三次元干渉顕微鏡観察
【課題】 三次元干渉顕微鏡観察を提供する。
【解決手段】 サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットが活性化され、活性化されたスイッチャブル光源が励起され、それにより、光ビームが、少なくとも２つの光路に沿って、活性化されたスイッチャブル光源から放出される。活性化されたスイッチャブル光源から第１の光路に沿って放出される第１の光ビームでの第１の波面修正が導入され、活性化されたスイッチャブル光源から第２の光路に沿って放出される第２の光ビームでの第２の波面修正が導入され、第２の波面修正が、第１の波面修正とは異なる。第１および第２の光ビームが、互いに干渉されて、複数の出力ビームを生成し、光源の三次元位置情報が、複数の出力ビームからの各出力ビームの強度に基づいて決定される。
【解決手段】 サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットが活性化され、活性化されたスイッチャブル光源が励起され、それにより、光ビームが、少なくとも２つの光路に沿って、活性化されたスイッチャブル光源から放出される。活性化されたスイッチャブル光源から第１の光路に沿って放出される第１の光ビームでの第１の波面修正が導入され、活性化されたスイッチャブル光源から第２の光路に沿って放出される第２の光ビームでの第２の波面修正が導入され、第２の波面修正が、第１の波面修正とは異なる。第１および第２の光ビームが、互いに干渉されて、複数の出力ビームを生成し、光源の三次元位置情報が、複数の出力ビームからの各出力ビームの強度に基づいて決定される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で２００６年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８７１，３６６号ならびに「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で２００７年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／９０８，３０７号に基づく優先権を主張する「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(Systems and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称の２００７年１２月２０日に出願された米国特許出願第１１／９６１，６０１号の一部継続出願である。これら全ての出願は、それらの全体が参照により本明細書に援用されるものとする。
【０００２】
技術分野
開示する主題は、たとえば、空間的に解像可能な点光源を含む、またはそのような点光源で標識されたサンプルの干渉顕微鏡観察を含めた、干渉顕微鏡観察に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
干渉位相を測定する顕微鏡観察システムは公知である。たとえば、１つの公知の顕微鏡観察システムは、外部光源で対象物の延在表面を照明することにより干渉位相を測定する。サンプルから反射された光は、ビームスプリッター中で参照ビームと干渉する。干渉ビームは、ディテクター上に画像化される。参照ビームとサンプルビームとの光路差は、出力干渉ビームの振幅を変調して、対象物の高さの尺度を提供することが可能である。また、対向する対物レンズを介してサンプルからの２つのビームを干渉させて１つの干渉出力ビームだけを測定する顕微鏡観察システムも公知である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
１つの一般的な態様では、第１および第２の直交次元によって定義されるサンプル平面に概して沿って延在するサンプル内にある光源が光駆動され、光源が複数の伝搬方向に光ビームを放出する。光源から放出された２つ以上の光ビームは互いに干渉されて複数の出力ビームが生成され、複数のディテクターに向けられる。複数の出力ビームからの各出力ビームの画像の中心領域に基づいて、第１の直交次元および第２の直交次元での光源の位置が決定される。複数の出力ビームそれぞれから個別に検出される強度に基づいて、サンプル平面に垂直な第３の直交次元での光源の取り得る位置の組が決定される。第３の直交次元での光源の位置と共に変化する波面修正に基づいて、１つまたは複数の光ビームおよび出力ビームの画像の形状が分析される。波面修正は、光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正である。分析された形状に基づいて、光源の位置が取り得る組の中から第３の直交次元での位置が決定される。
【０００５】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。たとえば、１つまたは複数の画像の形状が、波面修正を所定の波面修正と比較することによって分析することができる。１つまたは複数の画像の形状は、波面修正をモデル化された波面修正と比較することによって分析することもできる。１つまたは複数の画像の形状は、波面修正によって引き起こされ、第３の直交次元での光源の位置と共に変化する複素位相を分析することによって分析することもできる。
【０００６】
第３の直交次元での光源の位置は、１つまたは複数の画像の形状を、所定の波面修正に基づいて決定される所定の画像の形状と比較することによって、取り得る位置の組の中から決定することができる。
【０００７】
波面修正は、少なくとも１つの光ビームに能動的に導入することができる。波面修正は、ビーム伝搬方向に対する横方向にそれぞれ１つの焦点を有する焦点面間で、少なくとも１つの光ビームに伝搬方向に沿ったずれを導入することによって、導入することができる。波面修正は、少なくとも１つの光ビームにビーム伝搬方向に対する１つまたは複数の横方向に沿って波面の曲率を導入することによって、導入することができる。
【０００８】
波面修正は、少なくとも１つの光ビームの画像の輝度を変えることによって、少なくとも１つの光ビームに導入することができる。画像の輝度は、光ビームおよび出力ビームのうちの１つまたは複数のビームの１つの横方向に沿って、第２の横方向とは異なるように変えることができる。
【０００９】
別の一般的な態様では、装置は、光駆動システムと、干渉システムと、少なくとも２つのディテクターと、プロセッサーとを含む。光駆動システムは、概してサンプル平面に沿って延在するサンプル内にある光源が複数の光路に光ビームを放出するように構成される。干渉システムは、光源から放出された第１および第２の光ビームを受け取り、各光ビームを２つ以上の分割ビームに分割し、分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成するように構成される。各合成ビームは、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、これは、光源の位置に相対的な光ビームの光路長の差による光ビーム間での光源位相の差によって少なくとも部分的に引き起こされる。少なくとも２つのディテクターは、干渉システムから出力された各合成ビームの強度およびプロファイルの１つまたは複数を個別に検出するように構成される。プロセッサーは、少なくとも２つのディテクターから出力を受け取り、各合成ビームの画像の中心領域に基づいて、サブ回折確度で、サンプル平面内の光源の位置を計算し、各合成ビームの個別に検出された強度に基づいて、サンプル平面に垂直な第３の直交次元での光源の取り得る位置の組を計算し、第３の直交次元での光源の位置と共に変化する波面修正に基づいて、光ビームおよび合成ビームのうちの１つまたは複数のビームの画像の形状を分析し、分析された形状に基づいて、取り得る位置の組の中から第３の直交次元での光源の位置を決定するように構成される。波面修正は、光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正である。
【００１０】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。たとえば、光駆動システムは、サンプルに光学的に結合することができ、サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットを活性化させ、活性化されたスイッチャブル光源を励起するように構成することができ、それにより光ビームが、活性化されたスイッチャブル光源から、干渉システムに向けられた少なくとも２つの光路に沿って放出されるように構成することができる。
【００１１】
また、装置は、第１の光路に沿って放出された第１の光ビームを受け取り、第１の光ビームを干渉システムに少なくとも向け直すように構成された第１の光学素子と、第２の光路に沿って放出された第２の光ビームを受け取り、第２の光ビームを干渉システムに少なくとも向け直すように構成された第２の光学素子とを含むこともできる。
【００１２】
装置は、少なくとも１つの光ビームの可変の波面修正を導入するように構成された少なくとも１つの光路に、波面修正システムを含むことができる。波面修正システムは、１つまたは複数の光ビームおよび合成ビームの横方向に沿って焦点面をずらすように構成された少なくとも１つの光路に、デフォーカスシステムを含むことができる。デフォーカスシステムは、光源と干渉システムとの間の第１の光ビームの第１の光路内にあり、第１の光ビームの横方向に沿って焦点面をずらすように構成された第１のデフォーカスシステムと、光源と干渉システムとの間の第２の光ビームの第２の光路内にあり、第２の光ビームの横方向に沿って焦点面をずらすように構成された第２のデフォーカスシステムとを含むことができる。デフォーカスシステムは、サンプルと干渉システムとの間に置くことができる。
【００１３】
別の一般的な態様では、方法が、サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットを活性化する工程と、活性化されたスイッチャブル光源から少なくとも２つの光路に沿って光ビームが放出されるように、活性化されたスイッチャブル光源を励起する工程と、活性化されたスイッチャブル光源から第１の光路に沿って放出される第１の光ビームに第１の波面修正を導入し、活性化されたスイッチャブル光源から第２の光路に沿って放出される第２の光ビームに第２の波面修正を導入する工程であって、第２の波面修正が第１の波面修正と異なる工程と、複数の出力ビームを生成するために第１の光ビームと第２の光ビームを干渉させる工程と、複数の出力ビームからの各出力ビームの強度に基づいて、光源の三次元位置情報を決定する工程とを含む。
【００１４】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。たとえば、第２の波面修正は、第１の波面修正と方向が逆であってよい。
【００１５】
第１の波面修正は、第１の横方向に沿った第１の光ビームの焦点面を、第２の横方向に沿った第１の光ビームの焦点面に対して第１のシフト値だけシフトさせることによって導入することができ、第１および第２の横方向は第１の光路に対して横方向である。
【００１６】
第２の波面修正は、第１の横方向に沿った第２の光ビームの焦点面を第２の横方向に沿った第２の光ビームの焦点面に対して第２のシフト値だけシフトさせることによって導入することができ、第１および第２の横方向は第２の光路に対して横方向であり、第２のシフト値は第１のシフト値と逆である。
【００１７】
第１の波面修正は、第１の光路に対して横方向である少なくとも１つの方向に沿って、活性化されたスイッチャブル光源から放出される第１の光ビームをアンダーフォーカスすることによって導入することができ、第２の波面修正は、第２の光路に対して横方向である少なくとも１つの方向に沿って、活性化されたスイッチャブル光源から放出される第２の光ビームをオーバーフォーカスすることによって導入することができる。
【００１８】
また、この方法は、第１および第２の光ビームに第１および第２の波面修正を導入する前に、平行化された光ビームを形成する工程を含むこともできる。
【００１９】
三次元位置情報は、サンプルが概して延在するサンプル平面に垂直な次元での光源の位置を決定することによって決定することができる。
【００２０】
第１の波面修正は、第１の光ビームに波面曲率を導入することによって第１の光ビームに導入することができ、第２の波面修正は、第２の光ビームに波面曲率を導入することによって第２の光ビームに導入することができる。
【００２１】
各波面修正は、それぞれの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正であってよい。
【００２２】
別の一般的な態様では、方法が、点光源から放出される第１および第２の光ビームを、当該の第１および第２の異なる光路に関連する第１および第２の異なる方向に沿って向ける工程と、第１の光路での第１の光ビームに対して横方向で、焦点面を第１のシフト値だけシフトさせ、第２の光路での第２の光ビームに対して横方向で、焦点面を第２のシフト値だけシフトさせる工程であって、第２のシフト値が第１のシフト値と逆である工程と、第１および第２の光ビームの焦点面をシフトさせた後、第１および第２の光ビームをそれぞれ２つ以上の分割ビームに分割し、分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成する工程であって、各合成ビームが、第１および第２の光ビームの光路長の差によって少なくとも部分的に引き起こされる２つ以上の分割ビーム間の干渉を含む工程と、各合成ビームの画像を個別に検出する工程と、第１の直交次元および第２の直交次元での光源の位置を決定する工程と、各合成ビームの個別に検出された画像に基づいて、第３の直交次元での光源の位置を決定する工程とを含む。
【００２３】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。たとえば、第３の直交次元での光源の位置は、各合成ビームの個別に検出された画像に基づいて決定することができ、これは、個別に検出された画像の強度を所定の値と比較することによって光源の位置を決定する工程を含む。
【００２４】
１つの一般的な態様では、装置は、複数のディテクターとプロセッサーとを有する光学システムを含む。光学システムは、所与の時間で、各ディテクターで、第１の次元と第１の次元に実質的に直交する第２の次元とで、光源の画像を生成するように構成される。それらの画像からの各画像は光源からの放出の干渉に基づいており、この放出は２つの異なる光ビームを形成する。プロセッサーは、画像に基づいて第３の次元での位置を計算するように構成される。第３の次元は、第１の次元と第２の次元とに実質的に直交する。
【００２５】
１つの一般的な態様では、蛍光標識でタグ付けされた対象分子は、回折限界よりも良好な確度で三次元で位置特定が可能である。そのような実装形態では、画像に関連付けられる位相情報を用いてｚ座標で分子の位置に関する情報を決定することが可能であり、結果的に、三次元でサブ回折確度＜＜λ／２を有する３Ｄ（三次元）表現を達成することが可能である。すなわち、第３の次元（たとえばｚ座標）での分子の位置に関する情報は、２つの他の次元（たとえばｘおよびｙ座標）での分子の位置に関する情報を得るために使用されるのと同じ画像の組から得ることができる。
【００２６】
いくつかの一般的な態様では、点光源から放出される少なくとも２つの光ビームが、少なくとも２つの異なる方向に沿って向けられ、各方向が異なる光路に関連付けられる。光ビームはそれぞれ２つ以上の分割ビームに分割され、分割ビームの少なくとも２つ以上が組み合わされて複数の合成ビームを形成し、各合成ビームは、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、これは、光ビームの光路長の差による光ビーム間の光源位相の差によって少なくとも部分的に引き起こされる。各合成ビームの強度および画像プロファイルが個別に検出される。第１の直交次元および第２の直交次元での光源の位置が決定され、第３の直交次元での光源の位置は、各合成ビームの個別に検出された強度および画像プロファイルに基づいて決定される。
【００２７】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。少なくとも２つの発光ビームは、反対側のレンズを通るように少なくとも２つの光ビームをそれぞれ向けることによって方向付けることができる。少なくとも２つの発光ビームは、レンズの異なる部分を通るように少なくとも２つの光ビームをそれぞれ向けることによって方向付けることができる。各合成ビームの強度は、各合成ビームの強度を同時に検出することによって、個別に検出することができる。各発光ビームは、発光ビームの少なくとも１つを３つ以上の分割ビームに分割することによって分割することができる。
【００２８】
別の一般的な態様では、装置が、点光源から２つの異なる光路に沿って放出される少なくとも２つの光ビームを受け取り、各発光ビームを２つ以上の分割ビームに分割し、分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成するように構成されたビームスプリッターを含む。各合成ビームは、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、これは、光ビームの光路長の差による分割光ビーム間の位相差によって少なくとも部分的に引き起こされる。少なくとも２つのディテクターが、ビームスプリッターから出力される各合成ビームの強度および画像プロファイルを個別に検出するように構成される。プロセッサーは、少なくとも２つのディテクターからの出力を受け取り、第１、第２、および第３の直交次元での光源の位置をサブ回折確度で計算するように構成される。
【００２９】
別の一般的な態様では、サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットが活性化され、活性化されたスイッチャブル光源が励起され、それにより、光エネルギーが、活性化されたスイッチャブル光源から複数の方向で放出され、活性化されたスイッチャブル光源から複数の方向で放出された光エネルギーが干渉されて複数の出力ビームを生成し、光源の三次元位置情報が、複数の出力ビームからの各出力ビームの強度および画像プロファイルに基づいて決定される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】多位相干渉顕微鏡観察システムおよびサンプルのブロック図である。
【図２】二位相干渉顕微鏡システムおよび単一発光体サンプルのブロック図である。
【図３】図２の２つのディテクターで検出された放射光の強度のグラフである。
【図４】二位相干渉顕微鏡システムおよび延在サンプルのブロック図である。
【図５】図４の２つのディテクターで検出された放射光の強度のグラフである。
【図６】ビーム位相の表現を有する二位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図７Ａ】図６の当該のディテクターで検出された所与の出力ビームに関する成分のビーム強度の位相を表すグラフである。
【図７Ｂ】図６の当該のディテクターで検出された所与の出力ビームに関する成分のビーム強度の位相を表すグラフである。
【図７Ｃ】それぞれ図７Ａおよび７Ｂに関連付けられる出力ビームの強度を表すグラフである。
【図７Ｄ】それぞれ図７Ａおよび７Ｂに関連付けられる出力ビームの強度を表すグラフである。
【図８】三位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図８Ａ】三方向ビームスプリッターの側面図である。
【図８Ｂ】八方向ビームスプリッターの側面図である。
【図９】図８の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフである。
【図１０】三方向ビームスプリッターの側面図である。
【図１０Ａ】図１０の三方向ビームスプリッターでの、ビームスプリッッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーの図である。
【図１０Ｂ】図１０の三方向ビームスプリッターでの、ビームスプリッッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーの図である。
【図１０Ｃ】図１０の三方向ビームスプリッターでの、ビームスプリッッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーの図である。
【図１１】図１０の三方向ビームスプリッターの斜視図である。
【図１２】四位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図１３】図１２の４つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフである。
【図１４】回折グレーティングを有する四位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図１５】回折グレーティングを有する六位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図１６】２つの異なる潜在位置にある単一量子発光体の図である。
【図１７】単一対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図１８】図１７に示されるビームスプリッターおよび／またはアニュラーリバーサーシステムの一例のブロック図である。
【図１９】図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図である。
【図２０】図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの端面図である。
【図２１】図１７に示されるアニュラーエキスパンダーの６つのプリズム素子のうち３つの斜視図である。
【図２２】図１７の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフである。
【図２３】アニュラーエキスパンダーの平面図である。
【図２４】ラインＸＸ−ＸＸに沿って取られた図２３に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図である。
【図２５】ラインＸＸＩ−ＸＸＩに沿って取られた図２３に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図である。
【図２６】多位相干渉顕微鏡システムに関する校正プロセスのフロー図である。
【図２７】多位相干渉顕微鏡システム内部での光活性化されたサンプルの三次元位置情報を得るためのプロセスのフロー図である。
【図２８】多位相干渉顕微鏡観察システムおよびサンプルのブロック図である。
【図２９】図２８のシステムのプロセッサーによって行われる処置のフロー図である。
【図３０】三位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図３１Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３１Ｂ】図３１Ａのシステムでのサンプルの光源の楕円率と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【図３２】データへのあてはめ、データとあてはめとの差、およびデータの断面と共に、図３１Ａのシステム内部のディテクターから得られる生の画像データを示す表である。
【図３３】図３１Ａと同じ光源の楕円率と垂直位置との関係のグラフである。
【図３４】図３１Ａのサンプル光源の測定された垂直位置（干渉法データのみを使用して決定された直交位置の組）と実際の垂直位置との関係のグラフである。
【図３５】図３３および３４のグラフからのデータを使用した、図３１Ａのサンプル光源の推定される垂直位置と実際の垂直位置との関係のグラフである。
【図３６Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３６Ｂ】図３６Ａのシステムでのサンプルの光源の楕円率と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【図３７Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３７Ｂ】図３７Ａのシステムでのサンプルの光源の楕円率と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【図３８】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３９Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３９Ｂ】図３９Ａのシステムでのサンプルの光源の位相角差と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【図４０Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図４０Ｂ】図４０Ａのシステムでのサンプルの光源の楕円率と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
広義には、本明細書に記載の１つ以上の実装形態は、公知の光学顕微鏡観察よりも良好な解像度を有するサンプルの三次元レンダリングを生成することができる。いくつかの実装形態では、広視野干渉顕微鏡が、位相差を測定して、（たとえばｚ座標または垂直方向に沿った）第３の次元でのサンプル内にあるスイッチャブル光源の位置情報を決定すると同時に、（たとえばｘおよびｙ座標に沿った、またはサンプル平面に沿った）２つの他の直交次元での位置情報を測定することができる。いくつかの実装形態では、干渉顕微鏡は、タンパク質分子中の光活性化蛍光標識から光を内的に放射するサンプルなど、空間的に解像可能な一群の点光源を含むまたはそのような点光源で標識されたサンプルを測定することができる。
【００３２】
たとえば、サンプル中の特定の標識タンパク質の三次元（３Ｄ）レンダリングを生成することが可能である。特定の標識タンパク質によりコントラストを与えることが可能であるが、なおかつ専用の光学顕微鏡を用いてコントラストを得ることが可能である。たとえば、１つ以上の実装形態を用いて、全３Ｄ位置で細胞内の蛍光標識タンパク質の位置を決定することが可能である。
【００３３】
公知の顕微鏡観察システムの１つは、光活性化位置特定顕微鏡観察（「ＰＡＬＭ」）システムである。ＰＡＬＭシステムは、次の参考文献（参照により本明細書に援用されるものとする）に記載されている。「光変換性光学標識を用いた光学顕微鏡観察(Optical Microscopy with Phototransformable Optical Labels)」という名称で２００５年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６８３，３３７号、「ほぼ分子分解能での細胞内蛍光タンパク質のイメージング(Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Near-Molecular Resolution)」という名称で２００６年３月１０日出願に出願された米国仮特許出願第６０／７８０，９６８号、「光変換性光学標識を用いた光学顕微鏡観察(Optical Microscopy with Phototransformable Optical Labels)」という名称で２００６年５月２３日に出願されかつＰＣＴ国際公開第２００６／１２７６８２号として２００５年１１月１１日に公開されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９８８７号、Betzig, E. et al., "Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution," Science, Vol. 313, September 15, 2006、およびBetzig, E. et al., "Supporting online Material for 'Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution'," Science Express, August 10, 2006, [online] www.sciencemag.org/cgi/content/full/1127344/DC1（本明細書中ではまとめて「Betzig参考文献」と記す）。
【００３４】
ＰＡＬＭシステムは、主に二次元（２Ｄ）で、すなわちｘ，ｙ画像平面（またはサンプル平面）で分子の位置を特定して、回折限界顕微鏡のものよりも優れた高解像度画像を提供する。２Ｄ ＰＡＬＭシステムの場合において、スイッチャブル光学標識は、ＰＡ−ＧＦＰのような光活性蛍光タンパク質でありうる。ＰＡ−ＧＦＰは、ＧＦＰの光活性蛍光タンパク質変異体であり、４０５ｎｍの光を照射することにより非蛍光形からアニオン形に変換可能であり、アニオン形は、５００ｎｍの励起線を吸収して５２０ｎｍの蛍光線を発する。他の光活性タンパク質には、Ｄｒｏｎｐａ、Ｅｏｓ、ＰＡ−Ｃｈｅｒｒｙ、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ−ＦＰ、ＰＡ−ＣＦＰが含まれ、その多くは、単量体形、二量体形、および四量体形で使用可能である。そのようなタンパク質は、対象タンパク質を標識するように遺伝子発現および遺伝子結合が可能である。これによりタンパク質特異的画像を構築することが可能である。種々のケージド染料分子を使用することも可能であるが、それらは典型的には免疫標識スキームまたはそれに代わる結合スキームを必要とする。こうしたタンパク質／標識のいくつかは、十分に異なる光物理的性質、たとえば、発光波長、励起波長、または脱色速度を有するので、２つの異なるスイッチャブル光学標識を用いて画像を作成することが可能である。この場合、ビーム経路中にダイクロイックミラーを追加することにより、この３Ｄ干渉顕微鏡観察のための新しい第２さらには第３の一連の画像を得ることが可能である。１種のタンパク質の画像化および脱色を行ってから第２のタンパク質の画像化を行うように取得処理を順序付けることは、異なる標識タンパク質を画像化するもう１つの方法である。
【００３５】
慣例的に、標識された分子のｚ位置は、１つまたは複数の対物レンズの光軸の方向に沿っており、ｘおよびｙ位置は、サンプルの平面に沿って延在するｘおよびｙ方向に沿っており、ｘおよびｙ方向はｚ方向に直交する。
【００３６】
第３の次元（ｚ方向）での標識分子の位置に関する情報を取得するための一方法は、光路長の差の位相角情報を使用するものであり、それにより、標識分子のｘ，ｙ位置を決定することができる二次元強度画像と、標識分子のｚ位置を決定することができる位相依存画像とを両方同時に獲得することができ、再構成することができる。言い換えれば、サンプルからの２つ以上の発光ビームを２つ以上のビームにさらにスプリットして互いにペアワイズ干渉させ（それらの異なる位相に基づいて）、得られた干渉ビームで画像を形成し、画像を同時に記録してサンプルの局在化光源の経路長差（すなわちｚ位置）を再構築する。それに加えて、いくつかの実装形態では、干渉振幅を抽出して垂直方向位置の追加的尺度として使用することも可能である。
【００３７】
そのような実装形態は、多くの点で有利である。たとえば、以上で述べたように、本明細書に記載のいくつかの実装形態では、位相差を測定することにより、第３の次元（たとえばｚ方向）で位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘ方向およびｙ方向）で位置情報を測定することが可能である。これにより３つの直交する次元すべてで測定が可能になり、この測定は、こうした測定がさまざま時点で行われる公知のシステムよりも正確でありうる。本明細書に記載のそのような測定技術は、たとえば、時間変化する明るさを有する光活性サンプルのように静的でないサンプルに特に有利でありうる。
【００３８】
以上にも述べたように、本明細書に記載のいくつかの実装形態では、測定されるサンプルの成分は、サブ回折サイズの点光源として分離可能かつ同定可能である。これにより可能になる測定は、明確な画定が可能であるとともに、測定サンプル成分が位置の分布を有する拡張光源でありかつ光源の種々の部分が光源の他の部分と干渉する可能性がある公知のシステムよりも正確でありうる。本明細書に記載のそのような測定技術は、回折限界よりも正確に測定を行うのに特に有利でありうる。
【００３９】
図１を参照すると、サンプルＳで、第３の次元（たとえばｚ方向）での位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘおよびｙ方向）での位置情報を測定するために、二位相干渉顕微鏡観察システム１００が使用される。顕微鏡観察システム１００は、光学素子１３０および１４０と、干渉システム（多方向ビームスプリッターとも呼ぶ）１５０と、光学素子１６０および１７０と、ディテクター１６５および１７５とを含む。光学素子１３０および１４０は、サンプルＳからビームスプリッター１５０までそれぞれ光路１３２および１４２を画定する任意のタイプの光学素子でありうる。たとえば、光学素子１３０および１４０のそれぞれは、一連のミラー、レンズ、または対物レンズを含みうる。光学素子１３０および１４０は、たとえば、サンプルの点光源から放出される光エネルギーを平行化するレンズまたは対物レンズを含みうる。図１には２つの光学素子１３０および１４０中に至る２つの反対方向を向いて対向する経路１３２および１４２が示されているが、以下で論述されるいくつかの実装形態では、光学素子１４０のような単一の光学素子は、２つの対向しない経路１３２および１４２を含みうる。第１の方向での（すなわち光路１３２に沿った）光源の放出（すなわち、サンプルＳから放出される光エネルギー）と、第２の方向での（すなわち、光路１４２に沿った）光源の放出との干渉が、第１の方向に沿って進む放出と第２の方向に沿って進む放出との光路長の差によって少なくとも部分的に引き起こされる。
【００４０】
光学素子１３０および／または１４０は、サンプルＳが１種以上の活性化源を受容できるようにする追加の素子および／特徴部を含みうる。たとえば、いくつかの実装形態では、光源（たとえば、図１には示されていないが、図２８に示されている）からの光エネルギーを用いることによりサンプルＳの蛍光応答を活性化させて励起光子を生成することが可能である。そのような実装形態では、たとえば、光学素子１３０および／または１４０は、アパーチャーを含みうる。そしてディテクター１６５および／または１７５に向かって逆行する励起レーザーからの迷光放射を最小限に抑えつつ、アパーチャーを介して光源からの光エネルギーをサンプルＳに照射することが可能である。また、主に蛍光がディテクターに達するように、ディテクター１６５および／または１７５に至るビーム経路中にレーザーラインフィルターを存在させることも可能である。第１のレーザー光源は、たとえば、活性化ビームをサンプルＳに照射することが可能であり、かつ第２のレーザー光源は、たとえば、励起ビームをサンプルＳに照射することが可能である。他の実装形態では、レーザー以外の光源、たとえば、発光ダイオード、白熱ランプなどを活性化用および／または励起用の光源として使用することが可能である。以上で参照により援用されたBetzig参考文献にさらに詳細に記載されているように、活性化ビームは、サンプル中の個別に解像可能な光活性標識の十分に散在したサブセットを活性化させるように構成され、かつ励起ビームは、サンプルＳの活性化部分を励起して蛍光に基づく光子を放出させるように構成される。
【００４１】
他の選択肢の実装形態では、１種以上の化学物質を用いてサンプルの蛍光応答を活性化させることが可能である。そのような他の選択肢の実装形態では、サンプルを第１の化学物質に暴露してサンプルの分子の蛍光性散在サブセットを活性化させることが可能であり、続いて、光脱色を用いない場合、第２の化学物質に暴露してサンプルの蛍光を失活させることが可能である。
