｍＬの水に、６００ｍｇの葉酸を８００ｍｇのリジンと共に溶解した。
【０２０７】
続いて、各カゼイン塩溶液に１．５ｍＬの葉酸溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に８ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。
【０２０８】
最後に、製剤を１７，０００×ｇで、２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを２５ｍＬの水に再懸濁した。
【０２０９】
加えて、０．５ｇのカーボポールＵｌｔｒｅｚ １０を７５ｍＬの水に溶解した。該溶液にナノ粒子の懸濁液を加えた。混合液が一旦均質になったら、ｐＨ１０になるまで十分な量のトリメチルアミンを加えた。均質かつ安定で、わずかに黄色がかったカーボポールゲルが得られるまで混合液を均質化した。
【０２１０】
この同じ試験を、実施例４に記載される、高圧処理（４００ＭＰａ、５分）して、かつスプレー乾燥機によって乾燥させたナノ粒子の製剤を用いても行った。６００ｍｇの製剤を２５ｍＬの水に再懸濁後、既に上記した同じ方法を行った。得られたゲルもまたわずかに黄色がかった色であり、均質かつ安定な見掛けであった。
【０２１１】
実施例１０
葉酸をカプセル化したカゼインナノ粒子を有する化粧品製剤［３］
３ｇのモノステアリン酸グリセリンを、５ｇのミリスチン酸イソプロピルおよび２ｇのセチルアルコールと混合した。この混合液を水浴中で７０℃で加熱した。
【０２１２】
加えて、実施例８に記載した、葉酸を有するカゼインナノ粒子を含有する８７ｇのカーボポールゲルを、３ｇのソルビトール液と共に水浴中で５０℃まで加熱した。この溶液を前者に加え、均質なエマルションが得られるまで穏やかに撹拌した。
【０２１３】
実施例１１
ケルセチンを含有するカゼインナノ粒子の調製および性質決定
７．５ｍＬの水に、１００ｍｇのカゼインナトリウムおよび８．５ｍｇのリジン（または５．５ｍｇのアルギニン）を含有する溶液を調製した。
【０２１４】
加えて、濃度１２ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸ナトリウム水溶液を調製し、その０．５ｍＬをカゼイン塩およびリジンの混合物に加えた。アスコルビン酸ナトリウムを用いる理由は、ナノ粒子を得る過程の間に、ケルセチンの酸化を防止するためであった。
【０２１５】
加えて、５０ｍｇのケルセチンを５ｍＬのエタノールに溶解した。
【０２１６】
続いて、カゼイン塩溶液に０．１５ｍＬのケルセチン溶液を加えた。５分間のインキュベーションの後、マグネチックスターラーによる連続流の下に、この混合液に４ｍＬの０．８％ＣａＣｌ２を加えた。この方法は、それぞれの型の製剤について３回行った。
【０２１７】
各例において得られた物理化学的特性を第１２表に収載する。
【０２１８】
【表１３】
【０２１９】
得られた結果により、本発明のナノ粒子は、脂溶性の特性を有する生物活性化合物のカプセル化にも適し、そして高いカプセル化効率パーセンテージを得られることが示された。
【０２２０】
加えて、この結果により、一つまたは別のアミノ酸の存在は、得られたナノ粒子の物理化学的特性に影響しないことが確認される。
【０２２１】
カプセル化されたケルセチンの量を増大させるため、アミノ酸としてリジンおよび可変量のケルセチン（０．０５ないし０．５０ｍＬのケルセチンエタノール溶液）を用いて試験を反復した。得られた結果を第１３表に収載する。
【０２２２】
【表１４】
【０２２３】
得られた結果により、製剤中のケルセチン量の増加に伴って、カプセル化されたケルセチンの量も同比率で増加するが、カプセル化効率は一定のままであることが示される。
【０２２４】
さらに、先に記載した方法に従って試験を行ったが、カゼイン塩溶液へのケルセチン添加に先立ち、ケルセチンを（それをエタノール中に溶解する代わりに）水中に分散させた。得られた結果により、ケルセチンの一部はカゼインナノ粒子内にカプセル化されたが、カゼイン塩溶液へのケルセチン添加に先立ちケルセチンをエタノールに溶解した先の例よりもカプセル化効率は低いことが示された。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含んでなる、ナノ粒子。
【請求項２】
前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記二価金属が、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、二価型の鉄、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくはカルシウムである、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
生物活性化合物をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記生物活性化合物が、水溶性の生物活性化合物および脂溶性の生物活性化合物から選択されるものである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記水溶性の生物活性化合物が下記からなる群、
ａ）ＢまたはＣファミリー由来のビタミン；
ｂ）ａ）のビタミン誘導体；
ｃ）ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびチオクト酸から選択される化合物；
ｄ）前述の化合物ａ）〜ｃ）のいずれかの塩またはエステル；ならびに
ｅ）それらの組み合わせから選択されるものである、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記水溶性の生物活性化合物が、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項８】
カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含んでなるナノ粒子を製造する方法であって、
ａ）カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液を調製する工程；および
ｂ）工程ａ）の溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含んでなる、方法。