【００４２】
ビームスプリッター１５０は、任意のタイプの適切な光学素子でありうる。ただし、この光学素子は、光路１３２および１４２に沿って光エネルギーを受け取って組み合わせて、かつ組み合わされ混合された光エネルギーを２つ以上の光路１５２および１５４（それぞれ本明細書中では「レッグ」とも記す）に沿って光学素子１６０および１７０に伝送する。たとえば、ビームスプリッター１５０は、５０：５０ビームスプリッターでありうる。この場合、組み合わされた光エネルギーはスプリットされて、組み合わされた光エネルギーの実質的に５０パーセントは光路１５２で伝送され、かつ組み合わされた光エネルギーの実質的に５０パーセントは光路１５４で伝送される。光路１３２および１４２からの光エネルギーは、ビームスプリッター１５０により干渉され混合されるので、光路１５２に沿って得られる光エネルギーは、光路１３２および１４２からの光エネルギー間の相対位相差に基づく。同様に、光路１３２および１４２に沿った光エネルギーは、ビームスプリッター１５０中で干渉され混合されるので、光路１５４に沿って得られる光エネルギーは、光路１３２および１４２からの光エネルギー間の相対位相差に基づき、この相対位相差は、光路１５２に沿った光エネルギーに関連付けられる相対位相差とは異なる。この実装形態では、光路１５２に沿って得られる光エネルギーと光路１５４に沿って得られる光エネルギーとは、位相が約１８０度異なる。
【００４３】
別法として、ビームスプリッター１５０は、たとえば６６：３３または７０：３０など、任意の所望の比でビームを分割することができる。他の実装形態では、ビームスプリッター１５０は、複数のビームスプリッターの組合せであってよい。そのようなビームスプリッターは、たとえば、２つのガラスセグメントと２つのガラスセグメント間に配設された薄膜コーティングとのブロックから構成可能である。そのようなビームスプリッターは、３つ以上の出力、すなわち、１５２および１５４の２つよりも多くの出力を生成することが可能である。これにより、２つのビームの場合の０度および１８０度ではなく、３つ以上の干渉位相角（たとえば、０度、１２０度、および２４０度）で３つ以上の出力ビームを表現することが可能になる。さらに他の実装形態では、薄膜コーティングを有するビームスプリッターに加えてまたはその代わりに、回折グレーティングをビームスプリッターとして使用することが可能であり、かつそれによりビームを２つ以上のビームに分割することが可能である。また、グレーティングにより複数の入力ビームを受け取って、それらを混合して干渉させ、種々の出力ビームを生成することが可能である。いくつかの実装形態では、スイッチャブル散乱中心を有する標識（たとえば、活性散乱特性を有する光スイッチャブル標識）のように実質的に同一の波長で発光する点光源を有するサンプルと組み合わせて、回折グレーティングを使用することが可能である。実質的に同一の波長で発光する点光源を有するそのようなサンプルでは、回折グレーティングにより、入力ビームの波長の関数である比較的狭い偏向角で入力ビームを有利に偏向させることが可能である。
【００４４】
他の実装形態では、ビームスプリッターのうちの１つ以上は、回折グレーティングまたは薄膜コーティングの代わりにストライプ状ミラー部分を含みうる。一実装形態では、ストライプ状ミラー部分は、回折次数により画像平面内に再集光されないように、十分に小さいストライプ周期を有する。波長λ、焦点距離ｆ、および画像サイズｄの場合、これは、ｆλ／ｄ未満の周期を意味する。正方形もしくは六角形のポルカドットのような他のパターンを使用することが可能である。しかしながら、画像中のゴースト発生を防止するために、同一条件のポルカドット周期（すなわちｆλ／ｄ未満）を保持しなければならない。
【００４５】
光学素子１３０および１４０のときと同様に、光学素子１６０および１７０は、ビームスプリッター１５０からそれぞれディテクター１６５および１７５までそれぞれ光路１５２および１５４を画定する任意のタイプの光学素子でありうる。たとえば、光学素子１６０および１７０は、光エネルギーがそれぞれディテクター１６５および１７５に集束するように、それぞれ光路１５２および１５４からの光エネルギーを非平行にするレンズでありうる。いくつかの実装形態では、光学素子１３０、１４０、１６０、および１７０、ならびに／またはビームスプリッター１５０のような光学素子のうちの１つ以上は、補償光学素子を含みうる。
【００４６】
使用時、サンプルＳ中の個別画像化標識の統計学的散在サブセットを活性化した後、測定が行われる。以上で述べたように、サンプルＳ中の標識の統計学的散在サブセットは、適切な技術により、たとえば、光活性化または化学的活性化により、活性化可能である。活性化の後、レーザーのような励起光源によりサンプルＳを励起することが可能であり、結果として、サンプルＳから少なくとも光路１３２および１４２に沿って光子が放出されて光学素子１３０および１４０を介してビームスプリッター１５０に達する。光路１３２および１４２からの光エネルギーは、ビームスプリッター１５０で組み合わされ、そして経路１５２および１５４に沿って伝送されてそれぞれ光学素子１６０および１７０を介してディテクター１６５および１７５に達する。ビーム１３２とビーム１４２の光路長の差による位相差により、ビームスプリッター１５０で干渉が生じ、ディテクター１６５および１７５での検出信号の強度を変調する。以下にさらに詳細に説明するように、この変調された強度を使用して、ｚ座標での位置を決定することができる。それに加えて、ディテクター１６５および１７５における検出信号は、ｘ、ｙ方向の位置情報をも提供する。検出信号を収集した後、それらの標識からさらなる光信号を検出できなくなるように、サンプルＳ中の標識の活性化散在サブセットを反復励起により脱色することが可能であり、次に、追加の測定に供すべく、標識のさらなる散在サブセットを活性化し励起することが可能であり、そしてプロセスは反復される。
【００４７】
図２は、二位相干渉顕微鏡観察システムおよび単一活性発光体を有するサンプルのシステムブロック図を示している。図２に示されるように、単一量子発光体Ｓは、ｚ座標に沿って中心位置２２０から距離δの位置に配置される。単一量子発光体Ｓは、たとえば、蛍光分子、量子ドット、またはサブ波長散乱中心でありうる。放射光子は、量子発光体Ｓから上向きにレンズ２３０中にも下向きにレンズ２４０中にも逃散可能であり、これらのレンズでは、それぞれ、２つの平行ビーム２３２および２４２が形成される。平行ビーム２３２および２４２は、それぞれ、ミラー２３４および２４４により反射されて、ビームスプリッター２５０で受光される。
【００４８】
２つのビーム経路は、次のように画定される。すなわち、量子発光体Ｓからミラー２３４までおよびミラー２３４からビームスプリッター２５０までの第１のビーム経路（トップ経路とも呼ばれる）、ならびに量子発光体Ｓからミラー２４４までおよびミラー２４４からビームスプリッター２５０までの第２のビーム経路（ボトム経路とも呼ばれる）。ミラー２３４および２４４ならびにビームスプリッター２５０は、ビーム経路の長さがほぼ波長レベル内まで一致するように、すなわち、（Ｌ１＋Ｌ２）ｔｏｐ＝（Ｌ１＋Ｌ２）ｂｏｔｔｏｍになるように、量子発光体Ｓに対して定置される。ただし、ｚ座標に沿った発光体の位置変位δおよびトップビーム経路での９０度の位相シフトは除く。式中、Ｌ１は、中心位置２２０とミラー２３４または２４４との間の経路長であり、かつＬ２は、ミラー２３４または２４４とビームスプリッター２５０との間の経路長である。
【００４９】
この場合、トップビーム経路中の光ビームの電界は、Ｅ１＝Ａ×ｅｘｐ（−ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２＋ｉπ／２）、式中、ｋ＝２π／λ、となる。ボトムビーム経路中の光ビームの電界は、Ｅ２＝Ａ×ｅｘｐ（ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２）となる。
【００５０】
ビームスプリッター２５０で受け取られると、光ビームは分割され、組み合わされて、それぞれレンズ２６０および２７０を通して２つのディテクター２６５および２７５に伝送される。各ディテクター２６５および２７０に向かって進む光ビームの１つの光源からの電界は、Ｅ１２＝１／２０．５×（Ｅ１±Ｅ２）＝１／２０．５×（Ａ×ｅｘｐ（−ｉｋδ＋ｉｋ−Ｌ１＋ｉｋＬ２＋ｉπ／２）±Ａ×ｅｘｐ（ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２））となる。
【００５１】
この実装形態では、ディテクター２６５および２７５は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）ディテクターまたは（単一蛍光分子に対する感度向上のために）電子増倍電荷結合ディテクター（ＥＭＣＣＤ）である。図３に示されるように、ディテクター２６５で検出される放射光の強度３６５およびディテクター２７５で検出される放射光の強度３７５は、位相４πδ／λを有して正弦パターンで変化する。より具体的には、ディテクター２６５で検出される放射光の強度３６５は、Ｉ１＝１／２×（Ｅ１＋Ｅ２）２＝Ａ２×（１＋ｓｉｎ（２ｋδ））である。ディテクター２７５で検出される放射光の強度２７５は、Ｉ２＝１／２×（Ｅ１−Ｅ２）２＝Ａ２×（１＋ｓｉｎ（２ｋδ＋π））である。これら２つの式から分かるように、位置変位δが光源位相２ｋδをもたらし、干渉が干渉位相πをもたらす。次いで、２つの強度式を組み合わせることによって、ｚ方向変位δを計算することができる。すなわち、（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２）＝ｓｉｎ（４πδ／λ）またはδ＝λ ａｒｃｓｉｎ（（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２））／４πである。
【００５２】
この計算は、図４に示されるような顕微鏡観察システムに一般化することができる。より詳細には、図４は、二位相干渉顕微鏡観察システムおよび延在サンプルのシステムブロック図を示している。図４に示されるように、顕微鏡観察システムは、画像平面がディテクター４６５および４７５に画定されるように、顕微鏡対物レンズ４３０および４４０ならびにレンズ４６０および４７０を含む。サンプルＳの任意の点光源は、ディテクター４６５および４７５に画定される各画像平面上に分解能限界のスポットを形成するであろう。
【００５３】
次に、空間的に一体化されたスポットの強度を用いて、以上に記載の強度式によりサンプルＳの点光源のｚ変位（すなわちｚ座標位置）を計算することが可能である。ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、または他の大面積ディテクターを用いることにより、複数の画像スポットを同時に検出することが可能であり、かつサンプル３１０の各関連部分のｚ変位δを実質的に同時に確定することが可能である。検出される光信号の位相を１ラジアンの何分の一まで決定することが可能であるので、波長の何分の一よりも良好なレベル（たとえば＜２０％）で位置情報を決定することが可能である。たとえば、λ＝６００ｎｍの波長では、δ＝５０ｎｍに対応する１ラジアン未満まで位置情報を決定することが可能である。そのような干渉システムは、光源発光体のｘ，ｙ位置もまたナノメートルスケール分解能で測定できるように構成可能である。
【００５４】
サンプルＳの厚さは、一意的なｚ座標位置を測定しうる範囲に影響を及ぼす可能性がある。たとえば、図２または４に示される二位相の実装形態では、サンプル２１０の厚さはλ／４未満であり、その場合、一意的なｚ座標位置を測定することが可能である。こうした実装形態でのｚ変位δの感度は、一様でない。言い換えれば、図３および５に示されるように、強度が正弦波の最小または最大の近傍で決定されるような位相の場合、勾配はゼロに近づくので、感度はゼロに近づく。しかしながら、強度が正弦波の最小または最大から離れて決定されるような位相の場合、こうした実装形態での変位δの感度は、測定可能でありゼロではない。
【００５５】
図６は、ビーム位相の表現を有する二位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示す。この二位相干渉顕微鏡システムでは、０またはπの干渉位相がビームに与えられる。ビーム４３２は、サンプルの変位により、ビーム４４２の位相とは異なる位相を有し、出力ビーム４５２は、位相が異なる成分４５２’と４５２’’を含む。ビーム成分４５２’および４５２’’は、図６では分離されて示されているが、これは例示を目的としたものであり、当然のことながら、ビーム成分は、互いに同時に存在して干渉する。ビーム成分４５２’はビーム４３２に由来し、かつビーム成分４５２’’はビーム４４２に由来する。同様に、出力ビーム４５４は、位相が異なる成分４５４’および４５４’’を含む。ビーム成分４５４’および４５４’’は、図６では分離されて示されているが、これは例示を目的としたものであり、当然のことながら、ビーム成分は、互いに同時に存在して干渉する。ビーム成分４５４’はビーム４３２に由来し、かつビーム成分４５４’’はビーム４４２に由来する。この実装形態では、ビーム成分４５２’とビーム成分４５２’’の位相差（光源位相２ｋδと干渉位相０の両方を含む）が、ディテクターＣＣＤφ１で検出される強度Ｉ１を決定し、ビーム成分４５４’とビーム成分４５４’’の位相差（光源位相２ｋδおよび干渉位相πの両方を含む）が、ディテクターＣＣＤφ２で検出される強度Ｉ２を決定する。
【００５６】
図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、図６の各ディテクターで検出される所与の出力ビームの成分のビーム強度の位相を表すグラフを示している。図６の出力ビーム４５２および４５４は、入力ビーム４３２および４４２の成分を含む。図７Ａに示されるように、４５２’および４５２’’は、出力ビーム４５２の成分であり、位相差４８０（光源位相２ｋδと干渉位相０の組合せ）だけ位相が離されている。図７Ｂに示されるように、４５４’および４５４’’は、出力ビーム４５４の成分であり、位相差４９０（光源位相２ｋδと干渉位相πの組合せ）だけ位相が離されている。これらの位相差の差は、対象物の位置に応じて変化する。図７Ａに示されるビームの二乗和は、図７Ｃに示される強度Ｉ１を有するビームを生成し、同様に、図７Ｂに示されるビームの二乗和は、図７Ｄに示される強度Ｉ２を有するビームを生成する。これらの２つのビームＩ１とＩ２の相対強度が、光源位相を決定し、それにより垂直方向変位δを決定する。
【００５７】
他の選択肢の実装形態では、干渉顕微鏡観察システムは、二位相よりも多くの位相を有しうる。たとえば、図８は、三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。図９は、適切に干渉されて図８の３つのディテクターで検出された場合の点光源からの放射光の強度のグラフを示している。
【００５８】
図１０および１１は、三方向ビームスプリッターの一実装形態を示す。この三位相干渉顕微鏡システムでは、０、２π／３、または４π／３の干渉位相がビームに与えられる。２つの発光ビーム１０１０および１０２０は、５０−５０ビームスプリッティング表面１０５０に入る。２つの得られた干渉ビームは、上側６６：３３ビームスプリッティング表面１０４０および下側ミラー表面１０７０に進行する。上側ビームのほとんど（６６％）は、出力経路１０３０に入り、３３％は、経路１０２８に進行して、ミラー表面１０７０から反射されたビーム１０２４と干渉する。この最終干渉は、５０：５０ビームスプリッティング表面１０５２で起こり、第２および第３の出力ビーム１０３２および１０３４を生じる。３つの出力間でバランスのとれた三方向干渉（すなわち、出力ビーム１０３０、１０３２、および１０３４に対して類似の振幅）を得るために、ビームスプリッターに対するミラー１０７０の位置を変化させてギャップ１０６０のサイズを変化させることにより、干渉ビーム１０２８および１０２４の干渉位相を調整することができる。ガラスプリズムの底面上での残留反射率を最小限に抑えるために、ギャップ１０６０に屈折率整合油を充填することができる。
【００５９】
図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。ビーム経路中の望ましくない干渉を低減するために、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示される各ストライプ状ミラーは、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示される他のストライプ状ミラーに対して回転されている。
【００６０】
図１０および１１は、三方向ビームスプリッターの実装形態を介して対象物および画像平面に関連付けられた波面の伝搬をさらに示している。波面１０１２および１０２２を有する発光ビーム１０１０および１０２０は、ビームスプリッティング表面１０５０に入る。波面１０１２および１０２２は、サンプルの対象物平面に関連付けられ、かつビームスプリッティング表面１０５０で互いに干渉される。得られた波面は、三方向ビームスプリッターを通って伝搬する時、ビームスプリッティング表面１０４０および１０５２で互いに干渉する。ビームスプリッティング表面１０４０、１０５０、および１０５２は、ビームスプリッティング表面１０４０、１０５０、および１０５２での干渉時に波面の歪みおよび／または広がりに適合するのに十分な表面積を有する。出力ビーム１０３０、１０３２、および１０３４は、１０３６、１０３８、および１０３９の相対位相シフトでビーム１０１０と１０２０を組み合わせた状態で三方向ビームスプリッターから送出され、位相シフト１０３６は、２ｋδ（光源位相）＋０（干渉位相）であり、位相シフト１０３８は、２ｋδ（光源位相）＋２π／３（干渉位相）であり、位相シフト１０３９は、２ｋδ（光源位相）＋４π／３（干渉位相）である。これにより異なる強度のビーム１０３０、１０３２、および１０３が得られ、これらは、波面１０１２および１０２２のインタクトな干渉形であり、ディテクターの画像平面に伝搬する。
【００６１】
図１２は、四位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。図１３は、図１２の４つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。図８〜１２は、三位相もしくは四位相の干渉顕微鏡観察システムを有する実装形態を示しているが、四位相よりも多くの位相を有するシステム、たとえば、五位相干渉顕微鏡観察システム、六位相干渉顕微鏡観察システムなども可能である。
【００６２】
二位相干渉顕微鏡観察システムでは、たとえば、図２に示される５０：５０ビームスプリッター２５０のようなビームスプリッターを使用することが可能であるが、二位相よりも多くの位相を有する顕微鏡観察システム用のビームスプリッター（たとえば、図８に示されるもの）を多様な方法で具現化することが可能である。たとえば、図８に示されるように、ビームスプリッターは、複数の素子、すなわち、２つの５０：５０ビームスプリッター、６６：３３ビームスプリッター、およびミラーを含みうる。こうしたビームスプリッター素子は、たとえば、光学ベンチ上に手動で定置することが可能である。他の選択肢として、こうしたビームスプリッター素子を作製して１対の光学平面間に配設することが可能であり、そのようなビームスプリッター素子の位置を、たとえば、圧電トランスデューサーによる調整することが可能である。そのような調整を行えば、３本のレッグの位相シフトを２π／３だけ離したり、またはＮ本のレッグの実装形態の場合には２π／Ｎだけ離したりすることを保証できるようになり、しかも、スプリッティング平面の平行性を確保することも保証できるようになる。三方向ビームスプリッターの代替の実装形態が図８Ａに示される。
【００６３】
図８Ｂは、八方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。図８Ｂに示されるように、ビームスプリッターは、複数のビームスプリッター素子を含む。それらはいずれも、破線で表されている。図８Ｂは、８本の出力ビームを生成する１６個のビームスプリッター素子を有するビームスプリッターを明示的に示しているが、当然のことながら、Ｎ本の出力ビームを生成するより多数もしくはより少数のビームスプリッター素子の場合にもこの基本構造に従うことが可能である。こうしたビームスプリッター素子は、０〜１００％の範囲内の反射率を有しうる。透過率は公称でありうる。ビームスプリッター素子の表面が実質的に互いに平行である場合、ビームの実質的に全部（またはビームの一部）（直径Ｄを有する）は、元の入力ビームＡおよびＢの反射ビーム部分またはそれらからスプリットされた他のビーム部分にコヒーレントに干渉可能である。ビームスプリッター素子の表面は、実質的に平行でありうる。たとえば、それぞれ、＜λ／Ｄの角度の範囲内である。また、ビームスプリッター素子は、入力ビームのコヒーレンス長λ２／（ｎΔλ）の範囲内で等しく離間される。ただし、λは波長であり、Δλは波長の範囲であり、かつｎは媒体の屈折率である。この隔間により、干渉は、対象のビーム波長範囲ｄｌにわたり実質的にコヒーレントであることが保証される。入力ビームＡおよびＢは、Ａ−Ｂがビームスプリッターの平面に対して法線方向のベクトルになるように方向ベクトルを有してビームスプリッターに入る。両入力ビームは、第１のビームスプリッター素子上の同一点に向けられる。ビームスプリッターが平行平面構造であれば、ある範囲内のビーム角で自己干渉が可能になり、このビーム角範囲は、たとえば、いわゆるＣＣＤディテクター（図８Ｂには示されていない）の画像平面上に集束する前のビームの平行部分の画像に関連付けられる角度範囲に対応しうる。いくつかの実装形態では、１本だけの入力ビーム（たとえば入力ビームＡまたは入力ビームＢ）が適用される場合、Ｎ本の出力ビーム（図８Ｂはｎ＝８の場合を示す）に実質的に等しくスプリットされることが保証されるように、各ビームスプリッター素子の反射率およびビームスプリッター素子間の微細間隔（コヒーレンス長未満であるが干渉角を制御するのに十分である）を変化させることが可能である。さらには、いくつかの実装形態では、入力ビームＡと入力ビームＢとの間の干渉角を３６０度／Ｎの異なる間隔に設定することが可能である。したがって、Ｎ＝８である図８Ｂに示される例では、４５度、９０度、１３５度の間隔に設定することが可能である。
【００６４】
以上に述べたように、いくつかの実装形態では、１つ以上のビームスプリッターは、薄膜コーティングを有するビームスプリッターの代わりに回折グレーティングに基づくものでありうる。たとえば、図１４は、回折グレーティングを有する四位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。この実装形態では、ビームスプリッター１４５０は、回折グレーティング１４５１〜１４５４と、ミラー１４６２および１４６４と、位相シフター１４７２および１４７４と、を含む。回折グレーティング１４５１および１４５２は、それぞれ、ミラー１４３４および１４４４から光エネルギーを受け取る。回折グレーティング１４５１は、受け取った光エネルギーを分割し、分割部分をミラー１４６２および位相シフター１４７２に伝送する。回折グレーティング１４５２は、受け取った光エネルギーを分割し、分割部分をミラー１４６４および位相シフター１４７２に伝送する。回折グレーティング１４５３は、ミラー１４６２および位相シフター１４７４から光エネルギーを受け取って混合し、混合された光エネルギーを分割し、各分割部分を異なるディテクターに伝送する。同様に、回折グレーティング１４５４は、ミラー１４６４および位相シフター１４７２から光エネルギーを受け取って混合し、混合された光エネルギーを分割し、各分割部分を異なるディテクターに伝送する。図１５は、回折グレーティングを有する六位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【００６５】
いくつかの実装形態では、スイッチャブル光源から放出された光エネルギーへの特定の光エネルギーの寄与を低減または防止するために、分光フィルター（たとえば、帯域幅フィルター、ローパスフィルター、またはハイパスフィルター）を光路中に配設することが可能である。たとえば、光路内の迷光およびノイズならびにディテクターに向かう伝搬を低減するために、光活性化時および／または光励起時に使用される光エネルギーを光路から除去することが可能である。
【００６６】
いくつかの実装形態では、光路に沿った１つ以上のサンプル、対物レンズ、ミラー、光学素子、ビームスプリッター、レンズ、分光フィルター、および他の要素を、圧電アクチュエーターなどの多軸ポジショナーに個別に結合させることが可能である。そのような多軸ポジショナーを用いれば、自動もしくは非自動の校正および定置が可能になる。このほかに、そのような多軸ポジショナーを用いれば、定置および校正に関してマニュアル法よりも精度および確度を改良することが可能である。
【００６７】
干渉計システムの構成時ならびにその定置およびアライメントのためのガイドとして、２つの入力ビーム経路中に組み込まれたシャッターを有することが有用なこともある。これにより、各経路からの画像を独立して観測し、各経路が最適に焦点調整されていることを確認することが可能である。さらには、２つの部分の画像を観測できるので、両ビームに対してシャッターを開いた時に最適な干渉で重畳されるように、一方の画像を他方の画像に対して移動させることが可能である。
【００６８】
二位相よりも多い位相を有する他の選択肢の実装形態では、感度は位相不変でありうる。それに加えて、一意的な動作範囲をλ／２まで拡張することが可能である。変位が大きくなると、λ／２を法とする位置あいまい性を生じるであろう。これは、たとえば、空間領域および時間領域の両方でまたはサンプルのセクション化で選択的照射（励起または活性化）を行うなどの追加の技術を用いて、除去可能である。三位相または四位相干渉計測を行うそのような実装形態では、たとえば、サンプルの測定部分の位置は、以下の強度により決定される。すなわち、Ｉｉｊ＝Ｇｊ×（ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２＋２×βｊ×ＡＵｉ×ＡＬｉ×ｃｏｓ（（φｉ＋φｊ）＋Ｏｆｓｊ）であり、式中、ｊ＝０、１、２、・・・は、多位相干渉計のレッグを表し、Ｉｊ＝点光源のｊ番目のレッグの強度（オフセット補正なし）であり、ｊ＝ｊ番目のレッグの干渉補正因子であり、Ｇｊ＝ｊ番目のレッグのゲインであり、Ｏｆｓｊ＝ｊ番目のレッグのオフセットであり、ＡＵｉ＝ｉ番目の点光源の上側対物レンズの振幅であり、ＡＬｉ＝ｉ番目の点光源の下側対物レンズの振幅であり、φｊ＝ｊ番目のレッグの位相シフト（これは干渉位相である）であり、φｉ＝光路長の差による点光源（すなわち蛍光分子）の位相である。
【００６９】
暗校正（ＡＵｉ＝ＡＬｉ＝０）により、ｊ番目のディテクターからの暗信号を決定することができる。すなわち、Ｉｏｊ＝Ｇｊ×Ｏｆｓｊ、Ｉｉｊ＝Ｇｊ×（ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２＋２×βｊ×ＡＵｉ×ＡＬｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ）＋Ｏｆｓｊ）である。全体の振幅は、ＡＴｉ２＝ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２である。再スケール調整された干渉部分は、Ｘｉ＝２×ＡＵｉ×ＡＬｉ／ＡＴｉ２である。したがって、これらの変数を用いれば、強度は以下のようになる。Ｉｉｊ＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×ＡＴｉ２（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
【００７０】
ｚ方向に沿って基準光源をδだけ移動させる校正を用いて、残りの装置パラメーターＧｊ、βｊ、およびφｊを決定することができる。これにより、位相φｆ（ｚ）が約４×π／（ｎλ）δ（ｚ）だけ回転されている三位相の場合、図７と同様に各レッグにおいて振動する強度信号が得られる。ここで、ｎは、シフト経路長を有する媒体（たとえば液浸油）の屈折率である。
【００７１】
そのような一群の校正データへのあてはめを行えば、参照基準で発光基準の干渉部分Ｘｆおよびその強度ＡＴｉ２＝Ｉｆを用いて各レッグｊに対して以下の式が決定され、装置パラメーターＧｊ、βｊ、およびφｊがここで決定される。そのような校正は、位相シフト値が正確に１２０度（３本のレッグに関して）または２π／Ｎ（Ｎ本のレッグに関して）でない場合に有用となることがある。
Ｉｆｊ（ｚ）＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×Ｉｆ（１＋βｊ×Ｘｆ×ｃｏｓ（φｉ（ｚ）＋φｊ））
Ｇｊ、βｊは、基準単位、すなわちＩｆ＝１およびＸｆ＝１およびαｉ＝ＡＴｉ２／Ｉｆに規格化することによって定義することができる。
Ｉｉｊ＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×ＡＴｉ２（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
Ｄｉｊ＝（Ｉｉｊ−Ｉｏｊ）／（Ｇｊ×Ｉｆ） 再スケール調整された強度データ
Ｄｉｊ＝αｉ×（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
【００７２】
図２６は、自動校正法を用いる多位相干渉顕微鏡システム用の校正プロセス２６００のフロー図を示している。２６１０では、サブ回折基準などの発光体をｚ方向内の種々の位置で画像化して画像フレームシーケンスを生成する。２６１０でのこのプロセスは、サブプロセス２６１１および２６１２を含み、サブプロセスをｚ方向内の種々の位置に対して反復して画像フレームシーケンスを生成する。２６１１では、干渉顕微鏡システム中の各ディテクターで発光体の画像を取り込む。各ディテクターで取り込まれた画像フレームは、他のディテクターで取り込まれた画像フレーム中の情報に対して位相シフトされた位相関連特性（たとえば、ｊ番目のディテクターのφｊβｊ）を含む。２６１２で発光体のｚ位置をインクリメントし、２６１１をＮ回反復して画像フレームシーケンスを生成する。画像フレームシーケンス中の各画像フレームは、発光体の発光分布に関連するｘ，ｙ平面内の光エネルギー強度に基づく。
【００７３】
２６２１では、発光体の発光分布を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内の発光体発光分布を位置特定する。たとえば、特定の発光体は、ガウス分布に正確にあてはめることが可能な発光分布を有する。そのようなガウス分布により、たとえば、発光体の画像の点広がり関数の尤度を表すことが可能である。２６２２では、画像フレーム中に組み込まれた基準を用いてドリフトに関して画像フレームを補正する。次に、２６２３でドリフト補正フレームを変換して、ｘ，ｙ平面内の画像フレーム中に基準をアライメントした変換フレームを生成する。
【００７４】
２６２４では、ｚ方向における各位置に対して各イメージディテクターで取り込まれた画像フレームを和分して和分画像を生成する。和分画像は、各ディテクターにより取り込まれた位相シフト画像フレームの合成体である。２６２５では、和分画像を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内の発光体の中心を決定する。
【００７５】
２６２６で変換フレームをガウス分布のような所定の分布にあてはめ、そして２６２５で決定されたｘ，ｙ平面内の発光体の中心で各フレーム中の発光体発光分布の振幅を測定する。発光体の中心は、たとえば、発光体の位置の尤度を表すガウス分布（たとえば、三次元分布）の図心に基づきうる。２６２７では、発光体発光分布の振幅を２６２４で決定された和に規格化する。各画像に対して２６２７で決定された規格化振幅および関連ｚ位置を２６２８で記録する。たとえば、各フレームに対する規格化振幅および関連ｚ位置をルックアップテーブル内に記憶するかまたは上述の式によりパラメーター化してφｊおよびβｊを決定することが可能である。
【００７６】
以下の式は、干渉顕微鏡観察システムにより収集された強度データから光源のｚ変位δ（すなわち、サンプルの相対ｚ座標位置）を決定しうることを説明するものである。
【００７７】
校正が終了した後、データをスケール調整することが可能であり、その場合、干渉計の各出力ビームに対する値βｊおよびφｊもわかる。ｊ個の式：Ｄｉｊ＝αｉ×（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ（ｚ）＋φｊ））を用いて軸方向に沿った発光体の位置を決定することが可能である。したがって、ｉ番目の分子の強度に関する３つ以上のデータ値Ｄｉ０、Ｄｉ１、Ｄｉ２、…から、３つの未知の値：αｉ、Ｘｉ、および（最も興味深い）φｉ（ｚ）を決定するための３つ以上の式が得られる。３つの位相だけが存在する場合、３つの式からこれらの３つの未知量の一意解が得られるであろう。この値、特にφｉの値は、たとえば、ニュートン法により解くことが可能である。
【００７８】
３つの位相よりも多くの位相が存在する場合、４つ以上の式から３つの未知の値を決定することが可能であり、連立方程式は制約過剰である。その場合、未知量の最良値は、χ２最小化法を用いて決定可能である。これは、次式の誤差を最小化にすることによる。χｉ＝Σｊ［Ｄｉｊ−αｉ（１＋βｊｃｏｓ（φｉ＋φｊ））］２
【００７９】
十分にバランスの取れた干渉計システム（カメラ間の位相シフト増分、均等化ゲイン、および均等化干渉効率を意味する）の近似として、次式により与えられるφｉの最良値を得ることができる。ｔａｎ（φｉ）≒−ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ）
【００８０】
ｉ番目の発光体の位相φｉがわかった後、ｚ軸に沿った垂直方向位置（ｚ方向変位）δｉを次式によって第一近似で推定することができる。ｎがサンプル環境の屈折率であることに留意されたい。δｉ≒λ×φｉ／（４πｎ）＝λ／（４πｎ）×ａｔａｎ（ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ））
【００８１】
変位δについて解くこの最後の式は、強度データから決定される位相シフトを記述する。言い換えれば、この最後の式は、干渉顕微鏡システムの各レッグに対するディテクターで検出された強度データに基づいてどのように変位δを計算するかを示している。たとえば、三位相干渉顕微鏡システムでは、（φｊ）≒−２π／３、０、２π／３である。四位相干渉顕微鏡では、（φｊ）≒０、π／２、π、３π／２である。
【００８２】
変位δを計算するための以上の式は、種々の仮定に基づいていることに留意されたい。他の選択肢の実装形態では、他の仮定を用いて、変位δを計算するための１つ以上の代替手段を得ることが可能である。たとえば、高次の補正を実数部から計算することが可能であり、これにより、各干渉計レッグのＮ位相が等間隔で離間されるかまたは干渉計レッグの感度が等しいという近似が取り除かれる。他の選択肢の実装形態は、バランスがとれていない強度感度および位相混合角を校正および補正するための手段を提供するさらなる精密化を含みうる。
【００８３】
要約すると、Ｎ位相干渉計のＮ個のスポット強度は、垂直方向位置変位δに変換可能なデータＤｊになる。
【００８４】
φｉは周期解であるので、全２πに対して、一意的に決定可能な範囲は、λ／２ｎにわたる。これより厚いサンプルでは、δを決定するうえで、整数Ｎに対して±Ｎλ／２ｎだけあいまい性が存在する。測定される点広がり関数および干渉効率のような他の属性を用いて、可能性が最も高いＮを見いだしたりまたは多値解の最良値を選択したりすることが可能である。事実上、デフォーカスの範囲は、発光体が位置する場所でλ／２ｎ以内で推定するための代替的でそれほど精密ではないが適切な方法である。これを干渉計測により推定された位置と組み合わせることにより、発光体の一意的な垂直方向位置を得ることが可能である。垂直方向位置を推定する際のさらなる検討対象の一つは、ほぼＲａｙｌｅｉｇｈ長の距離ｚＲにわたり焦点でπだけ余分に前進させる余分項であるＧｏｕｙ位相を考慮することである。この場合、δは、次式を解くことにより与えられる。φｉ≒４πδ／（ｎλ）＋ａｔａｎ（δ／ｚＲ）
【００８５】
図２７は、多位相干渉顕微鏡システム内の光活性サンプルの三次元位置情報を取得するためのプロセスのフロー図を示している。工程２７１０では、サブ回折基準などの種々のスイッチャブル光源を画像化させて画像フレームシーケンスを生成する。工程２７１０は、サブ工程２７１１および２７１２を含み、これらのサブ工程を繰返し行って、蛍光標識の様々な散在サブセットを活性化および励起し、画像フレームシーケンスを生成する。工程２７１１で、光源（図２８に図示および説明されるものなど）からの光エネルギーを使用してスイッチャブル光源を活性化および励起する。工程２７１２では、干渉顕微鏡システム中の各ディテクターで画像フレームを取り込んで、工程２７１１をＮ回反復して画像フレームシーケンスを生成する。各ディテクターで取り込まれた画像フレームは、他のディテクターで取り込まれた画像フレーム中の情報に対して位相シフトされた位相関連特性を含む。画像フレームは、スイッチャブル光源の発光分布に関連するｘ，ｙ平面内の光エネルギー強度に基づく。
【００８６】
工程２７２１では、スイッチャブル光源の発光分布を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の発光分布を位置特定する。たとえば、特定のスイッチャブル光源は、ガウス分布に正確にあてはめうる発光分布を有する。そのようなガウス分布は、たとえば、発光体の画像の点広がり関数を表すことが可能である。工程２７２２では、画像フレーム中に組み込まれた基準を用いてドリフトに関して画像フレームを補正する。次に、ドリフト補正フレームを工程２７２３で変換して、ｘ，ｙ平面内の画像フレームシーケンスの画像フレーム中に基準をアライメントした変換フレームを生成する。
【００８７】
工程２７２４では、ｚ平面内の各位置に対して各イメージディテクターで取り込まれた画像フレームを和分して和分画像を生成する。工程２７２４で、各画像ディテクターで取り込まれた変換された画像フレームが重ね合わされて、足し合わされる（すなわち、和の合計は、三位相システムに関しては、第１のディテクターでの画像＋第２のディテクターでの画像＋第３のディテクターでの画像であり、三位相において、そのような足し合わされた三つ組が多数存在しうる）。和分画像は、各ディテクターにより取り込まれた干渉画像フレームの合成体である。工程２７２５では、和分画像を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の中心を決定する。
【００８８】
変換フレームをガウス分布のような所定の分布にあてはめ、工程２７２５で決定されたｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の中心で、各フレーム中のスイッチャブル光源の発光分布の振幅を測定する（工程２７２６）。発光体の中心は、たとえば、発光体の位置の尤度を表すガウス分布の図心に基づきうる。工程２７２７で、スイッチャブル光源のディテクターそれぞれへの発光分布の振幅を、工程２７２４で決定された和に規格化する。工程２７２８で、工程２７２７で決定された規格化振幅を使用して、前の工程２６２８で記録された校正データと相関付けることにより、スイッチャブル光源のｚ座標を取得する。そのような校正データは、たとえば、ルックアップテーブルに記憶することができる。ｚ座標は、たとえば、［ＣＡ１（ｚ）−ＰＡ１］２＋［ＣＡ２（ｚ）−ＰＡ２］２＋［ＣＡ３（ｚ）−ＰＡ３］２＋・・・＋［ＣＡＮ（ｚ）−ＰＡＮ］２の最小χ２を求めることによって、規格化振幅に基づいて計算することができ、式中、Ｎは、システム中のディテクターの数であり、ＣＡｉ（ｚ）は、ｚ座標での特定のサンプル位置に対して校正時に決定されたディテクターｉにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅であり、ＰＡｉは、現在のＰＡＬＭ画像フレームから決定されたディテクターｉにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅である。
【００８９】
他の実装形態では、干渉顕微鏡観察システムは、第３の次元ｚによって異なる経路長差をさらに生成する発光ビームの異なる部分を使用しうる。そのような他の選択肢の実装形態について図１６〜２２に関連させて論述する。より詳細には、図１６は、２つの異なる潜在位置の単一量子発光体の概念図を示しており、図１７および１８は、単一の対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図の例を示しており、図１９〜２１は、図１８のアニュラーエキスパンダーの例を示しており、図２２は、図１７の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。これらの図について以下で論述する。
【００９０】
図１６は、２つの可能な位置の単一量子発光体の例を示している。そのような量子発光体は、たとえば、蛍光分子、量子ドット、またはサブ波長散乱中心でありうる。放射光子（波長λ）は、図１７に示される対物レンズから離れる下方向および図１７に示される対物レンズ中に入る上方向などの全方向に伝搬する。対物レンズ中に伝搬する放射光子のエネルギー部分は、ほぼ等しい強度の２つの平行ビーム、すなわち、「Ｂ」と記された内側円柱状ビームおよび「Ｃ」と記された外側環状ビーム標識化とみなしうる。内側ビーム部分Ｂおよび外側ビーム部分Ｃのサイズは、それらの強度が実質的に等しくなるように選択可能であり、そのような実質的に等しい強度は、ビームの非線形強度プロファイルに基づいて異なるビーム部分領域に対応する（たとえば、ビームエネルギーのピークは、ビームの縁に向かって減少する強度を有するビームの中心にある）。たとえば、「Ｂ」と記された内側ビーム部分は、全ビーム半径のほぼ１／３に等しい半径を有しうる。「Ｃ」と記された外側ビーム部分は、内側ビーム部分「Ｂ」の半径に対応する内半径と全ビームの半径に対応する外半径とを有しうる。
【００９１】
サンプルが、正確に焦点が合っている場合、これらのビーム部分は、一致して同位相である（図１６の左側に示されるように）。しかしながら、発光体の位置変位Δｚが存在する場合（図１６の右側に示されるように）、位相ビーム部分ＢおよびＣは、それぞれ、ΔｉｎｎｅｒおよびΔｏｕｔｅｒだけ変位する。ただし、ΔｉｎｎｅｒはΔｚに等しく、ΔｏｕｔｅｒはΔｚ×ｃｏｓ（θ）に等しい。位相ビーム部分ＢおよびＣのこの変位は、外側ビーム部分Ｃのほうが少ない光路変化を受けてｃｏｓ（θ）倍になるという事実に基づく。ただし、θは、発光体からの光線の初期円錐角である。したがって、２つのビーム間の位相シフト差が残り、これは次の値に等しい。δ＝２π（Δｉｎｎｅｒ−Δｏｕｔｅｒ）／λ＝Δｚ×（１−ｃｏｓ（θ））×２πｎ／（λ）
【００９２】
位相が３６０度にわたり増加し反復するｚ範囲は、λ／（ｎ（１−ｃｏｓ（θ））である。この単一対物レンズの実装形態に対するこのｚ範囲は、図１〜１１に関連して以上で述べた対向する対物レンズの実装形態のｚ範囲よりも長い。発光体の周りの光学環境の屈折率ｎは、位相シフトを再スケール調整する。単一対物レンズシステムの実装形態については、図１７〜２０に関連して以下でより詳細に論述する。
【００９３】
図１７は、単一の対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図の例を示している。図１８は、図１７に示されるビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステムのシステムブロック図の例を示している。図１７に示されるように、干渉顕微鏡観察システムは、対物レンズ１７３０と、ミラー１７４４と、ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０と、ミラー１７５６と、ビームスプリッター１７５４、１７５５、および１７５８と、レンズ１７６０、１７７０、および１７８０と、ディテクター１７６５、１７７５、および１７８５と、を含む。図１８に示されるように、ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０は、ビームスプリッター１７４１と、ミラー１７４２〜１７４７と、アニュラーエキスパンダー１７４８と、アニュラーリデューサー１７４９と、を含む。
【００９４】
アニュラーエキスパンダー１７４８は、所与の半径を有する光を受光して光の半径を拡大する任意のタイプのデバイスでありうる。たとえば、アニュラーエキスパンダー１７４８は、ミラー１７４２からの光の内側円柱状ビームを受光することが可能であり（断面形状は、図１７を参照して論述された内側ビーム「Ｂ」に類似している）、より大きい外径を有する環形状を有する光を生成することが可能である（たとえば、断面形状は、図１７を参照して論述された外側ビーム「Ｃ」に類似している）。同様に、アニュラーリデューサー１７４９は、所与の半径を有する光を受光して光の半径を縮小する任意のタイプのデバイスでありうる。たとえば、アニュラーリデューサー１７４９は、ミラー１７４２からの光の外側環状ビームを受光することが可能であり（断面形状は、図１７を参照して論述された外側ビーム「Ｃ」に類似している）、より小さい内径を有する内側円柱形状（またはより小さい環形状）を有する光を生成することが可能である（たとえば、断面形状は、図１７を参照して論述された内側ビーム「Ｂ」に類似している）。
【００９５】
図１９〜２１は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの例を示している。より詳細には、図１９は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示しており、図２０は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの端面図を示しており、そして図２１は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの６つのプリズム素子のうちの３つの斜視図を示している。図１９〜２１に示されるように、アニュラーエキスパンダー１７４８は、アニュラーエキスパンダー１７４８の中心線の近傍に離間して配置された６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆを有する。ただし、６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの一方の端は、６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの他方の端によりまとめて画定される環状多面表面のサイズとは異なるサイズを有する環状多面表面をまとめて画定する。図１９に示されるように、光は、より小さい環状多面表面を画定するプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの端に入り、そしてより大きい環状多面表面を画定するプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの端から出る。図２０は、より大きい環状多面表面から、より小さい環状多面表面に向かって、ページ中の方向に見たアニュラーエキスパンダー１７４８の端面図を示している。明示的に示されていないが、アニュラーリデューサー１７４９は、アニュラーエキスパンダー１７４８と同様に構成される。ただし、光は、より小さい環状多面表面を画定するプリズムの端に入り、そしてより大きい環状多面表面を画定するプリズムの端から出る。
【００９６】
次に、図１７および１８に戻って、システムを介して伝搬する光を参照しながら、三位相干渉顕微鏡観察システムについて説明する。図１７に示されるように、エネルギーは、サンプル（図１７中で「Ｓ」と記される）から放射され、そしてミラー１７４４によりビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０の方向に反射される。ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０の５０：５０ビームスプリッター１７４１（図１７に示される）は、光の一部をミラー１７４２に伝送し、光の残りの部分をミラー１７４３に伝送する。光を２つのビーム部分に分離するために、ミラー１７４２は、外側ビーム部分Ｃをミラー１７４５の方向に反射するとともに、内側ビーム部分のビームＢをミラー１７４４の方向に反射する。ミラー１７４５および１７４４は、それぞれ、外側ビーム部分Ｃおよび内側ビーム部分Ｂを、それぞれ、アニュラーエキスパンダー１７４８およびアニュラーリデューサー１７４９の方向に反射する。アニュラーエキスパンダー１７４８は、受光した光をミラー１７４６の方向に拡大し、このミラーは、拡大された光をビームスプリッター１７５４の方向に反射する（図１７に示される）。同様に、アニュラーリデューサー１７４９は、その受光した光の半径をミラー１７４７の方向に縮小し、このミラーは、縮小された光を５０：５０ビームスプリッター１７５４の方向に反射する。
【００９７】
５０：５０ビームスプリッター１７５４は、ミラー１７４６および１７４７から受光した光の半分を６６：３３ビームスプリッター１７５５の方向に反射し、光の残りの半分をミラー１７５６に伝送する。５０：５０ビームスプリッター１７５４も同様に、ミラー１７４３からの受光した光の半分をミラー１７５６の方向に反射し、光の残りの半分を６６：３３ビームスプリッター１７５５に伝送する。６６：３３ビームスプリッター１７５５は、受光したビームの３３％を５０：５０ビームスプリッター１７５８の方向に反射し、受光したビームの残りの６６％をレンズ１７６０の方向に伝送する。ミラー１７５６は、受光したビームを５０：５０ビームスプリッター１７５８の方向に反射するとともに余分の位相シフトを追加する。５０：５０ビームスプリッター１７５８は、ミラー１７５６から受光したビームの５０％をレンズ１７８０の方向に反射し、ミラー１７５６から受光したビームの５０％をレンズ１７７０の方向に伝送する。５０：５０ビームスプリッター１７５８も同様に、６６：３３ビームスプリッター１７５５から受光したビームの５０％をレンズ１７７０の方向に反射し、６６：３３ビームスプリッター１７５５から受光したビームの５０％をレンズ１７８０の方向に伝送する。
【００９８】
光路長に差が存在するように、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８、ミラー１７５６、ならびに６６：３３ビームスプリッター１７５５を配置しうることに留意されたい。より詳細には、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８ならびに６６：３３ビームスプリッター１７５５の間の光路距離ｘは、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８ならびにミラー１７５６の間の距離ｘ＋δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒよりも短くすることが可能である。たとえば、２つの距離間の光路差δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒを波長λの１／８になるように選択することが可能でありかつ波長λが５８０ｎｍであると仮定すると、２つの距離間の差δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒは、７２ｎｍに選択可能である。
【００９９】
レンズ１７６０に伝送されたビーム、レンズ１７７０に伝送されたビーム、およびレンズ１７８０に伝送されたビームは、それぞれ、実質的に等しい振幅を有する。レンズ１７６０、１７７０、および１７８０は、それぞれ、それぞれのビームをディテクター１７６５、１７７５、および１７８５に集束させる。３つのディテクター１７６５、１７７５および１７８５での発光画像の強度は、光源位相（すなわち、サンプルのｚ位置）の関数として変化する。なぜなら、３つのディテクター１７６５、１７７５、および１７８５間の相対強度は、約１２０度の位相シフトを有するからである。図２２は、図１７に示される３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。３つのディテクター１７６５、１７７５、および１７８５により検出される強度をモニタリングすることにより、内側ビーム部分Ｂおよび外側ビーム部分Ｃの間の初期オフセットの位相シフトは、図１〜１１に関連して先に記載したように推定可能である。
【０１００】
この光源位相シフトδを用いて発光体のｚ位置を計算することが可能である。Δｚ＝δλ／（ｎ（１−ｃｏｓ（θ））
【０１０１】
いくつかの実装形態では、校正技術を用いて、ディテクターのバランスがとれていない強度感度および位相混合角を補正することが可能である。図１７〜２２に示される実装形態は、約１２０度の位相シフトを有する３つのディテクターに対して記述したものであるが、異なる数のディテクターを有する他の実装形態が可能である。さらに他の実装形態では、画像化スポット形状を用いて、いかなる周期的あいまい性または位置あいまい性をも解消することが可能である。他の選択肢として、位置計算用の追加情報として画像化スポット形状を使用することが可能である。
【０１０２】
図２３〜２５は、アニュラーエキスパンダーの例を示している。より詳細には、図２３は、アニュラーエキスパンダーの端面図を示しており、図２４は、ラインＸＸ−ＸＸに沿った図２３のアニュラーエキスパンダーの断面図を示しており、図２５は、ラインＸＸＩ−ＸＸＩに沿った図２３のアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。図２３〜２５に示されるように、アニュラーエキスパンダー２３００は、６つのプリズム２３１０ａ〜２３１０ｆと、６つのミラー２３２０ａ〜２３２０ｆと、６つのミラー２３３０ａ〜２３３０ｆと、を有する。プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍に離間して配置される。ただし、６つのプリズムの一方の端は、６つのプリズムの他方の端によりまとめて画定される環状表面のサイズとは異なるサイズを有する環状表面をまとめて画定する。ミラー２３２０ａ〜２３２０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍にかつ６つのプリズム２３１０ａ〜２３１０ｆにより画定される内側中央部分内に配置される。ミラー２３３０ａ〜２３３０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍にかつ隣接プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆ間の間隙により画定される外側部分の近傍に配置される。
【０１０３】
図２４に示されるように、各プリズム２３１０は、入射面２３１０’および出射面２３１０’’を含む。入射面２３１０’は、出射面２３１０’’に平行であり、かつそれよりも小さい内半径および外半径を有する。各プリズム２３１０はまた、全内部反射（ＴＩＲ）の条件が満たされるように、入射面２３１０’および出射面２３１０’’に対して角度を付けた２つの側壁２３１０’’’および２３１０’’’を含む。したがって、光は、入射面２３１０’で各プリズム２３１０に入り、側壁２３１０’’’でＴＩＲによる反射および側壁２３１０’’’’でＴＩＲによる反射を受け、次に、出射面２３１０’’から出る。このようにすれば、アニュラーエキスパンダー２３００を出る時に入射光の半径を拡大することが可能になる。
【０１０４】
図２５に示されるように、ミラー２３２０ａ〜２３２０ｆは、それぞれ、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線に沿ってかつその近傍でミラー２３３０ａ〜２３３０ｆの方向に外向きに光を反射する。ミラー２３３０ａ〜２３３０ｆは、隣接プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆにより画定される間隙間に受光した光を反射する。たとえば、ミラー２３２０ａは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍で光の一部をミラー２３３０ａの方向に反射し、ミラー２３３０ａは、プリズム２３１０ａおよびプリズム２３１０ｂとの間に画定された間隙間にこの光を反射する。全体として、これにより光の中央部分を拡大して、増大されたスループットを提供することが可能になる。
【０１０５】
明示的に示されていないが、アニュラーリデューサーは、アニュラーエキスパンダー２３１０と同様に構成することが可能である。ただし、光は、より大きい環状表面を画定するプリズムの端に入り、より小さい環状表面を画定するプリズムの端から出る。図１９〜２０および２３〜２５に示される実装形態は、特定の屈折素子および／または反射素子を用いて示されているが、他の実装形態および配置、たとえば、回折素子またはそれらの任意の組合せを有する実装形態も可能である。
【０１０６】
一意の垂直位置の決定
上述したように、φ１は循環解であり、したがって一意に決定可能な範囲は、２πごとにλ／２ｎである。したがって、初めに、取り得るｚ方向位置δｉの組が上述したように決定され、装備に応じて上述の一般式によって与えられる。たとえば、２つの対物レンズを有するシステムに関して、取り得るｚ方向位置の組に関する一般式は、δｉ≒λ×φｉ／（４πｎ）＝λ／（４πｎ）×ａｔａｎ（ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ））である。図２８〜４０Ｂに関して以下に論じるように、上述したシステムおよび方法は、取り得る位置の組の中から第３の直交次元（ｚ次元）での光源の位置を決定するように修正することができる。
【０１０７】
図２８を参照すると、多位相干渉顕微鏡観察装置２８００が、サンプル２８０４に光学的に結合された光駆動システム２８０２と、干渉システム２８０６と、少なくとも２つのディテクター２８０８、２８１０、２８１２と、少なくとも２つのディテクター２８０８、２８１０、２８１２に接続された制御装置（たとえばプロセッサー）２８１４とを含む。少なくとも２つのディテクター２８０８、２８１０が示されているが、干渉システム２８０６の幾何形状によっては追加のディテクター（ディテクター２８１２など）を使用することもできる。
【０１０８】
本明細書の残りの部分を通じて、座標系を説明するときには以下の慣例に従う。２つの座標系または基準フレームを使用する。第１の座標系は、サンプル（または対象物）座標系であり、これは、サンプルの位置での静止座標系である。サンプル座標系は、サンプル位置での一組の直交次元、すなわち、第１のサンプル次元２８１６（ｘ次元とも呼び、紙面から出る方向に向かう）と、第２のサンプル次元２８１８（ｙサンプル次元とも呼ぶ）と、第３のサンプル次元２８２４（ｚ次元または垂直次元とも呼ぶ）とによって定義される。また、第１および第２のサンプル次元２８１６、２８１８を横方向次元とも呼び、第３のサンプル次元２８２４を軸方向次元とも呼ぶ。第２の座標系は、ビーム座標系であり、これは、ビームと共に移動する移動可能な座標系である。ビーム座標系は、ビーム伝搬方向と、ビーム伝搬方向に対して横方向または垂直である２つの方向とによって定義される。
【０１０９】
サンプル２８０４は、概して、第１の直交サンプル次元２８１６と第２の直交サンプル次元２８１８によって定義されるサンプル平面に沿って延在する。光駆動システム２８０２は、サンプル２８０４内の光源が複数の光路に光ビームを放出するように、具体的には２つの正反対の光路または光伝搬方向２８２０、２８２２に沿って第１および第２の光ビームを放出するように構成され、これらの光伝搬方向２８２０、２８２２は、第３の直交サンプル次元２８２４と概して平行であり、光学素子２８４０、２８４４の対物レンズ内部で対物レンズを通過した後に干渉システム２８０６に向けられる。光駆動システム２８０２は、サンプル２８０４に光学的に結合され、サンプル２８０４内のスイッチャブル光源のうち十分に統計的に散在するサブセットを活性化するように構成される。活性化は、光源が少なくとも回折限界距離だけ離隔されるように、制御された散在する活性標識密度を生成する任意の活動であってよい。したがって、この離隔距離にするには光源が少なすぎる場合には、活性化によって光源を追加することができ、あるいは、光源が多すぎて、回折限界距離未満で離隔されている場合には、活性化を減少することによって光源を減らすことができる。また、システム２８０２は、活性化されたスイッチャブル光源を励起することもでき、それにより光ビームは、活性化されたスイッチャブル光源から複数の光路に沿って、具体的には干渉システム２８０６に交差する光路２８２０、２８２２に沿って放出される。
【０１１０】
したがって、光駆動システム２８０２は、活性化ビームをサンプル２８０６に照射する第１のレーザーと、サンプル２８０４内の活性化されたスイッチャブル光源を励起ビームによって励起する第２のレーザーとを含むことができる。他の実装形態では、光駆動システム２８０２は、活性化源および／または励起源として動作する発光ダイオードおよび白熱灯の１つまたは複数を含むことができる。光駆動システム２８０２は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２に達するノイズの量を減少させるために、サンプル２８０４から放出される光ビームの波長とは異なる波長で動作する。
【０１１１】
干渉システム２８０６は、光源から放出された第１および第２の光ビームを受け取り、第１および第２の光ビームをそれぞれ２つ以上の分割ビームに分割し、分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成し、合成ビームが、それぞれの光路（またはビーム伝搬方向）２８３０、２８３２、２８３４に沿って送られるように構成される。各合成ビーム（光路２８３０、２８３２、２８３４に沿って進む）は、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、これは、光源の位置に対する光ビームの光路長の差による光ビーム間の位相差によって少なくとも部分的に引き起こされる。干渉システム２８０６は、上述したビームスプリッター、たとえばビームスプリッター１５０、２５０、または１０５０、あるいは図８、８Ａ、８Ｂ、１０、１１、１２、１４、１５、１７、および１８に示されるビームスプリッターのいずれであってもよい。
【０１１２】
装置２８００は、光学素子２８４０、２８４４を含み、これらは、サンプル２８０４から干渉システム２８０６へのそれぞれの光路２８２０、２８２２を定義する任意のタイプの光学素子であってよい。各光学素子２８４０、２８４４は、１つまたは複数のミラー、レンズ、または対物レンズを含むことができる。各光学素子２８４０、２８４４は、サンプル２８０４内の光源から放出された光エネルギーを平行化するレンズまたは対物レンズを含むことができる。上述したように、光学素子２８４０、２８４４の１つまたは複数がアパーチャーを含むことができ、このアパーチャーを通して光駆動システム２８０２からの光エネルギーをサンプル２８０４に照射することができると共に、光駆動システム２８０２の励起レーザーからディテクター２８０８、２８１０、２８１２に向かって進む迷放射の量を減少する。
【０１１３】
また、装置２８００は、光学素子２８５０、２８５４、２８５８を含み、これらはそれぞれ、干渉システム２８０６から光路２８３０、２８３２、２８３４に沿って進む当該の合成ビームを受け取り、合成ビームを当該のディテクター２８０８、２８１０、２８１２に向け直す。上述したように、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２は、干渉システムから出力された各合成ビームの強度を個別に検出するように構成される。
【０１１４】
プロセッサー２８１４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２に接続され、λ／２ｎよりも厚いサンプルに関する取り得る垂直位置の組の中から、サンプル２８０４内の光源の垂直次元に沿った一意の位置δを決定するための処置を行うように構成され、ここで、λは、合成ビームでの光の波長であり、ｎは、サンプル２８０４の媒体の屈折率である。上述したように、λ／２ｎよりも厚いサンプルに関しては、垂直位置δを決定する際の±Ｎλ／２ｎ（Ｎは整数）に曖昧さがある。プロセッサー２８１４は、最も可能性の高いＮを見い出すために他の属性（光ビームまたは合成ビームの波面修正によって引き起こされる画像変化など）を使用し、多数解の最良垂直位置を選択する。プロセッサー２８１４によって使用される属性は、光源の垂直位置と共に変化する属性である。
【０１１５】
プロセッサー２８１４によって使用される光ビームまたは合成ビームの波面修正は、装置２８００を通って進む際に光ビームおよび／または合成ビームが相互作用することによって引き起こされる修正でありうる。
【０１１６】
代替としてまたは追加として、装置２８００は、当該の光学素子２８４０、２８４４の少なくとも１つに、波面修正システム２８６０、２８６４を含むことができる。波面修正システム２８６０、２８６４は、少なくとも１つの光ビームおよび／または合成ビームの可変の波面修正を能動的に導入するように構成される。図３１Ａ、３６Ａ、３９Ａ、および４０Ａに関して以下に詳細に述べるように、波面修正システム２８６０、２８６４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２に達する合成ビームに、デフォーカス、曲率、および輝度分散の１つまたは複数をもたらす１つ以上のデバイスを含むことができる。
【０１１７】
いくつかの実装形態では、装置２８００は、普通であれば干渉システム２８０６に向けられる小さなパーセンテージの光を除去するために、光路２８２０、２８２２の１つまたは複数に位置決めされたビームスプリッター２８８０を含む。ビームスプリッター２８８０は、ディテクターシステム２８８２に光を向け、ディテクターシステム２８８２は、光学素子およびディテクターを含むことができ、図３７Ａおよび３８に関して以下に論じるように、このディテクターはまたプロセッサー２８１４に接続される。ディテクターシステム２８８２は、図３７Ａに関して以下に論じるように、光ビームへの可変の波面修正を能動的に導入する光学素子を含むことができる。
【０１１８】
図２９を参照すると、プロセッサー２８１４は、サンプル２８０４内の光源の一意の垂直位置δを決定するための処置２９００を行う。プロセッサー２８１４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２から（またはディテクターシステム２８８２内のディテクターから）電子出力を受け取る（工程２９０４）。ディテクター２８０８、２８１０、２８１２は、各合成ビームの画像を検出し、画像のデータを電子信号に変換する。上で詳述したように、プロセッサー２８１４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２からの各合成ビームの画像の中心領域に基づいて、サブ回折確度で、サンプル平面内での光源の位置を計算する（工程２９０８）。また、上で詳述したように、プロセッサー２８１４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２からの各合成ビームの個別に検出された強度に基づいて、サンプル平面に垂直な第３の直交次元（垂直方向）における光源の取り得る位置の組を計算する（工程２９１２）。したがって、工程２９０８および２９１２で、プロセッサー２８１４は、光活性化局所干渉顕微鏡観察処置を行い、この処置は上で詳述したものであり、ここでは繰り返さない。
【０１１９】
プロセッサー２８１４は、波面修正に基づいて、第３の直交次元に沿った光源の位置と共に変化する合成ビーム（またはディテクターシステム２８８２が光路２８２０、２８２２内に装備されている場合には光ビーム）の画像の属性（たとえば形状またはピーク値）を分析する（工程２９１６）。以下により詳細に論じるように、波面修正は、サンプル２８０４の光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率（たとえばデフォーカスまたは非点収差）および形状のうちの１つまたは複数の修正である。
【０１２０】
プロセッサー２８１４は、分析された形状に基づいて、取り得る位置の組の中から第３の直交次元での光源の位置を決定する（工程２９２０）。
【０１２１】
図３０を参照すると、多位相干渉顕微鏡観察装置３０００は、サンプル３００４に光学的に結合された光駆動システム３００２と、干渉システム３００６と、少なくとも２つのディテクター３００８、３０１０、３０１２と、少なくとも２つのディテクター３００８、３０１０、３０１２に接続された制御装置（たとえばプロセッサー）３０１４とを含む。装置３０００は、サンプル３００４の両側にある光学素子３０４０、３０４４と、干渉システム３００６と当該のディテクター３００８、３０１０、３０１２との間にある光学素子３０５０、３０５４、３０５８とを含む。
【０１２２】
各光学素子３０４０、３０４４は、対物レンズ３０４１、３０４５およびミラー３０４２、３０４６を含む。対物レンズ３０４１、３０４５は、当該のミラー３０４２、４０４６に向けられる平行化された光ビームを形成し、ミラー３０４２、３０４６は、光ビームを干渉システム３００６に向け直す。
【０１２３】
それぞれディテクター３００８、３０１０、３０１２に達したビームは、波面修正によって、第３の直交次元での光源の位置と共に画像が変化するように変形されている。たとえば、波面を修正するためにサンプル３００４と干渉システム３００６の間に光学要素を追加することによって（たとえば図３６Ａ、３７Ａ、または３８に図示されるように）、または光ビームを修正するために、したがってディテクター３００８、３０１０、３０１２に達する合成ビームの波面を修正するために光学素子３０４０、３０４４内部の光学要素の１つを修正することによって（たとえば図３１Ａ、３９Ａ、または４０Ａに示されるように）、この波面修正機能を装置３０００に能動的に付け加えることができる。波面修正は、装置３０００の構成の固有の特性であってよく、図３８に示されるように検出することができる。いずれにせよ、波面修正は、各ディテクター３００８、３０１０、３０１２での画像の属性（たとえば形状）に変化を与え、その属性修正を分析して、第３の直交次元での光源の位置を決定することができる。
【０１２４】
図３１Ａを参照すると、多位相干渉顕微鏡観察装置３１００が、ミラー３１４２、３１４６を含み、これらのミラーは、サンプル３１０４から放出された当該の光ビームの波面曲率の比較的小さな修正をそれぞれ提供するように修正されている。ミラー３１４２、３１４６は、それぞれ、円筒形（ただ１つの方向に沿って湾曲された）または双円錐形（すなわち、２つの横方向に沿って逆に湾曲され、サドルまたは双曲放物面形状を有する）であってよい。たとえば、ミラー３１４２の表面は、ミラー３１４２の中心で取られた垂線３１７２に対して横方向である第１の方向３１７０に沿って凸形であり、垂線３１７２および第１の方向３１７０に対して横方向である第２の方向３１７４（紙面に向かう方向）に沿って凹形である（ミラー３１４２の拡大図でより詳細に示される）。さらに、ミラー３１４６の表面は、ミラー３１４６の中心で取られた垂線３１８２に対して横方向である第１の方向３１８０に沿って凹形であり、垂線３１８２および第１の方向３１８０に対して横方向である第２の方向３１８４（紙面から出る方向）に沿って凸形である（ミラー３１４６の拡大図でより詳細に示される）。ミラー３１４２、３１４６は、逆または補完形状を有するように設計され、それにより、ミラー３１４２、３１４６から反射される光ビームの波面が干渉システム３１０６を通過した後に互いに重なり合い、すなわち合成ビームの波面が干渉システム２８０６を通過した後に互いに重なり合う。