【請求項９】
カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびに生物活性化合物を含んでなるナノ粒子を製造する方法であって、
ａ）（ｉ）カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する水溶液を、（ｉｉ）生物活性化合物を含有する溶液と混合する工程；および
ｂ）工程ａ）で得られた混合液に、二価金属、三価金属、およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含んでなる、方法。
【請求項１０】
前記カゼイン源が、カゼインナトリウムを含んでなるものである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
前記金属が、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、二価型の鉄、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される二価金属、好ましくはカルシウムである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の前記水溶液が、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、硫酸カルシウム、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカルシウム塩の水溶液である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物活性化合物が、水溶性の生物活性化合物および脂溶性の生物活性化合物から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶性の生物活性化合物が下記からなる群：
ａ）ＢまたはＣファミリー由来のビタミン；
ｂ）ａ）のビタミン誘導体；
ｃ）ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびチオクト酸から選択される化合物；
ｄ）前述の化合物ａ）〜ｃ）のいずれかの塩またはエステル；ならびに
ｅ）それらの組み合わせから選択されるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶性の生物活性化合物が、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかもしくは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
形成されたナノ粒子を含有する懸濁液を、１００ないし８００ＭＰａの間の圧力の静水圧に、少なくとも１サイクルの付す工程をさらに含んでなる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１８】
形成されたナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥させる工程をさらに含んでなる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１９】
前記のナノ粒子を含有する前記懸濁液を乾燥させる工程が、保護剤の存在下、さらに場合により酸化防止剤の存在下で行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記保護剤が糖類である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸化防止剤がビタミンＣを含んでなるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項８に記載の方法によって得られる、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含んでなるナノ粒子。
【請求項２３】
請求項９に記載の方法によって得られる、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびに生物活性化合物を含んでなるナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも一種のナノ粒子、または請求項８〜２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる少なくとも１種のナノ粒子と、食品、薬品または化粧品において許容される担体とを少なくとも含んでなる、組成物。
【請求項２５】
ナノ粒子の平均径が５０ないし２００ｎｍの間に含まれ、好ましくは約１４０ｎｍである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
１０重量％ないし５０重量％のカゼイン；
０．９％重量％ないし２．５重量％の葉酸；
１重量％ないし６重量％のカルシウム；
１重量％ないし７重量％の塩基性アミノ酸；および
３０重量％ないし８０重量％の糖類を含み、
ここで、全ての比率が当該組成物の総重量に対する重量である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
１０重量％ないし５０重量％のカゼイン；
０．９％重量％ないし２．５重量％の葉酸；
１重量％ないし６重量％のカルシウム；および
１重量％ないし７重量％の塩基性アミノ酸；
２０重量％ないし５０重量％の糖類；および
１重量％ないし２５重量％のアスコルビン酸を含み、
ここで、全ての比率が当該組成物の総重量に対する重量である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記担体が、局所経路によるその投与に対して許容される、医薬的または美容的な賦形剤を含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ナノ粒子が乾燥粉末の形態である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項２４〜２７のいずれか一項、または請求項２９に記載の組成物を含んでなる、食料品。
【請求項３１】
液体、半固体、または固体の形態である、請求項３０に記載の食料品。