【０１２５】
いくつかの実装形態では、ミラー３１４２、３１４６は、波面曲率修正を加えるのに必要な形で平面ミラーを湾曲させるために平面ミラーの表面および／または裏面に沿った点に適当な力を加えることによって形成される。他の実装形態では、ミラー３１４２、３１４６は、ミラー表面上での適当な曲率を得るために平面ミラーを研磨または被覆することによって形成される。
【０１２６】
上述したように、ミラー３１４２または３１４６に当たる光ビームは、ビーム伝搬方向に対して横方向である２つの方向に沿ってその波面が平面であることで平行化されている。したがって、ミラー３１４２または３１４６が横方向間の対称性を破り、したがって両横方向で波面はもはや平面でない。波面は、円筒形ミラーを使用してただ１つの横方向で湾曲されるようになすことができ、または双円錐形ミラーを使用して両横方向で（しかしほぼ逆の量で）湾曲されるようになすこともできる。各ミラー３１４２、３１４６は、当該のビーム伝搬方向に対する２つの横方向に関して、わずかに異なる２つの焦点面を形成する。その結果、第３の直交次元での光源の位置がサンプル平面（垂直位置δがゼロである位置である）に関して変化するにつれて、画像の楕円率および向きが変化する。すなわち、ゼロ垂直位置にある光源は、ディテクターでの平均焦点面に相関し、したがってディテクターでの画像は円形または対称的に現れる。ゼロ垂直位置よりも上の光源は、第２の横方向よりも第１の横方向で強く合焦され、長手軸が第２の横方向に沿った楕円としてディテクターに現れ、一方、ゼロ垂直位置よりも下の光源は、第１の横方向よりも第２の横方向で強く合焦され、長手軸が第１の横方向に沿った楕円としてディテクターに現れる。
【０１２７】
各光ビームの波面に対する修正は、最終的に、ディテクターでの（ビーム伝搬方向に対して）第１の横方向に沿った第１の値の放物線状に変化する位相と、ディテクターでの（ビーム伝搬方向に対して）第２の横方向に沿った第２の値の放物線状に変化する位相とをもたらす。このようにして、上側または下側対物レンズにより近い点光源は、第１の横方向に沿った焦点面が第２の横方向に沿った焦点面とはずらされる。
【０１２８】
上述したように、干渉法のみを使用して決定された複数の値の組の中からサンプル内にある光源の垂直位置δを正確に決定することができるように、曲率の量は、ディテクターに達する合成ビームに十分なデフォーカスを与えるのに十分であるように選択される。もたらされた曲率が、ビームの中心とビームの外縁部の間で４πまたは２λ未満の位相差を生じるべきであり、ここでλは光の波長である。もたらされた曲率がこの量よりも大きい場合、ディテクターでの画像は、過度に楕円になることがあり、その結果、過剰に細長い軸に沿って中心を見い出すのはより難しい。中心を見い出すことは、（ｘおよびｙサンプル次元に沿った）サンプル平面内での光源の位置を決定するため、またはｚサンプル次元に沿った光源の取り得る位置の組を決定するために重要である。特に、サンプル平面での光源位置の精度は、分子画像のファジィ半径（すなわち、ガウスシグマ）に直接比例する。したがって、追加の曲率によるデフォーカスの量は、一般には動作範囲にわたって約２０〜３０％に保たれる。
【０１２９】
ミラー３１４２、３１４６によって引き起こされる波面曲率によって、点光源の点広がり関数（ＰＳＦ）は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２で測定されるときに楕円になる。垂直位置δの関数としての楕円率εの一般化したあてはめが、３つの異なる垂直位置δの値で、ディテクターでの一般的な蛍光画像と共に図３１Ｂに示される。プロセッサー２８１４が、第３の直交次元での光源の位置を決定するために合成ビームの蛍光画像の形状を分析する。
【０１３０】
また図３２を参照すると、ナノ粒子の３つの異なる既知の垂直座標Ｚに関して、単一の金ナノ粒子（光源として作用する）の実際の回折限界蛍光画像３２００がディテクターで取得されている。ナノ粒子は、既知の垂直座標Ｚ＝−２３０ｎｍ（左欄３２１０）、Ｚ＝０ｎｍ（中央欄３２２０）、およびＺ＝＋２３０ｎｍ（右欄３２３０）に配置されている。画像３２００に対応するガウスフィット３２４０、および画像３２００とそれに対応するガウスフィット３２４０との差３２５０が、当該の画像３２００の下に示される。さらに、データのｘおよびｙ断面３２６０が、当該の画像３２００およびガウスフィット３２４０の下に示される。
【０１３１】
蛍光画像のガウスフィット３２４０を用いることによって、蛍光画像３２００から属性、この場合は楕円率εが決定される。楕円率εは、以下の式から求められる。
【数１】
ここで、σｘおよびσｙは、対応するガウスフィット３２４０の標準偏差（ガウス幅）である。以下に他の実装形態において述べるように、装置の設計に応じて、他の属性（位相角差またはピーク輝度など）を使用することもできる。
【０１３２】
次に、図３３に示されるように、約２５μｍ×２５μｍの領域にわたって拡散された約４０個の金ナノ粒子の領域に関して、点光源の既知の垂直位置Ｚについて楕円率εが測定される。生のデータが、点として示される。さらに、生のデータは、式Ｚε＝ｍ１＋ｍ２・ε＋ｍ３・ε３に適合される。測定された、光源の垂直位置δに対する楕円率εの依存性は、決定された第１および第２の直交位置の精度よりも精度が低いが、この依存性は、単一の干渉縞に限定されず、単に縞次数を決定するために用いられ、これは、広い範囲の光源位置にわたる垂直位置δの正確な決定を可能にする。この決定は、以下のように行われる。
【０１３３】
装置２８００または３０００の校正中、（図３３に示されるように）属性（この場合は楕円率ε）と点光源のサンプル垂直位置Ｚとの関係の生データが記録され、３つのディテクターそれぞれでのピーク強度と点光源のサンプル垂直位置Ｚとの関係が記録される。このピーク強度から、取り得る垂直位置の組Ｚｉｎｔｅｒｆを決定することができる。取り得る垂直位置の組Ｚｉｎｔｅｒｆとサンプル垂直位置Ｚとの関係は、図３４のグラフに示される。実際の垂直位置δは、以下の式を使用して計算することができる。
【数２】
ここで、Ｚｉｎｔｅｒｆｒａｎｇｅは、反復される垂直距離の周期である。たとえば、図３３に示されるように、サンプル垂直位置に関して２４０ｎｍごとにＺｉｎｔｅｒｆの測定値が反復されるので、Ｚｉｎｔｅｒｆｒａｎｇｅは約２４０ｎｍである。Ｚｉｎｔｅｒｆｒａｎｇｅの値は、光ビームの波長λと、サンプル媒体の屈折率ｎとに依存し、約λ／２・ｎになると推定することができる。用語「丸め」は、式中のあまり正確でない第２の項によって、より正確な値Ｚｉｎｔｅｒｆを乱すのを避けるために、引数の値を最も近い整数値に単に丸めることである。丸め処理は、本質的に、干渉縞の整数次数のみを抽出する。図３３および３４からのデータを使用した計算結果が図３５に示される。ここから分かるように、計算は、約７００ｎｍの範囲にわたって有効であり、これは、実験で使用された高い開口数の対物レンズの被写界深度に近い。約−４５０ｎｍ〜＋３００ｎｍの範囲にわたる測定点の総数に対する、不正確に求められた干渉縞次数の数の誤り率は、約２．９％である。さらに、Ｚε−Ｚによって与えられる不確定性パラメーターＺｕを導入することによって、またＺｕが許容範囲外となるデータをフィルター除去することによって、エラー率を減少させることができる。
【０１３４】
また図３６Ａを参照すると、多位相干渉顕微鏡観察装置３６００は、当該の対物レンズ３６４１、３６４５とミラー３６４２、３６４６の間に配置されたレンズ３６４２、３６４７を含む。ミラー３６４２、３６４６は、サンプル３６０４から放出される光ビームに対して波面修正を行わないように平面状に形成することができる。しかし、この場合、レンズ３６４３、３６４７は、サンプル３６０４から放出される当該の光ビームの曲率に対して波面修正を提供する。したがって、レンズ３６４３、３６４７はそれぞれ、円筒形（ただ１つの方向に沿って湾曲された）または双円錐形（すなわち、ミラー３１４２、３１４６の表面と同様に、２つの横方向に沿って逆に湾曲され、サドルまたは双曲放物面形状を有する）であってよい。
【０１３５】
たとえば、レンズ３６４３の斜視図に示されるように、レンズ３６４３の表面は、ビーム伝搬方向に対して横方向である第１の方向に沿って凸形であってよく、ビーム伝搬方向および第１の方向に対して横方向である第２の方向に沿って凹形であってよい。さらに、レンズ３６４７の斜視図に示されるように、レンズ３６４７の表面は、ビーム伝搬方向に対して横方向である第１の方向に沿って凹形であってよく、ビーム伝搬方向および第１の方向に対して横方向である第２の方向に沿って凸形であってよい。レンズ３６４３、３６４７は、逆または補完形状を有するように設計され、それにより、光ビームの波面が干渉システムを通過した後に互いに重なり合い、すなわち合成ビームの波面がディテクターで互いに重なり合う（これは図２８および３０に示される）。
【０１３６】
レンズ３６４３、３６４７に当たる光ビームは、ビーム伝搬方向に対して横方向である２つの方向に沿ってその波面が平面であることで平行化されている。したがって、レンズ３６４３または３６４７が横方向間の対称性を破り、したがって両横方向で波面はもはや平面でない。装置３６００におけるレンズ３６４３、３６４７は、波面の曲率を修正する働きをするという点で、装置３１００における修正ミラー３１４２、３１４６と同じ目的を果たし、当該のビーム伝搬方向に対する２つの横方向に関して、わずかに異なる２つの焦点面を形成する。その結果、図３６Ｂに示されるように、第３の直交次元での光源の位置がサンプル平面（垂直位置δがゼロである位置）に対して変化するにつれて、画像の楕円率および向きが変化する。上述したように、この情報をプロセッサーが使用して、第３の直交次元での光源の位置を決定することができる。
【０１３７】
図３７Ａを参照すると、別の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置３７００が、普通であれば干渉システム（図２８の干渉システム２８０６など）に向けられる小さなパーセンテージの光をフィルター除去するために、各光路３７２０、３７２２内に位置決めされたビームスプリッター３７８０を含む。各ビームスプリッター３７８０は、当該のディテクターシステム３７８２に光を向け、各ディテクターシステム３７８２は、光学素子およびディテクターを含み、このディテクターはまたプロセッサー（図２８のプロセッサー２８１４など）に接続される。ディテクターは、たとえば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）であってよい。特に、下側ディテクターシステム３７８２は、下側ビームスプリッター３７８０からの光ビームを受け取る波面対称性破壊レンズ３７８４と、光ビームを合焦する集束レンズ３７８６と、特定の波長範囲外の光を遮断するフィルター３７８８と、ディテクター３７９０とを含む。波面対称性破壊レンズ３７８４は、図３６Ａに示される装置３６００におけるレンズ３６４７と同様に、光ビームに可変の波面修正を能動的に導入する。上側ディテクターシステム３７８２は、上側ビームスプリッター３７８０からの光ビームを受け取る波面対称性破壊レンズ３７９２と、光ビームを合焦する集束レンズ３７９４と、特定の波長範囲外の光を遮断するフィルター３７９６と、ディテクター３７９８とを含む。波面対称性破壊レンズ３７９２は、図３６Ａに示される装置３６００におけるレンズ３６４３と同様に、光ビームに可変の波面修正を能動的に導入する。レンズ３７８４および３７９２は、図３６Ａの装置３６００でのレンズ３６４７および３６４３と同様に設計され、したがってこれらのレンズは、当該のディテクター３７９０、３７９８で、当該のビーム伝搬方向に対する２つの横方向に関して、わずかに異なる２つの焦点面を形成する。その結果、図３７Ｂに示されるように、第３の直交次元での光源の位置がサンプル平面（垂直位置δがゼロである位置）に対して変化するにつれて、画像の楕円率および向きが変化する。上述したように、この情報を、ディテクター３７９０、３７９８に接続されたプロセッサー（図２８のプロセッサー２８１４など）が使用して、第３の直交次元での光源の位置を決定することができる。
【０１３８】
図３８を参照すると、別の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置３８００が、普通であれば干渉システム（図２８の干渉システム２８０６など）に向けられる小さなパーセンテージの光をフィルター除去するために、各光路３８２０、３８２２内に位置されたビームスプリッター３８８０を含む。各ビームスプリッター３８８０は、当該のディテクターシステム３８８２に光を向け、各ディテクターシステム３８８２は、光学素子およびディテクターを含み、このディテクターはまたプロセッサー（図２８のプロセッサー２８１４など）に接続される。ディテクターは、たとえば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）であってよい。特に、下側ディテクターシステム３８８２は、下側ビームスプリッター３８８０からの光ビームを受け取り、光ビームを合焦する集束レンズ３８８６と、特定の波長範囲外の光を遮断するフィルター３８８８と、ディテクター３８９０とを含む。上側ディテクターシステム３８８２は、上側ビームスプリッター３８８０からの光ビームを受け取り、光ビームを合焦する集束レンズ３８９４と、特定の波長範囲外の光を遮断するフィルター３８９６と、ディテクター３８９８とを含む。
【０１３９】
ディテクターシステム３８８２は、軸方向でずらされた２つのサンプル平面を検出するように設計される。この検出方式では、ディテクター３８９０、３８９８の１つまたは複数を、標準の画像平面から移動させることができ、かつ／またはレンズ３８８６、３８９４の１つまたは複数を、ディテクター３８９０、３８９８の直前または直後に画像平面を配置するように移動させることができ、その結果、標準の（ｚ＝０）対象物（サンプル）平面のオーバーフォーカスまたはアンダーフォーカス画像が得られる。これを行うことによって、焦点の独立したｚ依存性がディテクター３８９０、３８９８で観察される。
【０１４０】
この情報をプロセッサーが使用して、ディテクター３８９８、３８９０での第１の画像Ｂ１の規格化ピーク輝度を第２の画像の規格化ピーク輝度Ｂ２と比較することによって、第３の直交次元での光源の位置を決定することができる。したがって、ディテクターでの第１の画像のピーク輝度がｂ１であり、ディテクターでの第２の画像のピーク輝度がｂ２である場合、第１の画像の規格化ピーク輝度がＢ１、すなわちｂ１／（ｂ１＋ｂ２）となり、第２の画像の規格化ピーク輝度がＢ２、すなわちｂ２／（ｂ１＋ｂ２）となる。したがって、プロセッサーは、差Ｂ１−Ｂ２を求めてデフォーカスを示し、上述した処置に従って光源の垂直位置を決定する。
【０１４１】
他の実装形態では、プロセッサーは、デフォーカスを示すために、第１および第２の画像のあてはめ半径またはスポットサイズに関する情報を使用する。
【０１４２】
図３９Ａを参照すると、別の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置３９００が、ミラー３９４２、３９４６を含み、これらのミラーは、外側環状領域３９８４から分離された内径瞳孔領域３９８０を有するように修正されている。ミラー３９４２、３９４６は、各ミラー面が互いに異なる２つの反射角に向けられている２つのミラー面を有することができる。たとえば、内側領域と外側領域の角度の差は、約０．１〜１°であってよく、この差は、ディテクターで光源の二重画像を生成するのに十分である。
【０１４３】
この設計により、各ミラー３９４２、３９４６は、別個の２つの光ビーム（内径瞳孔領域３９８０からの内側光ビームと、外側環状領域３９８４からの外側光ビーム）を提供し、これらの光ビームが干渉システム（図２８の干渉システム２８０６など）内で個別に干渉する。２つの画像が各ディテクター２８０８、２８１０、２８１２に取り込まれ、一方の画像は、より短い距離でディテクターに進む内側光ビーム成分からのものであり、他方の画像は、より長い距離でディテクターに進む合成ビームの外側光ビーム成分からのものである。内側光ビームは、より速い位相変動を有し、したがって図３９Ｂに示されるように位相角差（これは内側光ビームと外側光ビームの位相差である）から位置を決定することができる。図３９Ｂは、位相角差と光源の垂直位置との関係のグラフを表す。
【０１４４】
ディテクターは、内側光ビーム成分および外側光ビーム成分から得られた２つの画像により、軸方向でずらされた２つのサンプル平面を検出するように設計される。この検出方式では、上で詳述したように、光活性化局所干渉顕微鏡観察が、第１および第２の直交次元での光源の位置を決定し、かつ第３の直交次元での光源の取り得る位置の組を決定する。光活性化局所干渉顕微鏡観察は、内側成分または外側成分に対して行うことができ、同時に第３の直交次元での光源の実際の位置を決定する。
【０１４５】
図４０Ａを参照すると、別の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置４０００が、ミラー４０４２、４０４６を含み、それらの形状は、（波面曲率を修正しないので）平面対称性を維持するように修正され、かつ波面の回転対称性を破壊するように修正されている。この場合、各ミラー４０４２、４０４６は、円形のミラーから縁部領域を除去して概して卵形のミラーを形成することによって修正され、各ミラーは他のミラーに対して約９０°回転され、それにより各ミラーが、光源の垂直位置に依存する異なる形状を生み出す。したがって、ミラー４０４２、４０４６から反射された光ビームが干渉システム内で干渉され、再結合されて合成ビームを形成するとき、光ビームは、中心領域では完全に重ね合わされるが、縁部領域では重ね合わされない。この場合、点広がりまたは画像対称性がミラーの形状の修正によって修正され、画像の振幅および／または形状がミラーの形状の修正によって修正されると言うことができる。形状が光源の垂直位置に依存することにより、この情報をプロセッサーが使用して、既知の光源を使用する装置４０００の校正に基づいて、ディテクターに当たる画像形状を分析することによって光源の垂直位置を決定することができる。（１つの軸に沿って他の軸よりも多くのミラーが存在することによって）ミラー４０４２、４０４６が何らかの楕円状の変化を伴って修正されるので、画像形状が何らかの楕円率シグネチャを示すはずであると予想される。
【０１４６】
ディテクターと基本的な合焦レンズとの相対配置により生じる平面のずれを測定することを含む別の実装形態では、たとえば図３０に示される基本設計の素子を実質的に修正せずに装置を設計することができる。その代わりに、装置は、ディテクター３００８、３０１０、３０１２が干渉システム３００６に対して移動されるように、かつ／または光学素子３０５０、３０５４、３０５８内部の合焦レンズが干渉システム３００６に対して移動されるように設計することができ、それにより各ディテクターが異なる画像平面に対して合焦される。たとえば、ディテクター３０１０は、ディテクター３００８に対して一方向でデフォーカスさせることができ、ディテクター３０１２は、ディテクター３００８に対して逆方向でデフォーカスさせることができる。この場合、３つのディテクターそれぞれでの画像半径が、光源の垂直位置に依存する情報を提供することができ、垂直位置を決定するためにこれを使用することができる。
【０１４７】
さらなる他の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置３８００は、ただ１つのディテクターシステム３８８２を有するように設計することができ、このディテクターシステム３８８２は、主要なディテクター３００８、３０１０、３０１２の１つまたは複数と共に移動させることができ、ディテクターのうちの１つまたは複数のデフォーカスを可能にし、そのようなデフォーカスは光源の垂直位置に依存する。
【０１４８】
いくつかの実装形態は、プロセッサーと、種々のプロセッサー実行操作を行うための命令またはコンピューターコードを有する関連プロセッサー可読媒体と、を含む。そのようなプロセッサーは、内蔵マイクロプロセッサー、コンピューターシステムの一部としてのマイクロプロセッサー、特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）、およびプログラマブルロジックデバイス（「ＰＬＤ」）のようなハードウェアモジュールとして実装可能である。そのようなプロセッサーはまた、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、Ｃ、アセンブラーのようなプログラミング言語、ハードウェア記述言語、または任意の他の好適なプログラミング言語で記述された１つ以上のソフトウェアモジュールとして実装することも可能である。プロセッサーは、１つもしくは複数の特定目的のために特別に設計および構成された媒体およびコンピューターコード（コードと呼ばれることもある）を含む。プロセッサー可読媒体の例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。磁気記憶媒体、たとえば、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、および磁気テープ、光記憶媒体、たとえば、コンパクトディスク／ディジタルビデオディスク（「ＣＤ／ＤＶＤ」）、コンパクトディスクリードオンリーメモリー（「ＣＤ−ＲＯＭ」）、およびホログラフィックデバイス、光磁気記憶媒体、たとえば、フロッピー（登録商標）ディスクならびにリードオンリーメモリー（「ＲＯＭ」）デバイスおよびランダムアクセスメモリー（「ＲＡＭ」）デバイス。コンピューターコードの例としては、マイクロコードまたはマイクロ命令、機械命令、たとえば、コンパイラーにより生成されるもの、およびインタープリターを用いてコンピューターにより実行されるより高レベルの命令を含有するファイルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。たとえば、プロセッサー実行指示は、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、または他のオブジェクト指向型プログラミング言語、および開発ツールを用いて実施可能である。コンピューターコードのそのほかの例としては、制御信号、暗号化コード、および圧縮コードが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
特定の実装形態を以上に示して説明してきたが、形態および細部にさまざまな変更を加えうることは、当業者であればわかるであろう。たとえば、照明技術の変更が可能であり、それにより強度データのモジュロλ／２周期性を改良することが可能である。それに加えて、Betzig参考文献に記載の種々の実装形態を本明細書に記載の種々の実装形態と組み合わせることが可能である。たとえば、一実装形態では、トップ／ボトムＴＩＲＦ照明を行って、一波長λまでの厚さを有するサンプルを測定することが可能である。他の選択肢の実装形態では、短パルスのコヒーレント再位相調整により照明平面を形成することが可能である。さらに他の実装形態では、サンプルの種々の高さのｚ座標でガウシアンウエストを形成する側方照明により、物理的セクション化に頼ることなくｚ座標方向の範囲をさらに拡張することが可能である。したがって、当然のことながら、本明細書に記載のシステムは、さまざまな記載の実装形態の素子および／または特徴部のさまざまな組合せおよび／または部分的組合せを含みうる。
【０１５０】
他の実装形態も、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【符号の説明】
【０１５１】
１００ 二位相干渉顕微鏡観察システム
１３０ 光学素子
１３２ 光路
１４０ 光学素子
１４２ 光路
１５０ ビームスプリッター
１６０ 光学素子
１６５ ディテクター
１７０ 光学素子
１７５ ディテクター
２５０ ビームスプリッター
２６０ レンズ
２６５ ディテクター
２７０ レンズ
２７５ ディテクター
Ｓ サンプル
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で２００６年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６０／８７１，３６６号ならびに「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(System and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称で２００７年３月２７日に出願された米国仮特許出願第６０／９０８，３０７号に基づく優先権を主張する「三次元干渉顕微鏡観察のためのシステムおよび方法(Systems and Methods for 3-Dimensional Interferometric Microscopy)」という名称の２００７年１２月２０日に出願された米国特許出願第１１／９６１，６０１号の一部継続出願である。これら全ての出願は、それらの全体が参照により本明細書に援用されるものとする。
【０００２】
技術分野
開示する主題は、たとえば、空間的に解像可能な点光源を含む、またはそのような点光源で標識されたサンプルの干渉顕微鏡観察を含めた、干渉顕微鏡観察に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
干渉位相を測定する顕微鏡観察システムは公知である。たとえば、１つの公知の顕微鏡観察システムは、外部光源で対象物の延在表面を照明することにより干渉位相を測定する。サンプルから反射された光は、ビームスプリッター中で参照ビームと干渉する。干渉ビームは、ディテクター上に画像化される。参照ビームとサンプルビームとの光路差は、出力干渉ビームの振幅を変調して、対象物の高さの尺度を提供することが可能である。また、対向する対物レンズを介してサンプルからの２つのビームを干渉させて１つの干渉出力ビームだけを測定する顕微鏡観察システムも公知である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
概要
１つの一般的な態様では、第１および第２の直交次元によって定義されるサンプル平面に概して沿って延在するサンプル内にある光源が光駆動され、光源が複数の伝搬方向に光ビームを放出する。光源から放出された２つ以上の光ビームは互いに干渉されて複数の出力ビームが生成され、複数のディテクターに向けられる。複数の出力ビームからの各出力ビームの画像の中心領域に基づいて、第１の直交次元および第２の直交次元での光源の位置が決定される。複数の出力ビームそれぞれから個別に検出される強度に基づいて、サンプル平面に垂直な第３の直交次元での光源の取り得る位置の組が決定される。第３の直交次元での光源の位置と共に変化する波面修正に基づいて、１つまたは複数の光ビームおよび出力ビームの画像の形状が分析される。波面修正は、光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正である。分析された形状に基づいて、光源の位置が取り得る組の中から第３の直交次元での位置が決定される。
【０００５】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。たとえば、１つまたは複数の画像の形状が、波面修正を所定の波面修正と比較することによって分析することができる。１つまたは複数の画像の形状は、波面修正をモデル化された波面修正と比較することによって分析することもできる。１つまたは複数の画像の形状は、波面修正によって引き起こされ、第３の直交次元での光源の位置と共に変化する複素位相を分析することによって分析することもできる。
【０００６】
第３の直交次元での光源の位置は、１つまたは複数の画像の形状を、所定の波面修正に基づいて決定される所定の画像の形状と比較することによって、取り得る位置の組の中から決定することができる。
【０００７】
波面修正は、少なくとも１つの光ビームに能動的に導入することができる。波面修正は、ビーム伝搬方向に対する横方向にそれぞれ１つの焦点を有する焦点面間で、少なくとも１つの光ビームに伝搬方向に沿ったずれを導入することによって、導入することができる。波面修正は、少なくとも１つの光ビームにビーム伝搬方向に対する１つまたは複数の横方向に沿って波面の曲率を導入することによって、導入することができる。
【０００８】
波面修正は、少なくとも１つの光ビームの画像の輝度を変えることによって、少なくとも１つの光ビームに導入することができる。画像の輝度は、光ビームおよび出力ビームのうちの１つまたは複数のビームの１つの横方向に沿って、第２の横方向とは異なるように変えることができる。
【０００９】
別の一般的な態様では、装置は、光駆動システムと、干渉システムと、少なくとも２つのディテクターと、プロセッサーとを含む。光駆動システムは、概してサンプル平面に沿って延在するサンプル内にある光源が複数の光路に光ビームを放出するように構成される。干渉システムは、光源から放出された第１および第２の光ビームを受け取り、各光ビームを２つ以上の分割ビームに分割し、分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成するように構成される。各合成ビームは、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、これは、光源の位置に相対的な光ビームの光路長の差による光ビーム間での光源位相の差によって少なくとも部分的に引き起こされる。少なくとも２つのディテクターは、干渉システムから出力された各合成ビームの強度およびプロファイルの１つまたは複数を個別に検出するように構成される。プロセッサーは、少なくとも２つのディテクターから出力を受け取り、各合成ビームの画像の中心領域に基づいて、サブ回折確度で、サンプル平面内の光源の位置を計算し、各合成ビームの個別に検出された強度に基づいて、サンプル平面に垂直な第３の直交次元での光源の取り得る位置の組を計算し、第３の直交次元での光源の位置と共に変化する波面修正に基づいて、光ビームおよび合成ビームのうちの１つまたは複数のビームの画像の形状を分析し、分析された形状に基づいて、取り得る位置の組の中から第３の直交次元での光源の位置を決定するように構成される。波面修正は、光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正である。
【００１０】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。たとえば、光駆動システムは、サンプルに光学的に結合することができ、サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットを活性化させ、活性化されたスイッチャブル光源を励起するように構成することができ、それにより光ビームが、活性化されたスイッチャブル光源から、干渉システムに向けられた少なくとも２つの光路に沿って放出されるように構成することができる。
【００１１】
また、装置は、第１の光路に沿って放出された第１の光ビームを受け取り、第１の光ビームを干渉システムに少なくとも向け直すように構成された第１の光学素子と、第２の光路に沿って放出された第２の光ビームを受け取り、第２の光ビームを干渉システムに少なくとも向け直すように構成された第２の光学素子とを含むこともできる。
【００１２】
装置は、少なくとも１つの光ビームの可変の波面修正を導入するように構成された少なくとも１つの光路に、波面修正システムを含むことができる。波面修正システムは、１つまたは複数の光ビームおよび合成ビームの横方向に沿って焦点面をずらすように構成された少なくとも１つの光路に、デフォーカスシステムを含むことができる。デフォーカスシステムは、光源と干渉システムとの間の第１の光ビームの第１の光路内にあり、第１の光ビームの横方向に沿って焦点面をずらすように構成された第１のデフォーカスシステムと、光源と干渉システムとの間の第２の光ビームの第２の光路内にあり、第２の光ビームの横方向に沿って焦点面をずらすように構成された第２のデフォーカスシステムとを含むことができる。デフォーカスシステムは、サンプルと干渉システムとの間に置くことができる。
【００１３】
別の一般的な態様では、方法が、サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットを活性化する工程と、活性化されたスイッチャブル光源から少なくとも２つの光路に沿って光ビームが放出されるように、活性化されたスイッチャブル光源を励起する工程と、活性化されたスイッチャブル光源から第１の光路に沿って放出される第１の光ビームに第１の波面修正を導入し、活性化されたスイッチャブル光源から第２の光路に沿って放出される第２の光ビームに第２の波面修正を導入する工程であって、第２の波面修正が第１の波面修正と異なる工程と、複数の出力ビームを生成するために第１の光ビームと第２の光ビームを干渉させる工程と、複数の出力ビームからの各出力ビームの強度に基づいて、光源の三次元位置情報を決定する工程とを含む。
【００１４】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。たとえば、第２の波面修正は、第１の波面修正と方向が逆であってよい。
【００１５】
第１の波面修正は、第１の横方向に沿った第１の光ビームの焦点面を、第２の横方向に沿った第１の光ビームの焦点面に対して第１のシフト値だけシフトさせることによって導入することができ、第１および第２の横方向は第１の光路に対して横方向である。
【００１６】
第２の波面修正は、第１の横方向に沿った第２の光ビームの焦点面を第２の横方向に沿った第２の光ビームの焦点面に対して第２のシフト値だけシフトさせることによって導入することができ、第１および第２の横方向は第２の光路に対して横方向であり、第２のシフト値は第１のシフト値と逆である。
【００１７】
第１の波面修正は、第１の光路に対して横方向である少なくとも１つの方向に沿って、活性化されたスイッチャブル光源から放出される第１の光ビームをアンダーフォーカスすることによって導入することができ、第２の波面修正は、第２の光路に対して横方向である少なくとも１つの方向に沿って、活性化されたスイッチャブル光源から放出される第２の光ビームをオーバーフォーカスすることによって導入することができる。
【００１８】
また、この方法は、第１および第２の光ビームに第１および第２の波面修正を導入する前に、平行化された光ビームを形成する工程を含むこともできる。
【００１９】
三次元位置情報は、サンプルが概して延在するサンプル平面に垂直な次元での光源の位置を決定することによって決定することができる。
【００２０】
第１の波面修正は、第１の光ビームに波面曲率を導入することによって第１の光ビームに導入することができ、第２の波面修正は、第２の光ビームに波面曲率を導入することによって第２の光ビームに導入することができる。
【００２１】
各波面修正は、それぞれの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正であってよい。
【００２２】
別の一般的な態様では、方法が、点光源から放出される第１および第２の光ビームを、当該の第１および第２の異なる光路に関連する第１および第２の異なる方向に沿って向ける工程と、第１の光路での第１の光ビームに対して横方向で、焦点面を第１のシフト値だけシフトさせ、第２の光路での第２の光ビームに対して横方向で、焦点面を第２のシフト値だけシフトさせる工程であって、第２のシフト値が第１のシフト値と逆である工程と、第１および第２の光ビームの焦点面をシフトさせた後、第１および第２の光ビームをそれぞれ２つ以上の分割ビームに分割し、分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成する工程であって、各合成ビームが、第１および第２の光ビームの光路長の差によって少なくとも部分的に引き起こされる２つ以上の分割ビーム間の干渉を含む工程と、各合成ビームの画像を個別に検出する工程と、第１の直交次元および第２の直交次元での光源の位置を決定する工程と、各合成ビームの個別に検出された画像に基づいて、第３の直交次元での光源の位置を決定する工程とを含む。
【００２３】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。たとえば、第３の直交次元での光源の位置は、各合成ビームの個別に検出された画像に基づいて決定することができ、これは、個別に検出された画像の強度を所定の値と比較することによって光源の位置を決定する工程を含む。
【００２４】
１つの一般的な態様では、装置は、複数のディテクターとプロセッサーとを有する光学システムを含む。光学システムは、所与の時間で、各ディテクターで、第１の次元と第１の次元に実質的に直交する第２の次元とで、光源の画像を生成するように構成される。それらの画像からの各画像は光源からの放出の干渉に基づいており、この放出は２つの異なる光ビームを形成する。プロセッサーは、画像に基づいて第３の次元での位置を計算するように構成される。第３の次元は、第１の次元と第２の次元とに実質的に直交する。
【００２５】
１つの一般的な態様では、蛍光標識でタグ付けされた対象分子は、回折限界よりも良好な確度で三次元で位置特定が可能である。そのような実装形態では、画像に関連付けられる位相情報を用いてｚ座標で分子の位置に関する情報を決定することが可能であり、結果的に、三次元でサブ回折確度＜＜λ／２を有する３Ｄ（三次元）表現を達成することが可能である。すなわち、第３の次元（たとえばｚ座標）での分子の位置に関する情報は、２つの他の次元（たとえばｘおよびｙ座標）での分子の位置に関する情報を得るために使用されるのと同じ画像の組から得ることができる。
【００２６】
いくつかの一般的な態様では、点光源から放出される少なくとも２つの光ビームが、少なくとも２つの異なる方向に沿って向けられ、各方向が異なる光路に関連付けられる。光ビームはそれぞれ２つ以上の分割ビームに分割され、分割ビームの少なくとも２つ以上が組み合わされて複数の合成ビームを形成し、各合成ビームは、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、これは、光ビームの光路長の差による光ビーム間の光源位相の差によって少なくとも部分的に引き起こされる。各合成ビームの強度および画像プロファイルが個別に検出される。第１の直交次元および第２の直交次元での光源の位置が決定され、第３の直交次元での光源の位置は、各合成ビームの個別に検出された強度および画像プロファイルに基づいて決定される。
【００２７】
実装形態は、以下の特徴の１つ以上を含むことができる。少なくとも２つの発光ビームは、反対側のレンズを通るように少なくとも２つの光ビームをそれぞれ向けることによって方向付けることができる。少なくとも２つの発光ビームは、レンズの異なる部分を通るように少なくとも２つの光ビームをそれぞれ向けることによって方向付けることができる。各合成ビームの強度は、各合成ビームの強度を同時に検出することによって、個別に検出することができる。各発光ビームは、発光ビームの少なくとも１つを３つ以上の分割ビームに分割することによって分割することができる。
【００２８】
別の一般的な態様では、装置が、点光源から２つの異なる光路に沿って放出される少なくとも２つの光ビームを受け取り、各発光ビームを２つ以上の分割ビームに分割し、分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成するように構成されたビームスプリッターを含む。各合成ビームは、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、これは、光ビームの光路長の差による分割光ビーム間の位相差によって少なくとも部分的に引き起こされる。少なくとも２つのディテクターが、ビームスプリッターから出力される各合成ビームの強度および画像プロファイルを個別に検出するように構成される。プロセッサーは、少なくとも２つのディテクターからの出力を受け取り、第１、第２、および第３の直交次元での光源の位置をサブ回折確度で計算するように構成される。
【００２９】
別の一般的な態様では、サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットが活性化され、活性化されたスイッチャブル光源が励起され、それにより、光エネルギーが、活性化されたスイッチャブル光源から複数の方向で放出され、活性化されたスイッチャブル光源から複数の方向で放出された光エネルギーが干渉されて複数の出力ビームを生成し、光源の三次元位置情報が、複数の出力ビームからの各出力ビームの強度および画像プロファイルに基づいて決定される。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】多位相干渉顕微鏡観察システムおよびサンプルのブロック図である。
【図２】二位相干渉顕微鏡システムおよび単一発光体サンプルのブロック図である。
【図３】図２の２つのディテクターで検出された放射光の強度のグラフである。
【図４】二位相干渉顕微鏡システムおよび延在サンプルのブロック図である。
【図５】図４の２つのディテクターで検出された放射光の強度のグラフである。
【図６】ビーム位相の表現を有する二位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図７Ａ】図６の当該のディテクターで検出された所与の出力ビームに関する成分のビーム強度の位相を表すグラフである。
【図７Ｂ】図６の当該のディテクターで検出された所与の出力ビームに関する成分のビーム強度の位相を表すグラフである。
【図７Ｃ】それぞれ図７Ａおよび７Ｂに関連付けられる出力ビームの強度を表すグラフである。
【図７Ｄ】それぞれ図７Ａおよび７Ｂに関連付けられる出力ビームの強度を表すグラフである。
【図８】三位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図８Ａ】三方向ビームスプリッターの側面図である。
【図８Ｂ】八方向ビームスプリッターの側面図である。
【図９】図８の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフである。
【図１０】三方向ビームスプリッターの側面図である。
【図１０Ａ】図１０の三方向ビームスプリッターでの、ビームスプリッッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーの図である。
【図１０Ｂ】図１０の三方向ビームスプリッターでの、ビームスプリッッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーの図である。
【図１０Ｃ】図１０の三方向ビームスプリッターでの、ビームスプリッッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーの図である。
【図１１】図１０の三方向ビームスプリッターの斜視図である。
【図１２】四位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図１３】図１２の４つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフである。
【図１４】回折グレーティングを有する四位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図１５】回折グレーティングを有する六位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図１６】２つの異なる潜在位置にある単一量子発光体の図である。
【図１７】単一対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図１８】図１７に示されるビームスプリッターおよび／またはアニュラーリバーサーシステムの一例のブロック図である。
【図１９】図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図である。
【図２０】図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの端面図である。
【図２１】図１７に示されるアニュラーエキスパンダーの６つのプリズム素子のうち３つの斜視図である。
【図２２】図１７の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフである。
【図２３】アニュラーエキスパンダーの平面図である。
【図２４】ラインＸＸ−ＸＸに沿って取られた図２３に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図である。
【図２５】ラインＸＸＩ−ＸＸＩに沿って取られた図２３に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図である。
【図２６】多位相干渉顕微鏡システムに関する校正プロセスのフロー図である。
【図２７】多位相干渉顕微鏡システム内部での光活性化されたサンプルの三次元位置情報を得るためのプロセスのフロー図である。
【図２８】多位相干渉顕微鏡観察システムおよびサンプルのブロック図である。
【図２９】図２８のシステムのプロセッサーによって行われる処置のフロー図である。
【図３０】三位相干渉顕微鏡システムのブロック図である。
【図３１Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３１Ｂ】図３１Ａのシステムでのサンプルの光源の楕円率と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【図３２】データへのあてはめ、データとあてはめとの差、およびデータの断面と共に、図３１Ａのシステム内部のディテクターから得られる生の画像データを示す表である。
【図３３】図３１Ａと同じ光源の楕円率と垂直位置との関係のグラフである。
【図３４】図３１Ａのサンプル光源の測定された垂直位置（干渉法データのみを使用して決定された直交位置の組）と実際の垂直位置との関係のグラフである。
【図３５】図３３および３４のグラフからのデータを使用した、図３１Ａのサンプル光源の推定される垂直位置と実際の垂直位置との関係のグラフである。
【図３６Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３６Ｂ】図３６Ａのシステムでのサンプルの光源の楕円率と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【図３７Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３７Ｂ】図３７Ａのシステムでのサンプルの光源の楕円率と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【図３８】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３９Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図３９Ｂ】図３９Ａのシステムでのサンプルの光源の位相角差と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【図４０Ａ】図２８の干渉顕微鏡システムの例示的な一部分のブロック図である。
【図４０Ｂ】図４０Ａのシステムでのサンプルの光源の楕円率と垂直位置との関係の一般化したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
広義には、本明細書に記載の１つ以上の実装形態は、公知の光学顕微鏡観察よりも良好な解像度を有するサンプルの三次元レンダリングを生成することができる。いくつかの実装形態では、広視野干渉顕微鏡が、位相差を測定して、（たとえばｚ座標または垂直方向に沿った）第３の次元でのサンプル内にあるスイッチャブル光源の位置情報を決定すると同時に、（たとえばｘおよびｙ座標に沿った、またはサンプル平面に沿った）２つの他の直交次元での位置情報を測定することができる。いくつかの実装形態では、干渉顕微鏡は、タンパク質分子中の光活性化蛍光標識から光を内的に放射するサンプルなど、空間的に解像可能な一群の点光源を含むまたはそのような点光源で標識されたサンプルを測定することができる。
【００３２】
たとえば、サンプル中の特定の標識タンパク質の三次元（３Ｄ）レンダリングを生成することが可能である。特定の標識タンパク質によりコントラストを与えることが可能であるが、なおかつ専用の光学顕微鏡を用いてコントラストを得ることが可能である。たとえば、１つ以上の実装形態を用いて、全３Ｄ位置で細胞内の蛍光標識タンパク質の位置を決定することが可能である。
【００３３】
公知の顕微鏡観察システムの１つは、光活性化位置特定顕微鏡観察（「ＰＡＬＭ」）システムである。ＰＡＬＭシステムは、次の参考文献（参照により本明細書に援用されるものとする）に記載されている。「光変換性光学標識を用いた光学顕微鏡観察(Optical Microscopy with Phototransformable Optical Labels)」という名称で２００５年５月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６８３，３３７号、「ほぼ分子分解能での細胞内蛍光タンパク質のイメージング(Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Near-Molecular Resolution)」という名称で２００６年３月１０日出願に出願された米国仮特許出願第６０／７８０，９６８号、「光変換性光学標識を用いた光学顕微鏡観察(Optical Microscopy with Phototransformable Optical Labels)」という名称で２００６年５月２３日に出願されかつＰＣＴ国際公開第２００６／１２７６８２号として２００５年１１月１１日に公開されたＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０１９８８７号、Betzig, E. et al., "Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution," Science, Vol. 313, September 15, 2006、およびBetzig, E. et al., "Supporting online Material for 'Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution'," Science Express, August 10, 2006, [online] www.sciencemag.org/cgi/content/full/1127344/DC1（本明細書中ではまとめて「Betzig参考文献」と記す）。
【００３４】
ＰＡＬＭシステムは、主に二次元（２Ｄ）で、すなわちｘ，ｙ画像平面（またはサンプル平面）で分子の位置を特定して、回折限界顕微鏡のものよりも優れた高解像度画像を提供する。２Ｄ ＰＡＬＭシステムの場合において、スイッチャブル光学標識は、ＰＡ−ＧＦＰのような光活性蛍光タンパク質でありうる。ＰＡ−ＧＦＰは、ＧＦＰの光活性蛍光タンパク質変異体であり、４０５ｎｍの光を照射することにより非蛍光形からアニオン形に変換可能であり、アニオン形は、５００ｎｍの励起線を吸収して５２０ｎｍの蛍光線を発する。他の光活性タンパク質には、Ｄｒｏｎｐａ、Ｅｏｓ、ＰＡ−Ｃｈｅｒｒｙ、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ−ＦＰ、ＰＡ−ＣＦＰが含まれ、その多くは、単量体形、二量体形、および四量体形で使用可能である。そのようなタンパク質は、対象タンパク質を標識するように遺伝子発現および遺伝子結合が可能である。これによりタンパク質特異的画像を構築することが可能である。種々のケージド染料分子を使用することも可能であるが、それらは典型的には免疫標識スキームまたはそれに代わる結合スキームを必要とする。こうしたタンパク質／標識のいくつかは、十分に異なる光物理的性質、たとえば、発光波長、励起波長、または脱色速度を有するので、２つの異なるスイッチャブル光学標識を用いて画像を作成することが可能である。この場合、ビーム経路中にダイクロイックミラーを追加することにより、この３Ｄ干渉顕微鏡観察のための新しい第２さらには第３の一連の画像を得ることが可能である。１種のタンパク質の画像化および脱色を行ってから第２のタンパク質の画像化を行うように取得処理を順序付けることは、異なる標識タンパク質を画像化するもう１つの方法である。
【００３５】
慣例的に、標識された分子のｚ位置は、１つまたは複数の対物レンズの光軸の方向に沿っており、ｘおよびｙ位置は、サンプルの平面に沿って延在するｘおよびｙ方向に沿っており、ｘおよびｙ方向はｚ方向に直交する。
【００３６】
第３の次元（ｚ方向）での標識分子の位置に関する情報を取得するための一方法は、光路長の差の位相角情報を使用するものであり、それにより、標識分子のｘ，ｙ位置を決定することができる二次元強度画像と、標識分子のｚ位置を決定することができる位相依存画像とを両方同時に獲得することができ、再構成することができる。言い換えれば、サンプルからの２つ以上の発光ビームを２つ以上のビームにさらにスプリットして互いにペアワイズ干渉させ（それらの異なる位相に基づいて）、得られた干渉ビームで画像を形成し、画像を同時に記録してサンプルの局在化光源の経路長差（すなわちｚ位置）を再構築する。それに加えて、いくつかの実装形態では、干渉振幅を抽出して垂直方向位置の追加的尺度として使用することも可能である。
【００３７】
そのような実装形態は、多くの点で有利である。たとえば、以上で述べたように、本明細書に記載のいくつかの実装形態では、位相差を測定することにより、第３の次元（たとえばｚ方向）で位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘ方向およびｙ方向）で位置情報を測定することが可能である。これにより３つの直交する次元すべてで測定が可能になり、この測定は、こうした測定がさまざま時点で行われる公知のシステムよりも正確でありうる。本明細書に記載のそのような測定技術は、たとえば、時間変化する明るさを有する光活性サンプルのように静的でないサンプルに特に有利でありうる。
【００３８】
以上にも述べたように、本明細書に記載のいくつかの実装形態では、測定されるサンプルの成分は、サブ回折サイズの点光源として分離可能かつ同定可能である。これにより可能になる測定は、明確な画定が可能であるとともに、測定サンプル成分が位置の分布を有する拡張光源でありかつ光源の種々の部分が光源の他の部分と干渉する可能性がある公知のシステムよりも正確でありうる。本明細書に記載のそのような測定技術は、回折限界よりも正確に測定を行うのに特に有利でありうる。
【００３９】
図１を参照すると、サンプルＳで、第３の次元（たとえばｚ方向）での位置情報を決定すると同時に２つの他の次元（たとえばｘおよびｙ方向）での位置情報を測定するために、二位相干渉顕微鏡観察システム１００が使用される。顕微鏡観察システム１００は、光学素子１３０および１４０と、干渉システム（多方向ビームスプリッターとも呼ぶ）１５０と、光学素子１６０および１７０と、ディテクター１６５および１７５とを含む。光学素子１３０および１４０は、サンプルＳからビームスプリッター１５０までそれぞれ光路１３２および１４２を画定する任意のタイプの光学素子でありうる。たとえば、光学素子１３０および１４０のそれぞれは、一連のミラー、レンズ、または対物レンズを含みうる。光学素子１３０および１４０は、たとえば、サンプルの点光源から放出される光エネルギーを平行化するレンズまたは対物レンズを含みうる。図１には２つの光学素子１３０および１４０中に至る２つの反対方向を向いて対向する経路１３２および１４２が示されているが、以下で論述されるいくつかの実装形態では、光学素子１４０のような単一の光学素子は、２つの対向しない経路１３２および１４２を含みうる。第１の方向での（すなわち光路１３２に沿った）光源の放出（すなわち、サンプルＳから放出される光エネルギー）と、第２の方向での（すなわち、光路１４２に沿った）光源の放出との干渉が、第１の方向に沿って進む放出と第２の方向に沿って進む放出との光路長の差によって少なくとも部分的に引き起こされる。
【００４０】
光学素子１３０および／または１４０は、サンプルＳが１種以上の活性化源を受容できるようにする追加の素子および／特徴部を含みうる。たとえば、いくつかの実装形態では、光源（たとえば、図１には示されていないが、図２８に示されている）からの光エネルギーを用いることによりサンプルＳの蛍光応答を活性化させて励起光子を生成することが可能である。そのような実装形態では、たとえば、光学素子１３０および／または１４０は、アパーチャーを含みうる。そしてディテクター１６５および／または１７５に向かって逆行する励起レーザーからの迷光放射を最小限に抑えつつ、アパーチャーを介して光源からの光エネルギーをサンプルＳに照射することが可能である。また、主に蛍光がディテクターに達するように、ディテクター１６５および／または１７５に至るビーム経路中にレーザーラインフィルターを存在させることも可能である。第１のレーザー光源は、たとえば、活性化ビームをサンプルＳに照射することが可能であり、かつ第２のレーザー光源は、たとえば、励起ビームをサンプルＳに照射することが可能である。他の実装形態では、レーザー以外の光源、たとえば、発光ダイオード、白熱ランプなどを活性化用および／または励起用の光源として使用することが可能である。以上で参照により援用されたBetzig参考文献にさらに詳細に記載されているように、活性化ビームは、サンプル中の個別に解像可能な光活性標識の十分に散在したサブセットを活性化させるように構成され、かつ励起ビームは、サンプルＳの活性化部分を励起して蛍光に基づく光子を放出させるように構成される。
【００４１】
他の選択肢の実装形態では、１種以上の化学物質を用いてサンプルの蛍光応答を活性化させることが可能である。そのような他の選択肢の実装形態では、サンプルを第１の化学物質に暴露してサンプルの分子の蛍光性散在サブセットを活性化させることが可能であり、続いて、光脱色を用いない場合、第２の化学物質に暴露してサンプルの蛍光を失活させることが可能である。
【００４２】
ビームスプリッター１５０は、任意のタイプの適切な光学素子でありうる。ただし、この光学素子は、光路１３２および１４２に沿って光エネルギーを受け取って組み合わせて、かつ組み合わされ混合された光エネルギーを２つ以上の光路１５２および１５４（それぞれ本明細書中では「レッグ」とも記す）に沿って光学素子１６０および１７０に伝送する。たとえば、ビームスプリッター１５０は、５０：５０ビームスプリッターでありうる。この場合、組み合わされた光エネルギーはスプリットされて、組み合わされた光エネルギーの実質的に５０パーセントは光路１５２で伝送され、かつ組み合わされた光エネルギーの実質的に５０パーセントは光路１５４で伝送される。光路１３２および１４２からの光エネルギーは、ビームスプリッター１５０により干渉され混合されるので、光路１５２に沿って得られる光エネルギーは、光路１３２および１４２からの光エネルギー間の相対位相差に基づく。同様に、光路１３２および１４２に沿った光エネルギーは、ビームスプリッター１５０中で干渉され混合されるので、光路１５４に沿って得られる光エネルギーは、光路１３２および１４２からの光エネルギー間の相対位相差に基づき、この相対位相差は、光路１５２に沿った光エネルギーに関連付けられる相対位相差とは異なる。この実装形態では、光路１５２に沿って得られる光エネルギーと光路１５４に沿って得られる光エネルギーとは、位相が約１８０度異なる。
【００４３】
別法として、ビームスプリッター１５０は、たとえば６６：３３または７０：３０など、任意の所望の比でビームを分割することができる。他の実装形態では、ビームスプリッター１５０は、複数のビームスプリッターの組合せであってよい。そのようなビームスプリッターは、たとえば、２つのガラスセグメントと２つのガラスセグメント間に配設された薄膜コーティングとのブロックから構成可能である。そのようなビームスプリッターは、３つ以上の出力、すなわち、１５２および１５４の２つよりも多くの出力を生成することが可能である。これにより、２つのビームの場合の０度および１８０度ではなく、３つ以上の干渉位相角（たとえば、０度、１２０度、および２４０度）で３つ以上の出力ビームを表現することが可能になる。さらに他の実装形態では、薄膜コーティングを有するビームスプリッターに加えてまたはその代わりに、回折グレーティングをビームスプリッターとして使用することが可能であり、かつそれによりビームを２つ以上のビームに分割することが可能である。また、グレーティングにより複数の入力ビームを受け取って、それらを混合して干渉させ、種々の出力ビームを生成することが可能である。いくつかの実装形態では、スイッチャブル散乱中心を有する標識（たとえば、活性散乱特性を有する光スイッチャブル標識）のように実質的に同一の波長で発光する点光源を有するサンプルと組み合わせて、回折グレーティングを使用することが可能である。実質的に同一の波長で発光する点光源を有するそのようなサンプルでは、回折グレーティングにより、入力ビームの波長の関数である比較的狭い偏向角で入力ビームを有利に偏向させることが可能である。
【００４４】
他の実装形態では、ビームスプリッターのうちの１つ以上は、回折グレーティングまたは薄膜コーティングの代わりにストライプ状ミラー部分を含みうる。一実装形態では、ストライプ状ミラー部分は、回折次数により画像平面内に再集光されないように、十分に小さいストライプ周期を有する。波長λ、焦点距離ｆ、および画像サイズｄの場合、これは、ｆλ／ｄ未満の周期を意味する。正方形もしくは六角形のポルカドットのような他のパターンを使用することが可能である。しかしながら、画像中のゴースト発生を防止するために、同一条件のポルカドット周期（すなわちｆλ／ｄ未満）を保持しなければならない。
【００４５】
光学素子１３０および１４０のときと同様に、光学素子１６０および１７０は、ビームスプリッター１５０からそれぞれディテクター１６５および１７５までそれぞれ光路１５２および１５４を画定する任意のタイプの光学素子でありうる。たとえば、光学素子１６０および１７０は、光エネルギーがそれぞれディテクター１６５および１７５に集束するように、それぞれ光路１５２および１５４からの光エネルギーを非平行にするレンズでありうる。いくつかの実装形態では、光学素子１３０、１４０、１６０、および１７０、ならびに／またはビームスプリッター１５０のような光学素子のうちの１つ以上は、補償光学素子を含みうる。
【００４６】
使用時、サンプルＳ中の個別画像化標識の統計学的散在サブセットを活性化した後、測定が行われる。以上で述べたように、サンプルＳ中の標識の統計学的散在サブセットは、適切な技術により、たとえば、光活性化または化学的活性化により、活性化可能である。活性化の後、レーザーのような励起光源によりサンプルＳを励起することが可能であり、結果として、サンプルＳから少なくとも光路１３２および１４２に沿って光子が放出されて光学素子１３０および１４０を介してビームスプリッター１５０に達する。光路１３２および１４２からの光エネルギーは、ビームスプリッター１５０で組み合わされ、そして経路１５２および１５４に沿って伝送されてそれぞれ光学素子１６０および１７０を介してディテクター１６５および１７５に達する。ビーム１３２とビーム１４２の光路長の差による位相差により、ビームスプリッター１５０で干渉が生じ、ディテクター１６５および１７５での検出信号の強度を変調する。以下にさらに詳細に説明するように、この変調された強度を使用して、ｚ座標での位置を決定することができる。それに加えて、ディテクター１６５および１７５における検出信号は、ｘ、ｙ方向の位置情報をも提供する。検出信号を収集した後、それらの標識からさらなる光信号を検出できなくなるように、サンプルＳ中の標識の活性化散在サブセットを反復励起により脱色することが可能であり、次に、追加の測定に供すべく、標識のさらなる散在サブセットを活性化し励起することが可能であり、そしてプロセスは反復される。
【００４７】
図２は、二位相干渉顕微鏡観察システムおよび単一活性発光体を有するサンプルのシステムブロック図を示している。図２に示されるように、単一量子発光体Ｓは、ｚ座標に沿って中心位置２２０から距離δの位置に配置される。単一量子発光体Ｓは、たとえば、蛍光分子、量子ドット、またはサブ波長散乱中心でありうる。放射光子は、量子発光体Ｓから上向きにレンズ２３０中にも下向きにレンズ２４０中にも逃散可能であり、これらのレンズでは、それぞれ、２つの平行ビーム２３２および２４２が形成される。平行ビーム２３２および２４２は、それぞれ、ミラー２３４および２４４により反射されて、ビームスプリッター２５０で受光される。
【００４８】
２つのビーム経路は、次のように画定される。すなわち、量子発光体Ｓからミラー２３４までおよびミラー２３４からビームスプリッター２５０までの第１のビーム経路（トップ経路とも呼ばれる）、ならびに量子発光体Ｓからミラー２４４までおよびミラー２４４からビームスプリッター２５０までの第２のビーム経路（ボトム経路とも呼ばれる）。ミラー２３４および２４４ならびにビームスプリッター２５０は、ビーム経路の長さがほぼ波長レベル内まで一致するように、すなわち、（Ｌ１＋Ｌ２）ｔｏｐ＝（Ｌ１＋Ｌ２）ｂｏｔｔｏｍになるように、量子発光体Ｓに対して定置される。ただし、ｚ座標に沿った発光体の位置変位δおよびトップビーム経路での９０度の位相シフトは除く。式中、Ｌ１は、中心位置２２０とミラー２３４または２４４との間の経路長であり、かつＬ２は、ミラー２３４または２４４とビームスプリッター２５０との間の経路長である。
【００４９】
この場合、トップビーム経路中の光ビームの電界は、Ｅ１＝Ａ×ｅｘｐ（−ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２＋ｉπ／２）、式中、ｋ＝２π／λ、となる。ボトムビーム経路中の光ビームの電界は、Ｅ２＝Ａ×ｅｘｐ（ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２）となる。
【００５０】
ビームスプリッター２５０で受け取られると、光ビームは分割され、組み合わされて、それぞれレンズ２６０および２７０を通して２つのディテクター２６５および２７５に伝送される。各ディテクター２６５および２７０に向かって進む光ビームの１つの光源からの電界は、Ｅ１２＝１／２０．５×（Ｅ１±Ｅ２）＝１／２０．５×（Ａ×ｅｘｐ（−ｉｋδ＋ｉｋ−Ｌ１＋ｉｋＬ２＋ｉπ／２）±Ａ×ｅｘｐ（ｉｋδ＋ｉｋＬ１＋ｉｋＬ２））となる。
【００５１】
この実装形態では、ディテクター２６５および２７５は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）ディテクターまたは（単一蛍光分子に対する感度向上のために）電子増倍電荷結合ディテクター（ＥＭＣＣＤ）である。図３に示されるように、ディテクター２６５で検出される放射光の強度３６５およびディテクター２７５で検出される放射光の強度３７５は、位相４πδ／λを有して正弦パターンで変化する。より具体的には、ディテクター２６５で検出される放射光の強度３６５は、Ｉ１＝１／２×（Ｅ１＋Ｅ２）２＝Ａ２×（１＋ｓｉｎ（２ｋδ））である。ディテクター２７５で検出される放射光の強度２７５は、Ｉ２＝１／２×（Ｅ１−Ｅ２）２＝Ａ２×（１＋ｓｉｎ（２ｋδ＋π））である。これら２つの式から分かるように、位置変位δが光源位相２ｋδをもたらし、干渉が干渉位相πをもたらす。次いで、２つの強度式を組み合わせることによって、ｚ方向変位δを計算することができる。すなわち、（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２）＝ｓｉｎ（４πδ／λ）またはδ＝λ ａｒｃｓｉｎ（（Ｉ１−Ｉ２）／（Ｉ１＋Ｉ２））／４πである。
【００５２】
この計算は、図４に示されるような顕微鏡観察システムに一般化することができる。より詳細には、図４は、二位相干渉顕微鏡観察システムおよび延在サンプルのシステムブロック図を示している。図４に示されるように、顕微鏡観察システムは、画像平面がディテクター４６５および４７５に画定されるように、顕微鏡対物レンズ４３０および４４０ならびにレンズ４６０および４７０を含む。サンプルＳの任意の点光源は、ディテクター４６５および４７５に画定される各画像平面上に分解能限界のスポットを形成するであろう。
【００５３】
次に、空間的に一体化されたスポットの強度を用いて、以上に記載の強度式によりサンプルＳの点光源のｚ変位（すなわちｚ座標位置）を計算することが可能である。ＣＣＤ、ＥＭＣＣＤ、または他の大面積ディテクターを用いることにより、複数の画像スポットを同時に検出することが可能であり、かつサンプル３１０の各関連部分のｚ変位δを実質的に同時に確定することが可能である。検出される光信号の位相を１ラジアンの何分の一まで決定することが可能であるので、波長の何分の一よりも良好なレベル（たとえば＜２０％）で位置情報を決定することが可能である。たとえば、λ＝６００ｎｍの波長では、δ＝５０ｎｍに対応する１ラジアン未満まで位置情報を決定することが可能である。そのような干渉システムは、光源発光体のｘ，ｙ位置もまたナノメートルスケール分解能で測定できるように構成可能である。
【００５４】
サンプルＳの厚さは、一意的なｚ座標位置を測定しうる範囲に影響を及ぼす可能性がある。たとえば、図２または４に示される二位相の実装形態では、サンプル２１０の厚さはλ／４未満であり、その場合、一意的なｚ座標位置を測定することが可能である。こうした実装形態でのｚ変位δの感度は、一様でない。言い換えれば、図３および５に示されるように、強度が正弦波の最小または最大の近傍で決定されるような位相の場合、勾配はゼロに近づくので、感度はゼロに近づく。しかしながら、強度が正弦波の最小または最大から離れて決定されるような位相の場合、こうした実装形態での変位δの感度は、測定可能でありゼロではない。
【００５５】
図６は、ビーム位相の表現を有する二位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示す。この二位相干渉顕微鏡システムでは、０またはπの干渉位相がビームに与えられる。ビーム４３２は、サンプルの変位により、ビーム４４２の位相とは異なる位相を有し、出力ビーム４５２は、位相が異なる成分４５２’と４５２’’を含む。ビーム成分４５２’および４５２’’は、図６では分離されて示されているが、これは例示を目的としたものであり、当然のことながら、ビーム成分は、互いに同時に存在して干渉する。ビーム成分４５２’はビーム４３２に由来し、かつビーム成分４５２’’はビーム４４２に由来する。同様に、出力ビーム４５４は、位相が異なる成分４５４’および４５４’’を含む。ビーム成分４５４’および４５４’’は、図６では分離されて示されているが、これは例示を目的としたものであり、当然のことながら、ビーム成分は、互いに同時に存在して干渉する。ビーム成分４５４’はビーム４３２に由来し、かつビーム成分４５４’’はビーム４４２に由来する。この実装形態では、ビーム成分４５２’とビーム成分４５２’’の位相差（光源位相２ｋδと干渉位相０の両方を含む）が、ディテクターＣＣＤφ１で検出される強度Ｉ１を決定し、ビーム成分４５４’とビーム成分４５４’’の位相差（光源位相２ｋδおよび干渉位相πの両方を含む）が、ディテクターＣＣＤφ２で検出される強度Ｉ２を決定する。