【請求項１】
カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含んでなる、ナノ粒子。
【請求項２】
前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記二価金属が、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、二価型の鉄、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、好ましくはカルシウムである、請求項１または２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
生物活性化合物をさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記生物活性化合物が、水溶性の生物活性化合物および脂溶性の生物活性化合物から選択されるものである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記水溶性の生物活性化合物が下記からなる群、
ａ）ＢまたはＣファミリー由来のビタミン；
ｂ）ａ）のビタミン誘導体；
ｃ）ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびチオクト酸から選択される化合物；
ｄ）前述の化合物ａ）〜ｃ）のいずれかの塩またはエステル；ならびに
ｅ）それらの組み合わせから選択されるものである、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記水溶性の生物活性化合物が、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかあるいは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項８】
カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含んでなるナノ粒子を製造する方法であって、
ａ）カゼイン源および塩基性アミノ酸を含有する水溶液を調製する工程；および
ｂ）工程ａ）の溶液に、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含んでなる、方法。
【請求項９】
カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびに生物活性化合物を含んでなるナノ粒子を製造する方法であって、
ａ）（ｉ）カゼイン源および第１の塩基性アミノ酸を含有する水溶液を、（ｉｉ）生物活性化合物を含有する溶液と混合する工程；および
ｂ）工程ａ）で得られた混合液に、二価金属、三価金属、およびそれらの組み合わせから選択される金属の水溶液を添加する工程を含んでなる、方法。
【請求項１０】
前記カゼイン源が、カゼインナトリウムを含んでなるものである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記塩基性アミノ酸が、アルギニン、リジン、ヒスチジン、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１２】
前記金属が、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、二価型の鉄、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される二価金属、好ましくはカルシウムである、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１３】
二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属の前記水溶液が、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム、ソルビン酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、クエン酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、硫酸カルシウム、およびそれらの混合物からなる群から選択されるカルシウム塩の水溶液である、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物活性化合物が、水溶性の生物活性化合物および脂溶性の生物活性化合物から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶性の生物活性化合物が下記からなる群：
ａ）ＢまたはＣファミリー由来のビタミン；
ｂ）ａ）のビタミン誘導体；
ｃ）ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、およびチオクト酸から選択される化合物；
ｄ）前述の化合物ａ）〜ｃ）のいずれかの塩またはエステル；ならびに
ｅ）それらの組み合わせから選択されるものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記水溶性の生物活性化合物が、葉酸、４−アミノ安息香酸、ナイアシン、パントテン酸、チアミン一リン酸、チアミンピロリン酸、チアミン三リン酸、アスコルビン酸、プテロイルポリグルタミン酸、フォリン酸、ニコチン酸、ヒアルロン酸、チオクト酸、ｐ−クマル酸、コーヒー酸、それらの医薬的もしくは美容的に許容されるかもしくは食品用の、誘導体、エステルまたは塩、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
形成されたナノ粒子を含有する懸濁液を、１００ないし８００ＭＰａの間の圧力の静水圧に、少なくとも１サイクルの付す工程をさらに含んでなる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１８】
形成されたナノ粒子を含有する懸濁液を乾燥させる工程をさらに含んでなる、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１９】