【００５６】
図７Ａおよび７Ｂは、それぞれ、図６の各ディテクターで検出される所与の出力ビームの成分のビーム強度の位相を表すグラフを示している。図６の出力ビーム４５２および４５４は、入力ビーム４３２および４４２の成分を含む。図７Ａに示されるように、４５２’および４５２’’は、出力ビーム４５２の成分であり、位相差４８０（光源位相２ｋδと干渉位相０の組合せ）だけ位相が離されている。図７Ｂに示されるように、４５４’および４５４’’は、出力ビーム４５４の成分であり、位相差４９０（光源位相２ｋδと干渉位相πの組合せ）だけ位相が離されている。これらの位相差の差は、対象物の位置に応じて変化する。図７Ａに示されるビームの二乗和は、図７Ｃに示される強度Ｉ１を有するビームを生成し、同様に、図７Ｂに示されるビームの二乗和は、図７Ｄに示される強度Ｉ２を有するビームを生成する。これらの２つのビームＩ１とＩ２の相対強度が、光源位相を決定し、それにより垂直方向変位δを決定する。
【００５７】
他の選択肢の実装形態では、干渉顕微鏡観察システムは、二位相よりも多くの位相を有しうる。たとえば、図８は、三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。図９は、適切に干渉されて図８の３つのディテクターで検出された場合の点光源からの放射光の強度のグラフを示している。
【００５８】
図１０および１１は、三方向ビームスプリッターの一実装形態を示す。この三位相干渉顕微鏡システムでは、０、２π／３、または４π／３の干渉位相がビームに与えられる。２つの発光ビーム１０１０および１０２０は、５０−５０ビームスプリッティング表面１０５０に入る。２つの得られた干渉ビームは、上側６６：３３ビームスプリッティング表面１０４０および下側ミラー表面１０７０に進行する。上側ビームのほとんど（６６％）は、出力経路１０３０に入り、３３％は、経路１０２８に進行して、ミラー表面１０７０から反射されたビーム１０２４と干渉する。この最終干渉は、５０：５０ビームスプリッティング表面１０５２で起こり、第２および第３の出力ビーム１０３２および１０３４を生じる。３つの出力間でバランスのとれた三方向干渉（すなわち、出力ビーム１０３０、１０３２、および１０３４に対して類似の振幅）を得るために、ビームスプリッターに対するミラー１０７０の位置を変化させてギャップ１０６０のサイズを変化させることにより、干渉ビーム１０２８および１０２４の干渉位相を調整することができる。ガラスプリズムの底面上での残留反射率を最小限に抑えるために、ギャップ１０６０に屈折率整合油を充填することができる。
【００５９】
図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃは、図１０の三方向ビームスプリッター中でビームスプリッティングデバイスとして使用されるストライプ状ミラーを示している。ビーム経路中の望ましくない干渉を低減するために、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示される各ストライプ状ミラーは、図１０Ａ、１０Ｂ、および１０Ｃに示される他のストライプ状ミラーに対して回転されている。
【００６０】
図１０および１１は、三方向ビームスプリッターの実装形態を介して対象物および画像平面に関連付けられた波面の伝搬をさらに示している。波面１０１２および１０２２を有する発光ビーム１０１０および１０２０は、ビームスプリッティング表面１０５０に入る。波面１０１２および１０２２は、サンプルの対象物平面に関連付けられ、かつビームスプリッティング表面１０５０で互いに干渉される。得られた波面は、三方向ビームスプリッターを通って伝搬する時、ビームスプリッティング表面１０４０および１０５２で互いに干渉する。ビームスプリッティング表面１０４０、１０５０、および１０５２は、ビームスプリッティング表面１０４０、１０５０、および１０５２での干渉時に波面の歪みおよび／または広がりに適合するのに十分な表面積を有する。出力ビーム１０３０、１０３２、および１０３４は、１０３６、１０３８、および１０３９の相対位相シフトでビーム１０１０と１０２０を組み合わせた状態で三方向ビームスプリッターから送出され、位相シフト１０３６は、２ｋδ（光源位相）＋０（干渉位相）であり、位相シフト１０３８は、２ｋδ（光源位相）＋２π／３（干渉位相）であり、位相シフト１０３９は、２ｋδ（光源位相）＋４π／３（干渉位相）である。これにより異なる強度のビーム１０３０、１０３２、および１０３が得られ、これらは、波面１０１２および１０２２のインタクトな干渉形であり、ディテクターの画像平面に伝搬する。
【００６１】
図１２は、四位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図を示している。図１３は、図１２の４つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。図８〜１２は、三位相もしくは四位相の干渉顕微鏡観察システムを有する実装形態を示しているが、四位相よりも多くの位相を有するシステム、たとえば、五位相干渉顕微鏡観察システム、六位相干渉顕微鏡観察システムなども可能である。
【００６２】
二位相干渉顕微鏡観察システムでは、たとえば、図２に示される５０：５０ビームスプリッター２５０のようなビームスプリッターを使用することが可能であるが、二位相よりも多くの位相を有する顕微鏡観察システム用のビームスプリッター（たとえば、図８に示されるもの）を多様な方法で具現化することが可能である。たとえば、図８に示されるように、ビームスプリッターは、複数の素子、すなわち、２つの５０：５０ビームスプリッター、６６：３３ビームスプリッター、およびミラーを含みうる。こうしたビームスプリッター素子は、たとえば、光学ベンチ上に手動で定置することが可能である。他の選択肢として、こうしたビームスプリッター素子を作製して１対の光学平面間に配設することが可能であり、そのようなビームスプリッター素子の位置を、たとえば、圧電トランスデューサーによる調整することが可能である。そのような調整を行えば、３本のレッグの位相シフトを２π／３だけ離したり、またはＮ本のレッグの実装形態の場合には２π／Ｎだけ離したりすることを保証できるようになり、しかも、スプリッティング平面の平行性を確保することも保証できるようになる。三方向ビームスプリッターの代替の実装形態が図８Ａに示される。
【００６３】
図８Ｂは、八方向ビームスプリッターのシステムブロック図を示している。図８Ｂに示されるように、ビームスプリッターは、複数のビームスプリッター素子を含む。それらはいずれも、破線で表されている。図８Ｂは、８本の出力ビームを生成する１６個のビームスプリッター素子を有するビームスプリッターを明示的に示しているが、当然のことながら、Ｎ本の出力ビームを生成するより多数もしくはより少数のビームスプリッター素子の場合にもこの基本構造に従うことが可能である。こうしたビームスプリッター素子は、０〜１００％の範囲内の反射率を有しうる。透過率は公称でありうる。ビームスプリッター素子の表面が実質的に互いに平行である場合、ビームの実質的に全部（またはビームの一部）（直径Ｄを有する）は、元の入力ビームＡおよびＢの反射ビーム部分またはそれらからスプリットされた他のビーム部分にコヒーレントに干渉可能である。ビームスプリッター素子の表面は、実質的に平行でありうる。たとえば、それぞれ、＜λ／Ｄの角度の範囲内である。また、ビームスプリッター素子は、入力ビームのコヒーレンス長λ２／（ｎΔλ）の範囲内で等しく離間される。ただし、λは波長であり、Δλは波長の範囲であり、かつｎは媒体の屈折率である。この隔間により、干渉は、対象のビーム波長範囲ｄｌにわたり実質的にコヒーレントであることが保証される。入力ビームＡおよびＢは、Ａ−Ｂがビームスプリッターの平面に対して法線方向のベクトルになるように方向ベクトルを有してビームスプリッターに入る。両入力ビームは、第１のビームスプリッター素子上の同一点に向けられる。ビームスプリッターが平行平面構造であれば、ある範囲内のビーム角で自己干渉が可能になり、このビーム角範囲は、たとえば、いわゆるＣＣＤディテクター（図８Ｂには示されていない）の画像平面上に集束する前のビームの平行部分の画像に関連付けられる角度範囲に対応しうる。いくつかの実装形態では、１本だけの入力ビーム（たとえば入力ビームＡまたは入力ビームＢ）が適用される場合、Ｎ本の出力ビーム（図８Ｂはｎ＝８の場合を示す）に実質的に等しくスプリットされることが保証されるように、各ビームスプリッター素子の反射率およびビームスプリッター素子間の微細間隔（コヒーレンス長未満であるが干渉角を制御するのに十分である）を変化させることが可能である。さらには、いくつかの実装形態では、入力ビームＡと入力ビームＢとの間の干渉角を３６０度／Ｎの異なる間隔に設定することが可能である。したがって、Ｎ＝８である図８Ｂに示される例では、４５度、９０度、１３５度の間隔に設定することが可能である。
【００６４】
以上に述べたように、いくつかの実装形態では、１つ以上のビームスプリッターは、薄膜コーティングを有するビームスプリッターの代わりに回折グレーティングに基づくものでありうる。たとえば、図１４は、回折グレーティングを有する四位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。この実装形態では、ビームスプリッター１４５０は、回折グレーティング１４５１〜１４５４と、ミラー１４６２および１４６４と、位相シフター１４７２および１４７４と、を含む。回折グレーティング１４５１および１４５２は、それぞれ、ミラー１４３４および１４４４から光エネルギーを受け取る。回折グレーティング１４５１は、受け取った光エネルギーを分割し、分割部分をミラー１４６２および位相シフター１４７２に伝送する。回折グレーティング１４５２は、受け取った光エネルギーを分割し、分割部分をミラー１４６４および位相シフター１４７２に伝送する。回折グレーティング１４５３は、ミラー１４６２および位相シフター１４７４から光エネルギーを受け取って混合し、混合された光エネルギーを分割し、各分割部分を異なるディテクターに伝送する。同様に、回折グレーティング１４５４は、ミラー１４６４および位相シフター１４７２から光エネルギーを受け取って混合し、混合された光エネルギーを分割し、各分割部分を異なるディテクターに伝送する。図１５は、回折グレーティングを有する六位相干渉顕微鏡システムのシステムブロック図を示している。
【００６５】
いくつかの実装形態では、スイッチャブル光源から放出された光エネルギーへの特定の光エネルギーの寄与を低減または防止するために、分光フィルター（たとえば、帯域幅フィルター、ローパスフィルター、またはハイパスフィルター）を光路中に配設することが可能である。たとえば、光路内の迷光およびノイズならびにディテクターに向かう伝搬を低減するために、光活性化時および／または光励起時に使用される光エネルギーを光路から除去することが可能である。
【００６６】
いくつかの実装形態では、光路に沿った１つ以上のサンプル、対物レンズ、ミラー、光学素子、ビームスプリッター、レンズ、分光フィルター、および他の要素を、圧電アクチュエーターなどの多軸ポジショナーに個別に結合させることが可能である。そのような多軸ポジショナーを用いれば、自動もしくは非自動の校正および定置が可能になる。このほかに、そのような多軸ポジショナーを用いれば、定置および校正に関してマニュアル法よりも精度および確度を改良することが可能である。
【００６７】
干渉計システムの構成時ならびにその定置およびアライメントのためのガイドとして、２つの入力ビーム経路中に組み込まれたシャッターを有することが有用なこともある。これにより、各経路からの画像を独立して観測し、各経路が最適に焦点調整されていることを確認することが可能である。さらには、２つの部分の画像を観測できるので、両ビームに対してシャッターを開いた時に最適な干渉で重畳されるように、一方の画像を他方の画像に対して移動させることが可能である。
【００６８】
二位相よりも多い位相を有する他の選択肢の実装形態では、感度は位相不変でありうる。それに加えて、一意的な動作範囲をλ／２まで拡張することが可能である。変位が大きくなると、λ／２を法とする位置あいまい性を生じるであろう。これは、たとえば、空間領域および時間領域の両方でまたはサンプルのセクション化で選択的照射（励起または活性化）を行うなどの追加の技術を用いて、除去可能である。三位相または四位相干渉計測を行うそのような実装形態では、たとえば、サンプルの測定部分の位置は、以下の強度により決定される。すなわち、Ｉｉｊ＝Ｇｊ×（ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２＋２×βｊ×ＡＵｉ×ＡＬｉ×ｃｏｓ（（φｉ＋φｊ）＋Ｏｆｓｊ）であり、式中、ｊ＝０、１、２、・・・は、多位相干渉計のレッグを表し、Ｉｊ＝点光源のｊ番目のレッグの強度（オフセット補正なし）であり、ｊ＝ｊ番目のレッグの干渉補正因子であり、Ｇｊ＝ｊ番目のレッグのゲインであり、Ｏｆｓｊ＝ｊ番目のレッグのオフセットであり、ＡＵｉ＝ｉ番目の点光源の上側対物レンズの振幅であり、ＡＬｉ＝ｉ番目の点光源の下側対物レンズの振幅であり、φｊ＝ｊ番目のレッグの位相シフト（これは干渉位相である）であり、φｉ＝光路長の差による点光源（すなわち蛍光分子）の位相である。
【００６９】
暗校正（ＡＵｉ＝ＡＬｉ＝０）により、ｊ番目のディテクターからの暗信号を決定することができる。すなわち、Ｉｏｊ＝Ｇｊ×Ｏｆｓｊ、Ｉｉｊ＝Ｇｊ×（ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２＋２×βｊ×ＡＵｉ×ＡＬｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ）＋Ｏｆｓｊ）である。全体の振幅は、ＡＴｉ２＝ＡＵｉ２＋ＡＬｉ２である。再スケール調整された干渉部分は、Ｘｉ＝２×ＡＵｉ×ＡＬｉ／ＡＴｉ２である。したがって、これらの変数を用いれば、強度は以下のようになる。Ｉｉｊ＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×ＡＴｉ２（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
【００７０】
ｚ方向に沿って基準光源をδだけ移動させる校正を用いて、残りの装置パラメーターＧｊ、βｊ、およびφｊを決定することができる。これにより、位相φｆ（ｚ）が約４×π／（ｎλ）δ（ｚ）だけ回転されている三位相の場合、図７と同様に各レッグにおいて振動する強度信号が得られる。ここで、ｎは、シフト経路長を有する媒体（たとえば液浸油）の屈折率である。
【００７１】
そのような一群の校正データへのあてはめを行えば、参照基準で発光基準の干渉部分Ｘｆおよびその強度ＡＴｉ２＝Ｉｆを用いて各レッグｊに対して以下の式が決定され、装置パラメーターＧｊ、βｊ、およびφｊがここで決定される。そのような校正は、位相シフト値が正確に１２０度（３本のレッグに関して）または２π／Ｎ（Ｎ本のレッグに関して）でない場合に有用となることがある。
Ｉｆｊ（ｚ）＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×Ｉｆ（１＋βｊ×Ｘｆ×ｃｏｓ（φｉ（ｚ）＋φｊ））
Ｇｊ、βｊは、基準単位、すなわちＩｆ＝１およびＸｆ＝１およびαｉ＝ＡＴｉ２／Ｉｆに規格化することによって定義することができる。
Ｉｉｊ＝Ｉｏｊ＋Ｇｊ×ＡＴｉ２（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
Ｄｉｊ＝（Ｉｉｊ−Ｉｏｊ）／（Ｇｊ×Ｉｆ） 再スケール調整された強度データ
Ｄｉｊ＝αｉ×（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ＋φｊ））
【００７２】
図２６は、自動校正法を用いる多位相干渉顕微鏡システム用の校正プロセス２６００のフロー図を示している。２６１０では、サブ回折基準などの発光体をｚ方向内の種々の位置で画像化して画像フレームシーケンスを生成する。２６１０でのこのプロセスは、サブプロセス２６１１および２６１２を含み、サブプロセスをｚ方向内の種々の位置に対して反復して画像フレームシーケンスを生成する。２６１１では、干渉顕微鏡システム中の各ディテクターで発光体の画像を取り込む。各ディテクターで取り込まれた画像フレームは、他のディテクターで取り込まれた画像フレーム中の情報に対して位相シフトされた位相関連特性（たとえば、ｊ番目のディテクターのφｊβｊ）を含む。２６１２で発光体のｚ位置をインクリメントし、２６１１をＮ回反復して画像フレームシーケンスを生成する。画像フレームシーケンス中の各画像フレームは、発光体の発光分布に関連するｘ，ｙ平面内の光エネルギー強度に基づく。
【００７３】
２６２１では、発光体の発光分布を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内の発光体発光分布を位置特定する。たとえば、特定の発光体は、ガウス分布に正確にあてはめることが可能な発光分布を有する。そのようなガウス分布により、たとえば、発光体の画像の点広がり関数の尤度を表すことが可能である。２６２２では、画像フレーム中に組み込まれた基準を用いてドリフトに関して画像フレームを補正する。次に、２６２３でドリフト補正フレームを変換して、ｘ，ｙ平面内の画像フレーム中に基準をアライメントした変換フレームを生成する。
【００７４】
２６２４では、ｚ方向における各位置に対して各イメージディテクターで取り込まれた画像フレームを和分して和分画像を生成する。和分画像は、各ディテクターにより取り込まれた位相シフト画像フレームの合成体である。２６２５では、和分画像を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内の発光体の中心を決定する。
【００７５】
２６２６で変換フレームをガウス分布のような所定の分布にあてはめ、そして２６２５で決定されたｘ，ｙ平面内の発光体の中心で各フレーム中の発光体発光分布の振幅を測定する。発光体の中心は、たとえば、発光体の位置の尤度を表すガウス分布（たとえば、三次元分布）の図心に基づきうる。２６２７では、発光体発光分布の振幅を２６２４で決定された和に規格化する。各画像に対して２６２７で決定された規格化振幅および関連ｚ位置を２６２８で記録する。たとえば、各フレームに対する規格化振幅および関連ｚ位置をルックアップテーブル内に記憶するかまたは上述の式によりパラメーター化してφｊおよびβｊを決定することが可能である。
【００７６】
以下の式は、干渉顕微鏡観察システムにより収集された強度データから光源のｚ変位δ（すなわち、サンプルの相対ｚ座標位置）を決定しうることを説明するものである。
【００７７】
校正が終了した後、データをスケール調整することが可能であり、その場合、干渉計の各出力ビームに対する値βｊおよびφｊもわかる。ｊ個の式：Ｄｉｊ＝αｉ×（１＋βｊ×Ｘｉ×ｃｏｓ（φｉ（ｚ）＋φｊ））を用いて軸方向に沿った発光体の位置を決定することが可能である。したがって、ｉ番目の分子の強度に関する３つ以上のデータ値Ｄｉ０、Ｄｉ１、Ｄｉ２、…から、３つの未知の値：αｉ、Ｘｉ、および（最も興味深い）φｉ（ｚ）を決定するための３つ以上の式が得られる。３つの位相だけが存在する場合、３つの式からこれらの３つの未知量の一意解が得られるであろう。この値、特にφｉの値は、たとえば、ニュートン法により解くことが可能である。
【００７８】
３つの位相よりも多くの位相が存在する場合、４つ以上の式から３つの未知の値を決定することが可能であり、連立方程式は制約過剰である。その場合、未知量の最良値は、χ２最小化法を用いて決定可能である。これは、次式の誤差を最小化にすることによる。χｉ＝Σｊ［Ｄｉｊ−αｉ（１＋βｊｃｏｓ（φｉ＋φｊ））］２
【００７９】
十分にバランスの取れた干渉計システム（カメラ間の位相シフト増分、均等化ゲイン、および均等化干渉効率を意味する）の近似として、次式により与えられるφｉの最良値を得ることができる。ｔａｎ（φｉ）≒−ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ）
【００８０】
ｉ番目の発光体の位相φｉがわかった後、ｚ軸に沿った垂直方向位置（ｚ方向変位）δｉを次式によって第一近似で推定することができる。ｎがサンプル環境の屈折率であることに留意されたい。δｉ≒λ×φｉ／（４πｎ）＝λ／（４πｎ）×ａｔａｎ（ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ））
【００８１】
変位δについて解くこの最後の式は、強度データから決定される位相シフトを記述する。言い換えれば、この最後の式は、干渉顕微鏡システムの各レッグに対するディテクターで検出された強度データに基づいてどのように変位δを計算するかを示している。たとえば、三位相干渉顕微鏡システムでは、（φｊ）≒−２π／３、０、２π／３である。四位相干渉顕微鏡では、（φｊ）≒０、π／２、π、３π／２である。
【００８２】
変位δを計算するための以上の式は、種々の仮定に基づいていることに留意されたい。他の選択肢の実装形態では、他の仮定を用いて、変位δを計算するための１つ以上の代替手段を得ることが可能である。たとえば、高次の補正を実数部から計算することが可能であり、これにより、各干渉計レッグのＮ位相が等間隔で離間されるかまたは干渉計レッグの感度が等しいという近似が取り除かれる。他の選択肢の実装形態は、バランスがとれていない強度感度および位相混合角を校正および補正するための手段を提供するさらなる精密化を含みうる。
【００８３】
要約すると、Ｎ位相干渉計のＮ個のスポット強度は、垂直方向位置変位δに変換可能なデータＤｊになる。
【００８４】
φｉは周期解であるので、全２πに対して、一意的に決定可能な範囲は、λ／２ｎにわたる。これより厚いサンプルでは、δを決定するうえで、整数Ｎに対して±Ｎλ／２ｎだけあいまい性が存在する。測定される点広がり関数および干渉効率のような他の属性を用いて、可能性が最も高いＮを見いだしたりまたは多値解の最良値を選択したりすることが可能である。事実上、デフォーカスの範囲は、発光体が位置する場所でλ／２ｎ以内で推定するための代替的でそれほど精密ではないが適切な方法である。これを干渉計測により推定された位置と組み合わせることにより、発光体の一意的な垂直方向位置を得ることが可能である。垂直方向位置を推定する際のさらなる検討対象の一つは、ほぼＲａｙｌｅｉｇｈ長の距離ｚＲにわたり焦点でπだけ余分に前進させる余分項であるＧｏｕｙ位相を考慮することである。この場合、δは、次式を解くことにより与えられる。φｉ≒４πδ／（ｎλ）＋ａｔａｎ（δ／ｚＲ）
【００８５】
図２７は、多位相干渉顕微鏡システム内の光活性サンプルの三次元位置情報を取得するためのプロセスのフロー図を示している。工程２７１０では、サブ回折基準などの種々のスイッチャブル光源を画像化させて画像フレームシーケンスを生成する。工程２７１０は、サブ工程２７１１および２７１２を含み、これらのサブ工程を繰返し行って、蛍光標識の様々な散在サブセットを活性化および励起し、画像フレームシーケンスを生成する。工程２７１１で、光源（図２８に図示および説明されるものなど）からの光エネルギーを使用してスイッチャブル光源を活性化および励起する。工程２７１２では、干渉顕微鏡システム中の各ディテクターで画像フレームを取り込んで、工程２７１１をＮ回反復して画像フレームシーケンスを生成する。各ディテクターで取り込まれた画像フレームは、他のディテクターで取り込まれた画像フレーム中の情報に対して位相シフトされた位相関連特性を含む。画像フレームは、スイッチャブル光源の発光分布に関連するｘ，ｙ平面内の光エネルギー強度に基づく。
【００８６】
工程２７２１では、スイッチャブル光源の発光分布を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の発光分布を位置特定する。たとえば、特定のスイッチャブル光源は、ガウス分布に正確にあてはめうる発光分布を有する。そのようなガウス分布は、たとえば、発光体の画像の点広がり関数を表すことが可能である。工程２７２２では、画像フレーム中に組み込まれた基準を用いてドリフトに関して画像フレームを補正する。次に、ドリフト補正フレームを工程２７２３で変換して、ｘ，ｙ平面内の画像フレームシーケンスの画像フレーム中に基準をアライメントした変換フレームを生成する。
【００８７】
工程２７２４では、ｚ平面内の各位置に対して各イメージディテクターで取り込まれた画像フレームを和分して和分画像を生成する。工程２７２４で、各画像ディテクターで取り込まれた変換された画像フレームが重ね合わされて、足し合わされる（すなわち、和の合計は、三位相システムに関しては、第１のディテクターでの画像＋第２のディテクターでの画像＋第３のディテクターでの画像であり、三位相において、そのような足し合わされた三つ組が多数存在しうる）。和分画像は、各ディテクターにより取り込まれた干渉画像フレームの合成体である。工程２７２５では、和分画像を所定の分布にあてはめてｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の中心を決定する。
【００８８】
変換フレームをガウス分布のような所定の分布にあてはめ、工程２７２５で決定されたｘ，ｙ平面内のスイッチャブル光源の中心で、各フレーム中のスイッチャブル光源の発光分布の振幅を測定する（工程２７２６）。発光体の中心は、たとえば、発光体の位置の尤度を表すガウス分布の図心に基づきうる。工程２７２７で、スイッチャブル光源のディテクターそれぞれへの発光分布の振幅を、工程２７２４で決定された和に規格化する。工程２７２８で、工程２７２７で決定された規格化振幅を使用して、前の工程２６２８で記録された校正データと相関付けることにより、スイッチャブル光源のｚ座標を取得する。そのような校正データは、たとえば、ルックアップテーブルに記憶することができる。ｚ座標は、たとえば、［ＣＡ１（ｚ）−ＰＡ１］２＋［ＣＡ２（ｚ）−ＰＡ２］２＋［ＣＡ３（ｚ）−ＰＡ３］２＋・・・＋［ＣＡＮ（ｚ）−ＰＡＮ］２の最小χ２を求めることによって、規格化振幅に基づいて計算することができ、式中、Ｎは、システム中のディテクターの数であり、ＣＡｉ（ｚ）は、ｚ座標での特定のサンプル位置に対して校正時に決定されたディテクターｉにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅であり、ＰＡｉは、現在のＰＡＬＭ画像フレームから決定されたディテクターｉにおける規格化ピーク光エネルギー強度振幅である。
【００８９】
他の実装形態では、干渉顕微鏡観察システムは、第３の次元ｚによって異なる経路長差をさらに生成する発光ビームの異なる部分を使用しうる。そのような他の選択肢の実装形態について図１６〜２２に関連させて論述する。より詳細には、図１６は、２つの異なる潜在位置の単一量子発光体の概念図を示しており、図１７および１８は、単一の対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図の例を示しており、図１９〜２１は、図１８のアニュラーエキスパンダーの例を示しており、図２２は、図１７の３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。これらの図について以下で論述する。
【００９０】
図１６は、２つの可能な位置の単一量子発光体の例を示している。そのような量子発光体は、たとえば、蛍光分子、量子ドット、またはサブ波長散乱中心でありうる。放射光子（波長λ）は、図１７に示される対物レンズから離れる下方向および図１７に示される対物レンズ中に入る上方向などの全方向に伝搬する。対物レンズ中に伝搬する放射光子のエネルギー部分は、ほぼ等しい強度の２つの平行ビーム、すなわち、「Ｂ」と記された内側円柱状ビームおよび「Ｃ」と記された外側環状ビーム標識化とみなしうる。内側ビーム部分Ｂおよび外側ビーム部分Ｃのサイズは、それらの強度が実質的に等しくなるように選択可能であり、そのような実質的に等しい強度は、ビームの非線形強度プロファイルに基づいて異なるビーム部分領域に対応する（たとえば、ビームエネルギーのピークは、ビームの縁に向かって減少する強度を有するビームの中心にある）。たとえば、「Ｂ」と記された内側ビーム部分は、全ビーム半径のほぼ１／３に等しい半径を有しうる。「Ｃ」と記された外側ビーム部分は、内側ビーム部分「Ｂ」の半径に対応する内半径と全ビームの半径に対応する外半径とを有しうる。
【００９１】
サンプルが、正確に焦点が合っている場合、これらのビーム部分は、一致して同位相である（図１６の左側に示されるように）。しかしながら、発光体の位置変位Δｚが存在する場合（図１６の右側に示されるように）、位相ビーム部分ＢおよびＣは、それぞれ、ΔｉｎｎｅｒおよびΔｏｕｔｅｒだけ変位する。ただし、ΔｉｎｎｅｒはΔｚに等しく、ΔｏｕｔｅｒはΔｚ×ｃｏｓ（θ）に等しい。位相ビーム部分ＢおよびＣのこの変位は、外側ビーム部分Ｃのほうが少ない光路変化を受けてｃｏｓ（θ）倍になるという事実に基づく。ただし、θは、発光体からの光線の初期円錐角である。したがって、２つのビーム間の位相シフト差が残り、これは次の値に等しい。δ＝２π（Δｉｎｎｅｒ−Δｏｕｔｅｒ）／λ＝Δｚ×（１−ｃｏｓ（θ））×２πｎ／（λ）
【００９２】
位相が３６０度にわたり増加し反復するｚ範囲は、λ／（ｎ（１−ｃｏｓ（θ））である。この単一対物レンズの実装形態に対するこのｚ範囲は、図１〜１１に関連して以上で述べた対向する対物レンズの実装形態のｚ範囲よりも長い。発光体の周りの光学環境の屈折率ｎは、位相シフトを再スケール調整する。単一対物レンズシステムの実装形態については、図１７〜２０に関連して以下でより詳細に論述する。
【００９３】
図１７は、単一の対物レンズを有する三位相干渉顕微鏡観察システムのシステムブロック図の例を示している。図１８は、図１７に示されるビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステムのシステムブロック図の例を示している。図１７に示されるように、干渉顕微鏡観察システムは、対物レンズ１７３０と、ミラー１７４４と、ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０と、ミラー１７５６と、ビームスプリッター１７５４、１７５５、および１７５８と、レンズ１７６０、１７７０、および１７８０と、ディテクター１７６５、１７７５、および１７８５と、を含む。図１８に示されるように、ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０は、ビームスプリッター１７４１と、ミラー１７４２〜１７４７と、アニュラーエキスパンダー１７４８と、アニュラーリデューサー１７４９と、を含む。
【００９４】
アニュラーエキスパンダー１７４８は、所与の半径を有する光を受光して光の半径を拡大する任意のタイプのデバイスでありうる。たとえば、アニュラーエキスパンダー１７４８は、ミラー１７４２からの光の内側円柱状ビームを受光することが可能であり（断面形状は、図１７を参照して論述された内側ビーム「Ｂ」に類似している）、より大きい外径を有する環形状を有する光を生成することが可能である（たとえば、断面形状は、図１７を参照して論述された外側ビーム「Ｃ」に類似している）。同様に、アニュラーリデューサー１７４９は、所与の半径を有する光を受光して光の半径を縮小する任意のタイプのデバイスでありうる。たとえば、アニュラーリデューサー１７４９は、ミラー１７４２からの光の外側環状ビームを受光することが可能であり（断面形状は、図１７を参照して論述された外側ビーム「Ｃ」に類似している）、より小さい内径を有する内側円柱形状（またはより小さい環形状）を有する光を生成することが可能である（たとえば、断面形状は、図１７を参照して論述された内側ビーム「Ｂ」に類似している）。
【００９５】
図１９〜２１は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの例を示している。より詳細には、図１９は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの断面図を示しており、図２０は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの端面図を示しており、そして図２１は、図１８に示されるアニュラーエキスパンダーの６つのプリズム素子のうちの３つの斜視図を示している。図１９〜２１に示されるように、アニュラーエキスパンダー１７４８は、アニュラーエキスパンダー１７４８の中心線の近傍に離間して配置された６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆを有する。ただし、６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの一方の端は、６つのプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの他方の端によりまとめて画定される環状多面表面のサイズとは異なるサイズを有する環状多面表面をまとめて画定する。図１９に示されるように、光は、より小さい環状多面表面を画定するプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの端に入り、そしてより大きい環状多面表面を画定するプリズム１７４８ａ〜１７４８ｆの端から出る。図２０は、より大きい環状多面表面から、より小さい環状多面表面に向かって、ページ中の方向に見たアニュラーエキスパンダー１７４８の端面図を示している。明示的に示されていないが、アニュラーリデューサー１７４９は、アニュラーエキスパンダー１７４８と同様に構成される。ただし、光は、より小さい環状多面表面を画定するプリズムの端に入り、そしてより大きい環状多面表面を画定するプリズムの端から出る。
【００９６】
次に、図１７および１８に戻って、システムを介して伝搬する光を参照しながら、三位相干渉顕微鏡観察システムについて説明する。図１７に示されるように、エネルギーは、サンプル（図１７中で「Ｓ」と記される）から放射され、そしてミラー１７４４によりビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０の方向に反射される。ビームスプリッター／アニュラーリバーサーシステム１７４０の５０：５０ビームスプリッター１７４１（図１７に示される）は、光の一部をミラー１７４２に伝送し、光の残りの部分をミラー１７４３に伝送する。光を２つのビーム部分に分離するために、ミラー１７４２は、外側ビーム部分Ｃをミラー１７４５の方向に反射するとともに、内側ビーム部分のビームＢをミラー１７４４の方向に反射する。ミラー１７４５および１７４４は、それぞれ、外側ビーム部分Ｃおよび内側ビーム部分Ｂを、それぞれ、アニュラーエキスパンダー１７４８およびアニュラーリデューサー１７４９の方向に反射する。アニュラーエキスパンダー１７４８は、受光した光をミラー１７４６の方向に拡大し、このミラーは、拡大された光をビームスプリッター１７５４の方向に反射する（図１７に示される）。同様に、アニュラーリデューサー１７４９は、その受光した光の半径をミラー１７４７の方向に縮小し、このミラーは、縮小された光を５０：５０ビームスプリッター１７５４の方向に反射する。
【００９７】
５０：５０ビームスプリッター１７５４は、ミラー１７４６および１７４７から受光した光の半分を６６：３３ビームスプリッター１７５５の方向に反射し、光の残りの半分をミラー１７５６に伝送する。５０：５０ビームスプリッター１７５４も同様に、ミラー１７４３からの受光した光の半分をミラー１７５６の方向に反射し、光の残りの半分を６６：３３ビームスプリッター１７５５に伝送する。６６：３３ビームスプリッター１７５５は、受光したビームの３３％を５０：５０ビームスプリッター１７５８の方向に反射し、受光したビームの残りの６６％をレンズ１７６０の方向に伝送する。ミラー１７５６は、受光したビームを５０：５０ビームスプリッター１７５８の方向に反射するとともに余分の位相シフトを追加する。５０：５０ビームスプリッター１７５８は、ミラー１７５６から受光したビームの５０％をレンズ１７８０の方向に反射し、ミラー１７５６から受光したビームの５０％をレンズ１７７０の方向に伝送する。５０：５０ビームスプリッター１７５８も同様に、６６：３３ビームスプリッター１７５５から受光したビームの５０％をレンズ１７７０の方向に反射し、６６：３３ビームスプリッター１７５５から受光したビームの５０％をレンズ１７８０の方向に伝送する。
【００９８】
光路長に差が存在するように、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８、ミラー１７５６、ならびに６６：３３ビームスプリッター１７５５を配置しうることに留意されたい。より詳細には、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８ならびに６６：３３ビームスプリッター１７５５の間の光路距離ｘは、５０：５０ビームスプリッター１７５４および１７５８ならびにミラー１７５６の間の距離ｘ＋δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒよりも短くすることが可能である。たとえば、２つの距離間の光路差δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒを波長λの１／８になるように選択することが可能でありかつ波長λが５８０ｎｍであると仮定すると、２つの距離間の差δｂｅａｍｓｐｌｉｔｔｅｒは、７２ｎｍに選択可能である。
【００９９】
レンズ１７６０に伝送されたビーム、レンズ１７７０に伝送されたビーム、およびレンズ１７８０に伝送されたビームは、それぞれ、実質的に等しい振幅を有する。レンズ１７６０、１７７０、および１７８０は、それぞれ、それぞれのビームをディテクター１７６５、１７７５、および１７８５に集束させる。３つのディテクター１７６５、１７７５および１７８５での発光画像の強度は、光源位相（すなわち、サンプルのｚ位置）の関数として変化する。なぜなら、３つのディテクター１７６５、１７７５、および１７８５間の相対強度は、約１２０度の位相シフトを有するからである。図２２は、図１７に示される３つのディテクターで検出される放射光の強度のグラフを示している。３つのディテクター１７６５、１７７５、および１７８５により検出される強度をモニタリングすることにより、内側ビーム部分Ｂおよび外側ビーム部分Ｃの間の初期オフセットの位相シフトは、図１〜１１に関連して先に記載したように推定可能である。
【０１００】
この光源位相シフトδを用いて発光体のｚ位置を計算することが可能である。Δｚ＝δλ／（ｎ（１−ｃｏｓ（θ））
【０１０１】
いくつかの実装形態では、校正技術を用いて、ディテクターのバランスがとれていない強度感度および位相混合角を補正することが可能である。図１７〜２２に示される実装形態は、約１２０度の位相シフトを有する３つのディテクターに対して記述したものであるが、異なる数のディテクターを有する他の実装形態が可能である。さらに他の実装形態では、画像化スポット形状を用いて、いかなる周期的あいまい性または位置あいまい性をも解消することが可能である。他の選択肢として、位置計算用の追加情報として画像化スポット形状を使用することが可能である。
【０１０２】
図２３〜２５は、アニュラーエキスパンダーの例を示している。より詳細には、図２３は、アニュラーエキスパンダーの端面図を示しており、図２４は、ラインＸＸ−ＸＸに沿った図２３のアニュラーエキスパンダーの断面図を示しており、図２５は、ラインＸＸＩ−ＸＸＩに沿った図２３のアニュラーエキスパンダーの断面図を示している。図２３〜２５に示されるように、アニュラーエキスパンダー２３００は、６つのプリズム２３１０ａ〜２３１０ｆと、６つのミラー２３２０ａ〜２３２０ｆと、６つのミラー２３３０ａ〜２３３０ｆと、を有する。プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍に離間して配置される。ただし、６つのプリズムの一方の端は、６つのプリズムの他方の端によりまとめて画定される環状表面のサイズとは異なるサイズを有する環状表面をまとめて画定する。ミラー２３２０ａ〜２３２０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍にかつ６つのプリズム２３１０ａ〜２３１０ｆにより画定される内側中央部分内に配置される。ミラー２３３０ａ〜２３３０ｆは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍にかつ隣接プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆ間の間隙により画定される外側部分の近傍に配置される。
【０１０３】
図２４に示されるように、各プリズム２３１０は、入射面２３１０’および出射面２３１０’’を含む。入射面２３１０’は、出射面２３１０’’に平行であり、かつそれよりも小さい内半径および外半径を有する。各プリズム２３１０はまた、全内部反射（ＴＩＲ）の条件が満たされるように、入射面２３１０’および出射面２３１０’’に対して角度を付けた２つの側壁２３１０’’’および２３１０’’’を含む。したがって、光は、入射面２３１０’で各プリズム２３１０に入り、側壁２３１０’’’でＴＩＲによる反射および側壁２３１０’’’’でＴＩＲによる反射を受け、次に、出射面２３１０’’から出る。このようにすれば、アニュラーエキスパンダー２３００を出る時に入射光の半径を拡大することが可能になる。
【０１０４】
図２５に示されるように、ミラー２３２０ａ〜２３２０ｆは、それぞれ、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線に沿ってかつその近傍でミラー２３３０ａ〜２３３０ｆの方向に外向きに光を反射する。ミラー２３３０ａ〜２３３０ｆは、隣接プリズム２３１０ａ〜２３１０ｆにより画定される間隙間に受光した光を反射する。たとえば、ミラー２３２０ａは、アニュラーエキスパンダー２３００の中心線の近傍で光の一部をミラー２３３０ａの方向に反射し、ミラー２３３０ａは、プリズム２３１０ａおよびプリズム２３１０ｂとの間に画定された間隙間にこの光を反射する。全体として、これにより光の中央部分を拡大して、増大されたスループットを提供することが可能になる。
【０１０５】
明示的に示されていないが、アニュラーリデューサーは、アニュラーエキスパンダー２３１０と同様に構成することが可能である。ただし、光は、より大きい環状表面を画定するプリズムの端に入り、より小さい環状表面を画定するプリズムの端から出る。図１９〜２０および２３〜２５に示される実装形態は、特定の屈折素子および／または反射素子を用いて示されているが、他の実装形態および配置、たとえば、回折素子またはそれらの任意の組合せを有する実装形態も可能である。
【０１０６】
一意の垂直位置の決定
上述したように、φ１は循環解であり、したがって一意に決定可能な範囲は、２πごとにλ／２ｎである。したがって、初めに、取り得るｚ方向位置δｉの組が上述したように決定され、装備に応じて上述の一般式によって与えられる。たとえば、２つの対物レンズを有するシステムに関して、取り得るｚ方向位置の組に関する一般式は、δｉ≒λ×φｉ／（４πｎ）＝λ／（４πｎ）×ａｔａｎ（ΣｊＤｉｊｓｉｎ（φｊ）／ΣｊＤｉｊｃｏｓ（φｊ））である。図２８〜４０Ｂに関して以下に論じるように、上述したシステムおよび方法は、取り得る位置の組の中から第３の直交次元（ｚ次元）での光源の位置を決定するように修正することができる。
【０１０７】
図２８を参照すると、多位相干渉顕微鏡観察装置２８００が、サンプル２８０４に光学的に結合された光駆動システム２８０２と、干渉システム２８０６と、少なくとも２つのディテクター２８０８、２８１０、２８１２と、少なくとも２つのディテクター２８０８、２８１０、２８１２に接続された制御装置（たとえばプロセッサー）２８１４とを含む。少なくとも２つのディテクター２８０８、２８１０が示されているが、干渉システム２８０６の幾何形状によっては追加のディテクター（ディテクター２８１２など）を使用することもできる。
【０１０８】
本明細書の残りの部分を通じて、座標系を説明するときには以下の慣例に従う。２つの座標系または基準フレームを使用する。第１の座標系は、サンプル（または対象物）座標系であり、これは、サンプルの位置での静止座標系である。サンプル座標系は、サンプル位置での一組の直交次元、すなわち、第１のサンプル次元２８１６（ｘ次元とも呼び、紙面から出る方向に向かう）と、第２のサンプル次元２８１８（ｙサンプル次元とも呼ぶ）と、第３のサンプル次元２８２４（ｚ次元または垂直次元とも呼ぶ）とによって定義される。また、第１および第２のサンプル次元２８１６、２８１８を横方向次元とも呼び、第３のサンプル次元２８２４を軸方向次元とも呼ぶ。第２の座標系は、ビーム座標系であり、これは、ビームと共に移動する移動可能な座標系である。ビーム座標系は、ビーム伝搬方向と、ビーム伝搬方向に対して横方向または垂直である２つの方向とによって定義される。
【０１０９】
サンプル２８０４は、概して、第１の直交サンプル次元２８１６と第２の直交サンプル次元２８１８によって定義されるサンプル平面に沿って延在する。光駆動システム２８０２は、サンプル２８０４内の光源が複数の光路に光ビームを放出するように、具体的には２つの正反対の光路または光伝搬方向２８２０、２８２２に沿って第１および第２の光ビームを放出するように構成され、これらの光伝搬方向２８２０、２８２２は、第３の直交サンプル次元２８２４と概して平行であり、光学素子２８４０、２８４４の対物レンズ内部で対物レンズを通過した後に干渉システム２８０６に向けられる。光駆動システム２８０２は、サンプル２８０４に光学的に結合され、サンプル２８０４内のスイッチャブル光源のうち十分に統計的に散在するサブセットを活性化するように構成される。活性化は、光源が少なくとも回折限界距離だけ離隔されるように、制御された散在する活性標識密度を生成する任意の活動であってよい。したがって、この離隔距離にするには光源が少なすぎる場合には、活性化によって光源を追加することができ、あるいは、光源が多すぎて、回折限界距離未満で離隔されている場合には、活性化を減少することによって光源を減らすことができる。また、システム２８０２は、活性化されたスイッチャブル光源を励起することもでき、それにより光ビームは、活性化されたスイッチャブル光源から複数の光路に沿って、具体的には干渉システム２８０６に交差する光路２８２０、２８２２に沿って放出される。
【０１１０】
したがって、光駆動システム２８０２は、活性化ビームをサンプル２８０６に照射する第１のレーザーと、サンプル２８０４内の活性化されたスイッチャブル光源を励起ビームによって励起する第２のレーザーとを含むことができる。他の実装形態では、光駆動システム２８０２は、活性化源および／または励起源として動作する発光ダイオードおよび白熱灯の１つまたは複数を含むことができる。光駆動システム２８０２は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２に達するノイズの量を減少させるために、サンプル２８０４から放出される光ビームの波長とは異なる波長で動作する。
【０１１１】
干渉システム２８０６は、光源から放出された第１および第２の光ビームを受け取り、第１および第２の光ビームをそれぞれ２つ以上の分割ビームに分割し、分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成し、合成ビームが、それぞれの光路（またはビーム伝搬方向）２８３０、２８３２、２８３４に沿って送られるように構成される。各合成ビーム（光路２８３０、２８３２、２８３４に沿って進む）は、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、これは、光源の位置に対する光ビームの光路長の差による光ビーム間の位相差によって少なくとも部分的に引き起こされる。干渉システム２８０６は、上述したビームスプリッター、たとえばビームスプリッター１５０、２５０、または１０５０、あるいは図８、８Ａ、８Ｂ、１０、１１、１２、１４、１５、１７、および１８に示されるビームスプリッターのいずれであってもよい。
【０１１２】
装置２８００は、光学素子２８４０、２８４４を含み、これらは、サンプル２８０４から干渉システム２８０６へのそれぞれの光路２８２０、２８２２を定義する任意のタイプの光学素子であってよい。各光学素子２８４０、２８４４は、１つまたは複数のミラー、レンズ、または対物レンズを含むことができる。各光学素子２８４０、２８４４は、サンプル２８０４内の光源から放出された光エネルギーを平行化するレンズまたは対物レンズを含むことができる。上述したように、光学素子２８４０、２８４４の１つまたは複数がアパーチャーを含むことができ、このアパーチャーを通して光駆動システム２８０２からの光エネルギーをサンプル２８０４に照射することができると共に、光駆動システム２８０２の励起レーザーからディテクター２８０８、２８１０、２８１２に向かって進む迷放射の量を減少する。
【０１１３】
また、装置２８００は、光学素子２８５０、２８５４、２８５８を含み、これらはそれぞれ、干渉システム２８０６から光路２８３０、２８３２、２８３４に沿って進む当該の合成ビームを受け取り、合成ビームを当該のディテクター２８０８、２８１０、２８１２に向け直す。上述したように、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２は、干渉システムから出力された各合成ビームの強度を個別に検出するように構成される。
【０１１４】
プロセッサー２８１４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２に接続され、λ／２ｎよりも厚いサンプルに関する取り得る垂直位置の組の中から、サンプル２８０４内の光源の垂直次元に沿った一意の位置δを決定するための処置を行うように構成され、ここで、λは、合成ビームでの光の波長であり、ｎは、サンプル２８０４の媒体の屈折率である。上述したように、λ／２ｎよりも厚いサンプルに関しては、垂直位置δを決定する際の±Ｎλ／２ｎ（Ｎは整数）に曖昧さがある。プロセッサー２８１４は、最も可能性の高いＮを見い出すために他の属性（光ビームまたは合成ビームの波面修正によって引き起こされる画像変化など）を使用し、多数解の最良垂直位置を選択する。プロセッサー２８１４によって使用される属性は、光源の垂直位置と共に変化する属性である。
【０１１５】
プロセッサー２８１４によって使用される光ビームまたは合成ビームの波面修正は、装置２８００を通って進む際に光ビームおよび／または合成ビームが相互作用することによって引き起こされる修正でありうる。
【０１１６】
代替としてまたは追加として、装置２８００は、当該の光学素子２８４０、２８４４の少なくとも１つに、波面修正システム２８６０、２８６４を含むことができる。波面修正システム２８６０、２８６４は、少なくとも１つの光ビームおよび／または合成ビームの可変の波面修正を能動的に導入するように構成される。図３１Ａ、３６Ａ、３９Ａ、および４０Ａに関して以下に詳細に述べるように、波面修正システム２８６０、２８６４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２に達する合成ビームに、デフォーカス、曲率、および輝度分散の１つまたは複数をもたらす１つ以上のデバイスを含むことができる。
【０１１７】
いくつかの実装形態では、装置２８００は、普通であれば干渉システム２８０６に向けられる小さなパーセンテージの光を除去するために、光路２８２０、２８２２の１つまたは複数に位置決めされたビームスプリッター２８８０を含む。ビームスプリッター２８８０は、ディテクターシステム２８８２に光を向け、ディテクターシステム２８８２は、光学素子およびディテクターを含むことができ、図３７Ａおよび３８に関して以下に論じるように、このディテクターはまたプロセッサー２８１４に接続される。ディテクターシステム２８８２は、図３７Ａに関して以下に論じるように、光ビームへの可変の波面修正を能動的に導入する光学素子を含むことができる。
【０１１８】
図２９を参照すると、プロセッサー２８１４は、サンプル２８０４内の光源の一意の垂直位置δを決定するための処置２９００を行う。プロセッサー２８１４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２から（またはディテクターシステム２８８２内のディテクターから）電子出力を受け取る（工程２９０４）。ディテクター２８０８、２８１０、２８１２は、各合成ビームの画像を検出し、画像のデータを電子信号に変換する。上で詳述したように、プロセッサー２８１４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２からの各合成ビームの画像の中心領域に基づいて、サブ回折確度で、サンプル平面内での光源の位置を計算する（工程２９０８）。また、上で詳述したように、プロセッサー２８１４は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２からの各合成ビームの個別に検出された強度に基づいて、サンプル平面に垂直な第３の直交次元（垂直方向）における光源の取り得る位置の組を計算する（工程２９１２）。したがって、工程２９０８および２９１２で、プロセッサー２８１４は、光活性化局所干渉顕微鏡観察処置を行い、この処置は上で詳述したものであり、ここでは繰り返さない。
【０１１９】
プロセッサー２８１４は、波面修正に基づいて、第３の直交次元に沿った光源の位置と共に変化する合成ビーム（またはディテクターシステム２８８２が光路２８２０、２８２２内に装備されている場合には光ビーム）の画像の属性（たとえば形状またはピーク値）を分析する（工程２９１６）。以下により詳細に論じるように、波面修正は、サンプル２８０４の光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率（たとえばデフォーカスまたは非点収差）および形状のうちの１つまたは複数の修正である。
【０１２０】
プロセッサー２８１４は、分析された形状に基づいて、取り得る位置の組の中から第３の直交次元での光源の位置を決定する（工程２９２０）。
【０１２１】
図３０を参照すると、多位相干渉顕微鏡観察装置３０００は、サンプル３００４に光学的に結合された光駆動システム３００２と、干渉システム３００６と、少なくとも２つのディテクター３００８、３０１０、３０１２と、少なくとも２つのディテクター３００８、３０１０、３０１２に接続された制御装置（たとえばプロセッサー）３０１４とを含む。装置３０００は、サンプル３００４の両側にある光学素子３０４０、３０４４と、干渉システム３００６と当該のディテクター３００８、３０１０、３０１２との間にある光学素子３０５０、３０５４、３０５８とを含む。
【０１２２】
各光学素子３０４０、３０４４は、対物レンズ３０４１、３０４５およびミラー３０４２、３０４６を含む。対物レンズ３０４１、３０４５は、当該のミラー３０４２、４０４６に向けられる平行化された光ビームを形成し、ミラー３０４２、３０４６は、光ビームを干渉システム３００６に向け直す。
【０１２３】
それぞれディテクター３００８、３０１０、３０１２に達したビームは、波面修正によって、第３の直交次元での光源の位置と共に画像が変化するように変形されている。たとえば、波面を修正するためにサンプル３００４と干渉システム３００６の間に光学要素を追加することによって（たとえば図３６Ａ、３７Ａ、または３８に図示されるように）、または光ビームを修正するために、したがってディテクター３００８、３０１０、３０１２に達する合成ビームの波面を修正するために光学素子３０４０、３０４４内部の光学要素の１つを修正することによって（たとえば図３１Ａ、３９Ａ、または４０Ａに示されるように）、この波面修正機能を装置３０００に能動的に付け加えることができる。波面修正は、装置３０００の構成の固有の特性であってよく、図３８に示されるように検出することができる。いずれにせよ、波面修正は、各ディテクター３００８、３０１０、３０１２での画像の属性（たとえば形状）に変化を与え、その属性修正を分析して、第３の直交次元での光源の位置を決定することができる。
【０１２４】
図３１Ａを参照すると、多位相干渉顕微鏡観察装置３１００が、ミラー３１４２、３１４６を含み、これらのミラーは、サンプル３１０４から放出された当該の光ビームの波面曲率の比較的小さな修正をそれぞれ提供するように修正されている。ミラー３１４２、３１４６は、それぞれ、円筒形（ただ１つの方向に沿って湾曲された）または双円錐形（すなわち、２つの横方向に沿って逆に湾曲され、サドルまたは双曲放物面形状を有する）であってよい。たとえば、ミラー３１４２の表面は、ミラー３１４２の中心で取られた垂線３１７２に対して横方向である第１の方向３１７０に沿って凸形であり、垂線３１７２および第１の方向３１７０に対して横方向である第２の方向３１７４（紙面に向かう方向）に沿って凹形である（ミラー３１４２の拡大図でより詳細に示される）。さらに、ミラー３１４６の表面は、ミラー３１４６の中心で取られた垂線３１８２に対して横方向である第１の方向３１８０に沿って凹形であり、垂線３１８２および第１の方向３１８０に対して横方向である第２の方向３１８４（紙面から出る方向）に沿って凸形である（ミラー３１４６の拡大図でより詳細に示される）。ミラー３１４２、３１４６は、逆または補完形状を有するように設計され、それにより、ミラー３１４２、３１４６から反射される光ビームの波面が干渉システム３１０６を通過した後に互いに重なり合い、すなわち合成ビームの波面が干渉システム２８０６を通過した後に互いに重なり合う。
【０１２５】
いくつかの実装形態では、ミラー３１４２、３１４６は、波面曲率修正を加えるのに必要な形で平面ミラーを湾曲させるために平面ミラーの表面および／または裏面に沿った点に適当な力を加えることによって形成される。他の実装形態では、ミラー３１４２、３１４６は、ミラー表面上での適当な曲率を得るために平面ミラーを研磨または被覆することによって形成される。
【０１２６】
上述したように、ミラー３１４２または３１４６に当たる光ビームは、ビーム伝搬方向に対して横方向である２つの方向に沿ってその波面が平面であることで平行化されている。したがって、ミラー３１４２または３１４６が横方向間の対称性を破り、したがって両横方向で波面はもはや平面でない。波面は、円筒形ミラーを使用してただ１つの横方向で湾曲されるようになすことができ、または双円錐形ミラーを使用して両横方向で（しかしほぼ逆の量で）湾曲されるようになすこともできる。各ミラー３１４２、３１４６は、当該のビーム伝搬方向に対する２つの横方向に関して、わずかに異なる２つの焦点面を形成する。その結果、第３の直交次元での光源の位置がサンプル平面（垂直位置δがゼロである位置である）に関して変化するにつれて、画像の楕円率および向きが変化する。すなわち、ゼロ垂直位置にある光源は、ディテクターでの平均焦点面に相関し、したがってディテクターでの画像は円形または対称的に現れる。ゼロ垂直位置よりも上の光源は、第２の横方向よりも第１の横方向で強く合焦され、長手軸が第２の横方向に沿った楕円としてディテクターに現れ、一方、ゼロ垂直位置よりも下の光源は、第１の横方向よりも第２の横方向で強く合焦され、長手軸が第１の横方向に沿った楕円としてディテクターに現れる。
【０１２７】
各光ビームの波面に対する修正は、最終的に、ディテクターでの（ビーム伝搬方向に対して）第１の横方向に沿った第１の値の放物線状に変化する位相と、ディテクターでの（ビーム伝搬方向に対して）第２の横方向に沿った第２の値の放物線状に変化する位相とをもたらす。このようにして、上側または下側対物レンズにより近い点光源は、第１の横方向に沿った焦点面が第２の横方向に沿った焦点面とはずらされる。
【０１２８】
上述したように、干渉法のみを使用して決定された複数の値の組の中からサンプル内にある光源の垂直位置δを正確に決定することができるように、曲率の量は、ディテクターに達する合成ビームに十分なデフォーカスを与えるのに十分であるように選択される。もたらされた曲率が、ビームの中心とビームの外縁部の間で４πまたは２λ未満の位相差を生じるべきであり、ここでλは光の波長である。もたらされた曲率がこの量よりも大きい場合、ディテクターでの画像は、過度に楕円になることがあり、その結果、過剰に細長い軸に沿って中心を見い出すのはより難しい。中心を見い出すことは、（ｘおよびｙサンプル次元に沿った）サンプル平面内での光源の位置を決定するため、またはｚサンプル次元に沿った光源の取り得る位置の組を決定するために重要である。特に、サンプル平面での光源位置の精度は、分子画像のファジィ半径（すなわち、ガウスシグマ）に直接比例する。したがって、追加の曲率によるデフォーカスの量は、一般には動作範囲にわたって約２０〜３０％に保たれる。
【０１２９】
ミラー３１４２、３１４６によって引き起こされる波面曲率によって、点光源の点広がり関数（ＰＳＦ）は、ディテクター２８０８、２８１０、２８１２で測定されるときに楕円になる。垂直位置δの関数としての楕円率εの一般化したあてはめが、３つの異なる垂直位置δの値で、ディテクターでの一般的な蛍光画像と共に図３１Ｂに示される。プロセッサー２８１４が、第３の直交次元での光源の位置を決定するために合成ビームの蛍光画像の形状を分析する。
【０１３０】
また図３２を参照すると、ナノ粒子の３つの異なる既知の垂直座標Ｚに関して、単一の金ナノ粒子（光源として作用する）の実際の回折限界蛍光画像３２００がディテクターで取得されている。ナノ粒子は、既知の垂直座標Ｚ＝−２３０ｎｍ（左欄３２１０）、Ｚ＝０ｎｍ（中央欄３２２０）、およびＺ＝＋２３０ｎｍ（右欄３２３０）に配置されている。画像３２００に対応するガウスフィット３２４０、および画像３２００とそれに対応するガウスフィット３２４０との差３２５０が、当該の画像３２００の下に示される。さらに、データのｘおよびｙ断面３２６０が、当該の画像３２００およびガウスフィット３２４０の下に示される。
【０１３１】
蛍光画像のガウスフィット３２４０を用いることによって、蛍光画像３２００から属性、この場合は楕円率εが決定される。楕円率εは、以下の式から求められる。
【数１】
ここで、σｘおよびσｙは、対応するガウスフィット３２４０の標準偏差（ガウス幅）である。以下に他の実装形態において述べるように、装置の設計に応じて、他の属性（位相角差またはピーク輝度など）を使用することもできる。
【０１３２】
次に、図３３に示されるように、約２５μｍ×２５μｍの領域にわたって拡散された約４０個の金ナノ粒子の領域に関して、点光源の既知の垂直位置Ｚについて楕円率εが測定される。生のデータが、点として示される。さらに、生のデータは、式Ｚε＝ｍ１＋ｍ２・ε＋ｍ３・ε３に適合される。測定された、光源の垂直位置δに対する楕円率εの依存性は、決定された第１および第２の直交位置の精度よりも精度が低いが、この依存性は、単一の干渉縞に限定されず、単に縞次数を決定するために用いられ、これは、広い範囲の光源位置にわたる垂直位置δの正確な決定を可能にする。この決定は、以下のように行われる。
【０１３３】
装置２８００または３０００の校正中、（図３３に示されるように）属性（この場合は楕円率ε）と点光源のサンプル垂直位置Ｚとの関係の生データが記録され、３つのディテクターそれぞれでのピーク強度と点光源のサンプル垂直位置Ｚとの関係が記録される。このピーク強度から、取り得る垂直位置の組Ｚｉｎｔｅｒｆを決定することができる。取り得る垂直位置の組Ｚｉｎｔｅｒｆとサンプル垂直位置Ｚとの関係は、図３４のグラフに示される。実際の垂直位置δは、以下の式を使用して計算することができる。
【数２】
ここで、Ｚｉｎｔｅｒｆｒａｎｇｅは、反復される垂直距離の周期である。たとえば、図３３に示されるように、サンプル垂直位置に関して２４０ｎｍごとにＺｉｎｔｅｒｆの測定値が反復されるので、Ｚｉｎｔｅｒｆｒａｎｇｅは約２４０ｎｍである。Ｚｉｎｔｅｒｆｒａｎｇｅの値は、光ビームの波長λと、サンプル媒体の屈折率ｎとに依存し、約λ／２・ｎになると推定することができる。用語「丸め」は、式中のあまり正確でない第２の項によって、より正確な値Ｚｉｎｔｅｒｆを乱すのを避けるために、引数の値を最も近い整数値に単に丸めることである。丸め処理は、本質的に、干渉縞の整数次数のみを抽出する。図３３および３４からのデータを使用した計算結果が図３５に示される。ここから分かるように、計算は、約７００ｎｍの範囲にわたって有効であり、これは、実験で使用された高い開口数の対物レンズの被写界深度に近い。約−４５０ｎｍ〜＋３００ｎｍの範囲にわたる測定点の総数に対する、不正確に求められた干渉縞次数の数の誤り率は、約２．９％である。さらに、Ｚε−Ｚによって与えられる不確定性パラメーターＺｕを導入することによって、またＺｕが許容範囲外となるデータをフィルター除去することによって、エラー率を減少させることができる。
【０１３４】
また図３６Ａを参照すると、多位相干渉顕微鏡観察装置３６００は、当該の対物レンズ３６４１、３６４５とミラー３６４２、３６４６の間に配置されたレンズ３６４２、３６４７を含む。ミラー３６４２、３６４６は、サンプル３６０４から放出される光ビームに対して波面修正を行わないように平面状に形成することができる。しかし、この場合、レンズ３６４３、３６４７は、サンプル３６０４から放出される当該の光ビームの曲率に対して波面修正を提供する。したがって、レンズ３６４３、３６４７はそれぞれ、円筒形（ただ１つの方向に沿って湾曲された）または双円錐形（すなわち、ミラー３１４２、３１４６の表面と同様に、２つの横方向に沿って逆に湾曲され、サドルまたは双曲放物面形状を有する）であってよい。
【０１３５】
たとえば、レンズ３６４３の斜視図に示されるように、レンズ３６４３の表面は、ビーム伝搬方向に対して横方向である第１の方向に沿って凸形であってよく、ビーム伝搬方向および第１の方向に対して横方向である第２の方向に沿って凹形であってよい。さらに、レンズ３６４７の斜視図に示されるように、レンズ３６４７の表面は、ビーム伝搬方向に対して横方向である第１の方向に沿って凹形であってよく、ビーム伝搬方向および第１の方向に対して横方向である第２の方向に沿って凸形であってよい。レンズ３６４３、３６４７は、逆または補完形状を有するように設計され、それにより、光ビームの波面が干渉システムを通過した後に互いに重なり合い、すなわち合成ビームの波面がディテクターで互いに重なり合う（これは図２８および３０に示される）。
【０１３６】
レンズ３６４３、３６４７に当たる光ビームは、ビーム伝搬方向に対して横方向である２つの方向に沿ってその波面が平面であることで平行化されている。したがって、レンズ３６４３または３６４７が横方向間の対称性を破り、したがって両横方向で波面はもはや平面でない。装置３６００におけるレンズ３６４３、３６４７は、波面の曲率を修正する働きをするという点で、装置３１００における修正ミラー３１４２、３１４６と同じ目的を果たし、当該のビーム伝搬方向に対する２つの横方向に関して、わずかに異なる２つの焦点面を形成する。その結果、図３６Ｂに示されるように、第３の直交次元での光源の位置がサンプル平面（垂直位置δがゼロである位置）に対して変化するにつれて、画像の楕円率および向きが変化する。上述したように、この情報をプロセッサーが使用して、第３の直交次元での光源の位置を決定することができる。
【０１３７】
図３７Ａを参照すると、別の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置３７００が、普通であれば干渉システム（図２８の干渉システム２８０６など）に向けられる小さなパーセンテージの光をフィルター除去するために、各光路３７２０、３７２２内に位置決めされたビームスプリッター３７８０を含む。各ビームスプリッター３７８０は、当該のディテクターシステム３７８２に光を向け、各ディテクターシステム３７８２は、光学素子およびディテクターを含み、このディテクターはまたプロセッサー（図２８のプロセッサー２８１４など）に接続される。ディテクターは、たとえば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）であってよい。特に、下側ディテクターシステム３７８２は、下側ビームスプリッター３７８０からの光ビームを受け取る波面対称性破壊レンズ３７８４と、光ビームを合焦する集束レンズ３７８６と、特定の波長範囲外の光を遮断するフィルター３７８８と、ディテクター３７９０とを含む。波面対称性破壊レンズ３７８４は、図３６Ａに示される装置３６００におけるレンズ３６４７と同様に、光ビームに可変の波面修正を能動的に導入する。上側ディテクターシステム３７８２は、上側ビームスプリッター３７８０からの光ビームを受け取る波面対称性破壊レンズ３７９２と、光ビームを合焦する集束レンズ３７９４と、特定の波長範囲外の光を遮断するフィルター３７９６と、ディテクター３７９８とを含む。波面対称性破壊レンズ３７９２は、図３６Ａに示される装置３６００におけるレンズ３６４３と同様に、光ビームに可変の波面修正を能動的に導入する。レンズ３７８４および３７９２は、図３６Ａの装置３６００でのレンズ３６４７および３６４３と同様に設計され、したがってこれらのレンズは、当該のディテクター３７９０、３７９８で、当該のビーム伝搬方向に対する２つの横方向に関して、わずかに異なる２つの焦点面を形成する。その結果、図３７Ｂに示されるように、第３の直交次元での光源の位置がサンプル平面（垂直位置δがゼロである位置）に対して変化するにつれて、画像の楕円率および向きが変化する。上述したように、この情報を、ディテクター３７９０、３７９８に接続されたプロセッサー（図２８のプロセッサー２８１４など）が使用して、第３の直交次元での光源の位置を決定することができる。
【０１３８】
図３８を参照すると、別の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置３８００が、普通であれば干渉システム（図２８の干渉システム２８０６など）に向けられる小さなパーセンテージの光をフィルター除去するために、各光路３８２０、３８２２内に位置されたビームスプリッター３８８０を含む。各ビームスプリッター３８８０は、当該のディテクターシステム３８８２に光を向け、各ディテクターシステム３８８２は、光学素子およびディテクターを含み、このディテクターはまたプロセッサー（図２８のプロセッサー２８１４など）に接続される。ディテクターは、たとえば、電荷結合素子（ＣＣＤ）または電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ）であってよい。特に、下側ディテクターシステム３８８２は、下側ビームスプリッター３８８０からの光ビームを受け取り、光ビームを合焦する集束レンズ３８８６と、特定の波長範囲外の光を遮断するフィルター３８８８と、ディテクター３８９０とを含む。上側ディテクターシステム３８８２は、上側ビームスプリッター３８８０からの光ビームを受け取り、光ビームを合焦する集束レンズ３８９４と、特定の波長範囲外の光を遮断するフィルター３８９６と、ディテクター３８９８とを含む。
【０１３９】
ディテクターシステム３８８２は、軸方向でずらされた２つのサンプル平面を検出するように設計される。この検出方式では、ディテクター３８９０、３８９８の１つまたは複数を、標準の画像平面から移動させることができ、かつ／またはレンズ３８８６、３８９４の１つまたは複数を、ディテクター３８９０、３８９８の直前または直後に画像平面を配置するように移動させることができ、その結果、標準の（ｚ＝０）対象物（サンプル）平面のオーバーフォーカスまたはアンダーフォーカス画像が得られる。これを行うことによって、焦点の独立したｚ依存性がディテクター３８９０、３８９８で観察される。
【０１４０】
この情報をプロセッサーが使用して、ディテクター３８９８、３８９０での第１の画像Ｂ１の規格化ピーク輝度を第２の画像の規格化ピーク輝度Ｂ２と比較することによって、第３の直交次元での光源の位置を決定することができる。したがって、ディテクターでの第１の画像のピーク輝度がｂ１であり、ディテクターでの第２の画像のピーク輝度がｂ２である場合、第１の画像の規格化ピーク輝度がＢ１、すなわちｂ１／（ｂ１＋ｂ２）となり、第２の画像の規格化ピーク輝度がＢ２、すなわちｂ２／（ｂ１＋ｂ２）となる。したがって、プロセッサーは、差Ｂ１−Ｂ２を求めてデフォーカスを示し、上述した処置に従って光源の垂直位置を決定する。