前記のナノ粒子を含有する前記懸濁液を乾燥させる工程が、保護剤の存在下、さらに場合により酸化防止剤の存在下で行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記保護剤が糖類である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記酸化防止剤がビタミンＣを含んでなるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項８に記載の方法によって得られる、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、ならびに二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属を含んでなるナノ粒子。
【請求項２３】
請求項９に記載の方法によって得られる、カゼインマトリックス、塩基性アミノ酸、二価金属、三価金属およびそれらの組み合わせから選択される金属、ならびに生物活性化合物を含んでなるナノ粒子。
【請求項２４】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の少なくとも一種のナノ粒子、または請求項８〜２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる少なくとも１種のナノ粒子と、食品、薬品または化粧品において許容される担体とを少なくとも含んでなる、組成物。
【請求項２５】
ナノ粒子の平均径が５０ないし２００ｎｍの間に含まれ、好ましくは約１４０ｎｍである、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
１０重量％ないし５０重量％のカゼイン；
０．９％重量％ないし２．５重量％の葉酸；
１重量％ないし６重量％のカルシウム；
１重量％ないし７重量％の塩基性アミノ酸；および
３０重量％ないし８０重量％の糖類を含み、
ここで、全ての比率が当該組成物の総重量に対する重量である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２７】
１０重量％ないし５０重量％のカゼイン；
０．９％重量％ないし２．５重量％の葉酸；
１重量％ないし６重量％のカルシウム；および
１重量％ないし７重量％の塩基性アミノ酸；
２０重量％ないし５０重量％の糖類；および
１重量％ないし２５重量％のアスコルビン酸を含み、
ここで、全ての比率が当該組成物の総重量に対する重量である、請求項２４または２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記担体が、局所経路によるその投与に対して許容される、医薬的または美容的な賦形剤を含んでなる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ナノ粒子が乾燥粉末の形態である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
請求項２４〜２７のいずれか一項、または請求項２９に記載の組成物を含んでなる、食料品。
【請求項３１】
液体、半固体、または固体の形態である、請求項３０に記載の食料品。
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図５Ｃ】
【図５Ｄ】
【図５Ｅ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１】
【公表番号】特表２０１３−５２０１９１（Ｐ２０１３−５２０１９１Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４３７９（Ｐ２０１２−５５４３７９）
【出願日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２０１１／０７０１１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４４１０
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５１２２２０８９１）ウニベルシダ デ ナバーラ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤ ＤＥ ＮＡＶＡＲＲＡ
【住所又は居所原語表記】Ｃａｒｒｅｔｅｒａ ｄｅｌ Ｓａｄａｒ， ｓｉｎ ｎｕｍｅｒｏ， Ｅ‐３１００８ Ｐａｍｐｌｏｎａ，Ｎａｖａｒｒａ ＥＳＰＡＮＡ
【出願人】（５１２２２０９０５）セントゥロ ナシオナル デ テクノロヒア イ セグリダ アリメンタリア、ラボラトリオ デル エブロ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＯ ＮＡＣＩＯＮＡＬ ＤＥ ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＡ Ｙ ＳＥＧＵＲＩＤＡＤ ＡＬＩＭＥＮＴＡＲＩＡ， ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯ ＤＥＬ ＥＢＲＯ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＳ２０１１／０７０１１８
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４４１０
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５１２２２０８９１）ウニベルシダ デ ナバーラ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＤＡＤ ＤＥ ＮＡＶＡＲＲＡ
【住所又は居所原語表記】Ｃａｒｒｅｔｅｒａ ｄｅｌ Ｓａｄａｒ， ｓｉｎ ｎｕｍｅｒｏ， Ｅ‐３１００８ Ｐａｍｐｌｏｎａ，Ｎａｖａｒｒａ ＥＳＰＡＮＡ
【出願人】（５１２２２０９０５）セントゥロ ナシオナル デ テクノロヒア イ セグリダ アリメンタリア、ラボラトリオ デル エブロ (1)
【氏名又は名称原語表記】ＣＥＮＴＲＯ ＮＡＣＩＯＮＡＬ ＤＥ ＴＥＣＮＯＬＯＧＩＡ Ｙ ＳＥＧＵＲＩＤＡＤ ＡＬＩＭＥＮＴＡＲＩＡ， ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＯ ＤＥＬ ＥＢＲＯ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]