【０１４１】
他の実装形態では、プロセッサーは、デフォーカスを示すために、第１および第２の画像のあてはめ半径またはスポットサイズに関する情報を使用する。
【０１４２】
図３９Ａを参照すると、別の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置３９００が、ミラー３９４２、３９４６を含み、これらのミラーは、外側環状領域３９８４から分離された内径瞳孔領域３９８０を有するように修正されている。ミラー３９４２、３９４６は、各ミラー面が互いに異なる２つの反射角に向けられている２つのミラー面を有することができる。たとえば、内側領域と外側領域の角度の差は、約０．１〜１°であってよく、この差は、ディテクターで光源の二重画像を生成するのに十分である。
【０１４３】
この設計により、各ミラー３９４２、３９４６は、別個の２つの光ビーム（内径瞳孔領域３９８０からの内側光ビームと、外側環状領域３９８４からの外側光ビーム）を提供し、これらの光ビームが干渉システム（図２８の干渉システム２８０６など）内で個別に干渉する。２つの画像が各ディテクター２８０８、２８１０、２８１２に取り込まれ、一方の画像は、より短い距離でディテクターに進む内側光ビーム成分からのものであり、他方の画像は、より長い距離でディテクターに進む合成ビームの外側光ビーム成分からのものである。内側光ビームは、より速い位相変動を有し、したがって図３９Ｂに示されるように位相角差（これは内側光ビームと外側光ビームの位相差である）から位置を決定することができる。図３９Ｂは、位相角差と光源の垂直位置との関係のグラフを表す。
【０１４４】
ディテクターは、内側光ビーム成分および外側光ビーム成分から得られた２つの画像により、軸方向でずらされた２つのサンプル平面を検出するように設計される。この検出方式では、上で詳述したように、光活性化局所干渉顕微鏡観察が、第１および第２の直交次元での光源の位置を決定し、かつ第３の直交次元での光源の取り得る位置の組を決定する。光活性化局所干渉顕微鏡観察は、内側成分または外側成分に対して行うことができ、同時に第３の直交次元での光源の実際の位置を決定する。
【０１４５】
図４０Ａを参照すると、別の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置４０００が、ミラー４０４２、４０４６を含み、それらの形状は、（波面曲率を修正しないので）平面対称性を維持するように修正され、かつ波面の回転対称性を破壊するように修正されている。この場合、各ミラー４０４２、４０４６は、円形のミラーから縁部領域を除去して概して卵形のミラーを形成することによって修正され、各ミラーは他のミラーに対して約９０°回転され、それにより各ミラーが、光源の垂直位置に依存する異なる形状を生み出す。したがって、ミラー４０４２、４０４６から反射された光ビームが干渉システム内で干渉され、再結合されて合成ビームを形成するとき、光ビームは、中心領域では完全に重ね合わされるが、縁部領域では重ね合わされない。この場合、点広がりまたは画像対称性がミラーの形状の修正によって修正され、画像の振幅および／または形状がミラーの形状の修正によって修正されると言うことができる。形状が光源の垂直位置に依存することにより、この情報をプロセッサーが使用して、既知の光源を使用する装置４０００の校正に基づいて、ディテクターに当たる画像形状を分析することによって光源の垂直位置を決定することができる。（１つの軸に沿って他の軸よりも多くのミラーが存在することによって）ミラー４０４２、４０４６が何らかの楕円状の変化を伴って修正されるので、画像形状が何らかの楕円率シグネチャを示すはずであると予想される。
【０１４６】
ディテクターと基本的な合焦レンズとの相対配置により生じる平面のずれを測定することを含む別の実装形態では、たとえば図３０に示される基本設計の素子を実質的に修正せずに装置を設計することができる。その代わりに、装置は、ディテクター３００８、３０１０、３０１２が干渉システム３００６に対して移動されるように、かつ／または光学素子３０５０、３０５４、３０５８内部の合焦レンズが干渉システム３００６に対して移動されるように設計することができ、それにより各ディテクターが異なる画像平面に対して合焦される。たとえば、ディテクター３０１０は、ディテクター３００８に対して一方向でデフォーカスさせることができ、ディテクター３０１２は、ディテクター３００８に対して逆方向でデフォーカスさせることができる。この場合、３つのディテクターそれぞれでの画像半径が、光源の垂直位置に依存する情報を提供することができ、垂直位置を決定するためにこれを使用することができる。
【０１４７】
さらなる他の実装形態では、多位相干渉顕微鏡観察装置３８００は、ただ１つのディテクターシステム３８８２を有するように設計することができ、このディテクターシステム３８８２は、主要なディテクター３００８、３０１０、３０１２の１つまたは複数と共に移動させることができ、ディテクターのうちの１つまたは複数のデフォーカスを可能にし、そのようなデフォーカスは光源の垂直位置に依存する。
【０１４８】
いくつかの実装形態は、プロセッサーと、種々のプロセッサー実行操作を行うための命令またはコンピューターコードを有する関連プロセッサー可読媒体と、を含む。そのようなプロセッサーは、内蔵マイクロプロセッサー、コンピューターシステムの一部としてのマイクロプロセッサー、特定用途向け集積回路（「ＡＳＩＣ」）、およびプログラマブルロジックデバイス（「ＰＬＤ」）のようなハードウェアモジュールとして実装可能である。そのようなプロセッサーはまた、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、Ｃ、アセンブラーのようなプログラミング言語、ハードウェア記述言語、または任意の他の好適なプログラミング言語で記述された１つ以上のソフトウェアモジュールとして実装することも可能である。プロセッサーは、１つもしくは複数の特定目的のために特別に設計および構成された媒体およびコンピューターコード（コードと呼ばれることもある）を含む。プロセッサー可読媒体の例としては、次のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。磁気記憶媒体、たとえば、ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、および磁気テープ、光記憶媒体、たとえば、コンパクトディスク／ディジタルビデオディスク（「ＣＤ／ＤＶＤ」）、コンパクトディスクリードオンリーメモリー（「ＣＤ−ＲＯＭ」）、およびホログラフィックデバイス、光磁気記憶媒体、たとえば、フロッピー（登録商標）ディスクならびにリードオンリーメモリー（「ＲＯＭ」）デバイスおよびランダムアクセスメモリー（「ＲＡＭ」）デバイス。コンピューターコードの例としては、マイクロコードまたはマイクロ命令、機械命令、たとえば、コンパイラーにより生成されるもの、およびインタープリターを用いてコンピューターにより実行されるより高レベルの命令を含有するファイルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。たとえば、プロセッサー実行指示は、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ＋＋、または他のオブジェクト指向型プログラミング言語、および開発ツールを用いて実施可能である。コンピューターコードのそのほかの例としては、制御信号、暗号化コード、および圧縮コードが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
特定の実装形態を以上に示して説明してきたが、形態および細部にさまざまな変更を加えうることは、当業者であればわかるであろう。たとえば、照明技術の変更が可能であり、それにより強度データのモジュロλ／２周期性を改良することが可能である。それに加えて、Betzig参考文献に記載の種々の実装形態を本明細書に記載の種々の実装形態と組み合わせることが可能である。たとえば、一実装形態では、トップ／ボトムＴＩＲＦ照明を行って、一波長λまでの厚さを有するサンプルを測定することが可能である。他の選択肢の実装形態では、短パルスのコヒーレント再位相調整により照明平面を形成することが可能である。さらに他の実装形態では、サンプルの種々の高さのｚ座標でガウシアンウエストを形成する側方照明により、物理的セクション化に頼ることなくｚ座標方向の範囲をさらに拡張することが可能である。したがって、当然のことながら、本明細書に記載のシステムは、さまざまな記載の実装形態の素子および／または特徴部のさまざまな組合せおよび／または部分的組合せを含みうる。
【０１５０】
他の実装形態も、添付の特許請求の範囲の範囲内にある。
【符号の説明】
【０１５１】
１００ 二位相干渉顕微鏡観察システム
１３０ 光学素子
１３２ 光路
１４０ 光学素子
１４２ 光路
１５０ ビームスプリッター
１６０ 光学素子
１６５ ディテクター
１７０ 光学素子
１７５ ディテクター
２５０ ビームスプリッター
２６０ レンズ
２６５ ディテクター
２７０ レンズ
２７５ ディテクター
Ｓ サンプル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
概して第１および第２の直交次元によって定義されるサンプル平面に沿って延在するサンプル内にある光源を光駆動して、光源が複数の伝搬方向に光ビームを放出させる工程と、
前記光源から放出された２つ以上の光ビームを干渉させて、複数のディテクターに向けられる複数の出力ビームを生成する工程と、
前記複数の出力ビームからの各出力ビームの画像の中心領域に基づいて、前記第１の直交次元および前記第２の直交次元での前記光源の位置を決定する工程と、
前記複数の出力ビームそれぞれの個別に検出される強度に基づいて、前記サンプル平面に垂直な第３の直交次元での前記光源の取り得る位置の組を決定する工程と、
前記第３の直交次元での前記光源の位置と共に変化する波面修正に基づいて、光ビームおよび出力ビームのうちの１つまたは複数のビームの画像の形状を分析する工程であって、前記波面修正が、前記光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正である工程と、
前記分析された形状に基づいて、取り得る位置の組の中から第３の直交次元での前記光源の位置を決定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記１つまたは複数の画像の形状を分析する工程が、前記波面修正を所定の波面修正と比較する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数の画像の形状を分析する工程が、前記波面修正をモデル化された波面修正と比較する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数の画像の形状を分析する工程が、前記波面修正によって引き起こされ、前記第３の直交次元での前記光源の位置と共に変化する複素位相を分析する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
取り得る位置の組の中から前記第３の直交次元での前記光源の位置を決定する工程が、前記１つまたは複数の画像の形状を、所定の波面修正に基づいて決定される所定の画像の形状と比較する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの光ビームに前記波面修正を導入する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの光ビームに前記波面修正を導入する工程が、前記ビーム伝搬方向に対して当該の横方向にそれぞれ１つの焦点を有する焦点面間に、前記伝搬方向に沿ったずれを導入する工程を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの光ビームに前記波面修正を導入する工程が、前記ビーム伝搬方向に対する１つまたは複数の横方向に沿って前記波面の曲率を導入する工程を含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの光ビームに前記波面修正を導入する工程が、前記少なくとも１つの光ビームの画像の輝度を変える工程を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記画像の輝度が、前記光ビームおよび出力ビームのうちの１つまたは複数のビームの１つの横方向に沿って、第２の横方向とは異なるように変えられる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
概してサンプル平面に沿って延在するサンプル内にある光源が複数の光路に光ビームを放出するように構成された光駆動システムと、
前記光源から放出された第１および第２の光ビームを受け取り、前記各光ビームを２つ以上の分割ビームに分割し、前記分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成するように構成された干渉システムであって、前記各合成ビームが、前記２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、前記干渉が、前記光源の位置に対する前記光ビームの光路長の差による前記光ビーム間での光源位相の差によって少なくとも部分的に引き起こされる干渉システムと、
前記干渉システムから出力された前記各合成ビームの強度およびプロファイルの１つまたは複数を個別に検出するように構成された少なくとも２つのディテクターと、
前記少なくとも２つのディテクターから出力を受け取り、
各合成ビームの画像の中心領域に基づいて、サブ回折確度で、前記サンプル平面内での光源の位置を計算し、
各合成ビームの個別に検出された強度に基づいて、前記サンプル平面に垂直な第３の直交次元での前記光源の取り得る位置の組を計算し、
前記第３の直交次元での前記光源の位置と共に変化する波面修正に基づいて、光ビームおよび合成ビームのうちの１つまたは複数のビームの画像の形状を分析し、その際、前記波面修正が、前記光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正であり、
前記分析された形状に基づいて、前記取り得る位置の組から前記第３の直交次元での前記光源の位置を決定する
ように構成されたプロセッサーと
を備える装置。
【請求項１２】
前記光駆動システムが、前記サンプルに光学的に結合され、前記サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットを活性化させ、前記活性化されたスイッチャブル光源を励起するように構成され、それにより前記光ビームが、前記活性化されたスイッチャブル光源から、前記干渉システムに向けられた少なくとも２つの光路に沿って放出される請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
第１の光路に沿って放出された前記第１の光ビームを受け取り、少なくとも前記第１の光ビームを前記干渉システムに向け直すように構成された第１の光学素子と、
第２の光路に沿って放出された前記第２の光ビームを受け取り、少なくとも前記第２の光ビームを前記干渉システムに向け直すように構成された第２の光学素子と
をさらに備える請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
少なくとも１つの光ビームの可変の波面修正を導入するように構成された波面修正システムを、光路の少なくとも１つにさらに備える請求項１１に記載の装置。
【請求項１５】
前記波面修正システムが、１つまたは複数の光ビームおよび合成ビームの横方向に沿った焦点面をずらすように構成されたデフォーカスシステムを、前記光路の少なくとも１つに備える請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記デフォーカスシステムが、
前記光源と前記干渉システムとの間で第１の光ビームの第１の光路内にあり、前記第１の光ビームの横方向に沿った焦点面をずらすように構成された第１のデフォーカスシステムと、
前記光源と前記干渉システムとの間で第２の光ビームの第２の光路内にあり、前記第２の光ビームの横方向に沿った焦点面をずらすように構成された第２のデフォーカスシステムと
を備える請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記デフォーカスシステムが、前記サンプルと前記干渉システムとの間にある請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットを活性化する工程と、
前記活性化されたスイッチャブル光源から少なくとも２つの光路に沿って光ビームが放出されるように、前記活性化されたスイッチャブル光源を励起する工程と、
前記活性化されたスイッチャブル光源から第１の光路に沿って放出される第１の光ビームに第１の波面修正を導入し、前記活性化されたスイッチャブル光源から第２の光路に沿って放出される第２の光ビームに第２の波面修正を導入する工程であって、前記第２の波面修正が前記第１の波面修正と異なる工程と、
複数の出力ビームを生成するために前記第１の光ビームと第２の光ビームを干渉させる工程と、
前記複数の出力ビームからの各出力ビームの強度に基づいて、前記光源の三次元位置情報を決定する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
前記第２の波面修正が、前記第１の波面修正と方向が逆である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の波面修正を導入する工程が、第１の横方向に沿った第１の光ビームの焦点面を第２の横方向に沿った前記第１の光ビームの焦点面に対して第１のシフト値だけシフトさせる工程を含み、前記第１および第２の横方向が前記第１の光路に対して横方向である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の波面修正を導入する工程が、第１の横方向に沿った第２の光ビームの焦点面を第２の横方向に沿った前記第２の光ビームの焦点面に対して第２のシフト値だけシフトさせる工程を含み、前記第１および第２の横方向が前記第２の光路に対して横方向であり、前記第２のシフト値が前記第１のシフト値と逆である請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の波面修正を導入する工程が、前記第１の光路に対して横方向である少なくとも１つの方向に沿って、前記活性化されたスイッチャブル光源から放出される第１の光ビームをアンダーフォーカスする工程を含み、
前記第２の波面修正を導入する工程が、前記第２の光路に対して横方向である少なくとも１つの方向に沿って、前記活性化されたスイッチャブル光源から放出される第２の光ビームをオーバーフォーカスする工程を含む
請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および第２の光ビームに前記第１および第２の波面修正を導入する前に、平行化された光ビームを形成する工程をさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
三次元位置情報を決定する工程が、前記サンプルが概して延在するサンプル平面に垂直な次元での前記光源の位置を決定する工程を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の光ビームに前記第１の波面修正を導入する工程が、前記第１の光ビームに波面曲率を導入する工程を含み、
前記第２の光ビームに前記第２の波面修正を導入する工程が、前記第２の光ビームに波面曲率を導入する工程を含む
請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
各波面修正が、当該の光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正である請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
点光源から放出される第１および第２の光ビームを、当該の第１および第２の異なる光路に関連する第１および第２の異なる方向に沿って向ける工程と、
前記第１の光路での前記第１の光ビームに対して横方向で、焦点面を第１のシフト値だけシフトさせ、前記第２の光路内の前記第２の光ビームに対して横方向で、焦点面を第２のシフト値だけシフトさせる工程であって、前記第２のシフト値が前記第１のシフト値と逆である工程と、
前記第１および第２の光ビームの焦点面をシフトさせた後、前記第１および第２の光ビームをそれぞれ２つ以上の分割ビームに分割し、前記分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成する工程であって、前記各合成ビームが、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、前記干渉が、前記第１および第２の光ビームの前記光路長の差によって少なくとも部分的に引き起こされる工程と、
前記各合成ビームの画像を個別に検出する工程と、
第１の直交次元および第２の直交次元での前記光源の位置を決定する工程と、
前記各合成ビームの個別に検出された画像に基づいて、第３の直交次元での前記光源の位置を決定する工程と
を含む方法。
【請求項２８】
前記合成ビームそれぞれの個別に検出された画像に基づいて前記第３の直交次元での前記光源の位置を決定する工程が、個別に検出された画像の強度を所定の値と比較することによって前記光源の位置を決定する工程を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項１】
概して第１および第２の直交次元によって定義されるサンプル平面に沿って延在するサンプル内にある光源を光駆動して、光源が複数の伝搬方向に光ビームを放出させる工程と、
前記光源から放出された２つ以上の光ビームを干渉させて、複数のディテクターに向けられる複数の出力ビームを生成する工程と、
前記複数の出力ビームからの各出力ビームの画像の中心領域に基づいて、前記第１の直交次元および前記第２の直交次元での前記光源の位置を決定する工程と、
前記複数の出力ビームそれぞれの個別に検出される強度に基づいて、前記サンプル平面に垂直な第３の直交次元での前記光源の取り得る位置の組を決定する工程と、
前記第３の直交次元での前記光源の位置と共に変化する波面修正に基づいて、光ビームおよび出力ビームのうちの１つまたは複数のビームの画像の形状を分析する工程であって、前記波面修正が、前記光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正である工程と、
前記分析された形状に基づいて、取り得る位置の組の中から第３の直交次元での前記光源の位置を決定する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記１つまたは複数の画像の形状を分析する工程が、前記波面修正を所定の波面修正と比較する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つまたは複数の画像の形状を分析する工程が、前記波面修正をモデル化された波面修正と比較する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つまたは複数の画像の形状を分析する工程が、前記波面修正によって引き起こされ、前記第３の直交次元での前記光源の位置と共に変化する複素位相を分析する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
取り得る位置の組の中から前記第３の直交次元での前記光源の位置を決定する工程が、前記１つまたは複数の画像の形状を、所定の波面修正に基づいて決定される所定の画像の形状と比較する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの光ビームに前記波面修正を導入する工程をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの光ビームに前記波面修正を導入する工程が、前記ビーム伝搬方向に対して当該の横方向にそれぞれ１つの焦点を有する焦点面間に、前記伝搬方向に沿ったずれを導入する工程を含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの光ビームに前記波面修正を導入する工程が、前記ビーム伝搬方向に対する１つまたは複数の横方向に沿って前記波面の曲率を導入する工程を含む請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの光ビームに前記波面修正を導入する工程が、前記少なくとも１つの光ビームの画像の輝度を変える工程を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記画像の輝度が、前記光ビームおよび出力ビームのうちの１つまたは複数のビームの１つの横方向に沿って、第２の横方向とは異なるように変えられる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
概してサンプル平面に沿って延在するサンプル内にある光源が複数の光路に光ビームを放出するように構成された光駆動システムと、
前記光源から放出された第１および第２の光ビームを受け取り、前記各光ビームを２つ以上の分割ビームに分割し、前記分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成するように構成された干渉システムであって、前記各合成ビームが、前記２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、前記干渉が、前記光源の位置に対する前記光ビームの光路長の差による前記光ビーム間での光源位相の差によって少なくとも部分的に引き起こされる干渉システムと、
前記干渉システムから出力された前記各合成ビームの強度およびプロファイルの１つまたは複数を個別に検出するように構成された少なくとも２つのディテクターと、
前記少なくとも２つのディテクターから出力を受け取り、
各合成ビームの画像の中心領域に基づいて、サブ回折確度で、前記サンプル平面内での光源の位置を計算し、
各合成ビームの個別に検出された強度に基づいて、前記サンプル平面に垂直な第３の直交次元での前記光源の取り得る位置の組を計算し、
前記第３の直交次元での前記光源の位置と共に変化する波面修正に基づいて、光ビームおよび合成ビームのうちの１つまたは複数のビームの画像の形状を分析し、その際、前記波面修正が、前記光源から放出される少なくとも１つの光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正であり、
前記分析された形状に基づいて、前記取り得る位置の組から前記第３の直交次元での前記光源の位置を決定する
ように構成されたプロセッサーと
を備える装置。
【請求項１２】
前記光駆動システムが、前記サンプルに光学的に結合され、前記サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットを活性化させ、前記活性化されたスイッチャブル光源を励起するように構成され、それにより前記光ビームが、前記活性化されたスイッチャブル光源から、前記干渉システムに向けられた少なくとも２つの光路に沿って放出される請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
第１の光路に沿って放出された前記第１の光ビームを受け取り、少なくとも前記第１の光ビームを前記干渉システムに向け直すように構成された第１の光学素子と、
第２の光路に沿って放出された前記第２の光ビームを受け取り、少なくとも前記第２の光ビームを前記干渉システムに向け直すように構成された第２の光学素子と
をさらに備える請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
少なくとも１つの光ビームの可変の波面修正を導入するように構成された波面修正システムを、光路の少なくとも１つにさらに備える請求項１１に記載の装置。
【請求項１５】
前記波面修正システムが、１つまたは複数の光ビームおよび合成ビームの横方向に沿った焦点面をずらすように構成されたデフォーカスシステムを、前記光路の少なくとも１つに備える請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記デフォーカスシステムが、
前記光源と前記干渉システムとの間で第１の光ビームの第１の光路内にあり、前記第１の光ビームの横方向に沿った焦点面をずらすように構成された第１のデフォーカスシステムと、
前記光源と前記干渉システムとの間で第２の光ビームの第２の光路内にあり、前記第２の光ビームの横方向に沿った焦点面をずらすように構成された第２のデフォーカスシステムと
を備える請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記デフォーカスシステムが、前記サンプルと前記干渉システムとの間にある請求項１５に記載の装置。
【請求項１８】
サンプル内にあるスイッチャブル光源のうち統計的に散在するサブセットを活性化する工程と、
前記活性化されたスイッチャブル光源から少なくとも２つの光路に沿って光ビームが放出されるように、前記活性化されたスイッチャブル光源を励起する工程と、
前記活性化されたスイッチャブル光源から第１の光路に沿って放出される第１の光ビームに第１の波面修正を導入し、前記活性化されたスイッチャブル光源から第２の光路に沿って放出される第２の光ビームに第２の波面修正を導入する工程であって、前記第２の波面修正が前記第１の波面修正と異なる工程と、
複数の出力ビームを生成するために前記第１の光ビームと第２の光ビームを干渉させる工程と、
前記複数の出力ビームからの各出力ビームの強度に基づいて、前記光源の三次元位置情報を決定する工程と
を含む方法。
【請求項１９】
前記第２の波面修正が、前記第１の波面修正と方向が逆である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の波面修正を導入する工程が、第１の横方向に沿った第１の光ビームの焦点面を第２の横方向に沿った前記第１の光ビームの焦点面に対して第１のシフト値だけシフトさせる工程を含み、前記第１および第２の横方向が前記第１の光路に対して横方向である請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の波面修正を導入する工程が、第１の横方向に沿った第２の光ビームの焦点面を第２の横方向に沿った前記第２の光ビームの焦点面に対して第２のシフト値だけシフトさせる工程を含み、前記第１および第２の横方向が前記第２の光路に対して横方向であり、前記第２のシフト値が前記第１のシフト値と逆である請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の波面修正を導入する工程が、前記第１の光路に対して横方向である少なくとも１つの方向に沿って、前記活性化されたスイッチャブル光源から放出される第１の光ビームをアンダーフォーカスする工程を含み、
前記第２の波面修正を導入する工程が、前記第２の光路に対して横方向である少なくとも１つの方向に沿って、前記活性化されたスイッチャブル光源から放出される第２の光ビームをオーバーフォーカスする工程を含む
請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１および第２の光ビームに前記第１および第２の波面修正を導入する前に、平行化された光ビームを形成する工程をさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
三次元位置情報を決定する工程が、前記サンプルが概して延在するサンプル平面に垂直な次元での前記光源の位置を決定する工程を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の光ビームに前記第１の波面修正を導入する工程が、前記第１の光ビームに波面曲率を導入する工程を含み、
前記第２の光ビームに前記第２の波面修正を導入する工程が、前記第２の光ビームに波面曲率を導入する工程を含む
請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
各波面修正が、当該の光ビームの波面の曲率および形状のうちの１つまたは複数の修正である請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
点光源から放出される第１および第２の光ビームを、当該の第１および第２の異なる光路に関連する第１および第２の異なる方向に沿って向ける工程と、
前記第１の光路での前記第１の光ビームに対して横方向で、焦点面を第１のシフト値だけシフトさせ、前記第２の光路内の前記第２の光ビームに対して横方向で、焦点面を第２のシフト値だけシフトさせる工程であって、前記第２のシフト値が前記第１のシフト値と逆である工程と、
前記第１および第２の光ビームの焦点面をシフトさせた後、前記第１および第２の光ビームをそれぞれ２つ以上の分割ビームに分割し、前記分割ビームの少なくとも２つ以上を組み合わせて複数の合成ビームを形成する工程であって、前記各合成ビームが、２つ以上の分割ビーム間の干渉を含み、前記干渉が、前記第１および第２の光ビームの前記光路長の差によって少なくとも部分的に引き起こされる工程と、
前記各合成ビームの画像を個別に検出する工程と、
第１の直交次元および第２の直交次元での前記光源の位置を決定する工程と、
前記各合成ビームの個別に検出された画像に基づいて、第３の直交次元での前記光源の位置を決定する工程と
を含む方法。
【請求項２８】
前記合成ビームそれぞれの個別に検出された画像に基づいて前記第３の直交次元での前記光源の位置を決定する工程が、個別に検出された画像の強度を所定の値と比較することによって前記光源の位置を決定する工程を含む請求項２７に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６Ａ】
【図３６Ｂ】
【図３７Ａ】
【図３７Ｂ】
【図３８】
【図３９Ａ】
【図３９Ｂ】
【図４０Ａ】
【図４０Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図７Ｃ】
【図７Ｄ】
【図８】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１Ａ】
【図３１Ｂ】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６Ａ】
【図３６Ｂ】
【図３７Ａ】
【図３７Ｂ】
【図３８】
【図３９Ａ】
【図３９Ｂ】
【図４０Ａ】
【図４０Ｂ】
【公開番号】特開２０１１−５９１００（Ｐ２０１１−５９１００Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１０−１４００６５（Ｐ２０１０−１４００６５）
【出願日】平成２２年６月２１日（２０１０．６．２１）
【出願人】（５０２３５２４２７）ハワード ヒューズ メディカル インスティチュート (3)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１４００６５（Ｐ２０１０−１４００６５）
【出願日】平成２２年６月２１日（２０１０．６．２１）
【出願人】（５０２３５２４２７）ハワード ヒューズ メディカル インスティチュート (3)
【Ｆターム（参考）】
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